Jäst kväveutnyttjande i fyllosfären under växtens livslängd under reglering av autofagi | vetenskapliga rapporter

Jäst kväveutnyttjande i fyllosfären under växtens livslängd under reglering av autofagi | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • autophagy
  • Cellulär mikrobiologi

Abstrakt

Nyligen har mikrob-växtinteraktioner vid ovanstående delar väckt stor uppmärksamhet. Här beskriver vi kvävemetabolism och reglering av autofagi i metylotrofisk jäst Candida boidinii , sprider sig och överlever på bladen av Arabidopsis thaliana. Efter kvantitativa analyser av jästtillväxt på bladen hos A. thaliana med vildtypen och flera mutanta jäststammar, visade vi att på unga blad var nitratreduktas (Ynr1) nödvändigt för jästförökning, och jästen använde nitrat som kvävekälla . Å andra sidan avslöjade en nyutvecklad metylaminsensor uppkomsten av metylamin på äldre blad, och metylaminmetabolism inducerades i C. boidinii och Ynr1 utsattes för nedbrytning. Biokemisk och mikroskopisk analys av Ynr1 in vitro under en förskjutning av kvävekälla från nitrat till metylamin avslöjade att Ynr1 transporterades till vakuolen, som var lasten för biosyntetisk cytoplasma-till-vakuol-målsökningsväg (Cvt) och nedbruten. Våra resultat avslöjar förändringar i kvävekällans sammansättning för fylosfäriska jästar under åldrande av växter och efterföljande anpassning av jästarna till denna miljöförändring medierad genom reglering av autofagi.

Introduktion

Växtbladen täcker ett stort område av global markyta, ungefär 10 9 kvadratkilometer . Varje blad ger en livsmiljö för kolonisering av mikrober 2, 3 . Många mikrober bildar sporer, antingen för att överleva under näringsbegränsade förhållanden eller för att skilja från sporer till appressoria innan invasionen av värdväxter. Asporogena mikrober bor och överlever även under långa perioder på bladytor under en växts hela livslängd, dvs. under tillväxten från frö till vuxen ålder, följt av åldring och död 4 . Vid värdväxtens död återvänder mikrober på växtkroppen till jorden, där biomassan i växten bryts ned av jordmikrober och återvinner näringsämnen för användning av nästa generation. Vissa mikrober som finns i phyllosfären (de ovan jordnära delarna av växter som används som mikrobiella livsmiljöer) dyker upp från jorden under växttillväxt 5 . Trots sin potentiella betydelse är information om mikrob-växtinteraktioner och mikrobiell fysiologi, i samband med hela växtens livslängd, mycket begränsad. Följaktligen förblir de faktiska näringskällorna som används av mikrober på ovanstående delar av växtytorna mestadels okända.

Metylotrofer är mikrober som kan använda reducerade en-kol (C1) -föreningar, t.ex. metan, metanol eller metylamin, som enda kol- och energikälla. Eftersom metanol är rikligt i phyllosphere 6, är metylotrophs allestädes närvarande på växtbladytor och dominerar phyllosphere populationen 7 . Även om föreningarna och symbiotiska förhållandet mellan växter och metylotrofiska bakterier är väl dokumenterade 8, 9, 10, har metylotrofiska jäst inte studerats i stort. Nyligen upptäckte vi att den växtskyddande asporogena metylotrofiska jäst Candida boidinii kan sprida sig på växande växtlöv och assimilera metanol för dess tillväxt och överlevnad 6 .

Hittills har de flesta forskare fokuserat på mikrobväxtinteraktion vid underjordisk del och undersökt mikrobiell kvävemetabolism, såsom kvävefixering, nitrifikation och denitrifikation 11, 12 . Å andra sidan, ovan marken av växter, speciellt i den phyllsopheric miljön, som antas påverkas direkt av växtens dagliga cykel, t.ex. fotosyntetisk metabolism, förblir det okänt vilka av dessa kväveföreningar som används av mikrober, även om proteomiska analys och tillväxttestanalys med användning av växande växtvävnader visade flera möjliga kvävekällor för mikrober 13, 14 . C. boidinii kan använda flera kvävekällor in vitro , t.ex. ammonium, nitrat och metylamin. Baserat på vår interna analys av C. boidinii genomanalys, spekulerar vi att denna jäst använder nitratreduktas (Ynr1) för att reducera nitrat till nitrit, vilket därefter reduceras till ammonium. Metylamin omvandlas å andra sidan till ammonium genom peroxisomal aminoxidas (Amo1) (fig. La). Generellt i jäst katalyseras ammoniumassimilering av ATP-beroende glutaminsyntas, vilket ger glutamin från a-ketoglutarat och ammonium. Glutamin fungerar som en allmän acceptor för aminogrupper från aminosyror och andra kväveföreningar 15, och C. boidinii tros ha en liknande väg för ammoniumassimilering.

(a) Kväveutnyttjningsväg i metylotrof jäst C. boidinii . Ynr1, nitratreduktas; Yni, nitritreduktas; Amo1, aminoxidas; GS: glutaminsyntetas; GOT, glutaminoxoglutarat aminotransferas. (b) Konfokala mikroskopbilder av Venus-märkt vildtyp, amo1Δ och ynr1Δ- belastning på växande A. thaliana- blad. C. boidinii- celler upptäcktes på unga Arabidopsis- blad (2-3 veckor efter grodd) och observerades den angivna dagen. Bar, 10 um. (c) Kvantifiering av C. boidinii- cellpopulationer på A. thaliana- bladen med qPCR-metod. Bladen på vilka C. boidinii- stammarna ympades hämtades vid de angivna tidspunkterna och utsattes för qPCR som förstärkte VENUS- genen integrerad i C. boidinii- genomet. Felfältna visar standardavvikelser för tredubbla mätningar.

Bild i full storlek

Eftersom jästmetanolmetabolism kräver peroxisombiogenes, induceras peroxisomer när celler odlas in vitro på metanol som kolkälla 16, 17 . En övergång till medium som innehåller andra kolkällor, eller till näringsbegränsade förhållanden, provocerar nedbrytning av peroxisomer via pexofagi, en typ av selektiv autofagi 18 . På unga växtlöv uppvisar metanolkoncentrationen en daglig dynamisk svängningscykel (hög under den mörka perioden, låg i ljusperioden), och peroxisom biogenes och pexofagi regleras dynamiskt som svar på metanolcykeln 6 . I en tidigare rapport visade vi att pexophagy spelar avgörande roller i spridningen av C. boidinii på växtlöv 6 . Andra bevis på bevis från svampväxtpatogener indikerar att pexofagi krävs för invasion av svampceller till värdväxter 19 .

Autophagy är en väl karakteriserad katabolisk väg som ansvarar för nedbrytning av överflödiga eller dysfunktionella cellkomponenter 20 . Denna process bidrar till intracellulär ombyggnad, såväl som borttagning av aggregat och skadade organeller. Den vanligaste formen av autofagi är svältinducerad makroautofagi, ett icke-selektivt system för bulknedbrytning av cytoplasmiska komponenter 21 . Under denna process sekvenseras subcellulära substrat i dubbelmembranbundna strukturer som kallas autofagosomer. Dessa strukturer smälter samman med vakuoler, vilket leder till nedbrytning eller återvinning av deras last 21 .

Till skillnad från bulknedbrytningssystemet för makroautofagi, finns det också selektiva autofagiska vägar, i vilka cytoplasmatiska laddningar selektivt erkänns och transporteras till vakuolen för nedbrytning 22 . En sådan selektiv väg är pexofagi, beskrivet ovan, som ansvarar för nedbrytning av överskott av peroxisomer. Ytterligare typer av selektiv autofagi motsvarar andra organeller: mitofagi för mitokondrier, lipofagi för lipiddroppar, ribofagi för ribosomer och ER-fagi för endoplasmatisk retikulum 23, 24, 25, 26 . Dessutom har jästar en konstitutiv biosyntetisk väg, cytoplasma-till-vakuolinriktningsvägen (Cvt), som är ansvarig för transporten av flera vakuolära enzymer inklusive aminopeptidas Ι (ApeΙ), aspartylaminopeptidas (Ape4) och alfa mannosidas id ( AmsΙ) 27, 28, 29 . ApeΙ, som syntetiseras som en föregångare ApeΙ (pre-ApeΙ), bildar ett stort Cvt-komplex som sekvenseras av en dubbelmembranstruktur och bildar en Cvt-vesikel. Och efter leveransen till vakuolen mognas pre-ApeΙ genom avlägsnande av propeptiden 30 .

I denna studie undersökte vi kväveutnyttjningsvägen för metylotrof jäst C. boidinii på växtblad. Ynr1 var nödvändigt för spridningen av denna jäst på unga löv. På äldre blad spelade metylamin emellertid en viktigare roll som kvävekälla, och Ynr1 transporterades till vakuolen och försämrades . Analyser av dynamiken hos Ynr1 efter kvävekällkopplaren avslöjade att Ynrl-protein transporteras till vakuolen för nedbrytning via de autofagiska vesiklarna i biosyntetisk Cvt-väg. Dessa resultat belyser jästkvävemetabolismen och regleringen av autofagi på växtlöv som svar på värdväxtens livsfas.

Resultat

C. boidinii använder nitrat på odling av A. thaliana- blad

Homologinsökningar i C. boidinii- genomdatabasen avslöjade generna som kodar för enzymer som är involverade i nitrat- och metylaminanvändningsvägar som förutses ge ammonium. Generna som kodar de initiala stegen för dessa vägar är YNR1 , som kodar för nitratreduktas Ynrl och AMO1 , som kodar aminoxidaset Amo1 (fig la). Dessa gener tilldelades först baserat på anpassningen med ortologa enzymer från den metylotrofiska jäst Hansenula polymorpha (kompletterande figur la, b). För att avslöja funktionerna hos YNR1 och AMO1 i C. boidinii , stördes dessa gener genom att ersätta den lämpliga ORF med Zeocin TM- resistensgenen som en selektiv markör. Ynrl- och amol- stammarna kunde inte använda nitrat respektive metylamin som kvävekälla (kompletterande fig. 2a, b, c). Vidare förlorades nitratreduktas- och aminoxidasaktiviteter i stammarna ynrl respektive amol (tilläggstabell 1), vilket bekräftar att dessa gener kodar proteiner med motsvarande aktiviteter.

En tidigare studie etablerade en teknik för utvärdering av spridning av C. boidinii på växtlöv med användning av en kombination av qPCR och fluorescerande mikroskopi 6 . I denna studie använde vi den tekniken för att jämföra tillväxten av ynr1r- och amo1Δ- stammarna på unga A. thaliana- blad (2-3 veckor efter groddningen) med den för en motsvarande stam som uttrycker Venus under kontroll av den konstitutiva ACT1- promotorn. I vildtyps- och amo1- stammarna, samtidigt med ökningar i cellantalet som observerades under fluorescensmikroskopi (Fig. 1b), upptäcktes 4–8 gånger ökningar i kopietalet av VENUS- genen integrerad i C. boidinii- genomet efter 13 dagar av ympning, vilket indikerar spridning av stammarna på bladen. Å andra sidan observerades inte sådan spridning för ynrl- stammen (fig. Ib, c). Dessa resultat indikerade att YNR1 är nödvändig för C. boidinii- spridning på odling av unga A. thaliana- blad och att C. boidinii kan använda nitrat som kvävekälla.

YNR1 , men inte AMO1 , uttrycks på unga löv

Därefter undersökte vi regleringen av YNR1- och AMO1- uttrycket , liksom aktiviteterna för motsvarande enzymer, som svar på olika kvävekällor. YNR1 och AMO1 inducerades specifikt av nitrat respektive metylamin vid både enzymaktiviteten (kompletterande tabell 2) och transkriptionsnivåer (kompletterande tabell 3).

Därefter konstruerade vi stammar som uttrycker Venus under kontroll av YNR1- promotorn (stam PYNR) eller AMO1- promotorn (stam PAMO) och undersökte sedan deras promotoraktiviteter på unga växtlöv. Efter 4 timmars inkubation efter att ha blottats på ovansidan av växande unga blad observerades cellerna under ett fluorescerande mikroskop. Stam PYNR uppvisade klar cytosolisk fluorescens, medan PAMO-stam inte gjorde (fig. 2a). Således uttrycktes YNR1 på unga blad av A. thaliana , medan AMO1 inte var det. Därför ansåg vi att YNR1- uttryck induceras av nitrat närvarande på växtblad.

(a) Mikroskopiska bilder av C. boidinii ympade på ytan av ett ungt blad. Venusfluorescerande protein uttrycktes under kontroll av YNR1- eller AMO1- promotorn. DIC representerar bilden från mikroskopi med differentiell interferenskontrast. Bar, 5 um. (b) Mikroskopiska bilder av C. boidinii ympade på ytan av ett vissnande blad. Venusfluorescerande protein uttrycktes under kontroll av AMO1- promotorn. Bar, 5 um. (c) Intracellulär lokalisering av Venus-Ynr1 på växtlöv. Venus-Ynrl-fusionsprotein uttrycktes under kontroll av den infödda YNR1- promotorn i celler som lever på växande eller vissnande löv av A. thaliana visade i de övre bilderna. Vita pilspetsar visar prickliknande strukturer av Venus-Ynr1, och gula pilspetsar visar den diffusa Venusfluorescensen i vakuolen. Bar, 2 um.

Bild i full storlek

Generna för metanolanvändning uppvisar en daglig periodicitet i sitt uttryck, vilket återspeglar svängningen i metanolkoncentration: högt uttryck under den mörka perioden och låga nivåer under ljusperioden. Exempelvis är transkriptionsnivån för DAS1 , som kodar peroxisomal dihydroxyacetonsyntas, ~ tre gånger högre under den mörka perioden än ljusperioden 6 . Därför undersökte vi om transkriptionsnivån för YNR1 förändras under den dagliga cykeln. För detta ändamål extraherades det totala RNA från C. boidinii som förökades på bladytor och utsattes för qRT-PCR-analys. Transkriptionsnivån för YNR1 ökade 2, 8 gånger och toppade vid 8 timmar (4 timmar efter början av ljusperioden) och minskade gradvis till sitt minimum vid 4 timmar (8 timmar efter början av mörk period) (Kompletterande Fig. 3a). Dessa fynd indikerar att YNR1- uttrycket också fluktuerar på unga växtlöv under den dagliga cykeln.

AMO1- uttryck och förändring av Venus-Ynr1-lokalisering på åldriga löv

Under växternas livscykel (tillväxt, mognad, vissnande och död) måste mikrober i phyllosfären anpassa sig till värdåldersberoende förändringar i bladmiljön. På unga växande löv oscillerar metanolkoncentrationen i phyllosfären under en daglig cykel. Denna svängning försvinner i vissnande löv, och koncentrationen ökar stadigt när vallningen fortskrider och bladet dör. På gamla blad kan jäst inte sprida sig; istället överlever de genom att använda sina högt utvecklade peroxisomer som proteinlagringsorganeller 6 .

Med användning av PAMO-stam undersökte vi om AMO1 uttrycktes på vissnande växtlöv (2-3 månader efter grodd). Cytosolisk fluorescens kunde detekteras på vallande blad (fig. 2b), vilket antydde att metylaminmetabolism induceras i C. boidinii på en åldrad eller död värdväxt. Med hjälp av en standardkurva för fluorescensintensitet, baserad på agarplattor innehållande olika koncentrationer av metylamin (kompletterande fig. 4), bestämde vi att metylaminkoncentrationen vid phylosfären var i genomsnitt 4, 78 × 10 −3 mM.

För att bestämma lokaliseringen av Ynr1 på åldriga växter konstruerade vi en stam som uttrycker ett Venus-Ynr1-fusionsprotein under kontroll av YNR1- promotorn. Expression av Venus-Ynr1-protein återställde tillväxten av ynr1- stam på nitrat som en solo-kvävekälla (data visas inte). När Venus-Ynr1-uttryckande celler ympades på unga blad av växande växt (2-3 veckor efter grodd) såg vi cytosolisk fluorescens (fig. 2c). Å andra sidan upptäckte vi prickliknande strukturer av Venus-Ynr1 och diffunderar vakuolär fluorescens i celler ympade på åldriga blad av vissnande växt (2-3 månader efter grodd) (Fig. 2c). Dessa resultat fick oss att antaga att Ynr1 utsätts för autofagisk nedbrytning orsakad av anpassningen till förändringen av bladmiljön.

Ynr1-aktiviteten minskade efter övergången från nitrat- till metylamininnehållande medium

För att förstå jästens anpassningsmekanism för miljöändring på löv under åldrande av värdväxt, beslutade vi att undersöka dynamiken i Ynr1 in vitro . Först övervakade vi enzymaktiviteten för Ynr1 efter en övergång från nitrat- till metylamininnehållande flytande medium. Specifikt odlade vi vildtyp C. boidinii på 10 mM nitrat som den enda kvävekällan (nitratmedium) och överförde dem sedan till 10 mM metylamin (metylaminmedium) eller nitratmedium (som en kontroll.) Den enzymatiska aktiviteten för Ynr1 minskade snabbt inom 1 timme efter övergången från nitrat till metylaminmedium. Däremot påverkade överföring till nitratmedium inte signifikant enzymatisk aktivitet (fig. 3).

Symboler: ♦, 10 mM metylamin; ▴, 10 mM nitrat. Experiment upprepades tre gånger. Enzymaktivitet uttrycks som det relativa värdet för var och en av de uppmätta värdena vid tidpunkten 0 h: (♦) 73, 2 och (▴) 87, 9 U (umol / mg protein). Felfält visar standardavvikelserna för tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Ynr1 transporteras till vakuolen via autofagi efter övergången till metylamin

Eftersom Ynr1-enzymaktiviteten minskade efter kvävekällskiftet antog vi att Ynr1 utsattes för autofagisk nedbrytning. För att belysa den molekylära basen för autofagisk nedbrytning av Ynr1 efter kvävekällskiftet använde vi en stam där Venus-Ynr1-fusionsprotein uttrycktes under YNR1- promotorn. När Venus-Ynrl har levererats till vakuolen avlägsnas Venus-delen proteolytiskt från resten av fusionsproteinet, varefter den är relativt stabil och kan detekteras genom immunblotanalys 31 .

Vi odlade vildtypsjäst såväl som atg1Δ- och atg8Δ- celler, som är nedsatta i alla autofagiska processer, på medium innehållande nitrat, och flyttade sedan cellerna till metylaminmedium eller medium utan kvävekälla (kväve svält). Tolv timmar efter övergången från nitratmedium till metylaminmedium detekterades den klyvda formen av Venus i vilda typceller , men inte i atg1 ^ celler eller atg8 ^ celler (fig. 4a och kompletterande fig. 5a). På liknande sätt, när cellerna utsattes för kväve-svältförhållanden för att inducera bulk-autofagi, detekterades den spjälkade formen av Venus i vildtypstammen men inte atg1- stammen (Fig. 4b).

(a) Immunoblot-analys av Venus-märkt Ynrl i C. boidinii vildtyp och atg1 ^ celler överförda från nitrat till metylaminmedium. (b) Immunoblotanalys av Venus-märkt Ynrl i C. boidinii vildtyp och atg1 ^ celler överförda från nitratmedium till kväve-svältförhållanden. (c) Mikroskopiska bilder av Venus-Ynr1 uttryckta i vildtyp- och atg1Δ- celler under övergången från nitratmedium till kväve-svältförhållanden. Sammanlagda bilder är kombinerade bilder av Venus gul fluorescens och DIC-bilder. Bar, 5 um.

Bild i full storlek

Intressant nog var bandintensiteterna för den spjälkade formen av Venus, detekterade efter mediumöverföringen från nitrat till metylamin, mer intensiva än de som detekterades efter övergången till kväve-svältförhållanden (fig. 4b). Dessa resultat antyder att Ynrl utsätts för mer effektivt för nedbrytning efter en kvävekälla-övergång från nitrat till metylamin än under förhållanden som inducerar bulk autofagi.

Vi använde även fluorescensmikroskopi för att övervaka ödet för Venus-Ynr1 efter det mediumskiftet. Efter övergången från nitrat till kväve-svältmedium detekterades Venus-fluorescens i vakuolen i vilda typceller, men förblev i cytosolen i atg1 ^ -celler (fig. 4c). Dessa morfologiska resultat överensstämde också med den biokemiska analysen, som indikerade att Venus-Ynrl transporteras till vakuolen via autofagi efter förskjutningen av kvävekälla.

Transport av Ynr1 till vakuolen kräver den selektiva autofagi-faktorn Atg11

Atg11 krävs för selektiva autofagivägar, inklusive Cvt-vägen, mitofagi och pexofagi. Det fungerar som ett byggnadsställningsprotein för rekrytering av last till det fagoforiska monteringsstället (PAS) för förpackning i vesiklar 22 . Vi undersökte om Ynr1 transporteras till vakuolen på ett Atg11-beroende sätt. I atg11 ^ -celler var bandintensiteten för den spjälkade formen av Venus klart svagare än den i vildtypceller efter mediumskiftet från nitrat till metylamin (Fig. 5a).

(a) Immunoblot-analys av Venus-märkta Ynrl i atg11- och atg30Δ- stammar överförda från nitrat till metylaminmedium. (b) Fluorescerande bilder av Venus-Ynr1 – uttryckande C. boidinii vildtyp, atg1Δ och atg11Δ celler under kvävekällskiftet från nitrat till metylamin. Bar, 5 um. (c) Kvantifiering av antalet Venus-Ynr1 puncta per cell, uppskattat från analys av de fluorescerande bilderna som visas i (b). För varje prov analyserades minst 50 celler. Felfält visar standardavvikelser.

Bild i full storlek

Amo1 är ett peroxisomalt aminoxidas, som har ett peroxisomalt inriktningssignal typ 2 (PTS2) -motiv med konsensussekvensen av (R, K) - (L, V, I) -X5- (H, Q) - (L, A, F). Under anpassning till metylaminmedium i metylotrof jäst Hansenula polymorpha 32 inducerades Amo1 och transporterades till peroxisomerna. Atg11 är också nödvändig för pexofagi 33 . Därför frågade vi om Atg11-beroende transport av Venus-Ynr1 var oberoende av pexofagi. I metylotrofisk jäst Pichia pastoris krävs Atg30 för pexofagi, men inte för Cvt-vägen eller mitofagi 34 . Tolv timmar efter mediumskiftet upptäckte vi den klyvda formen av Venus i atg30Δ- celler, såväl som i vildtypceller, vilket indikerar att Ynr1-transport till vakuolen är oberoende av pexofagi (fig. 5a). Ynr1 försämrades också i atg17Δ- stammen, vilket är nedsatt i icke-selektiv bulk autofagi (kompletterande fig. 5b).

Vi observerade också lokaliseringen av Venus-Ynr1 med fluorescensmikroskopi. När celler odlades på nitratmedium, hittades Venus-Ynr1 dispergerad i cytosolen (fig. 5b). I vildtypsceller, 0, 5 timmar efter övergången från nitrat till metylaminmedium, bildade Venus-Ynrl prickar, som var detekterbara i ytterligare 3 timmar. Därefter lokaliserades Venus-fluorescensen inuti vakuolen tills 12 timmar efter skiftet. I atg1- och atg8Δ- celler transporterades däremot Venus-Ynr1 inte till vakuolen (fig. 5b och kompletterande fig. 5c). Atg11 och Atg17 fungerar som ställningsproteiner för fagoforbildning i de selektiva och icke-selektiva autofagiska vägarna. Frekvensen för bildning av Venus-Ynrl-punkter var låg i atg11 ^ -celler (fig. 5b, c), men normal i atg17Δ- celler (kompletterande fig. 5c, d). Således berodde handel med Venus-Ynr1 till vakuolen av selektiv autofagi men inte av icke-selektiv autofagi. Faktum är att efter det mediumskiftet uppvisade Venus uttryckt i cytosolen inte vakuolär fluorescens (kompletterande figur 5e), vilket indikerar att svältinducerad autofagi inte inträffade. Dessa biokemiska och morfologiska data bekräftade att Ynrl selektivt transporteras till vakuolen på Atg11-beroende sätt.

Ynr1 transporteras till vakuolen via Cvt-vägen under anpassning från nitrat till metylaminmedium

Vi tolkade Venus-Ynr1 prickbildning som ett tecken på sekvestrering till autofagosomer. För att testa denna idé konstruerade vi vilda typceller som uttrycker både mCherry-Ynr1 och Atg11-Venus och undersökte den subcellulära lokaliseringen av båda proteinerna. Efter övergången från nitrat till metylamin samlokaliserades mCherry-Ynr1 och Atg11-Venus i en utsträckning som ökade med tiden (Fig. 6a, b). Atg8 är en autofagosommarkör som tidigare har använts för att följa dynamiken i autofagi 35, och samlokalisering av mCherry-Ynr1 och Venus-Atg8 observerades också i vildtypstammen (kompletterande fig 6a). Dessa resultat antydde att Ynrl rekryteras selektivt och kompesteras i autofagiska vesiklar för transport till vakuolen.

(a) Mikroskopiska bilder av C. boidinii vilda typceller som uttrycker Atg11-Venus och mCherry-Ynr1. Cellerna utsattes för kvävekällskiftet från nitrat till metylamin. Gula pilspetsar indikerar samlokalisering av Atg11-Venus och mCherry-Ynr1. Samlade bilder är kombinerade bilder av Venus grön fluorescens och mCherry röda fluorescensbilder. Bar, 2 um. (b) Kvantifiering av samlokalisering av Atg11-Venus och mCherry-Ynr1 i stammen C. boidinii av vildtyp som användes för den mikroskopiska avbildningsanalysen som visas i (a). Procentsatser representerar förhållandet mellan antalet samlokaliserade puncta och antalet Atg11-Venus puncta eller mCherry-Ynr1 puncta. symboler:

, förhållandet mellan antalet samlokaliserade puncta och antalet Atg11-Venus puncta;

, förhållandet mellan antalet samlokaliserade puncta och antalet mCherry-Ynr1 puncta. För varje prov analyserades minst 50 celler. Felfält visar standardavvikelser för prickmätningar för alla celler. (c) Samlokalisering av Venus-Ape1 och mCherry-Ynr1 i vilda typceller 1 timme efter kvävekällskiftet från nitrat till metylamin. Gula pilspetsar indikerar samlokaliserade punkter. Bar, 2 um.

Bild i full storlek

För att undersöka involvering av Cvt-vägen i Ynr1-transporten till vakuolen konstruerade vi vildtypceller som uttrycker både mCherry-Ynr1 och Venus-Ape1. När cellerna skiftades från nitrat till metylaminmedium, lokaliserades mCherry-Ynr1 ofta med Venus-Ape1 (Fig. 6c). Vi observerade också samlokalisering av mCherry-Ynr1 och Ape4-Venus, en annan medlem av Cvt-komplexet 28 (kompletterande figur 6b). Dessa resultat visar att Ynrl bildar prickar förknippade med Cvt-komplexet, sekstreras i Cvt-vesiklar och till slut levereras till vakuolen. Dessa data indikerade att Ynrl bildar ett komplex för dess nedbrytning med andra vakuolära enzymer för biosyntes.

Ynr1 försämras via Cvt-vägen på vissnande växtlöv

Slutligen övervakade vi lokaliseringen av mCherry-Ynr1 och Venus-Ape1 i C. boidinii- celler odlade på växtblad. Såsom visas i fig. 7a, b, bildade Venus-Ape1 prickar i celler som odlats på både unga och vissnande växtlöv. Å andra sidan observerades prickliknande strukturer av mCherry-Ynr1 endast på vissnande växtlöv (fig. 7b), även om antalet och storleken på dessa prickar var mindre än de som detekterades i celler odlade i metylamininnehållande flytande medium. Dessa resultat stöder idén att den aktiva formen av Ynr1 katalyserar reduktion av nitrat till nitrit i cytosolen hos celler som växer på unga växtlöv, medan på gamla blad Ynr1 transporteras till vakuolen som en ny last av de biosyntetiska Cvt-vesiklarna och bryts ned (Fig. 7c).

(a) och (b) Mikroskopiska bilder av C. boidinii- celler som uttrycker mCherry-Ynr1 och Venus-Ape1 på (a) växande eller (b) visnande A. thaliana- blad. Gula pilspetsar indikerar samlokalisering av Atg11-Venus och mCherry-Ynr1. Samlade bilder är kombinerade bilder av Venus grön fluorescens och mCherry röda fluorescensbilder. Bar, 2 um. (c) Ynr1 omsättning på växtlöv via Cvt-banan. På växande växtlöv använder C. boidinii nitrat som kvävekälla, och aktiv Ynr1 (blå) katalyserar reduktion av nitrat till nitrit. Transkriptionsnivån för YNR1 justeras i enlighet med anläggningens dagliga ljus-mörka cykel. När växten blir äldre läcker metylamin (och andra föreningar) från växtytan och kan användas som kvävekälla av C. boidinii . (1). I detta skede rekryteras inaktiv Ynr1 (grå) till Ape1-komplexet (2) på atg11-beroende sätt. Efter sekvestrering av Ynr1 inuti Cvt-vesikeln (3) smälter vesikeln med vakuolen, vilket frigör Cvt-kroppen i det vakuolära lumen (4). Släppt Ynr1 utsätts för nedbrytning. (d) Kvävsmetabolism och reglering av autofagi i metylotrof jäst i phylosfären. På växande blad kan nitrat användas som kvävekälla. Å andra sidan, på vissnande löv, används metylamin av C. boidinii och Ynrl inaktiveras, införlivas i Cvt-vesikeln med andra vakuolära hydrolaser och bryts ned.

Bild i full storlek

Diskussion

Asporogena jästar som bebor växtytor spekuleras för att utveckla andra strategier än att bilda sporer för att överleva miljöförändringar i deras ekologiska nisch. Här visar vi att nitrat användes av jäst C. boidinii på yngre blad medan metylamin blev viktigare som kvävekälla på äldre blad, och visar att nitratreduktas Ynr1, nödvändigt för jästförökning på unga blad, transporterades till och nedbrytades i vakuol medierad av en Atg11-beroende selektiv väg som liknar Cvt-vägen på åldriga löv. Cvt-vägen är en konstitutiv biosyntetisk väg, och Ape1-transport till vakuum föreslogs verkligen på unga löv (fig. 7a, b). På åldriga löv blev Ynr1 en lastmedlem av Cvt-vesiklar och förstördes i vakuolen (fig. 2c och fig. 7b). Eftersom Amo1 transporteras till peroxisomer och katalyserar metylaminmetabolismen på åldriga löv är det logiskt att Ynr1-nedbrytning är oberoende av pexofagi.

Reglering av autofagi vid C. boidinii spelar en avgörande roll i den dagliga miljöanpassningen under tillväxt på unga blad 6 Under sådana förhållanden aktiverades någon typ av autofagi (t.ex. Cvt-vägen) konstitutivt, bedömt genom klyvning av Venus-Atg8 och lipidering av Atg8, men Ynr1 undkom nedbrytning. Däremot regleras både peroxisomförökning och pexofagi genom den dagliga cykeln med metanolkoncentration, den viktigaste kolkällan för denna organisme på växtlöv. Pexophagy inträffar endast under ljusperioden när metanolkoncentrationen är låg 6, och denna specifika nedbrytning av peroxisomer, medierad av Atg30, är ​​nödvändig för spridning av denna jäst på unga växande växtlöv. Förutom växtens dagliga ljusmörkcykel visade vi här vikten av reglering av autofagi för att anpassa en dynamiskt föränderlig miljö som svar på åldrande av värdväxt. Ynr1, som fungerar på unga löv, försämras inte via autofagi på unga växtlöv. Men på vissnande växtlöv blir det en last för den konstitutiva Cvt-vägen, som har visat sig förekomma på växten. Och våra resultat föreslår en ny roll av Cvt-vägen för proteinnedbrytning, som tros vara en biosyntetisk väg. Tillsammans med resultaten från de senaste studierna visar våra resultat att selektiv autofagi kontrolleras strikt på ett sofistikerat sätt. Så vitt vi vet representerar dessa fynd den första beskrivningen av hur eukaryota mikrober som överlever på växtytor anpassar sig till miljön genom att reglera flera autofagiska vägar på ett sofistikerat och strikt sätt, inte bara under den dagliga cykeln utan också under växternas livslängd. En sådan reglering av autofagi föreslogs att existera också i en växtpatogena svampar under differentiering av appressorium på växtblad 19 .

Vi undersökte också rollen av autofagi på Ynr1-aktivitet in vitro under en kvävekälla-övergång från nitrat till metylamin. Efter kvävekällskiftet inaktiverades Ynr1 snabbt och minskade till ~ 20% av dess enzymatiska aktivitet efter 6 timmar. Å andra sidan upptäckte vi den klyvda formen av Venus endast 12 timmar efter mediumöverföringen, vilket indikerade att Ynr1 inaktiverades innan dess transport till vakuolen för nedbrytning. Enzymaktiviteten minskade med liknande hastigheter i atg1- och atg11Δ- stammarna. Although activation of Ynr1 in H. polymorpha has been studied at the level of expression 36, 37, inactivation of yeast Ynr1 has not been reported previously. On the other hand, nitrate reductases from higher plants contain a well-conserved serine residue within the hinge 1 region that is phosphorylated in response to light or CO 2 38 . We could neither find a conserved region in Ynr1 nor detect phosphorylation of Ynr1 during the process of adaptation to methylamine. We speculate that inactivated Ynr1 can be distinguished from its active form, and can therefore be recognized by some autophagic receptor protein and thereby recruited to Cvt vesicles for degradation. Atg19, a receptor protein of the Ape Ι complex, is not present in C. boidinii . Thus, the detailed mechanisms underlying inactivation of Ynr1, and specific recruitment of the inactivated enzyme to Cvt vesicles, remain to be elucidated.

By quantitative growth analysis, we showed that the C. boidinii ynr1Δ strain could not proliferate on young leaves. Therefore, nitrate sufficient to support yeast proliferation is present on young leaves. It has been widely assumed that nitrate is an abundant compound in many plants, and that plants can store excess nitrate in their tissues, including leaves 39, 40, 41 . Furthermore, nitrate assimilation was recently shown to be important in colonization of plant leaves by an aerobic Gram-negative and asporogenous bacterium 14 . Although all of these observations suggested that nitrate available for microbes is present on leaves, our observation of the impaired growth of the C. boidinii ynr1Δ strain on plant leaves provides the first demonstration that microbes utilize nitrate on young plant leaves.

Ynr1 expression oscillated during the daily cycle on young leaf, in a cycle similar to the daily oscillations of methanol, methanol-inducible genes, and peroxisome dynamics (Supplementary Fig. 3). Although we could not estimate the nitrate concentration in the phyllosphere in C. boidinii strain PYNR, which expressed Venus from the YNR1 promoter, previous reports have indicated that the nitrate concentration in plant leaves is several times higher in the light than in the dark 42, 43 . Furthermore, nitrate reductase activity in leaves is higher in the light period, and it is rapidly inactivated in the dark 44 . Therefore, it is likely that the daily oscillation of YNR1 expression reflected the daily fluctuation of nitrate concentration in the phyllosphere.

Another important finding of this study is that the importance of particular nitrogen sources for microbes in the phyllosphere changes during the plant life cycle, and microbes must also adapt to this change. On aged leaves, C. boidinii cells express peroxisomal Amo1 and utilize methylamine (and possibly other unidentified nitrogen compounds) that leak from the plant cells. At this stage, Ynr1 is transported to the vacuole for degradation. When we used a C. boidinii cell sensor expressing the AMO1 promoter–driven Venus to assess the local methylamine concentration on A. thaliana leaves, we did not detect methylamine on growing young leaves (Fig. 2a). By contrast, on aged plants, methylamine was estimated to be present at a concentration of 4.78 × 10 −3 mM. Intracellular nitrogen compounds leak from the aged plant cells, resulting in a dramatic change in the importance of each nitrogen source for phyllospheric microbes. These changes will affect the population and activity of microbes on alive and dead plant surfaces, mediating environmental element circulation by decomposing dead organisms.

To further understand the adaptation mechanisms of the yeast to the change in leaf environment during plant lifespan, we set up and conducted in vitro culture experiments, and found that the change of nitrogen source from nitrate to methylamine induced degradation of Ynr1 via selective autophagy. While we could observe induction of AMO1 expression and the appearance of Ynr1 punctates on aged leaves, these might not be due to simple change of nitrogen source from nitrate to methylamine rather due to complex environmental changes in the phyllosphere.

In conclusion, we elucidated the influence of nitrogen metabolism on the regulation of autophagy in C. boidinii on both growing and wilting leaves of A. thaliana (Fig. 7d). On growing leaves, C. boidinii utilizes nitrate and adjusts the expression levels of YNR1 in accordance with daily oscillation of nitrate concentration. During the light period, while pexophagy is active on young leaves, Ynr1 escapes from autophagic degradation. In contrast, on wilting leaves, the yeast responds to the change of leaf environment by expressing peroxisomal Amo1 and degrading cytosolic Ynr1 via the Cvt pathway. Overall, we showed that the composition of available nitrogen sources for phyllospheric yeasts changes during plant lifespan. Moreover, our study has shed light on a new role of Cvt pathway for protein degradation together with the importance of regulation of autophagy in eukaryotic microbes as the survival strategy on the plant surfaces. These will improve our knowledge and concept of how microbes adjust to changing of environmental conditions and how they survive in nature.

metoder

Yeast strains, vectors, and plasmids

The wild-type, atg1Δ , atg8Δ and atg30Δ C. boidinii strains were described previously 6 . The ynr1Δ and amo1Δ strains were constructed by replacing the appropriate ORF of C. boidinii strain TK62 ( ura3 45 ) with the Zeocin TM resistance gene as a selective marker 46, using the modified lithium acetate method 47 . The atg11Δ and atg17Δ C. boidinii strains were constructed in the same way with the primer sets Fw-ATG11u- Pst I/Rv-ATG11u- Not I and Fw-ATG17u- Eco RI/Rv-ATG17u- Bam HI for their upstream regions, and Fw-ATG11d- Xho I/Rv-ATG11d- Pst I and Fw-ATG17d- Cla I/Rv-ATG17d- Eco RI for their downstream regions, respectively. The vector pACT1-Venus, encoding Venus under the control of the ACT1 promoter 6, was transformed into the ynr1Δ and amo1Δ strains. The strain expressing Venus-Ynr1 fusion protein under the control of the YNR1 promoter was used for fluorescence microscopy and immunoblot analysis. The plasmid pEX-Venus-Atg8, encoding Venus-Atg8 under the control of the ATG8 promoter 6, the plasmid pACT1-Venus-Ape1, encoding Venus-Ape1 under the control of the ACT1 promoter, and the plasmid pACT1-Ape4-Venus, encoding Ape4-Venus under the control of the ACT1 promoter were also transformed into the wild-type strain. The PYNR strain and the PAMO strain which express Venus under the YNR1 promoter and the AMO1 promoter, respectively, were used for expression tests on plant leaves. The nucleotide sequences of CbYNR1 , CbAMO1 , CbATG11 , CbATG17 , CbAPE1 , and CbAPE4 , were deposited in the DDBJ/EMBL/GenBank under accession numbers AB972403, AB972404, AB972405, AB972406, AB972407, and AB972408, respectively. The primer sequences for the constructed strains are described in the supplementary information (Supplementary Table 4).

Media and culture conditions

C. boidinii cells were grown at 28°C on YPD medium (1% Bacto-yeast extract, 2% Bacto-peptone, 2% glucose) and SD medium (0.17% yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate, 2% glucose, and nitrogen sources). Nitrogen sources were (NH 4 ) 2 SO 4, KNO 3, and CH 3 NHCl. The pH of SD medium was adjusted to 6.0 with NaOH. Growth was monitored by measuring the optical density at 610 nm (OD 610 ).

Construction of the YNR1 and AMO1 disruptant strains

The upstream region (1.1 kb) and downstream (1.3 kb) regions of the YNR1 gene were amplified by PCR with the primer sets Fw-YNRu- Bam HI/Rv-YNRu- Xho I and Fw-YNRd- Not I/Rv-YNRd- Bam HI, respectively, using genomic DNA as a template. These PCR-amplified fragments were ligated into the Xho I- Not I backbone fragment of pBluescript II SK+/Zeocassette TM . The resultant vector (6.5 kb) was linearized with Bam HI and used to transform C. boidinii strain TK62 using a modified version of the lithium acetate method 47 . Zeocin-resistant colonies were selected on YPD medium supplemented with Zeocin 46 . The upstream (1.3 kb) and downstream (1.5 kb) regions of the AMO1 gene were amplified by PCR with the primer sets Fw-AMOu- Bam HI/Rv-AMOd-XhoI and Fw-AMOd- Not I/Rv-AMOd- BamHI, respectively. These PCR-amplified fragments were ligated into the Xho I- Not I backbone fragment of pBluescript II SK+/Zeocassette TM . The resultant vector (6.9 kb) was linearized with Bam HI and used to transform C. boidinii strain TK62. The disruptions of these genes were confirmed by Southern blot analysis as previously described 48 .

Generation of C. boidinii strains expressing Venus-Ynr1 fusion protein

A fragment of the 1.0-kb 5′ untranslated region and 2.7-kb YNR1 coding region was amplified by PCR with the primer set Fw-YNR1- Afl III inf/Rv-YNR1- Pst I inf. The PCR product was fused with the 5.7-kb Afl III- Pst I fragment of pACT1-Venus 6 to form pEX-Ynr1 by In-fusion HD ® cloning kit (TaKaRa, Kyoto, Japan). Next, a 9.4-kb fragment was amplified by inverse PCR with the generated plasmid as a template DNA, using the primer set Fw-YNR1- Sac I inv/Rv-YNR1- Kpn I inv. The Venus-coding region was PCR amplified with the primer set Fw-VENUS- Kpn I inf/Rv-VENUS- Sac I inf. These two fragments were fused to form pEX-Venus-Ynr1. The resulting plasmid was linearized with AfeI and then introduced into the wild-type host strain, atg1Δ , atg11Δ , and atg30Δ mutant strains.

VENUS-APE1 and APE4-VENUS expressions in C. boidinii

A backbone vector pACTL - Venus, encoding Venus under the control of the ACT1 promoter with LEU2 48 as Leucine auxotrophic marker was constructed by ligation of an AatII- Nar I fragment from pACT1-Venus 6 with an Aat II- Nar I fragment of LEU2 gene. For the construction of the plasmid for VENUS-APE1 expression, a 1.3-kb APE1 fragment was amplified by PCR with the primer set Fw-APE1- Pst I inf/Rv-APE1- PstI inf. Next, a 8.8-kb fragment was amplified by inverse PCR with the pACTL - Venus plasmid as a template DNA, using the primer set Fw-Tact- Pst I inv/Rv-VENUS- Pst I inv. These two fragments were fused to form pACTL-Venus-APE1 with the In-fusion HD ® cloning kit. The plasmid for APE4-VENUS expression, termed pACTL-APE4-Venus, was constructed from a Sal I-digested fragment of pACT1-Venus and an APE4 -coding region that was amplified with the primer set Fw-APE4- Sal I inf/Rv-APE4- Sal I inf, using the In-fusion HD ® cloning kit.

Construction of the C. boidinii P YNR- and P AMO - reporter strains

Putative promoter regions of YNR1 and AMO1 genes were amplified by PCR with the primer sets Fw-PYNR/Rv-PYNR and Fw-PAMO/Rv-PAMO, respectively. These 1.0-kb PCR-amplified fragments were fused with a fragment from pACT1-Venus digested with Afl III/ Sal I, using the In-fusion HD ® cloning kit, which yielded two expression vectors of Venus under the regulations of P YNR or P AMO promoters.

Host plant growth condition and yeast inoculation on plant leaves

A. thaliana plants were cultivated on mini-pots of cultivable lock-fiber (Nittobo) with Hoagland solution in growth chambers, as previously described 6 . C. boidinii cells were cultured to OD 610 = 1.0. To follow yeast proliferation on the leaves of A. thaliana , 1 µl of yeast cell suspension (OD 610 = 0.5) was spotted onto the upper sides of the leaves. To observe Venus and/or mCherry expression in C. boidinii , 5 µl of yeast suspension (OD 610 = 0.5) was sprayed onto the upper sides of the leaves. To prepare the samples for qRT-PCR, yeast suspension was sprayed onto A. thaliana leaves and incubated for 5 days. For these experiments, we used leaves of two different ages. Young plant leaves, which were used in Figure 1, 2, 7, and S3, were growing leaves that had been grown for 2–3 weeks after the germination. Aged plant leaves, which were used in Figure 2 and 7, were wilting leaves that had been grown for 2–3 months after the germination.

Comparison of yeast populations on A. thaliana

After C. boidinii cells were inoculated on the leaves of A. thaliana, 5 leaves were collected. Isolation of genomic DNA of C. boidinii and quantitation of the yeast populations on plant leaves were performed as previously described 6 .

RNA preparation from cells grown on plants

Fifty to sixty leaves of A. thaliana onto which C. boidinii cells had been inoculated were harvested in tubes and frozen using liquid nitrogen. Total cellular RNA was extracted using ISOGEN, and qRT-PCR was performed as previously described 6 .

Preparation of cell-free extract

C. boidinii cells were first cultured on SD supplemented with 7.6 mM ammonium for 12 h, shifted to SD containing with 7.6 mM of the indicated nitrogen source, and then collected 4 h after the medium transfer. Cells (approximately 100 OD 610 units of cells grown in SD medium) were then resuspended in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) and disrupted with 0.5-mm zirconia beads in a Multi-Beads Shocker (YASUI KIKAI Co., Ltd, Osaka, Japan). Cell debris was removed by centrifugation at 15, 000 rpm for 10 min at 4°C, and the resultant supernatant (cell-free extract) was used for enzyme assays. Protein concentrations were determined by the Bradford method 49 using a protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), using bovine serum albumin as the standard.

Enzyme assay

Ynr1 activity was measured according to Boer et al. 50 with slight modifications. The assay mixture contained potassium phosphate buffer (final concentration 0.1 M, pH 7.5), 10 µL of 10 mM DTT, 10 µL of 1 mM FAD, 10 µL of 20 mM NADPH, and 250 µL cell-free extract in a final volume of 1 mL in a polystyrene cuvette (light path, 10 mm). The cuvettes were incubated for 2–3 min at 28°C, and the absorbance at 340 nm was monitored. The reaction was then initiated by the addition of 100 µL of 100 mM potassium nitrate, and the rate of decrease in absorbance at 340 nm was measured against a blank containing all the assay components expect potassium nitrate. Ynr1 activity is expressed in units (µmol/mg protein). Amo1 activity was measured as follows: the assay mixture contained potassium phosphate buffer (final concentration 0.1 M, pH 7.0), 15 µL of 50 mM 2, 2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline)- 6-sulfonate (ABTS), 15 µL of 100 units/mL horseradish peroxidase, and 100 µL of cell-free extract in a final volume of 1 mL in a polystyrene cuvette (light path, 10 mm). The cuvettes were incubated for 2–3 min at 28°C, and the absorbance at 405 nm was monitored. The reaction was then initiated by addition of 40 µL of 80 mM methylamine hydrochloride, and the rate of increase in absorbance at 405 nm was measured against a blank containing all assay components except methylamine hydrochloride. Amo1 activity is expressed in units (µmol/mg protein).

Immunoblot analysis

To prepare samples for immunoblot analysis, cells were grown to A 610 = 1.0 on nitrate medium, and then shifted to SD containing either 10 mM methylamine or no nitrogen source. Cells equivalent to 5 OD 610 units were collected at the appropriate time points, washed once with water, suspended in lysate buffer containing 0.25 N NaOH and 150 mM β-mercaptoethanol, and incubated at 4°C for 10 min. Next, trichloroacetic acid (final concentration, 10%) was added. The samples were vortexed, incubated at 4°C for 10 min, and centrifuged. Subsequently, the pellet was washed twice with acetone and resuspended in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. The samples were denatured by boiling in SDS sample buffer, separated on 12% SDS-PAGE gels, and electrotransferred to nitrocellulose membranes. Blots were blocked for 1 h in 5% skim milk in TBS-T buffer (25 mM Tris, 220 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.1% Tween 20, pH 8.0). These blots were incubated for 1 h with polyclonal anti-GFP antibody (Life Technologies) at 1:1000 dilution in TBS-T buffer, and then washed three times with TBS-T. Subsequently, blots were incubated for 1 h with anti–rabbit IgG antibody (life technologies) at 1:10000 dilution in TBS-T, and then washed again three times in TBS-T. Immunoreactive bands were detected with the Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (Perkin-Elmer Life Science), and the signals were detected using the Light-Capture II system (ATTO). To ascertain the reproducibility, each of immunoblot analysis was conducted at least twice.

Fluorescence microscopy

Confocal microscopy was carried out using a Zeiss LSM510 META/Axiovert 200 laser-scanning confocal inverted microscope equipped with a Plan Fluor 100×/1.45 NA oil objective. Venus fluorescence was obtained with a multiline (458, 477, 488, and 514 nm) argon laser and a 530–600 nm filter for emission. An HFT 405/514 beam splitter was used as a connecting filter. Fluorescence microscopy was performed using an IX81 inverted microscope (Olympus) equipped with an Uplan-Apochromat 100×/1.35 NA oil iris objective lens. Venus and mCherry signals were acquired using a Plan Fluor 100× lens (Carl Zeiss) with pinhole set to 1.02 airy units for YFP acquisition. Fluorescence observations of cells cultured in vitro were repeated at least twice and three shots at different fields were taken each time. For fluorescence microscopy of the cells on the plant surface, 3 different leaves were harvested for observation. At least five shots at different fields were taken per leaf.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.