En molekylkrets yap / taz-mir-130/301 utövar systemnivåkontroll av fibros i ett nätverk av mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd | vetenskapliga rapporter

En molekylkrets yap / taz-mir-130/301 utövar systemnivåkontroll av fibros i ett nätverk av mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • sjukdomar
  • Mekanismer för sjukdom
  • miRNA

Abstrakt

Det molekylära ursprunget till fibros som påverkar flera vävnadsbäddar förblir ofullständigt definierat. Tidigare avgränsade vi den kritiska rollen för kontroll av extracellulär matris (ECM) förstyvning av den mekanosensitiva mikroRNA-130/301-familjen, som aktiverats av YAP / TAZ-samtranskriptionsfaktorerna, för att främja pulmonell hypertoni (PH). Vi ansåg att liknande mekanismer kan diktera fibros i andra vävnadssängar bortom lungkärlen. Genom att använda en kombination av silikon av mikroRNA-målförutsägelse, transkriptomisk analys av 137 mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd och avancerad gennätmodellering, förutspådde vi mikroRNA-130/301-familjen som en masterregulator för fibrotiska vägar över en kohorte av till synes olikartade sjukdomar och betingelser. Vid två sådana sjukdomar (lungfibros och leverfibros) förhindrade hämning av microRNA-130/301 induktion av ECM-modifiering, YAP / TAZ och nedströms vävnadsfibros. Således verkar mekaniska krafter genom en central återkopplingskrets mellan mikroRNA-130/301 och YAP / TAZ för att upprätthålla en vanlig fibrotisk fenotyp över ett nätverk av humana fysiologiska och patofysiologiska tillstånd. Sådan omkonceptualisering av sammankopplingar baserade på delade sjukdomssystem och gennätverk som inte är sjukdomar kan ha breda konsekvenser för framtida konvergerande diagnostiska och terapeutiska strategier.

Introduktion

Ökningar i vävnadsstyvhet och intracellulär spänning styrs av molekylära förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) och är vanliga egenskaper hos fibros, som finns i hälsa och sjukdom 1, 2 . ECM-ombyggnad är en komplex process som inträffar genom förändringar i balansen mellan matrisavsättning och matrixnedbrytning och genom kollagen tvärbindande enzymer såsom lysyloxidas (LOX). Två relaterade transkriptionella koaktivatorer, YAP (Yes Associated Protein 1) och TAZ (eller WWRT1) är avgörande för mekanotransduktion, en process som omvandlar extracellulära mekaniska signaler till intracellulär signalering 3 och reglerar cellproliferation och överlevnad 4, 5 samt organtillväxt 6 . Dessa koaktiverare har i allt högre grad uppskattats som aktiva faktorer som styr ECM-plastisitet 7 vid normal utveckling och fysiologi såväl som patologisk fibros 8 . Nyligen beskrev vi en kritisk roll för kontrollen av ECM-förstyvning av den mekanosensitiva mikroRNA-130/301-familjen, som aktiverats av YAP / TAZ, i att främja pulmonell hypertoni (PH) 9 . Identifiering av en sådan självförstärkande återkopplingsslinga i PH som ledde till perivaskulär fibros föreslog att liknande molekylära mekanismer som involverar extracellulär biomekanisk signaler och mikroRNA (miRNA) aktivitet spelar viktiga roller i andra fibrotiska sammanhang.

Mer specifikt kontrollerar enskilda miRNA-familjer ofta flera målgener och fenotyper, vilket gör dem till attraktiva kandidater som uppströms "master" -reglerare av till synes olika processer, inklusive cell-cell- och cell-matrixinteraktioner 10 . Övergång mellan miRNA-biologi och de biomekaniska ECM-egenskaperna över vävnadstyper har emellertid i stort sett inte utforskats. Nyligen har vi använt nätverksteori för att förutsäga i silico de dominerande miRNA som styr ett specifikt sjukdomsgennätverk 11, 12 . Med tanke på det breda omfånget av mänskliga förhållanden där ECM-plastisitet kan framträda framträdande, antagde vi att ombyggnad av ECM kan vara ett patogent eller normalt fysiologiskt drag som delas mellan till synes olikartade förhållanden, och miRNA kan vara en uppströms regulator för denna molekylära kaskad. För att ta itu med dessa frågor utvecklade vi en avancerad nätverksbaserad strategi för att söka efter en global miRNA-regulator (er) av humana fibrotiska fenotyper över 137 olika mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd.

På så sätt har vi nu identifierat miR-130/301 som en masterregulator för ECM-biologi över en kohort av fysiologiska och patofysiologiska tillstånd - allt relaterat till en delad signatur av fibrosrelevanta gener. Sammantaget definierar dessa resultat denna miRNA-familj som en avgörande punkt för kommunikation mellan biomekanisk stress och fibros i ett nätverk av in vivo- sammanhang. Dessa fynd betonar också den alltmer attraktiva kandidaten till miR-130/301 för selektiv terapeutisk inriktning vid sådana relaterade sjukdomar.

Resultat

Nätverksanalys avslöjar att miR-130/301-medlemmar riktar sig till en delad kohort av fibrotiska gener över mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd relaterade till PH

Med tanke på vikten av YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen i PH 9, postulerade vi att denna återkopplingsslinga kan vara på liknande sätt aktiv för att kontrollera ECM-plastisitet i andra fibrotiska tillstånd. För att definiera miRNA som bär övergripande reglerande kontroll av vävnadsfibros över olika sammanhang, använde vi en i silico- kombination av miRNA-målförutsägelse, transkriptomisk analys över 137 mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd och avancerad gennätmodellering (Fig. 1A). Först för att identifiera miRNA med globala reglerande effekter i ett visst tillstånd, beskrev vi tidigare en "miRNA-spännvidd" (se Metoder ) baserat på antalet och arkitektoniska fördelningen av förutsagda miRNA-mål inom ett representativt gennät 12 . Genom att använda ett " silikonätverk " i silikon 9 som består av kuraterade frögener kända för att vara orsakande involverade i ECM-ombyggnad och deras första gradsinteraktorer (fig. 1B), hittade vi en bred och varierad kontingent av faktorer relaterade till ECM-ombyggnad inom den förutsagda poolen av miR-130/301 målgener och deras relaterade nätverksgrannar.

Image

( A ) Strategi som används för att identifiera miRNA som utövar kontroll på systemnivå över fibros. ( B ) Ett fibrosnätverk, sammansatt av kända fibrotiska gener (frögener, cirklar) och deras närmaste första gradsinteraktorer (trianglar, se tillägg). Färgkodning anger inkludering i kända kommenterade vägar som är relevanta för fibros och ECM (från GO-, Kegg-, Reactome-, NCBI PID- och Biocarta-databaserna) och visar relevansen av integrerade förstegradsinteraktorer för fibrotiska processer. miR-130/301 rankades bland de fem bästa miRNA: erna genom att sträcka poäng i detta nätverk (mål omkretsade i svart), vilket återspeglar dess robusta, systemnivåkontroll över fibros och matrixombyggnad. ( C ) Baserat på transkriptomisk profilering och nätverkskonstruktion (se Metoder) grupperades 137 nätverk som representerade olika sjukdomar och fysiologiska tillstånd i kohorter, enligt överlappning med fibrosnätverket. MiRNAs poängsattes sedan med en riktning omvänd korrelation (enkelriktad ANOVA) av deras genomsnittliga tilldelade spännviddsrankning över kohorter. miR-130/301 rankades bland de fem bästa miRNA: erna och underströk dess betydelse för sjukdomar med en stark fibrotisk komponent (röd ruta). ( D ) Ett förkortat nätverk genererades från 137 sjukdomar och fysiologiska tillstånd (indexerat i tabell S1). Kanter bland förhållandena betecknar signifikant överlappning (hypergeometriskt p-värde <0, 1). Röda förhållanden rankades starkt baserat på deras sammankoppling med fibrosnätet och familjen miR-130/301 (topp 25%, rankad i tabell S1), och alla visade sig ha en distinkt kohort av fibrotiska gener inbäddade i överlappningen med PH-nätverket. Prevalensen av fibrotiska tillstånd som förutsägs involvera miR-130/301 ger bevis för ett delat fibrotiskt program som kontrolleras av denna miRNA-familj i ett brett spektrum av mänsklig patologi och tillstånd utöver lungkärlen (se tabell S3).

Bild i full storlek

För att bestämma förhållandet mellan dessa ECM-specifika miRNA-åtgärder till andra fysiologiska sammanhang sammanställde vi en serie transkriptomiska datasätt av påverkad mänsklig vävnad jämfört med normala kontroller (n = 137) från offentligt tillgängliga databaser, vilket representerar ett brett tvärsnitt av mänskliga vävnader patologi och fysiologiska tillstånd (se Metoder och tabell S1). För att kontrollera för statistiskt brus från stora variationer i nätverksstorlek konstruerades specifika sjukdomsgennätverk genom att välja topp 250 (genom vikningsförändring) signifikant differentiellt uttryckta gener i varje grupp, jämfört med icke-påverkade kontroller. Vi korsreferenserade dessa utsädesgener med den konsoliderade interaktomen och integrerade välkopplade första-gradsinteraktorer för att "förstärka" molekylsignalen för dessa förmodade systemnivåförändringar. Varje nätverk kategoriserades i en av fyra kohorter, enligt definitionen genom att öka överlappningen med fibrosnätverket. För vart och ett av de 137 nätverken rangordnades sedan miRNA med spännvidd, såsom beskrivits ovan. Även om det verkade som att många miRNA: er kan ha relevanta åtgärder vid fibros, identifierade vi med dessa data miR-130/301-familjemedlemmar bland de mest rankade miRNA: erna (Rank # 4) med en robust enkelriktad invers korrelation (ett sätt ANOVA) mellan deras tilldelade räckviddsrankning och storleken på den fibrotiska komponenten för var och en av de 137 nätverken (fig. 1C, tabell S2). Tillsammans med topprankningen för denna miRNA-familj genom att spänna poäng i förhållande till fibrosnätet direkt (fig. 1B), förutspådde dessa fynd att miR-130/301-medlemmar är integrerade i det fibrotiska programmet över en mängd olika sjukdomar och vävnadsbäddar. I överensstämmelse med den kända relevansen av miR-130/301 i PH 12 är dessutom en delmängd, bland de 137 nätverk som beskrivits ovan, rankad starkt efter deras sammankoppling med fibrosnätverket och miR-130/301-familjen (tabell S1, S3), visade sig dela en distinkt kohort av fibrotiska gener inbäddade i överlappningen med ett tidigare rapporterat 12 PH-sjukdomarnas nätverk (fig. 1D, tabell S3). Således förutspådde en kombination av nätverksanalyser en unik position för familjen miR-130/301 vid skärningspunkten mellan fibrotisk genprogrammering och denna uppsättning associerade sjukdomar och fysiologiska tillstånd.

miR-130/301-uttryck korrelerar med aktivering av YAP / TAZ, PPARY-APOE-LRP8-axeln och matrisförstivning vid lungfibros och leverfibros

För att demonstrera den förmodade förenande biologin av miR-130/301 i denna kohort av fysiologiska tillstånd valdes lungfibros (indexsjukdomar nr 11 och # 19, tabell S1) och fibrotisk leversjukdom (indexsjukdom nr 4, tabell S1) för ytterligare förhör. I musmodeller av bleomycininducerad lungfibros (Fig. 2) ökades uttrycket miR-130/301 (Fig. 2A, B). I överensstämmelse med induktion av miR-130/301 av de mekanosensitiva YAP / TAZ-transkriptionsfaktorerna i PH 9, observerades en positiv korrelation bland miR-130a-uttryck, YAP-nukleär lokalisering och nedströms kollagen tvärbindning i lungfibros (Fig. 2C). I överensstämmelse med den direkta nedregleringen av de associerade faktorerna peroxisomproliferatoraktiverad receptor gamma (PPARy), apolipoprotein E (APOE) och apolipoprotein E-receptorn LRP8 av miR-130/301 i PH 9 minskades dessutom både Ppary och Lrp8 vid lungfibros ( Fig.S1 ). För att definiera de exakta celltyperna i vilka miR-130/301 uppreglerades utvecklades ett in situ- protokoll för att färga samtidigt för miRNA och protein (se Metoder ). I lungan hos möss behandlade med bleomycin, regulerades uttrycket miR-130a i parenkymala fibroblaster, vilket demonstrerades genom samlokalisering av miR-130a med vimentin, en fibroblastmarkör och a-glatt muskelaktin (α – SMA), en markör för både aktiverade fibroblaster och glatta muskelceller (Fig. 2D). På motsvarande sätt observerades samma förhållanden mellan miR-130/301, YAP / TAZ och kollagen tvärbindning, i enlighet med vår nätverksalgoritm (indexsjukdomar nr 11 och # 19, tabell S1) i lungvävnad härrörande från en kohort av patienter som lider från idiopatisk lungfibros (Fig. 2E, F, Fig. S1). Således, bortom PH, är YAP / TAZ-miR-130/301 återkopplingsslingan aktiv i lungfibros och specifikt i fibroblaster anatomiskt långt bort från själva lungkärlen.

Image

En musmodell av lungfibros (bleomycininduktion, n = 9-10 / grupp) analyserades. miR-130/301 ökades signifikant med RT-qPCR ( A ), och seriella avsnitt av lungan ( B ) visade ökat kollagen (Picrosirius Red), miR-130a och YAP genom hybridisering in situ . ( C ) Vid sjuk lunga korrelerades miR-130a och YAP-kärnlokalisering positivt med kollagen tvärbindning. ( D ) In situ- färgning för miR-130a och fibroblastmarkörer (vimentin och α – SMA) utfördes med fluorescerande mikroskopi. Vimentin / miR-130a och α – SMA / miR-130a-positiva celler ökades i bleomycin-behandlad lungvävnad (n = 8 per grupper; 5 20X fält per objektglas kvantifierades). ( E, F ) I lungorna hos patienter med idiopatisk lungfibros ökades miR-130/301 och YAP1 med RT-qPCR ( E ; [kontroller n = 5, fibros n = 15]) och in situ- fläck ( F ; [kontrollerar n = 8, fibros n = 10]). (Se även Fig.S1). Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Bild i full storlek

På liknande sätt ökades miR-130/301 (Fig. 3A, B) och Ppary och Lrp8 minskade på motsvarande sätt i en musmodell av koltetraklorid (CCl4) och Fig. åtföljt av en positiv korrelation mellan kollagen tvärbindning, miR-130a-expression och YAP-nukleär lokalisering (Fig. 3C). Via leverfläck in situ från möss behandlade med CCl4, uttrycktes miR-130a uttryck med både desmin, en stellatcellmarkör och α – SMA (fig. 3D). På liknande sätt visade vi sig att minR-130a och YAP ökade i fibrotisk mänsklig levervävnad - som styrs av våra nätverksförutsägelser beträffande olika fibrotiska leversjukdomar - i detta fall härrörande från icke-alkoholisk steatohepatit ( Fig. 3E patientdemografi i tabell S4). Såsom avgränsas av våra i silico- förutsägelser, åtskilda från PH, aktiveras således YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen över både lung- och leversjukdomar hos djur och människor.

Image

En musmodell av leverfibros (CCl4-induktion, n = 9-10 / grupp) analyserades. miR-130/301 ökades signifikant med RT-qPCR ( A ), och seriella avsnitt av lungan ( B ) visade ökat kollagen (Picrosirius Red), miR-130a och YAP genom hybridisering in situ . ( C ) Vid sjuk lunga korrelerades miR-130a och YAP-kärnlokalisering positivt med kollagen tvärbindning. ( D ) In situ- färgning för miR-130a mi-130a och stellatcellmarkörer (desmin och a-SMA) utfördes med fluorescerande mikroskopi. Desmin / miR-130a och en-SMA / miR-130a-positiva celler ökades i CCl 4- behandlad lever (n = 8 per grupper; 5 20X fält per objektglas kvantifierades). ( E ) På liknande sätt visade in situ- färgning en ökning i miR-130a och YAP i fibrotisk levervävnad hos patienter (n = 4 per grupp) med icke-alkoholisk steatohepatit (NASH + fibros) (se även tabell S4 och Fig.S2) . Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Bild i full storlek

Tvångsuttryck i miR-130/301 aktiverar ECM-ombyggnad och leverfibros hos möss

Vi har tidigare visat att tvingat uttryck av miR-130/301 i lungan hos möss är tillräckligt för att inducera pulmonell hypertoni 12 och lungkärlsfibros 9 . För att bestämma om miR-130a är tillräcklig för att inducera leverfibros studerades kronisk leveruttryck av miR-130a. Tillförsel av MiRNA uppnåddes genom seriell (var tredje dag under 4 veckor) intraperitoneala injektioner av liposomalt inkapslat miR-130a oligonukleotid efterliknar i närvaro eller frånvaro av suboptimal dos av CCl 4 (0, 1 ml per kg kropp per vecka). Detta protokoll ledde till uppreglerat uttryck av miR-130a (men inte andra familjemedlemmar) i hela levervävnaden (fig. 4A). Sådan leverans nedreglerad målgenuttryck av Ppary och Lrp8 såväl som måttligt aktiverad Yap1-nukleär lokalisering och kollagen tvärbindning (Fig. 4B – D). Dessa effekter förbättrades genom tillförsel av både miR-130a tillsammans med en minskad dos CCl4, främjande av en robust nedreglering av Lrp8 och Ppary och mer väsentligt ökad Yap1-aktivering och kollagen tvärbindning, jämfört med CCl4 ensam, CCl4 + miR -kontroll (miR-NC), eller miR-130a ensam (fig. 4C, D). Dessutom var tvingad miR-130a och ökad ECM-stelning tillräcklig för att aktivera en självförstärkande återkopplingsslinga och ytterligare öka endogent miR-130/301-familjeuttryck (Fig.4A). Sammantaget, i överensstämmelse med de miR-130a-beroende verkningarna i lungvaskulärområdet, visade dessa resultat att detta miRNA också är tillräckligt för att inducera leverfibros.

Image

( A ) Som bedömts med RT-qPCR ökade seriell intraperitoneal leverans av miR-130a mimisk oligonukleotid (miR-130a) miR-130a i hela levern hos möss jämfört med kontroll (miR-NC), antingen med eller utan veckinjektion av suboptimal CCl 4- dos. ( B ) Genom Metavir-poäng ökade antingen en suboptimal dos av CCl 4 eller miR-130a oberoende leverfibros, medan miR-130a + CCl 4 ännu mer kraftigt ökade sådan fibros. ( C, D) Hybridisering in situ av miR-130a (övre raden) bekräftade effektiv leverans i levern från möss. Immunohistokemi avslöjade också att miR-130a minskade Lrp8 och Ppary samt något ökad YAP-nukleär lokalisering och kollagenavlagring och tvärbindning. Dessutom minskade miR-130a + CCl 4 mer robust Lrp8 och Ppary samt mer robust ökad YAP-kärnlokalisering, kollagenavlagring och tvärbindning.

Bild i full storlek

Hämning av familjen miR-130/301 förhindrar ombyggnad av ECM och sjukdomsprogression i musmodeller av lungfibros och leverfibros

För att bestämma om familjemedlemmar med miR-130/301 är nödvändiga för kontroll av fibros över både lung- och leverfibros administrerades möss seriell kontroll mot Short-130, en antisense-oligonukleotid bekräftade att hämma alla familjemedlemmar i miR-130/301 i odlade celler 12 och in vivo i muslever (fig. 5A, B) och mus-lunga (fig. 6A, B). I båda modellerna av lung- (bleomycin-exponering) och lever (CCl4-exponering) fibros, hämmade Short-130 miR-130/301 och reverserade nedregleringen av miR-130/301 målgenerna Ppary och Lrp8 (fig 5 och 6C), minskat Lox-uttryck, reducerat kollagenuttryck och kollagen tvärbindning (Fig. 5C, E, F och 6C, E, F) och reducerad Yap-nukleär lokalisering (Fig. 5C och 6C) och YAP-aktivering, vilket återspeglas genom CTGF-uttryck (Fig.5E och 6E). Därigenom minskade miR-130/301-hämning signifikant slutstegsfibros, som bedömdes med Metavir (Fig. 5D) och Ashcroft-poäng (Fig. 6D).

Image

I en modell av leverfibros (CCl4-induktion) behandlades möss med Short-NC eller Short-130 (n = 8/10 per grupp). Kort-130-leverans (n ​​= 8 per grupp; A ) och aktivitet (n = 5 per grupp; ( B ) bekräftades. Short-130 minskade fibros, bedömd med α – SMA och kollagenfärgning ( C ), samt Metavir-poäng ( D ). Vid in situ- fläck ( C ) minskade Short-130 kärl YAP-nukleär lokalisering och ökade Ppary och Lrp8. Short-130 minskade också transkriptionsuttryck av Ctgf, kollagenisoformer och Lox ( E ) samt minskade kollagenavsättning och kollagen tvärbindning ( F ). Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Bild i full storlek

Image

I en modell av lungfibros (bleomycininduktion) behandlades möss med kontroll (Short-NC) eller miR-130/301-hämmare (Short-130) (n = 8/10 per grupp). Kort-130-leverans (n ​​= 8 per grupp; ( A ) och aktivitet (n = 5 per grupp; ( B )) bekräftades. Kort-130 minskade fibros, bedömd med α – SMA och kollagenfärgning ( C ), som Ashcroft-poäng ( D ). Vid in situ- färgning ( C ) minskade Short-130 kärl YAP-kärnlokalisering och ökade Ppary och Lrp8. Short-130 minskade också transkriptionsuttryck av Ctgf, kollagenisoformer och Lox ( E ) såväl som minskad kollagenavsättning och kollagen tvärbindning ( F ). Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Bild i full storlek

Farmakologisk aktivering av APOE med LXR-agonist GW3965 minskar peri-arteriolar fibros och förbättrar lungfibros in vivo

För att bestämma om nedströms ApoE är avgörande för miR-130/301-inducerad fibros, försökte vi förhindra lungfibros i bleomycin-exponerade möss via behandling med en farmakologisk aktivator av ApoE 13, lever-X-kärnhormonreceptoragonisten GW3965 (Fig. 7). När GW3965 administrerades seriellt efter exponering för bleomycin, inhiberades kollagen tvärbindning (fig. 7A), vilket ledde till minskade index för lungfibros, vilket återspeglas av Ashcroft-poäng (fig. 7B). I överensstämmelse med våra tidigare resultat av en positiv återkopplingsslinga i PH som involverar YAP / TAZ-miR-130/301 som både initierar och resultat från ECM-förstyvning 9, reducerade GW3965-behandlingen också YAP-kärnlokalisering (Fig. 7A) och YAP-aktivering, vilket återspeglas genom minskat Ctgf-uttryck (fig. 7C), såväl som omvänd Ppary- och Lrp8-nedreglering (fig. 7A). Följaktligen kan vi dra slutsatsen att YAP-TAZ-miR-130/301-kretsen fungerar som en masterregulator för både fibrotisk genprogrammering och ECM-ombyggnad över flera patobiologiska sammanhang in vivo . Genom att ge bevis på våra i silico- förutsägelser identifierar dessa fynd de fibrotiska verkningarna av familjen miR-130/301 som en enande molekylär grund för det konvergerande förhållandet mellan till synes olika sjukdomar (fig. 7D).

Image

I en modell av lungfibros (bleomycin-exponering) behandlades möss med LXR-agonisten GW3965 eller kontroll (n = 6 per grupp) via dietintag (100 mg / kg). GW3965 förbättrade graden av lungfibros såsom kvantifierades genom a-SMA-märkning ( A ) och Aschcroft-poäng ( B ). Picrosirius Röd fläck och färgning in situ av muselung ( A ) visade att GW3965 trubbade bleomycin-medierade ökningar av kollagen tvärbindning och YAP, samt minskade av Lrp8 och Ppar y uttryck. C) Genom RT-qPCR ökades Ctgf, kollagenisoformer och Lox i sjuk lunga (bleomycin), men GW3965 reducerade ett sådant ökat uttryck. ( D ) Enande modell för den centrala rollen för YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen för kontroll av ECM-plastisitet över relaterade sjukdomar. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Bild i full storlek

Diskussion

Genom att använda nätverksbaserad beräkningsmodellering och in vivo- experiment har vi definierat YAP / TAZ-miR-130/301-molekylkretsen och dess nedströms kontroll av ECM-ombyggnad som ett delat och förenande in vivo- ursprung för ett nätverk av mänskliga sjukdomar och fysiologiska förhållanden (Fig. 7D). Sådan identifiering av "nätverksbaserade" regulatorer har breda konsekvenser för den grundläggande betydelsen av ECM-plastisitet i det delade fibrotiska ursprunget som kopplar till synes skilda fenotyper och patofenotyper. Det antyder inte bara användningen av relaterade farmakologiska strategier ( dvs hämmare av miR-130/301) för sådana associerade sjukdomar utan också vikten av selektiv användning för att undvika oavsiktliga skadliga konsekvenser av att manipulera en väg som är så bred delad mellan fibrotiska processer. Slutligen ger framgången med detta tillvägagångssätt mycket efterlängtade experimentella bevis för den kliniska användbarheten av att återkonceptualisera sjukdomar baserade på system med delade gennätverk och deras molekylära reglerare 14 .

Våra resultat visar kraften i avancerad analys av gennätverksarkitektur inte bara för att förutsäga ett relevant fibrotiskt gen "program" som delas mellan relaterade mänskliga sjukdomar och fysiologiska tillstånd utan också för att identifiera dess övergripande regulatorer, såsom familjen miR-130/301, över dessa förhållanden (fig 1 och 7D). För närvarande dyker experimentella bevis och expertis bara för att stödja användning av nätverksteori för att vägleda analys över mänskliga sjukdomar. Det är en ökande uppskattning att "mellanliggande" fenotyper som vävnadsfibros är vanliga bland mänskliga sjukdomar som tidigare trott utvecklas oberoende. Den molekylära överlappningen av komplexa mänskliga sjukdomstillstånd har börjat förhöras på en systemomfattande nivå 15, 16 men vår förmåga att urskilja förekomsten av övergripande "nätverksbaserade" regulatorer under patologiska förhållanden har förblivit begränsad. I den vägen upptäckte vår nätverksanalys också delade miR-130/301-specifika förhållanden bland sjukdomar som sällan, om någonsin, har varit kliniskt associerade med fibros ( dvs. ebola-infektion, schizofreni, bland andra; tabell S1). Den förmodade kopplingen av miR-130/301 och ECM-biologi till schizofreni är särskilt spännande, eftersom det är en störning där ECM-ombyggnad i perineuronala nät redan misstänks kontrollera slutliga psykiatriska manifestationer 17 . Vidare är det möjligt att en ännu mer komplex och vidsträckt interaktion finns bland miR-130/301 och ytterligare miRNA: er förutsagda att känna igen stora delar av samma fibrotiska sjukdomsnätverk (fig. 1, tabell S2). Mer detaljerade analyser av den interaktoms arkitektur kan ytterligare avslöja mekaniska kopplingar mellan denna miRNA-familj, ECM-biologi och till synes oberoende biologiska processer. Framtida experimentell validering in vivo av dessa principer skulle främja konceptet att omklassificera sjukdomar baserat på alltmer tillgängliga data om molekylära signaturer som driver ursprunget till sjukdom 14 .

Kopplingen av sådan nätverksbaserad modellering med experimentell validering underlättade också identifieringen av YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen som en bred förmedlare av mekanotransduktion över olika vävnadssängar och sjukdomskontekster. Isolerade faktorer såsom PPARy 18, 19, 20 och ApoE 21, 22, 23 såväl som deras nedströmseffektorer CTGF 24 och lysyloxidasfamiljen 25, 26, 27 har tidigare varit inblandade i olika former av fibros. Men deras molekylära sammankopplingar med uppströmsregulatorer har varit svåra att definiera. Separat har en växande uppskattning uppkommit beträffande aktiviteten hos YAP / TAZ och mikroRNA i allmänhet vid reglering av ECM-biologi. Exempelvis kan YAP / TAZ driva fibrogenes och tumörgenes i en grupp transformerad vävnad 28, 29, 30, såsom levern 31 och icke-transformerad vävnad inklusive lungan 8 . Dessutom har en kohort av så kallade "fibromiRs" definierats i specifika cancerrelaterade och icke-cancerrelaterade fibrotiska sjukdomar, inklusive miR-155 32, let-7 33, miR-29 34, 35, 36, miR- 21 37, 38, 39 och miR-199 40, 41, bland andra. Ändå har endast unika miRNA, såsom miR-29 42 och miR-18 43, visat sig vara känsliga för YAP-aktivitet och vävnadsmekanik 43, 44 i specifika sammanhang som bröstcancer. Till skillnad från tidigare studier av familjemedlemmar med miR-130/301 med fokus på specialiserade tillstånd såsom levercancer 45, 46, bröstcancer 47, 48, scleroderma 49, betonar våra resultat här den globala dysreguleringen av familjen miR-130/301 och dess svårfångade samtrafik med fibroblastens molekylära fibrotiska maskiner. Med tanke på den justerbara, återkopplingsdrivna egenskapen, kan miR-130/301-YAP / TAZ-kretsen delvis vara ansvarig för individualiserad "avstämning" av ECM-ombyggnad som observerats bland olika fibrotiska störningar. Med tanke på vår växande uppskattning av YAP / TAZ-aktivitet som härrör från fysiska stimuli såsom skjuvspänning 50, är det också möjligt att miR-130/301 och andra YAP / TAZ-associerade miRNA kan utgöra en nyligen definierad uppsättning faktorer som svarar på ett brett spektrum av fysiska förändringar (dvs vaskulär hemodynamik) av mikromiljön förutom styvhet ensam. Identifiering av dessa sammankopplingar kastar ett nytt ljus på komplexiteten hos fibrotiska sjukdomar och belyser den attraktiva kandidaten till YAP / TAZ 51 och miR-130/301 12, 52, 53 för terapeutisk inriktning.

När det gäller förhållandet mellan detta sjukdomsnätverk och PH specifikt, ger identifiering av centralen hos YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen också molekylär insikt i de heterogena kliniska föreningarna av sekundära sjukdomar som finns med detta gåtfulla vaskulära tillstånd 54 . Till exempel är Världshälsoorganisationen (WHO) grupp I pulmonal arteriell hypertoni (PAH) en allvarlig form av PH där olika sekundära sjukdomar katalogiseras tillsammans baserat på histopatologiska paralleller snarare än molekylära likheter (inklusive leversjukdom och portopulmonell hypertoni bland andra). Alternativt innesluter WHO Group III PH en mängd olika lungsjukdomar inklusive idiopatisk lungfibros (IPF) där hypoxi har beskrivits som en miljömässig triggare som länkar lungpatologi till PH. Men för en PH-relaterad sjukdom, såsom idiopatisk lungfibros (IPF), är det troligt att andra förenande men fortfarande oidentifierade molekylära faktorer och / eller cellulära patofenotyper utöver hypoxi är framträdande. Våra data som påverkar ombyggnaden av ECM bland detta nätverk av sjukdomar utgör grunden för två icke-ömsesidigt exklusiva modeller av hur sjukdomar som lungfibros och fibrotiska leversjukdomar kan korsa PH. Först kan dessa sjukdomar utvecklas på ett autonomt sätt, drivna av separata skador [såsom hypoxi, inflammation och specifika genetiska mutationer kopplade till PH 12 ] som inducerar miR-130/301 i distinkta vävnadsbäddar. Således är det frestande att spekulera att genetiska mutationer kopplade till PH och miR-130/301 9 också kan bidra till separata fibrotiska lung- och leversjukdomar. En andra modell implicerar icke-celliga autonoma metoder för att aktivera denna molekylära återkopplingsslinga bland distinkta anatomiska vävnadsbäddar. Till exempel, i WHO-grupp III PH associerad med lungfibros, indikerar våra resultat att oberoende av hypoxi kan parenkymfibros aktivera YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen i adventitiva fibroblaster och kanske andra relaterade mesenkymala stamceller 55, accelererande vaskulär styvhet. Med tanke på ökade miR-130/301-nivåer i plasma hos PH-patienter 12, 56 är patogen överföring och endokrin signalering av miR-130/301 mellan lunga och levern en spännande möjlighet. Båda modellerna kan vara aktiva, och identifieringen av centrala faktorer som är gemensamma för alla sjukdomar ger ett välbehövligt molekylärt landmärke för att avkoda ytterligare komplicationer av sjukdomsförbindelse.

Identifieringen av ett fibrotiskt miRNA-beroende genprogram delat över flera sjukdomar medför breda kliniska förgreningar utöver klassificering av sjukdomar. På diagnostisk nivå kan molekylär screening för denna fibrotiska signatur underlätta förmågan att identifiera personer i riskzonen för ett sådant besläktat "syndrom" av sjukdomar. Alternativt, om vissa fibrotiska sjukdomstillstånd existerar ( dvs. potentiellt vid tidigare tidpunkter för sjukdomens progression eller specifika kliniska subtyper) där enskilda molekyler aktiveras isolerat såsom miR-130/301 eller ApoE, kan mer skräddarsydd terapi försökas och kan vara effektiv i dessa fall. Som sådan kan biopsier före behandlingen vara till hjälp, även om utvärdering skulle kräva samtidig RNA- och proteinanalyser - protokoll som ännu inte är utbredda i klinisk praxis. Trots dessa utmaningar kan man tänka sig en möjlig väg för personlig behandling och diagnos.

På terapeutisk nivå har effektiviteten av inriktning på enskilda fibrotiska enzymer, såsom matrismetalloproteinaser (MMP), varit suboptimal, särskilt när den testades i det kliniska steget 57, 58 . Speciellt eftersom YAP / TAZ och miR-130/301 verkar aktivera en positiv återkopplingsslinga för robust ECM-stelning åtminstone i PH 9, en farmakologisk kombination av miR-130/301-hämning via kortare 59 förutom att manipulera nedströms miR-130 / 301-beroende vägar såsom LXR / APOE-aktivitet (fig. 7) erbjuder en rationell väg för kooperativ terapeutisk inriktning av fibros. Ändå på grund av systemnivåverkningarna av miR-130/301 på flera kärlcellfenotyper 9, 12, 52 kan korrekt klinisk användning av miR-130/301-hämmare ha förbehåll. Först, eftersom fibros och matrisproduktion också har positiva och anpassningsbara egenskaper under vissa förhållanden ( dvs. normal sårläkning och organutveckling), kan hämning av miR-130/301 ha betydande fallgropar om de används i icke-selektiva sammanhang. För det andra kan sådana fallgropar överdrivas av de utbredda men celltypspecifika funktionerna hos denna miRNA-familj utöver fibroblasten, antagligen dikterad av en icke identisk kohort av miR-130/301-specifika målgener som är aktiva i olika celltyper 9 . Ändå ger selektiv farmakologisk inriktning av fibroblasten i specifika sjukdomstillstånd ett lovande, och framtida biologisk bekräftelse av den bredare, nätverksbaserade åtgärden från familjen miR-130/301 kan ytterligare vägleda en sådan systemfarmakologisk strategi för att rikta fibros som ännu inte har varit förföljde i stort djup.

Tillsammans definierar resultaten här kontrollen av ett fibrotiskt genprogram genom YAP / TAZ-miR-130/301-kretsen, delad bland ett nätverk av relaterade sjukdomar. Dessa fynd definierar vår uppfattning om det svårfångade molekylära ursprunget till dessa sjukdomar och erbjuder därmed välbehövliga molekylära diagnostiska och terapeutiska möjligheter. Genom att kombinera avancerade nätverksanalyser med experimentell förhör ger våra resultat en färdplan för att studera systemnivå på samarbetsnivå som är genomgripande bland miRNA och nätverket för mänskliga sjukdomar i allmänhet. Sådant framtida arbete har potential att avslöja ytterligare dolda men ändå grundläggande länkar som finns i till synes oberoende patologi.

metoder

Insamling och analys av Expression Array-data

För att inkludera transkriptomiska data i vår statistiska bedömning av miRNA-aktivitet i fibrotiska tillstånd, sammanställde vi en uppsättning av 137 expressionsuppsättningar som analyserade mänsklig vävnad i en mängd olika sjukdomstillstånd och fysiologiska tillstånd (se även tabell S1). Publiskt tillgängliga matriser hittades i databasen Gene Expression Omnibus (GEO), filtrerad för att inkludera endast analyser utförda på obehandlad, påverkad människa och utdraget blod (jämfört med matchade, icke-sjuka kontrollprover av samma vävnadstyp), med en array per vävnadstyp per sjukdom eller fysiologiskt tillstånd. Där det var tillgängligt, valde vi studier där frisk vävnad från levande, åldersmatchade patienter var tillgänglig, men för provstorleks skull använde vi också studier där biomatisering efter postmortem användes, om inga andra data fanns tillgängliga. Förhållanden utesluts för vilka de enda tillgängliga vävnadsproven inte var direkt relevanta för fysiologin i fråga, som i fallet med pulmonell hypertoni (PH), där endast perifera blodprover från PH-patienter hade analyserats, i motsats till mer sjukdomsrelevant fast vävnad från lungan. Det sista datasättet representerade 137 uttryckssatser som representerade 105 olika villkor och inkluderade ett brett tvärsnitt av mänsklig patologi. Vi valde de generna i varje matrisuppsättning som visade en vikningsändring> ± 2, 0 och ett p-värde <0, 05 och korsreferenserade den resulterande genuppsättningen med det konsoliderade interaktomet för att bilda ett unikt gennätverk.

Endast de översta 250 generna (genom vikningsförändring) valdes i fall där antalet signifikant differentiellt uttryckta gener överskred denna avgränsning. Dessa nätverk utvidgades sedan till att omfatta väl anslutna första-gradsinteraktorer, såsom beskrivits ovan. Sådan trunkering var nödvändig för att optimera vår förmåga att urskilja biologiskt meningsfull molekylöverlappning på grund av det inneboende bruset och effektmättnaden vid jämförelse av alltför stora genuppsättningar. Först, eftersom uttryckningsanalyser är mottagliga för brus, minskade vi antalet falska positiva närvarande i vårt nätverk genom att bara inkludera de gener som visar den största mängden modulering i ett visst tillstånd. För det andra, eftersom mätvärden, såsom den spännande poängen i stor utsträckning baseras på överlappningen av miRNA-målpooler med det aktuella nätet, skulle ett alltför stort gennät presentera en situation där den övre änden av poängspektrumet kan bli mättad och därmed öka svårigheter att skilja det relativa inflytandet av topprankade miRNA från varandra. Medan viss information kan gå förlorad vid sådan trunkering (vilket leder till högre falsk-negativ hastighet), postulerade vi att fokusering på gener med de största uttrycksförändringarna skulle ge en rimlig representation av nyckeln, systemnivåändringar i varje sjuk vävnad. Vidare tillhandahöll processen med första tröskelvärdet och sedan utvidga nätverket genom att lägga till väl anslutna första-gradsinteraktorer en ytterligare metod (tillsammans med standardvikten för vikningsändring och p-värde som beskrivs ovan) för att isolera och förstärka molekylsignalen hos dessa förmodade systemnivåförändringar. Sammantaget genererade vi således en konservativ representation av de tillgängliga uttrycksdata, vilket gynnade mer exakta nätverk med få falska positiva effekter över nätverk som är helt omfattande.

För vart och ett av de 137 nätverken bestämde vi (a) fraktionen av nätverket som överlappade med fibros-signaturen och (b) den rankade listan över miRNA (genom att spänna poäng) som påverkade nätverket. In order to isolate miRNAs that are specifically relevant to fibrosis (and not simply influential across all networks by virtue of having a large and well-connected target pool), we grouped networks into four cohorts according to the size of their overlap with the fibrosis signature. We then ranked miRNAs based on a one-way ANOVA means comparison test for their assigned spanning score rank for the networks in each cohort. miRNAs that scored well by this metric had higher average spanning scores in strongly fibrotic disease groups, relative to their performance overall. Because miRNA-target predictions were generated based on seed sequence matching 60, our spanning scores group individual miRNAs into families with identical seed regions.

Upon identifying the miR-130/301 family as a critical regulator of fibrosis across contexts, we ranked each of the 137 networks according to (a) its overlap with the fibrosis network and (b) the spanning score rank assigned to miR-130/301 in that context. This was quantified as the average of two values: (1) the fraction of network genes that were shared with the fibrosis network and (2) the fraction of the highest possible rank achieved by miR-130/301 [1 – rank 130 /rank MAX ]. This ranking identified networks that contained significant fibrotic components and were heavily influenced by this miRNA family.

Hybridisering in situ

The protocol for in situ hybridization for miRNA detection was based on a prior report 12 . Specifically, 5 μm tissues sections were probed using a 3′ fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled miRCURY LNA hsa-miR-130a detection probe (Exiqon; 5′-ATGCCCTTTTAACATTGCACTG-3′). The miRCURY LNA scramble-miR probe was used as negative control. Following re-hydration (Sigma) tissues were formaldehyde-fixed (4% formaldehyde, Sigma) before inactivation of endogenous enzymes by acetylation buffer [873 uL of triethanolamine (Sigma) and 375 uL acetic anhydride (Fisher) in 75 ml distilled water]. Probe annealing (25 nM LNA probe) was performed in hybridization buffer (Sigma, H7782) for 16 hours at RNA-Tm-22 °C (62 o C). Following serial washes with 2X SSC, 1X SSC, and 0.5X SSC (Sigma) at 62 o C, immunolabeling was performed with an anti-FITC biotinconjugated antibody for overnight at 4 o C (1:400; Sigma-Aldrich). For detection, development was achieved by adding streptavidin-biotinylated alkaline phosphatase complex (Vector Labs) followed by Nitro blue tetrazolium chloride/5-Bromo–4-chloro–3–indolyl phosphate substrate solution (NBT/BCIP, Roche), and positive staining was evident by a blue color. MiR-130a expression was quantified in the vascular wall of 15–20 pulmonary arteries or for liver tissue in 10 random 20x fields per animal using ImageJ software (NIH).

For co-detection of proteins and miRNA, after probe hybridization and following serial washes with SCC immunolabeling was performed with anti-α–SMA (1/500; Sigma-Aldrich), anti-vimentin (1/250; Abcam) and/or anti-Desmin (1/1000; Abcam) antibody for overnight at 4 o C. After 3 washes in TBS Tween 0.1% slides were incubated with donkey anti-mouse and donkey anti-rabbit Alexa-conjugated antibody (Alexa 568 and Alexa 647) for 1 hour at room temperature. After 3 washes in TBS/Tween 0.1%, slides were mounted with anti-fading medium with DAPI (Vectashields, Vector).

djur

All animal treatments and analyses were conducted in a controlled and non-blinded manner.

Lung fibrosis model

Age-matched male C57BL/6 mice (7–8 weeks old, substrain N) were exposed to 0.035 U of bleomycin via oropharyngeal route. In the control group, saline (PBS) was administered via the same route. Mice were euthanized 14 days or 21 days after bleomycin administration.

Liver fibrosis model

For chronic CCl 4 –induced liver fibrosis, age matched male C57BL/6 mice (7–8 weeks old, substrain N) were injected (intra-peritoneal) with 1 mL per kg body weight sterile CCl 4 in a 1:5 ratio in corn oil or corn oil alone (control) every 5 days for 4–6 weeks. Livers were harvested 72 h after the last injection.

Inhibition of miR-130/301 in a mouse model of pulmonary fibrosis

Eight-week-old mice (C57Bl6) were injected with bleomycin (1.5U/kg Sigma Aldrich) followed by 10 intraperitoneal injections (every 2 days) of control or miR-130/301 shortmer oligonucleotides, designed as antisense inhibitors recognizing the seed sequence of this miRNA family (20 mg/kg/dose; Regulus). Shortmer generation was previously described 12 . Two days after the last injection, lung tissue was harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Forced expression of miR-130a in liver tissue of mice

Eight-week-old mice (C57BL/6) were injected by intraperitoneal route every 3 days during 6 weeks with 1 nmol of miR-control (pre-miR-NC) or miR-130a (pre-miR-130a) (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies) mixed in 100 μl PBS solution containing 5% Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies). These injections were accompanied by 6 intraperitoneal injections (once every seven days) of suboptimal dose of CCl4 (0.1mg/kg body weight) or vehicle (Corn oil, Sigma-Aldrich). Two days after the last injection, liver, lung and kidney tissues were harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Inhibition of miR-130/301 in a mouse model of liver fibrosis

Eight-week-old mice (C57Bl6) were injected with CCl 4 (1mL per kg of body weight) every 5 days accompanied by intraperitoneal injections (every 2 days) of control or miR-130/301 shortmer oligonucleotides (20mg/kg/dose; Regulus). Two days after the last injection, liver tissue was harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Treatment of mice with oral ingestion of the liver-X nuclear hormone receptor (LXR) agonist GW3965

To determine the effects of the LXR agonist GW3965 (Sigma-Aldrich) and consequent APOE induction on lung fibrosis, as previously described 13, mice were exposed to bleomycin (as described above) and simultaneously assigned to control chow or chow supplemented with GW3965 (Research Diets, Inc .) at doses of 100 mg of drug per kilogram of mouse per day (based on average daily intake of 3.5 gm of chow). After two weeks, harvest of lung tissue was performed for RNA/protein extraction or paraffin embedding.

Study approval and ethics statement

All human and animal experiments were carried out in accordance with the approved guidelines listed below. Specifically, all animal experiments were approved by the Harvard Center for Comparative Medicine. All experimental procedures involving the use of human tissue were approved by Institutional Review Boards at Partners Healthcare, Boston Children's Hospital, National Institutes of Health, as well as the New England Organ Bank. Ethical approval for this study conformed to the standards of the Declaration of Helsinki. For formalin-fixed paraffin embedded lung samples and flash frozen samples, human idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) specimens were collected from discarded surgical samples following lung transplantation. Control lung samples were collected in cases where non-IPF donor lungs were declined for transplantation. All subjects provided informed consent prior to tissue procurement. No additional clinical data were available. As previously described 61, explant lung tissue samples were procured within one hour of the transplant procedure, tissue slides were obtained from paraffin-embedded blocks of explants fixed in 4% paraformaldehyde, snap frozen or stored in RNA preservative. For formalin-fixed paraffin embedded liver samples, informed consent was obtained for standard-of-care wedge liver biopsy samples, collected from patients (Massachusetts General Hospital) undergoing weight loss surgery for the purpose of evaluating for nonalcoholic steatohepatitis (NASH). For this study, specimens were analyzed from unused surgical specimens that had previously been evaluated by a pathologist blinded to clinical data and scored as previously described 62, 63 .

Statistik.

The number of animals in each group was calculated to measure at least a 20% difference between the means of experimental and control groups with a power of 80% and standard deviation of 10%. The number of unique patient samples for this study was determined primarily by clinical availability. In situ expression/histologic analyses of both rodent and human tissue, and pulmonary vascular hemodynamics in mice and rats were performed in a blinded fashion. Numerical quantifications for physiologic experiments using rodents or human reagents represent mean ± standard error of the mean (SEM). Paired samples were compared by a 2-tailed student's t test. A P-value less than 0.05 was considered significant. Correlation analyses were performed by Pearson correlation coefficient calculation.

ytterligare information

How to cite this article : Bertero, T. et al. A YAP/TAZ-miR-130/301 molecular circuit exerts systems-level control of fibrosis in a network of human diseases and physiologic conditions. Sci. Rep. 5, 18277; doi: 10.1038/srep18277 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.