En visuell rörelsedetekteringskrets föreslagen av drosophila connectomics | natur

En visuell rörelsedetekteringskrets föreslagen av drosophila connectomics | natur

Anonim

ämnen

  • Rörelsedetektor
  • neuro~~POS=TRUNC

Abstrakt

Djurens beteende härrör från beräkningar i neuronala kretsar, men vår förståelse av dessa beräkningar har varit frustrerad av bristen på detaljerade synaptiska anslutningskartor eller connectomes. Till exempel, trots intensiva undersökningar över ett halvt sekel, förblir den neuronala implementeringen av lokal rörelsedetektion i det insekta visuella systemet svårt. Här utvecklar vi en halvautomatisk pipeline med elektronmikroskopi för att rekonstruera en connectome, som innehåller 379 neuroner och 8 637 kemiska synaptiska kontakter, inom Drosophila optic medulla. Genom att matcha rekonstruerade neuroner till exempel från ljusmikroskopi, tilldelade vi neuroner till celltyper och monterade en koppling av den upprepande modulen i medulla. Inom denna modul identifierade vi celltyper som utgör en rörelsedetekteringskrets och visade att anslutningarna till enskilda rörelsekänsliga nervceller i denna krets överensstämde med deras riktningsselektivitet. Våra resultat identifierar cellulära mål för framtida funktionella undersökningar och visar att connectomer kan ge nyckelinsikter om neuronala beräkningar.

Huvudsaklig

Vision hos insekter har varit föremål för intensiva beteende 1, fysiologiska 2 och anatomiska 3 undersökningar, men vår förståelse för dess underliggande neurala beräkningar är fortfarande långt ifrån fullständig. En sådan beräkning, etologiskt mycket relevant, är rörelsedetektering, som tros förlita sig på jämförelsen mellan signaler som är förskjutna i rymden och tiden 4, 5, 6 (fig. La, b). Trots att de är i fokus för teoretiska och experimentella undersökningar i mer än ett halvt sekel 7, förblir den exakta mekanismen som ligger bakom denna beräkning ett mysterium. Ett centralt hinder för att avslöja denna mekanism har varit vår ofullständiga kunskap om relevanta neuroner och synapser.

Image

a, högerriktningskomponent i modellen Hassenstein – Reichardt EMD 4 . Ljusinmatning (blixtbult) till vänster kanal (magenta) överförs med en ytterligare fördröjning, τ , relativt den till höger kanal (cyan). För ett objekt som rör sig åt höger kommer signaler från båda kanalerna att ansluta sig till multiplikationsenheten närmare varandra och blir därför olinjärt förbättrade (och vice versa för objekt som rör sig åt vänster). Som ett resultat svarar modellen företrädesvis på rörelse åt höger. b, alternativ Barlow – Levick-liknande EMD 6- modell, föredrar också rörelse åt höger. Observera att ingångarna kombineras med motstående skyltar och fördröjningen är nu i höger (cyan) kanal. c, Bodian silverfärgad horisontell sektion 45 i det visuella systemet Drosophila melanogaster som avslöjar de fyra neuropilerna i den optiska loben. Medullaområdet av intresse (solid rektangel, expanderat i d ) och den bredare avbildade volymen (streckad rektangel) som används för att spåra in i lobulaplattan visas schematiskt. d, Den 37 μm × 37 μm medulla regionen av intresse är centrerad på referenskolonnen (röd) och sex omgivande närliggande grannskolumner (blå). Medulla har tio lager (M1 – M10) definierade av arboriseringarna av dess celltyper. Skalstänger, 50 μm ( c ) och 10 μm ( d, i alla tre riktningar).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

I flugan börjar visuell bearbetning i den optiska loben, som består av fyra retinotopiskt organiserade neuropiller. Var och en är en matris med upprepande moduler motsvarande det sexkantiga gitteret av ommatidia i det sammansatta ögat (fig. 1c). Varje modul i den första neuropilen, lamina, innehåller en upprepande krets 8, 9 som tar emot ingångar från sex fotoreceptorer som upptäcker ljus från samma plats i synfältet. Utgångscellerna från varje lamina-modul projicerar till en motsvarande modul i den andra neuropilen, medulla (fig. 1c). Varje medulla-modul, kallad en kolumn (fig. 1d), tros också innehålla stereotypa kretsar 10 . Dessa kolumner, i sin tur, innerverar två nedströms neuropiler, lobula och lobulaplatta (fig. 1c).

Svar på lokal rörelse måste beräknas åtminstone delvis inom de stereotypa kretsarna i medulla-kolumnerna. I själva verket är medulla den första neuropilen med rörelsespecifik aktivitet 11, och, direkt nedströms medulla, integrerar lobula platta tangentiella celler (LPTC) lokala rörelsessignaler för att producera rörelserespons 12, 13 . Fram till nu har emellertid bristen på en medulla connectome frustrerade undersökningar av lokal rörelsedetektion.

Halvautomatisk återuppbyggnad av connectome

För att ge en pålitlig grund för beräkningsmodellering och identifiera mål för elektro / optofysiologiska inspelningar, försökte vi en fullständig, tät rekonstruktion av den kemiska synaptiska anslutningen inom medulla med hjälp av elektronmikroskopi, guldstandarden för neuroanatomi 14 . Med tanke på den tidskrävande naturen för sådana rekonstruktioner ville vi bestämma den minsta medullavolym, vars rekonstruktion skulle göra det möjligt för oss att identifiera en krets som ligger till grund för beräkningen av lokal rörelse. Både riktningsvridningssvar 15 och elektrofysiologiska svar i LPTCs 16 kan framkallas i flugor genom sekventiell stimulering av två fotoreceptorer motsvarande intilliggande punkter var som helst i synfältet 17 . Detta antyder att någon upprepande komponent i rörelsedetekteringskretsen måste finnas i alla två intilliggande medullakolonner. Vi beslutade därför att rekonstruera alla synaptiska anslutningar mellan neuroner inom en enda referenskolonn, liksom alla förbindelserna mellan referenskolonnen och neuronerna inom sex närmaste kolumner i nästa granne (fig. 1d).

Eftersom manuell rekonstruktion av till och med en sju-kolonns volym skulle vara oöverkomligt tidskrävande 18, utvecklade vi en halvautomatisk rekonstruktionsrörledning 19 och applicerade den på medullavolymen (Fig. 2, Metoder och kompletterande data 1) och rekonstruerade 379 celler ( Kompletterande figur 1 och kompletterande video 1).

Image

a, ett representativt mikrograf, en av 2 769 från elektronmikroskopiserien. b, Korrekturläsning av mikrografen i a till neuritprofiler (enstaka färger). c, Synapser innefattar en presynaptisk process innehållande ett T-stångband (röd pil) och tillhörande neuriter med postsynaptiska tätheter (PSD) (blå pilspetsar) intill T-stången. En icke-synaptisk process (grön cirkel) saknar en PSD (i både detta och andra sektionsplan som innehåller denna T-stapel). d, Neuriter rekonstrueras genom att länka profiler i på varandra följande avsnitt (vänster) för att konstruera ett 3D-objekt (höger). e, Ett exempel på en neuron rekonstruerad från elektronmikroskopi (vänster), identifierad genom jämförelse med den Golgi-impregnerade cellen (centrum) 20 som typ Mi1 och korsvaliderad av en motsvarande genetisk enkelcell (GSC) -märkt neuron (höger) (Kompletterande metoder). f, Samma som e för celltyp Tm3. Skalstänger, 500 nm ( a, b ), 250 nm ( c ) och 10 μm ( e, f ).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

För att kartlägga vår rekonstruktion på den befintliga kroppen av kunskap, tilldelade vi dessa celler till tidigare föreslagna celltyper 20 genom att jämföra formerna på rekonstruerade arbors (kompletterande figur 1) med de som rapporterats från ljusmikroskopi med Golgi-impregnering eller genetisk encellsmärkning ( Fig. 2e, f och kompletterande metoder). Eftersom det fanns flera rekonstruerade exempel för nästan alla neuronala typer (kompletterande figur 1 och kompletterande tabell 2) var det möjligt att karakterisera de gemensamma strukturella kännetecknen för varje typ. I många fall gjorde det att vi på ett entydigt sätt matchade en rekonstruerad cell med ett Golgi-impregnerat 20, för vilket det sedan kallades (kompletterande metoder). Men det fanns också en delmängd av celltyper för vilka en Golgi-motsvarighet inte kunde hittas men som vi validerade med användning av isomorfer från genetisk encellsmärkning. Vi namngav dessa celltyper Mi13, Mi14, Mi15, TmY14, Dm9 och Dm10 (kompletterande figur 2). Totalt från samlingen av 379 rekonstruerade celler (kompletterande fig 1) kunde vi klassificera 290 av dem i 56 celltyper (kompletterande tabell 2).

För att avslöja förbindelserna mellan de 379 rekonstruerade neuronerna, identifierade vi pre- och postsynaptiska platser och tilldelade dem till sina respektive moderceller. Inom referenskolonnen och dess omedelbara omgivning kommenterade vi 10 093 presynaptiska platser och 38 465 associerade postsynaptiska platser (3, 8 ± 1, 2 (medelvärde ± sd) per presynaptisk plats) (Fig. 2c och kompletterande tabell 1). Även om presynaptiska T-staplar vanligtvis föll på korrekturlästa profiler av neuroner, föll postsynaptiska platser vanligtvis på isolerade profiler, otilldelade till någon neuron. Således var det nödvändigt att spåra dendriten som innehåller varje postsynaptisk plats tillbaka till en överordnad cell. Denna postsynaptiska spårning var oerhört utmanande eftersom Drosophila neuron dendrites grenar uttömmande och faktiskt kan vara tunnare än sektionens tjocklek.

Den utmanande postsynaptiska spårningen ledde till (1) några felaktigt identifierade synaptiska kontakter och (2) en hög fraktion (∼ 50%) av kontakter som inte kunde spåras till deras föräldersneuron och var därför oidentifierade. För att öka vårt förtroende för de identifierade kontakterna (1), hade vi två korrekturläsare som spårar alla postsynaptiska webbplatser (Metoder) och accepterade endast de kontakter som båda korrekturläsarna identifierade oberoende. Däremot var det inte möjligt att experimentellt minska antalet oidentifierade kontakter (2). Men vi kunde fortfarande konstruera en anslutning som är värdefull för att dra slutsatsen, eftersom vi fann att inom medulla, anslutningar av hög vikt (det vill säga ett stort antal synaptiska kontakter per anslutning) båda fångar upp en stor del av den totala anslutningsvikten och kan identifieras med hög trohet. Faktum är att fördelningen av anslutningsvikten i vår anslutning är tungt svansad (fig. 3b, inbyggd och tilläggsfigur. 3), såsom har hittats i andra organismer 21, 22 . Under förutsättning att synapser är lika svåra att läsa korrekt, fann vi att någon stark anslutning (med> 5 synaptiska kontakter) kommer att identifieras med> 95% sannolikhet. Därför identifieras 8, 637 synaptiska kontakter i det resulterande connectome exakt och alla starka anslutningar representeras.

Image

a, Synaptisk anslutningsmatris för modulära celltyper sammansatta från 2 495 synapser (kompletterande tabell 1). Tre vägar, identifierade via Louvain-klusteranalysen 46, är märkta med färgade rutor. De namnges av deras primära inmatade neuron (er): vägarna L1 (magenta), L2 (grön) och L3 / R7 / R8 (cyan). Vägarna ordnas av det totala antalet anslutningar inom en väg, i fallande ordning, och celltyperna inom varje väg beställs av summan av deras för- och postsynaptiska anslutningar till och från andra celltyper inom deras väg, också i fallande ordning. b, Medulla connectome-modul som en 3D-graf. Celltyper med starkare anslutningar placeras närmare varandra genom att visualisera algoritmen 47 för likhetslayout . Tre rumsligt segregerade grupper observeras som passar nära de vägar som identifieras genom klustering (färgning av sfärer). Den dominerande riktningen för signalflödet orienteras in på sidan 22 . Inmatning i b visar fraktionen av synaptiska anslutningar inom hela anslutningen med en anslutningsvikt större än indikerat.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Anslutningsmodulen och dess vägar

För att identifiera vägar som utför lokala beräkningar, såsom rörelsedetektering, var det nödvändigt att generera en mer bekväm abstraktion av hela anslutningen. Eftersom vi förväntar oss att intressekretsarna upprepas inom varje kolumn, extraherade vi från medulla connectome en periodisk modul med anslutningar mellan identifierade celltyper som arboriserar i varje kolumn. Dessa inkluderar både så kallade synperiodiska celltyper med enstaka neuroner i varje kolumn i medulla 23, och celltyper med flera medlemmar inom varje kolumn, som vi kallar ultraperiod. Vi inkluderar inte infraperiodiska tangentiella eller lokala amacrinliknande celler, även om de har arboriseringar i varje kolumn, eftersom detta inte kan bestämmas entydigt från vår elektronmikroskopi-rekonstruktion (kompletterande tabell 2). Vi använde förekomsten av flera representanter från intilliggande kolumner i vår elektronmikroskopi-rekonstruktion (kompletterande fig. 1) för att identifiera 25 celltyper som synperiodiska, såväl som två celltyper, Tm3 och T4, som ultraperiod (med 1, 5 och 4 celler per kolumn (tilläggstabell 2). Vi kallade dessa 27 celltyper modulära.

Antagande att anslutningar mellan modulära celler är stereotypa mellan kolumner, konstruerade vi den upprepade kretsmodulen genom att hitta alla anslutningar mellan dessa celltyper (Metoder). Till skillnad från glesa rekonstruktioner fångar den resulterande connectome-modulen (fig. 3a) exakt inte bara närvaron utan också frånvaron av starka förbindelser mellan två celltyper.

För att bestämma vilka neuroner som kan vara involverade i olika lokala beräkningar, dissekerade vi connectome-modulen i tre separata signalbehandlingsvägar, med både en klustering och en layoutalgoritm (Fig. 3). Vi kände igen dem som de tidigare identifierade vägarna, L1, L2 och L3 / R7 / R8. Nedströmsmålen för R7 och R8 har tidigare varit inblandade i färgsyn. Eftersom färgvägar är separerade i olika kolumner som tar emot ingångar från antingen blek eller gul ommatidia 24, förväntar vi oss att de bör lita på infraperiodiska celltyper som utelämnas från vår connectome-modul. Därför kommer den fina strukturen för L3 / R7 / R8-vägen att ses över någon annanstans.

De återstående L1- och L2-vägarna signaliserar visuell kontrast och är inblandade i rörelsedetektering 7, 25, 26, 27, 28, 29 . Beteendexperiment och elektrofysiologiska inspelningar bekräftar denna roll för L1 och L2: inte bara är var och en nödvändig för aspekter av rörelsedetektion 29, 30, 31, utan bland cellerna som är postsynaptiska till fotoreceptorerna R1 – R6, är båda också mest tillräckligt 30, 31 för beräkningen. Emellertid saknar L1 och L2 själva riktningsselektiva svar 7, 25 . För att söka efter rörelsedetekteringskrets (er) inom connectome-modulen undersökte vi neuronerna nedströms L1 och L2 mer i detalj.

Kandidatens rörelsedetekteringskrets

Flera bevislinjer indikerar att rörelsesinformation beräknad nedströms L1 och L2 överförs till lobulaplattan via celltyperna T4 och T5 (ref. 25). Först visar inspelningar från LPTC: er i fruktflyg med genetiskt tystnad T4 och T5 att åtminstone en av dessa columnar celltyper är nödvändig för att upptäcka riktningsselektivitet 32 . För det andra innefattar T4- och T5-celler i Drosophila var och en fyra subtyper som är differentierade med lobula-plattskiktet i vilka deras axoner är arboriserade 20 . För det tredje uppvisar vart och ett av dessa fyra skikt i lobulaplattan aktivitet som svar på bredfältstimuli som rör sig i en viss riktning: nedåt, uppåt, bakåt och framåt (fig. 4b, e), avslöjat genom deras upptag av deoxyglukos 11, 27 . Slutligen upptar dendriter av LPTC med olika rörelsepreferenser lobulaplattskikten som motsvarar deras riktningspreferens 20 och får dessutom direkta synaptiska anslutningar från T4-terminalerna 28 . Sammantaget antyder dessa data att varje subtyp av T4 / T5 bildar utgången från rörelsedetekteringskretsar som signalerar en viss rörelseriktning.

Image

a, Bottenvy av dendriter från Mi1 (cyan) och Tm3 (magenta) neuroner som är presynaptiska till T4-12, överlagda på matrisen av L1 axonala terminaler (gul). Färgmättnaden för varje dendritisk båge återspeglar antalet synaptiska kontakter gjorda på T4-12 (se b och d ). Pilen visar förskjutningen från Tm3 masscentrum till Mi1 masscentrum beräknat såsom illustreras i e . b, sidovy av T4-12 och dess presynaptiska Mi1- och Tm3-celler. Riktningens preferens för en T4-cell (färgad för att matcha riktningsinställningarna i e ) bestäms av lobulaplattans arboriseringslager hos axonterminalerna (T-stänger i svart). c, Förstoring (streckad rektangel i a ) som visar rekonstruerade neuriter av Mi1, Tm3 och L1 celler (utan de viktade färgerna i a ) och deras synaptiska kontakter (L1 → Mi1: blå; L1 → Tm3: röd). d, Rekonstruerad dendritisk båge av T4-12 med synapser från Mi1 (blå) och Tm3 (röd). e, Tecknad film av ingångar till en enda T4-cell genom Mi1- och Tm3-celler. Långa synaptiska vikter illustrerar hur de mottagande fälten beräknades. Masscentrumet för Mi1 (eller Tm3) -komponent, blå (eller röd) cirkel, beräknas genom att placera massan som motsvarar den sammansatta synaptiska vikten från L1 till Mi1 (eller Tm3) till T4 i mitten av motsvarande kolonn. Skalstänger, 8 μm ( a ), 8 μm ( b ), 1 μm ( c ) och 4 μm ( d ).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Därefter hävdar vi att riktningsselektiva utgångar från T5 och särskilt T4 beräknas i stort sett oberoende av varandra. I överensstämmelse med stratum-överlappningsanalys i Drosophila 26 och stora flugor 25 indikerar vår anknytning (fig. 3a, b) att T4 tillhör L1-vägen. Omvänt, även om vi inte spårar in i lobulaen, samarbetar dendritterna från T5-celler lager i lobula med axonterminalerna till neuroner som Tm1 (refs 20, 25), Tm2 (ref. 20) och Tm4 (ref. 20), som tillhör L2-vägen (fig. 3b). Elektrofysiologiska 30 och beteende 29- bevis indikerar att L1- och L2-vägarna i anslutningsmodulen (fig. 3a, b) är beräkningsoberoende och motsvarar PÅ- och AV-banor i de visuella systemen för ryggradsdjur 30 . Vidare anländer de flesta av anslutningarna från L2 till L1-vägen via L5 (fig. 3a), en celltyp som inte är inblandad i rörelsedetektion 33 . Därför beslutade vi att söka efter en rörelsedetekteringskrets nedströms L1 som konvergerar på T4-celler. Detta beslut fattades trots elektrofysiologiska bevis som visar en brist på riktningsselektivitet i T4-celler 34, men har sedan vårt arbete avslutats stöttats av kalciumavbildning av T4-celler 35 .

För att identifiera kandidatelement i en rörelsedetekteringskrets som överbryggar mellan L1 och T4, utnyttjade vi det faktum att rörelsedetektering är både snabb och robust till brus 16, 17, och följaktligen bör implementeras av både framåt och starka anslutningar. Vår täta rekonstruktion av elektronmikroskopi identifierade fem celltyper med signifikant ingång från L1: Mi1, Tm3, L5, C2 och C3 (Fig. 3a). Celltyperna Mi1 och Tm3 är de två största mottagarna av L1-ingångar, tillsammans står för mer än hälften av de synaptiska kontakterna i L1. I sin tur bidrar Mi1 och Tm3 tillsammans> 80% av presynaptiska ingångar till T4 (inklusive alla ingångar från både modulära och icke-modulära celltyper) och bildar således de två starkaste vägarna från L1 till T4. Däremot är celltyp C3 i kontakt med T4 med en storleksordning färre synapser än Mi1 och Tm3, vilket antyder att dess bidrag är mycket svagare. Slutligen har celltyperna L5 och C2 inga synapser direkt med T4. Dessa funktioner leder till att vi föreslår att Mi1 och Tm3 är de primära underlagen för robust och snabb rörelsedetektion inom L1-vägen.

Anatomiska mottagliga fält för T4-celler

För att undersöka ytterligare om Mi1- och Tm3-celler som konvergerar på T4-celler kan utgöra de två armarna i en korrelationsbaserad rörelsesdetektor (Fig. 1a, b) undersökte vi om rörelsesaxeln definierad av dessa ingångar på en viss T4 är förenlig med dess föredragen riktning, mätt med dess utgångar. Denna utgångsföredragna riktning bestämdes för 16 T4-neuroner genom att spåra deras axoner in i lobulaplattan och identifiera deras arboriseringsskikt 11, 27 (fig. 4b, e).

För att jämföra preferensen för T4-utgång med rörelsesaxeln som härrör från dess ingångar, konstruerade vi ingångsrörelsesaxeln genom att analysera antalet kontakter från enskilda Mi1- och Tm3-celler på T4-neuronet i fråga. Vi fann att varje T4 mottar ingångar från flera Mi1- och Tm3-nervceller vilket antyder att, till skillnad från kretsarna i fig. La och b, tillhandahåller flera punkter i synfältet ingångar till varje arm i rörelsedetektorn (fig. 4a, b, e) . Denna observation stöds av strukturen för samplingsenheter som härleds från inspelningar i blowfly H1 (ref. 36), som tar emot ingångar från LPTCs 37 . Vi behövde därför karakterisera ingångarna till varje T4 som Mi1- och Tm3-medierade mottagande fältkomponenter, mappade i det visuella fältet. För att göra detta spårade vi synaptiska anslutningar från L1-terminaler i 19 kolumner (referenskolonnen och omgivande 18 kolumner) till de nedströms Mi1- och Tm3-cellerna och sedan från Mi1- och Tm3-nervcellerna till T4-celler som får inmatning från referenskolonnen (som händer också nummer 19). De resulterande mottagande fälten (fig. 4a och kompletterande fig. 4) visar T4-ingångarna som är mappade som om på L1-matrisen och därmed in i det visuella fältet.

För alla T4-celler överlappar de Mil- och Tm3-medierade komponenterna i T4-mottagningsfältet väsentligen med varandra (kompletterande figur 4). Faktum är att de två komponenternas masscentrum förskjuts mindre än ett avstånd mellan ommatidiala (fig. 5a). Emellertid för 15 av T4-cellerna är denna förskjutning fortfarande betydligt större ( P <0, 05) än vad som skulle ha erhållits av en slump från spårningsfel. En sådan liten förskjutningsstorlek i förhållande till de mottagande fältenas bredder överensstämmer med tidigare bevis som härleddes från H1-inspelningar av blåsflyg och har teoretiskt motiverats 36 .

Image

a, förskjutningsvektorer för varje T4-neuron ( n = 19). Neuroner med betydande förskjutning (namn med fetstil) har 95% konfidensintervall (ellipser) som utesluter ursprunget (Metoder). Vektorerna är i den ommatidiella referensramen (inom ∼ 30 ° från de visuella axlarna). b, Top, medelförskjutning, beräknad från a, i genomsnitt över cellerna med samma föredragna riktning för deras utgång. I botten korrelerar vinkelskillnaden mellan den rumsliga förskjutningen för enskilda T4-neuroner och den föredragna riktningen för dess utgång (för lobulaplattlager 1-3 (LP1–3)) med fraktionen av saknade L1-ingångar (metoder). T4-celler med> 15% av saknade L1-ingångar utelämnades från medelförskjutningarna (överst). Skala staplar, 0, 5 ( a ) och 0, 2 ( b ) av avståndet från centrum till centrum mellan intilliggande fasetter.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Är förskjutningsriktningen mellan Tm3- och Mi1-mottagningsfältkomponenterna för en T4-neuron i överensstämmelse med riktningsförmågan hos neuronet, som definieras av djupet i dess terminala axonala arborisering i lobulaplattan? Antagande att förskjutningsriktningen bestäms från Tm3 till Mi1-komponentens masscentrum, visar Fig. 5b (överst) att förskjutningsriktningen överensstämmer med riktningens preferens för tre av de fyra lobulaplattskikten. Avvikelsen i förskjutningsriktningen och företrädesvis fram-till-rygg-rörelsepreferensen för T4-celler som avslutas i det fjärde skiktet (lobulaplatta senare 4, LP4) kan orsakas av försummade kretsar som specifikt bidrar till svaren från dessa T4-neuroner. Till exempel beteende beteende implicerar C3-nervceller i rörelsedetektering 33 framifrån och bakifrån, och faktiskt, preliminära spårningsresultat indikerar att trots C3-celler som ger en ordningsstorlek färre insatser till T4-celler än Mi1- eller Tm3-celler riktar C3-neuroner sig LP4 T4-celler företrädesvis.

En del av skillnaden mellan mottagningsfältförskjutningen och riktningsförmågan hos enskilda T4-celler (fig. 5a) innerverande lobulaplattlager 1-3 orsakas förmodligen av ett systematiskt fel i vår rekonstruktion som är resultatet av den ändliga storleken på det rekonstruerade området. Faktum är att skillnaden mellan den uppmätta ingångsförskjutningen för en given T4 och dess förutsagda riktningspreferens korrelerar med den viktade fraktionen av saknade L1-ingångar på Tm3-celler uppströms om den T4 (fig. 5b, botten), vilket stödjer uppfattningen att fälten i perifera T4-celler kan inte rekonstrueras helt. Dessutom kan en del av den återstående variationen i offsetorienteringen också vara verklig, med tanke på den observerade halvbredden på 60–90 ° av avstämningskurvorna erhållna genom kalciumavbildning av enskilda T4-undertyper 35 .

Vårt val att mäta förskjutning från Tm3 till Mi1 (och inte i omvänd ordning) verkar godtyckligt utan att inkludera information om förseningar och synaptisk polaritet (Fig. 1a, b). För att uppskatta en eventuell ledningsfördröjning, mätte vi både banlängden och kaliberet för de huvudsakliga axonstammarna som leder signaler längs Mi1- och Tm3-cellerna från L1-synapser till T4-synapser och fann att de var lika, inom 10% av varandra. Vidare, med användning av ett antal elektroniska parametrar uppmätta i andra fluganeroner 38, var motsvarande kabelförseningar fortfarande endast i storleksordningen ett millisekund, en storleksordning mindre än den som krävs för rörelsedetektering 29 . Även om vissa neurotransmittorer har identifierats för de involverade celltyperna, känner vi inte till deras associerade receptorer och därmed den resulterande synaptiska polariteten.

I avsaknad av bevis för både relativ fördröjning och synapspolaritet är vi fria att välja mätriktningen från Tm3 till Mi1, vilket leder till rumsliga förskjutningar som överensstämmer med riktningsförmånen förutsagt av djupet på T4-terminalen i lobulaplattan. Antagande att Mi1- och Tm3-ingångarna till T4 kombineras med samma skylt, som i Hassenstein – Reichardt elementär rörelsesdetektor (EMD) -modell 4 (fig. 1a), förutspår vi att Tm3-armen i rörelsesdetektorn bör införa en längre fördröjning än Mi1-armen. Om dock ingångarna kombinerades med motsatta tecken, som i den Barlow – Levick-liknande EMD-modellen 6 (fig. 1b), skulle vår förutsägelse vara motsatt. Beträffande fördröjningsmekanismen, med att ha de två armarna i kretsen implementerade av olika celltyper möjliggör möjligheten att fördröjningen kan implementeras biologiskt med metabotropa receptorer, såsom rapporterats i ryggrads näthinnan 39 .

Genom att utforska de rekonstruerade T4-cellerna identifierade vi ett hittills okänt kännetecken för deras medulla dendritiska arbors (se emellertid T4a, d i Fig. 14 i ref. 20, och NJ Strausfeld, personlig kommunikation): de dendritiska grenarna i varje T4-neuron är orienterade främst i en riktning (fig. 6a och metoder). Dessutom kluster orienteringen för varje T4, mätt från dendritspetsarna till deras baser, runt en av fyra riktningar (fig. 6b). Dessa fyra riktningar, när de mappas från medulla-koordinatramen på synfältet (fig. 6c), anpassar sig till utgångsriktningens preferens för varje lobula-plattskikt (fig. 6b). Denna observation tillät oss att korsvalidera klassificeringen av var och en av de 16 T4-cellerna till subtyper av riktningspreferenser (fig. 6a, b och kompletterande fig. 5). Vi använde sedan denna observation för att dra slutsatsen om riktning för de återstående tre T4-cellerna, för vilka spårning i lobulaplattan inte kunde slutföras (fig. 6c).

Image

a, Fyra representativa medulla dendritiska arbors av T4-celler. Färgerna representerar lokal dendritisk grenorientering. Färgkarta konstruerades genom att tilldela färger från varje lobulaplattskikt (fig. 4e) till den genomsnittliga dominerande grenorienteringen över alla neuroner i varje lager (pilar inom färgkarta) och jämnt interpolera. b, Djupet hos axonal båg av en T4-neuron i lobulaplattan korrelerar med dominerande dendritisk grenorientering i medulla (Metoder). I djupaxeln är fyra lager märkta och nervcellerna i varje lager färgas som i fig. 4e. De dominerande orienteringarna för neuroner med axoner som inte spåras till lobulaplattan ritas på x- axeln (1: T4-5, 2: T4-4, 3: T4-14), och de färgas med klusterens färg till som de troligtvis tillhör (tilläggsfigur 5). c, omvandla den dominerande dendritiska orienteringen (± sem) från det utrymme som definieras av arrayen av medulla kolumner (i lager M10) till riktningarna i det visuella utrymmet. Skala bar, 5 μm.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Diskussion

Denna rapport har introducerat en ny högeffektiv, halvautomatisk pipeline för rekonstruktion av elektronmikroskopi och använt den för att rekonstruera en connectome-modul omfattande inom medulla, en neuropil som länge har motstått sådana försök. Vidare, med connectomics, identifierade vi Mi1 och Tm3-ingångar till T4-neuroner som de två armarna i en kandidatkorrelationsbaserad rörelsesdetektor. Även om anatomi ensam inte tillåter oss att undersöka den olinjära operationen eller tidsfördröjningen, och därmed skilja mellan olika korrelationsbaserade modeller 5, 6, 40, kunde vi förutsäga vilken celltyp som skulle införa en längre fördröjning, med tanke på deras synaptiska polariteter (Fig. La, b).

Analogt med vår föreslagna krets nedströms om L1, anslutningarna i vår elektronmikroskopi rekonstruktion tillåter oss att föreslå kandidat celltyper - Tm1, Tm2 och Tm4 - som kan utgöra rörelsedetekteringskretsen nedströms L2. Bekräftelse av detta förslag måste naturligtvis vänta på tät rekonstruktion av anslutningarna till T5-neuroner i lobula.

Denna rapport har flera intressanta paralleller med resultat från ryggradsdjur. Först påminner förekomsten av de fyra subtyperna av T4-celler som svarar på de fyra kardinalrörelserna på de fyra subtyperna av ON-OFF riktningsselektiva ganglionceller (DSGC) i kaninhinnan 41 . För det andra påminner vår upptäckt att riktningselektivitet för T4-celler är i linje med deras dendritiska orientering som påminner om JAM-B-ganglionceller 42 och starburst amacrine celler (SAC) 43 i musens näthinna. Till skillnad från JAM-B- och SAC-celler är den föredragna riktningen för T4-celler emellertid borta från spetsen av dendritterna och till skillnad från SAC-celler men som JAM-B-celler, alla dendriter i en T4-punkt i samma riktning. För det tredje demonstrerades de högspecifika anslutningarna mellan SAC: er och DSGC: er som ansvarade för den sistnämnda riktningens selektivitet också tidigare med användning av storskaliga connectomics 44 . Till skillnad från SAC-till-DSGC-kretsen kan kretsen vi rapporterar dock beräkna riktningsselektiva svar från icke-riktningsingångar.

Vår identifiering av kandidatrörelsedetekteringsvägen nedströms om L1 hjälptes till stor del av omfattningen av vår elektronmikroskopi-rekonstruktion. I förhållande till anslutningar uppskattade av arbor överlappar 26, med de exakta synaptiska räkningarna gör det möjligt för oss att entydigt upprätta anslutningar (kompletterande figur 6). På detta sätt identifierade vi Tm3 som en primär komponent i rörelsedetekteringskretsen, ett faktum som undkom tidigare forskare på grund av dess minimala arborisering i M10. I förhållande till glesa rekonstruktioner i andra system, till exempel synaptiska förbindelser mellan SAC: er och DSGC: er 44, möjliggör omfattningen att argumentera både frånvaron av alternativa vägar och den numeriska betydelsen av den föreslagna vägen.

Betydelsen av den täta medulla connectome går också långt utöver den lokala rörelsesdetektorn och gäller för många andra visuella beräkningar. Även om mycket återstår att göra, speciellt för att införliva tangentiella celler och infraperiodiska celler fullt ut, innehåller vår anslutning de kolumnerna neuroner som finns i varje kolumn och tar därför bort ett långvarigt block för att förstå insektsyn. Mer generellt illustrerar våra resultat att, i kombination med en rik samling experimentella och teoretiska resultat, kan connectomes genom att identifiera underliggande kretsar ge nyckelinsikter om neuronal beräkning.

Metoder Sammanfattning

En flues hjärna bereddes för elektronmikroskopi genom frysning / fryssubstitution med högt tryck, följt av inbäddning och sektionering. Sektioner avbildades med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Elektronmikrografer samlades i en tredimensionell bunt korrekt representerande de relativa platserna för de avbildade strukturerna med hjälp av olinjär registrering. Den inriktade bunten med gråskalabilder delades upp av maskininlärningsalgoritmer i deluppsättningar av pixlar, var och en tillhörde bara en enda neuron (se //bitbucket.org/shivnaga/sstem). Denna översegmenterade partition inspekterades manuellt och agglomererades till enskilda neuroner ("korrekturläsning"). Presynaptiska terminaler och postsynaptiska tätheter kommenterades sedan för hand och tilldelades neuroner (kompletterande data 1). Dessa manuella steg krävde ∼ 14 400 timmar (inklusive ∼ 2500 experttimmar). Typerna av rekonstruerad neuron bestämdes genom att matcha deras former till exempel från ljusmikroskopi. Hela connectome kondenserades till en connectome-modul, som delades in i vägar med hjälp av graflayout och klusteralgoritmer. Genom att räkna antalet synaptiska kontakter mellan L1, Mi1, Tm3 och T4-celler beräknade vi den relativa förskjutningen av ingångskomponenterna. Vi korsvaliderade denna förskjutning mot riktningens preferens för T4-celler som hittades genom att spåra deras axoner i lobulaplattan.

Online-metoder

Vävnadsberedning, elektronmikroskopi och avbildning

Den högra delen av hjärnan av en vildfluga av Oregon R-kvinnlig fluga delades i serie i 40-nm skivor. Totalt 1 769 sektioner, som passerar medulla och nedströms neuropiller (fig. 1c), avbildades med en förstoring av × 5 000. Denna process beskrivs i de kompletterande metoderna.

Halvautomatisk rekonstruktionsrörledning

För att få en tät elektronmikroskopi-rekonstruktion av referenskolonnen använde vi en sekvens av automatiserade inriktnings- och segmenteringssteg, följt av manuell korrekturläsning och rekonstruktion, som vi beskrev som den halvautomatiska rekonstruktionsrörledningen 19 .

Bildjustering

Vi hittade först en grov inriktning av hela bildstacken, ignorerar artefakter som veck, tårar och smutsavstängningar, genom att använda TrakEM2 styvregistrering 48 för att anpassa bildblock bestående av 20 sektioner av 9 × 9 mosaiker och sedan justera block med en automatiserad sök över bilder i mitten av varje mosaik. Denna grova anpassning tjänade till att bestämma vilka bilder som var överlappade, vilket möjliggjorde en mer exakt analys av vävnader med artefakter, och i synnerhet stora veck. Pixlar som är mycket mörkare än genomsnittet antogs motsvara veck och användes för att dela upp varje bild i två eller flera anslutna komponenter, kallad patches. För varje par överlappande lappar, både inom en sektion (längs gränsen) och sektion till sektion, hittades korrespondenspunkter genom korrelation (∼ 1 per 500 000 överlappande pixlar). En minst kvadratisk passning av dessa punkter med regularisering för skala och skev användes sedan för att producera en global affinjustering av alla lappar. Undersökning av fel från denna anpassning identifierade bilder för vilka den automatiska uppdelningen i korrigeringar var felaktig och dessa uppdelningar korrigerades manuellt. När väl en tillfredsställande anpassning erhölls förvrängdes varje patch av varje bild något för att ge en bästa matchning till sin granne medan de fortfarande förblev nära den globala affinen. Mer information finns i ref. 49.

Automatisk bildsegmentering

I nästa steg delade vi upp medulla regionen av intresse inom den inriktade bunten med gråskalabilder i delmängder av pixlar som tillhör enskilda neuroner. Med tanke på att upplösningen av transmissionselektronmikroskopi (TEM) datauppsättningen är anisotropisk, utvecklade vi en tvåstegsprocess som omfattar 2D-segmentering för att identifiera tvärsnitt av neuroner följt av koppling av dessa segment i 3D. Ingen enskild algoritm användes på all data, eftersom många olika segmenteringstekniker testades parallellt med korrekturläsningsinsatser, och det var kontraproduktivt att re-segmentera delar som redan korrigerats. Ett typiskt 2D-segmenteringssteg innebar att skapa gränssannolikskartor med användning av morfologiska drag 50, 51, 52 följt av boostad kantinlärning 53, mitokondriadetektion för att reducera falska gränser 54, följt av vattendragsegmentering 55 och agglomerativ gruppering 56 med medelvärden och mediangränsvärden för att 2D-segment. 3D-kopplingssteget konstruerade en länkdiagram över på varandra följande 2D-segment i intilliggande sektioner. Återigen användes flera tekniker, inklusive enkla mätvärden som överlappning och maskininlärningsmetoder som beräknade lämpliga vikter av funktioner från tidigare korrekturlästa data. Mer information om några av våra automatiska segmenteringsmetoder finns i tidigare publikationer 19, 57 . Med tanke på att alla segmenteringsalgoritmer gör misstag till följd av avbildningsartiklar och låg z- upplösning, och eftersom manuell korrigering av översegmenteringar är enklare än undersegmenteringar, ställde vi in ​​våra automatiska algoritmer för att producera en översegmenterad bildvolym. Dessutom bevarade vi vattenskyddsregioner kallade superpixlar för att underlätta manuell korrigering av översegmentering i nästa steg. Vi har släppt den senaste (och vi tror bäst) versionen av segmenteringskoden som vi använde (//bitbucket.org/shivnaga/sstem), men varnar läsaren att även vår bästa automatiska segmentering krävde omfattande manuell korrekturläsning, korrigering och kommentering (se nedan) för att ge de resultat vi rapporterar i denna artikel.

Korrekturläsning och återuppbyggnad

Vi inspekterade nästa resultaten av automatisk segmentering, korrigerade återstående fel och tilldelade synapser till korrekturläsningscellerna. Eftersom detta var tidskrävande utbildade vi en grupp professionella redaktörer, kallad korrekturläsare, vars arbete övervakades av tre erfarna elektronmikroskopister (Sh.T., Sa.T. och PKR) (experter). Korrekturläsare och experter utförde sina uppgifter med hjälp av ett dedikerat anpassat mjukvaruverktyg, Raveler (DJO et al. , Manuskript förberedelse). Totalt tog dessa korrekturläsningssteg ∼ 12 940 timmar (inklusive 900 persontimmar bidragit av våra experter). Det fanns fem viktiga steg inom rekonstruktionsförfarandet: (1) volym korrekturläsning, (2) synapsanteckning, (3) postsynaptisk spårning, (4) förankring av ankarkroppar, och (5) selektiv gles spårning, detaljerad i de kompletterande metoderna.

Tillförlitligheten för kopplingsschemat

Som introducerats ovan tilldelade vi två korrekturläsare till varje synapse för att öka tillförlitligheten för korrekturläsning. Karaktäriserande av detta kunde i 48, 2% av fallen båda korrekturläsarna inte identifiera en överordnad cell antingen för att de inte kunde spåra processen på ett säkert sätt eller eftersom det lämnade medullaregionen av intresse. I 44, 0% av fallen spårade båda korrekturläsarna PSD till samma förankringskropp, och i 7, 5% av fallen kunde en korrekturläsare inte fullfölja spårningen medan den andra spårade PSD till en ankarkropp (nummer extraherade från tilläggstabell 1). Men endast i mycket få fall (0, 23%) nådde de två korrekturläsarna olika ankarkroppar. Dessa siffror antyder att en stor bråkdel av anslutningar kommer att missas, efter den två korrekturläseavtalsprocessen; emellertid har alla anslutningar som identifierats mycket stor sannolikhet för att vara korrekta.

För att ytterligare utvärdera vår återuppbyggnadskvalitet genererade vi två anslutningar från de dubbla korrekturläsningsresultaten - en inkluderande version som inkluderade anslutningar som hittades av endera korrekturläsare och en konsensusversion där anslutningar accepterades endast när båda korrekturläsarna enades om. Att jämföra dessa två kopplingar var generellt lugnande. Även om den inkluderande anslutningen har ∼ 16% fler anslutningar, hade alla ytterligare anslutningar bara en synaptisk kontakt. Alla anslutningar med två eller flera synapser finns i båda anslutningarna (tilläggstabell 1). Vi använde konsensus connectome för alla våra analyser. Slutsatserna förblir emellertid oförändrade när man använder det inkluderande connectome.

Generellt sett var det höga antalet missade synaptiska kontakter i vår korrekturläsning acceptabelt för vårt projekt eftersom vår avsikt var att studera förbindelser med flera, parallella synaptiska kontakter. Vi kan bekräfta att connectome innehåller en stor del av sådana starka förbindelser genom att plotta fördelningen av antalet kontakter mellan anslutna parpar.

Vi hittade en starkt svansad fördelning av det totala antalet kontakter för varje anslutet par både i hela anslutningen (inbyggd i fig. 3b) och inom delmängden av glesspårade celltyper som är involverade i rörelsedetektering (tilläggsfig. 3). Med tanke på att storleken på T-stänger i medulla är relativt likformig (A. McGregor et al. , Opublicerade observationer) och storleken på synaptiska strukturer tros korrelera med deras fysiologiska styrka 58, såg vi antalet parallella synaptiska kontakter mellan två neuroner som en fullmakt av synaptisk vikt. Om vi ​​antar att sannolikheten för att sakna en synaptisk kontakt under korrekturläsning är enhetlig på alla postsynaptiska platser, kan vi dessutom uppskatta att konsensus-anslutningen innehåller alla anslutningar med> 5 synapser med en konfidensnivå> 95% (kompletterande metoder). Därför tror vi att vårt samförstånd är både exakt och omfattande för starka förbindelser.

Konstruera en anslutande modul

Vid konstruktion av en upprepande modul inom medulla connectome identifierades alla medlemmar i varje klass av neuroner i referenskolonnen, och antalet synapser från dessa neuroner till alla andra neuroner i den postsynaptiska klassen var medelvärde över de presynaptiska cellerna. För de ultraperiodiska celltyperna, till exempel Tm3, kan detta resultera i en fraktionerad vikt. Eftersom det i genomsnitt finns 1, 5 Tm3-celler per kolumn beräknar vi den synaptiska vikten genom att multiplicera den med 1, 5. Dessa fraktionsvikter ger medelanslutningsstyrkan över olika kolumner, eftersom vissa kolumner bara har en enda Tm3, medan andra har två.

Den riktade sammanfattningen som användes här valdes eftersom vi i vår återuppbyggnad försökte korrekturläsa varje postsynaptiskt element till dess associerade neuron. Vi försökte emellertid inte korrekturläsa alla presynaptiska platser tillbaka till sin moderneuron (eftersom vissa sådana element kan komma från icke-referens kolumner, som inte var tät rekonstruerade).

Denna metod modifierades för de fyra anslutningarna i rörelsedetekteringskretsen: L1 till Mi1, L1 till Tm3, Mi1 till T4 och Tm3 till T4. I dessa fall ersattes antalet synaptiska kontakter från den tätt rekonstruerade medulla connectome med antalet synaptiska kontakter som identifierats under gles spårning av dessa specifika anslutningar (tilläggstabell 3).

Beräkna Mi1- och Tm3-mottagningsfältkomponenterna

Vi beräknade Mi1- och Tm3-komponenterna i det mottagande fältet för varje T4 genom att multiplicera antalet synaptiska kontakter från varje L1-neuron till en enda mellanliggande Mi1- eller Tm3-neuron med antalet kontakter från den mellanliggande cellen till T4 och sedan summera över alla Mi1- och Tm3-neuronerna som mottar inmatning från samma L1 (Fig. 4e). Denna multiplikation är ekvivalent med att räkna antalet oberoende synaptiska rutter från varje L1 till varje T4, i vilken varje rutt måste använda ett annat par av de synaptiska kontakterna mellan L1 och mellanliggande målceller, och mellanmålen och T4.

Monte Carlo feluppskattning

Vår korrekturläsningsmetodik resulterar i mycket få falska positiva fel, men många falska negativa fel mellan neuronpar (se tidigare). Därför är det mycket troligt att det observerade antalet synaptiska kontakter ( m ) är en delmängd av ett högre, sant antal synaptiska kontakter mellan två neuroner ( n ). Antagande att för varje anslutet par neuroner hade varje synaptisk kontakt en lika falsk negativ sannolikhet, och med användning av denna sannolikhet i en binomial fördelning, var vårt mål att uppskatta den bakre sannolikheten, P ( n | m ) (det vill säga sannolikheten för det sanna n med tanke på det observerade m ), för olika värden på n . För att göra detta, eftersom den tidigare distributionen över n är okänd, ungefärliga denna bakre sannolikhet med sannolikheten, P ( m | n ) (det vill säga sannolikheten för att observera m givet något värde av det sanna n ), för olika värden på n . Vi genererade 1 000 olika uppskattningar av den verkliga anslutningsvikten, för varje anslutet neuronpar, genom sampling från uppsättningen av möjliga n- värden med den beräknade sannolikheten som ges varje värde på n . Neuronpar som kopplades bort på grund av höga falska negativa felfrekvenser fick också ansluta om deras neuritprofiler överlappade i 3D. Antalet kontakter uppskattades med samma provtagningsmetod som tidigare (men med m lika med noll). På detta sätt genererade vi 1 000 olika anslutningsmatriser. Förskjutningen beräknades sedan för varje matris. Egenvärdena och egenvektorerna för kovariansmatrisen över alla förskjutningsvektorer beräknades och användes för att plotta en ellips längs egenvektoraxlarna med 2 ß konfidensintervall (Fig. 5a). För att utvidga denna konstruktion till den genomsnittliga förskjutningen över en grupp av nervceller, beräknades 1 000 variationer av medelvärdet genom att först provtagas från de förskjutningar som genererades för varje neuron och sedan beräkna medelvärdet för varje uppsättning av prover. Ellipserna beräknades sedan, på samma sätt som tidigare, över denna uppsättning av 1 000 medelvärden (fig. 5b, överst).

Effekt av begränsad rekonstruktionsstorlek

Eftersom spridningen av de dendritiska arborerna av Tm3-cellerna som är anslutna till en given T4 är större än för Mi1-cellerna, är Tm3-celler mer sannolikt att delvis rekonstrueras, och följaktligen saknas L1-ingångar nära kanterna på vår 19 kolonnrekonstruktion . För att ge ett mått på effekten av denna avskärning på varje T4, inspekterade vi först visuellt varje Tm3-neuron och klassificerade det i en av fyra klasser, beroende på procentandelen av bågen som saknades i rekonstruktionen av 19 kolumner. Tm3-celler som rekonstruerades helt mottog input från i genomsnitt sex L1-neuroner. Däremot fick Tm3-celler i den fjärde klassen, som hade de flesta av sina trädgårdar utanför vår intressanta region, input från i genomsnitt endast två L1-neuroner. Genom att summera den fraktion av L1-ingångar som saknas, viktad med fraktionen av ingångar som tillhandahålls av varje Tm3-klass till den givna T4, erhöll vi en uppskattning av den viktade fraktionen av L1-ingångar som saknas (genom Tm3-kanalen) för varje T4 ( x axel i fig. 5b, nedre). Vi använde också denna metrisk för att motivera borttagandet av T4-celler som saknas> 15% av deras viktade L1-ingångar (genom Tm3-kanalen), för att konstruera medelreaktionerna för T4-celler med samma utgångsriktningspreferenser (Fig. 5b, överst).

Dendritorientering

Efter korrekturläsning skelettades T4-arboriseringarna inom M10, med början från mitten av den tjockaste gren, och anpassade ref-metoden. 59 med en modifierad viktningsfunktion. Den axonala grenpunkten bestämdes av Sh.T. för att identifiera den dendritiska delen av medulla arborization exakt. Den lokala orienteringen kring varje dendritisk nod beräknades (med användning av tre noder i båda riktningarna runt varje nod, och ignorerar alla noder med färre än tre angränsande noder i båda riktningarna). Den dominerande dendritiska grenorienteringen, för varje T4 (fig. 6b), beräknades genom att ta den snabba Fourier-transformen (MATLAB och Statistics Toolbox, version R2012b) för fördelningen av orienteringar över noder, och definierades vara fasen för det grundläggande läget del av transformationen. Med antagande av en normalfördelning för den dominerande orienteringen av cellerna tilldelade ett skikt (via deras axonbågdjup), beräknade vi sannolikheten för varje ospårad T4 som ligger inom varje grupp av celler, med tanke på dess uppmätta dominanta orientering. Tilldelningen av cell T4-4 till skikt 1 var signifikant ( P <0, 05), men tilldelningen av de andra två cellerna var inte. Färgkarta för de dendritiska arborerna (fig. 6a och kompletterande fig. 5) valdes genom att centrera färger på medelvärdet av den dendritiska grenorienteringen för varje kluster (fig. 6b) och variera färgen kontinuerligt mellan kluster.

Datatillgång

Vid publicering kommer skelett av alla celler att laddas upp till //neuromorpho.org. Vi kommer att vara värd för en webbplats (//openwiki.janelia.org/wiki/display/flyem/Medulla+TEM+Rekonstruktion) som gör det möjligt för tittaren att söka i konsensus-connectome för anslutna neuronpar. Vi kommer också att förse hela segmenteringen med synapsanteckningar, tillsammans med Raveler för att öppna datauppsättningen, på begäran. Den begärande parten måste leverera en hårddisk.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Den här filen innehåller kompletterande figurer 1-6, kompletterande metoder, kompletterande tabeller 1-3, en fullständig legend som följer med den kompletterande datafilen, den fullständiga videolegenden och kompletterande referenser.

  2. 2.

    Kompletterande figur

    Denna fil innehåller den fullständiga versionen av Kompletterande figur 1 (se Kompletterande informationsfil s.1 för fullständig legend).

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

    Denna fil innehåller den fullständiga versionen av tilläggstabell 1 (se kompletterande informationsfil s.16 för legend).

Zip-filer

  1. 1.

    Kompletterande data

    Denna zip-fil innehåller kompletterande data 1 - se kompletterande informationsfil s.23 för legend).

videoklipp

  1. 1.

    Neuronrekonstruktioner

    Den här videon visar EM-bildstacken för medullaområdet av intresse (Fig. 1c). Bilder från bunten tas successivt bort (riktas mot de djupare skikten), och rekonstruktioner av 379 neuroner läggs till i följd i slumpvis utvalda färger. Neuronerna grupperas i sex klasser, med text som beskriver klassen som läggs till samtidigt med neuronerna från varje klass: (1) Fotoreceptorterminaler, från näthinnan och neuroner från lamina som innerverar referenskolonnen i medulla. (2) Neuroner som får direkt inmatning från näthinnan och lamina neuroner. (3) Neuroner som får direkt inmatning från nervcellerna i klass (2). (4) Neuroner som arboriserar i referenskolonnen, men sprids över flera kolumner. (5) Tangentiella neuroner, av vilka ofta bara ett fragment som passerar genom intressant region har rekonstruerats. (6) Ytterligare neuroner, ofta av samma klass som neuroner i klasserna (1) - (5), men från intilliggande kolumner.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.