Valosininnehållande protein reglerar den proteasomförmedlade nedbrytningen av dna-pkcs i gliomceller | celldöd och sjukdom

Valosininnehållande protein reglerar den proteasomförmedlade nedbrytningen av dna-pkcs i gliomceller | celldöd och sjukdom

Anonim

ämnen

  • Terapeutisk resistens mot cancer
  • CNS-cancer
  • strålbehandling
  • Ubiquitylation

Abstrakt

DNA-beroende proteinkinas (DNA-PK) har en viktig roll i reparationen av DNA-skada och reglerar strålningskänsligheten för glioblastomceller. Det VCP (valosininnehållande proteinet), ett chaperonprotein som reglerar ubiquitinberoende proteinnedbrytning, fosforyleras av DNA-PK och rekryteras till DNA-dubbelsträngsbrytningsställen för att reglera reparation av DNA-skador. Det är emellertid inte klart om VCP är involverat i nedbrytning av DNA-PKcs (DNA-PK-katalytisk underenhet) eller om det reglerar strålningskänsligheten hos glioblastom. Våra data visade att DNA-PKcs var ubikvitinerad och bunden till VCP. VCP-knockdown resulterade i ackumulering av DNA-PKcs-proteinet i glioblastomceller, och proteasominhibitorn MG132 synergiserade denna ökning. Som förväntat främjade denna ökning effektiviteten av DNA-reparation i flera glioblastomcellinjer; i sin tur minskade denna förbättrade aktivitet strålningskänsligheten och förlängde överlevnadsfraktionen av glioblastomceller in vitro . Dessutom reducerade VCP-nedslagningen i glioblastomceller överlevnadstiden för de xenograftade mössen med strålningsbehandling relativt de xenograftade glioblastom-mössen med kontroll. Dessutom nedreglerades VCP-proteinet också i ∼ 25% av GBM-vävnader från patienter (WHO, grad IV-astrocytom), och VCP-proteinnivån korrelerades med patientens överlevnad (R2 = 0, 5222, P <0, 05). Dessa fynd visade att VCP reglerar nedbrytning av DNA-PKcs och ökar GBM-cellers känslighet för strålning.

Huvudsaklig

Valosininnehållande protein (VCP) är medlem i AAA-klassen av ATPaser och förknippat med olika cellulära aktiviteter. 1, 2 VCP är ett rikligt protein i cytosol och kärnan, 3, 4 och finns fysiologiskt som en homohexamer. De flesta, om inte alla, hexamerer tillverkar ytterligare komplex med andra adapterproteiner, såsom p47 eller Ufd1 – Npl4, 5, 6 och eskorterar ubiquitin-proteinkonjugat till proteasomen genom protein-protein-interaktioner för att förhindra bildandet av en överdriven multiubiquitinkedja storlekar. 2 Dessutom visar nya data att VCP även reglerar ubiquitering av protein genom att aktivera ett deubiquitinerande enzym, Ataxin-3. 7 Det antas att VCP riktas till relevanta cellulära processer genom differentiell bindning till specifika adapterproteiner. 8 Varje VCP-protomer består av fyra regioner: N-terminalen, två ATPas (D1 och D2) och C-terminalregionerna. 1, 9 Den N-terminala regionen har bindningsaktiviteter till adapterproteinerna såväl som ubiquitinerade proteiner. 1 VCP har föreslagits att utföra många fysiologiska cellfunktioner, såsom proteinnedbrytningen medierad av ubiquitin-proteasomsystemet. 5, 10, 11, 12, 13, 14

Intressant nog har VCP också rapporterats rekryteras till DNA-dubbelsträngsbrott (DSB: er) genom att interagera med BRCA1, p53 och RAD51, och det kan reglera reparation av DNA-skador. 4, 15, 16 En ny studie har visat att VCP är ett nytt substrat av DNA-beroende proteinkinas (DNA-PK) och andra PIKK-familjemedlemmar. 17 Som svar på DNA-skada fosforyleras VCP vid Ser 784 inom dess COOH-terminal, ett område som visas att rikta VCP till specifika intracellulära fack; VCP ackumuleras sedan på platserna för DSB med ubiquitin ligas RNF8, ubiquitin adapter UFD1 – NPL4 och Lys-48-länkade ubiquitin (K48-Ub) kedjor. 16 Den DNA-skada-inducerade fosforyleringen av VCP och dess rekrytering till DSB: s platser antyder en roll för VCP i DNA-reparation.

DNA-PK är ett DNA-aktiverat serin / treoninproteinkinas konserverat i ryggradsdjur. 18 DNA-PK består av en katalytisk underenhet (DNA-PKcs) och en Ku-heterodimer, 19 och den uttrycks allmänt i nästan alla däggdjursceller. Många studier har visat att DNA-PK har väsentliga roller i reparationen av DSB: er, särskilt vid icke-homolog slutförening (NHEJ). Dessutom har DNA-PK inte bara en kritisk roll i reparationsvägen för DNA-skador, utan den är också involverad i andra viktiga fysiologiska eller patologiska processer, 20 såsom strålningskänslighet, inflammatoriska svar och metabolisk genuttryck. 21, 22, 23 Det är emellertid fortfarande okänt hur nedbrytning av DNA-PK-proteiner regleras och om VCP påverkar strålningskänsligheten.

I denna studie undersökte vi sambandet mellan VCP och DNA-PKcs och effekten av regleringen av VCP på radiosensitiviteten hos glioblastomceller. Våra data visade att DNA-PKcs var ubikvitinerad och bunden till VCP; VCP-nedslagningen resulterade i ackumulering av DNA-PKcs-protein i glioblastomceller och ökad DNA-PK-aktivitet, vilket så småningom ökade överlevnadsfraktionen av GBM-celler efter IR och förkortade överlevnadstiden för ortotopiska xenograftade möss.

Resultat

VCP är associerat med DNA-PK och D1-domänen i VCP är väsentlig för denna bindning

Enligt bioinformatisk analys innehåller DNA-PKcs-proteinet ett VCP-interagerande motiv (VIM), som bevaras i däggdjur såsom människor, apor, kor och vargar (figur 1a). För att bestämma om VCP är associerat med DNA-PK utfördes samimmunutfällning (co-IP) med användning av DNA-PKcs antikropp i flera glioblastomcellinjer; M059J-cellen är DNA-PKcs-brist och användes som en negativ kontroll. Western blots efter co-IP visade att VCP dras ned med DNA-PKcs (figur Ib); dessutom, i överensstämmelse med vår tidigare studie, 24 ju mer känslig cellen är, desto mer VCP förknippas med DNA-PK, vilket indikerar att VCP kan vara relaterat till strålningsresistens. Strålningen i sig påverkar emellertid inte signifikant bindningen av VCP med DNA-PKcs (data visar inte).

VCP var associerat med DNA-PK. ( a ) VIM och proteinsekvensinriktningen mellan människor, apor, kor och vargar. ( b ) VCP drogs ned genom DNA-PKcs IP i olika GBM-cellinjer (WL: helcellslisater). DNA-PKcs-bristfälliga M059J-celler betraktades som negativa kontroller. ( c ) Den schematiska ritningen av det trunkerade VCP-proteinet. Alla trunkerade taggades med flaggepitopen (FL: i full längd). ( d ) Plasmiderna som uttrycker olika domäner av VCP transfekterades separat till 293T-celler (con: tom vektor), och flaggimmunutfällning utfördes. Både DNA-PKcs och flagga detekterades i helcellslysat (bottenpaneler, visade som WL) eller flagg-IP: er (toppaneler)

Bild i full storlek

För att ytterligare bestämma vilken domän av VCP som är väsentlig för denna bindning transfekterades plasmiderna innehållande olika VCP-domäner separat till 293T-celler. Inklusive en tom vektor, sju plasmider, som beskrivs i den schematiska ritningen i figur 1c, tillhandahöll generöst av Dr. Ueffing. 25 Två dagar efter transfektion utsattes hela lysat från 293T-celler för Western blot-analys och 1 mg totalt protein användes för IP mot flaggantikroppen. Västra blott efter IP visade att fullängd, den isolerade N-domänen och den isolerade D1-domänen, men inte D2-domänen, kan direkt binda till DNA-PK, och endast ND1-domänen i fusionsproteinerna kan binda med DNA-PK . ND2-fusionsproteinerna har ingen detekterbar bindning med DNA-PK, och D1D2-fusionsproteinet försvagar också bindningsaffiniteten för D1-domänen till DNA-PK. Dessa observationer antyder att D2-domänen har ett negativt inflytande på bindningen av DNA-PK med VCP, vilket kan förmedlas av flera mekanismer, inklusive ömsesidigt exklusiva bindnings- eller konformationella förändringar.

Dessutom var det fullängds VCP-immunutfällt DNA-PKcs-proteinet mindre än det immunutfällt av den isolerade N-domänen eller D1-domänen; dessutom minskade det totala DNA-PKcs-proteinet i de fullständiga VCP-transfekterade 293T-cellerna också. Dessa observationer antyder att den reducerade signalen troligen resulterade från det minskade totala DNA-PKcs-proteinet och att överuttrycket av VCP kan ha orsakat nedbrytningen av DNA-PKcs. Western blot för helcellslysat visade att alla trunkeringar innehållande VCP-domäner var lika överuttryckta (bottenpanelen i figur 1d).

DNA-PKcs-nedbrytning är ubiquitin-proteasomberoende och regleras av VCP

För att bestämma om DNA-PK-proteinnedbrytning är beroende av proteasomer och om VCP reglerar DNA-PK-nedbrytning slogs VCP ned av lentivirusmedierat shRNA (detta shRNA verifierades av den andra gruppen 26 ) i U251-celler eller U87-celler. Western blots visade att DNA-PKcs uppreglerades i VCP-knockdown-celler, medan överuttrycket av VCP reducerade mängden DNA-PKcs (figur 2a), vilket indikerar att VCP reglerar DNA-PKcs-proteinnivån. Beträffande VCP: s funktion kan VCP påverka nedbrytningen av DNA-PKcs. För att utesluta möjligheten att VCP reglerar transkriptionen av DNA-PKcs utfördes kvantitativ PCR (q-PCR) för att bedöma nivån av DNA-PKcs mRNA. Nivån av DNA-Pkcs-mRNA detekterades i VCP-knockdown-celler, kontrollceller och förälderceller (figur 2b). Som väntat fanns det ingen signifikant skillnad i DNA-PKcs-mRNA-nivåer bland VCP-knockdown U87, kontroll U87 eller föräldrar U87-celler, vilket antyder att VCP kan reglera DNA-PKcs-nedbrytning istället för att modulera dess transkription.

VCP reglerade DNA-PKcs-nedbrytning och denna nedbrytning var ubiquitin-proteasomberoende. ( a ) U251- eller U87-celler infekterades med VCP-shRNA-lentivira eller VCP-expressionslentivirus. Immunoblots utfördes mot helcellslysat (Par: moder U251-celler; Consi: icke-specifikt RNA; VCPsi: VCP-specifikt siRNA). ( b ) PCR i realtid utfördes med användning av DNA-PKcs-specifik primer i U251-celler infekterade med olika lentivirus (Par: moder U251-celler); DNA-PKcs-mRNA-nivåer är relativt GAPDH. ( c ) Topppanelen: DNA-PKcs immunutfälldes, och både DNA-PKcs och ubiquitin detekterades på samma membran (WL: helcellslysat). Bottenpanel: DNA-PKcs detekterades i moder U251-celler behandlade med MG132 (125 nM) för den indikerade dosen. ( d ) Föräldrar U251-celler eller U251-celler infekterade med olika lentivirus behandlades med proteasominhibitorn MG132 (50 μM ), och DNA-PKcs-proteinet detekterades vid de angivna tidpunkterna. ( e ) Föräldrar U251-celler eller celler infekterade med olika lentivirus behandlades med lysosominhibitorn kloroform vid de angivna koncentrationerna, och DNA-PKcs-proteinet detekterades 12 timmar efter behandling

Bild i full storlek

Eftersom den VCP-medierade proteinnedbrytningen är ubiquitin-proteasomberoende, för att bestämma om DNA-PKcs är ubikvitinerad, renades DNA-PKcs via IP och följdes av ubiquitin-detektion. Western blot visade att ubiquitinsignalen endast visade sig i DNA-PKcs-kompetenta U251-celler vid storleken av DNA-PKcs, men inte i DNA-PKcs-bristfälliga M059J-celler eller icke-specifika IgG-spår, vilket indikerar att DNA-PKcs ubikvitinerades (figur 2c). För att ytterligare identifiera om nedbrytning av DNA-PKcs är beroende av proteasomsystemet behandlades U251-celler med proteasominhibitorn MG132 (125 nM) och skördades vid de angivna tidpunkterna (0, 12, 24, 48, 72 timmar) baserat på halveringstiden för DNA-PKcs-proteinet.

Western blot-data visade att DNA-PKcs-proteinnivån ökades signifikant 24 timmar efter MG132-behandling; ju längre behandlingen varade, desto mer samlades DNA-PKcs (figur 2c), vilket indikerar att nedbrytningen av DNA-PKcs var beroende av det ubiquitin-proteasome systemet, även om de typiska smutsiga banden inte sågs, kanske på grund av det höga molekylvikt av DNA-PKcs (460 KD). För att bestämma om VCP-knockdown har synergistiska effekter på DNA-PKcs-ansamling med proteasominhibering behandlades kontrollen och VCP-knockdown U251-cellerna med MG132 under den angivna tiden (0, 3, 6, 12 timmar). Immunblotterna visade att DNA-PKcs ökade dramatiskt i VCP-knockdown U251-celler 3 timmar efter MG132-behandling (figur 2d). För att utesluta möjligheten att denna ökning var beroende av lysosomer, behandlades VCP-nedtänkta U251-celler dessutom med lysosominhibitorn klorookin i den angivna koncentrationen. Western blot visade att klorokin inte hade några effekter på DNA-PKcs ansamling, till och med 6 timmar efter behandling; däremot minskade klorokin proteinnivåerna för både DNA-PKcs och VCP (figur 2e). I korthet visade våra data att DNA-PKcs var ubikvitinerade och att VCP reglerade DNA-PKcs-nedbrytning genom ubiquitin-proteasome systemet.

Knockdown av VCP förbättrar DNA-PK-aktiviteten och ökar effektiviteten för reparation av DNA-skador

För att bestämma om VCP reglerar DNA-PK-aktivitet såväl som DNA-PKcs-proteinnivåer, utvärderades den endogena DNA-PK-aktiviteten direkt via in vitro -kinasanalys och mättes indirekt genom fosforylering av endogen RPA32 (32-kDa-subenheten för replikation protein A). Även om RPA32 differentiellt fosforyleras av tre PI3K: er (ataxia telangiectasia-muterat protein, ATM, ATM-Rad3-relaterat protein och DNA-PK) som svar på olika DNA-skadliga medel, är DNA-PK det primära kinaset som är ansvarigt för kamptotecin (CPT) -inducerad RPA32-fosforylering; 27, 28, 29, 24 är således CPT-inducerad RPA32-fosforylering en annan indikator på DNA-PK-aktivitet.

I in vitro -kinasanalysen visade våra data att DNA-PK aktiverades genom joniserande strålning och att VCP-knockdown förstärkte denna aktivering, som var en och en halv gånger mer än den i kontrollcellerna, såsom visas i den första grafiken i figur 3a . Som svar på CPT-behandling observerades Ser 4/8-fosforylering av RPA32 som utseendet på ett band med nedsatt rörlighet relativt moder-RPA32-bandet, och detta skiftade band bekräftades av den fosforyleringsspecifika antikroppen. Denna CPT-inducerad RPA32-fosforylering i föräldrar U251-celler, U251-celler med VCP-knockdown eller kontroll-siRNA (figur 3a) analyserades med densitometri med användning av ImageJ-programvara (NIH, USA). Förhållandet mellan fosforylerad RPA32 (toppanelen) och total RPA32 (två band i den andra panelen), som representerar DNA-PK-aktivitet, beräknades i varje bana. Förhållandet p-RPA32 i VCP-knockdown U251-cellerna var två gånger mer än det i kontroll U251, såsom visas i den sista bilden i figur 3a. Den totala RPA32 ökades i VCP-knockdown-cellerna, men orsaken till detta är okänd.

VCP-knockdown ökade DNA-PK-aktiviteten och främjade effektiviteten för reparation av DNA-skador. ( a ) Föräldrar U87-celler eller celler infekterade med kontroll-lentivirus eller VCP-shRNA-lentivirus behandlades med 5 Gy strålning eller camptothecin (20 μM ). In vitro -kinasanalysen utfördes på celler behandlade med strålning. Celler behandlade med CPT utsattes för immunoblot, och ser 4/8 fosforylering av RPA32 detekterades genom densitometri-analys 2 timmar efter behandlingen (kolonnerna visade medelvärdet ± SD, tre oberoende experiment utfördes). Förhållandet mellan fosfor-RPA32 och totalt RPA32 beräknades, och värdet normaliserades till p -aktindensiteten. ( b ) U87-celler infekterade med kontrolllentivirus eller VCP-shRNA-lentivirus behandlades med 5 Gy strålning; cellerna skördades vid angivna tidpunkter för kometanalys, och 100 celler i varje grupp mättes för värdet av OTM och svanslängd. ( c ) U87-celler med kontrolllentivirus eller VCP-shRNA-lentivirus immunfargades med y- H2AX efter mottagande av 2 Gy-strålning; 100 celler räknades, och grafiken visar det genomsnittliga antalet foci per cell vid de angivna tidpunkterna (röd: y- H2AX; blå: DAPI). (Par: moder U87-celler; Consi: icke-specifikt RNA; VCPsi: VCP-specifikt siRNA)

Bild i full storlek

Dessutom genomfördes COMET-analysen och y- H2AX-detekteringen, som representerar DNA-skadnivån i varje cell, för att bedöma effektiviteten av reparation av DNA-skador. I COMET-analysen bestrålades cellerna med 10 Gy-strålning på is. Behandlade celler skördades och utvanns under den angivna tiden (30, 180, 360 min), och cellerna utsattes för encells elektrofores under neutrala förhållanden. Varje gång mättes 200 celler för varje grupp vid 200 gånger förstoring. Svanslängderna mättes och värdena för olivsvansmoment (OTM) beräknades med användning av CASP-mjukvara baserat på formeln: OTM = svans-DNA% × (medelvärde för svanshuvud). Efter 30 minuter fanns det ingen signifikant skillnad mellan kontroll U251-cellerna och VCP-knockdown-cellerna. Emellertid, efter 3 eller 6 timmars återhämtning, var svanslängderna eller OTM-värdena uppenbarligen längre eller större i kontroll U251-celler jämfört med det i VCP-knockdown U251-celler ( P <0, 05), såsom visas i figur 3b, vilket antyder att VCP-knockdown främjade DNA-reparationseffektivitet.

Vidare räknades också en annan DNA-skademarkör, y- H2AX-foci, i U251-cellerna behandlade med 2 Gy strålning (data med andra doser av strålning visas inte). En timme efter strålning observerades massiva y- H2AX-foci i både U251-kontrollcellerna och VCP-knockdown-cellerna, och nästan varje enskild cell innehöll många foci (röda prickar). Sex timmar efter strålning hade de flesta kontrollceller inga dramatiska förändringar i y- H2AX-färgning medan focierna i hälften av VCP-knockdown-cellerna hade försvunnit ( P <0, 01) (figur 3c). Så småningom hade både kontroll- och VCP-knockdown-celler inga foci detekterbara efter 24 timmars återhämtning. Alla dessa observationer visar att VCP-knockdown förbättrar DNA-PK-aktiviteten och ökar effektiviteten för reparation av DNA-skador.

VCP-knockdown ökar överlevnadsfraktionen av GBM-celler efter strålbehandling och förkortar överlevnaden för ortotopiska xenograftade möss

För att bestämma om VCP reglerar strålningskänsligheten för GBM-celler användes en in vitro klonogen analys och in vivo ortotopmusmodell i denna studie. I den klonogena analysen ympades signaliserade VCP-knockdown U87-celler eller U251-celler i 100 mm skålar (400 celler vardera); cellerna bestrålades vid den angivna dosen och odlades sedan i 2 veckor. Kolonierna innehållande 50 celler eller mer räknades. VCP-knockdown ökade överlevnadsfraktionen i både U251-celler och U87-celler. Efter 2 Gy strålning främjade VCP-knockdown överlevnaden av U251-celler från 29, 3 till 51, 3% ( P <0, 01) och överlevnaden av U87-celler från 34, 9 till 62, 3% ( P <0, 01) (figur 4a). U87-celler var mer resistenta mot strålning än U251-celler, vilket var förenligt med vår tidigare studie. 24 Det fanns inga signifikanta effekter på överlevnad mellan kontroll- och föräldrar U251- eller U87-celler. För att ytterligare bekräfta om VCP-knockdown ökad strålningsresistens är beroende av DNA-PK användes ett par DNA-PKcs-kompetenta (M059K) och brist- (M059J) GBM-celler i denna studie. Våra data visade att VCP-knockdown signifikant förbättrade överlevnaden av DNA-PK-kompetenta M059K-celler, men inte DNA-PK-bristfälliga M059J-celler, vilket visar att VCP-knockdown-producerad strålningsresistens är DNA-PK-beroende.

VCP-knockdown ökade strålningsmotståndet för GBM-celler. ( a ) Exponentiellt växande moder U251-, U87-, M059K-, M059J-celler eller celler infekterade med kontrolllentivirus eller VCP-shRNA-lentivira utsattes separat i 10 cm skålar (400 celler per skål), klonogena analyser utfördes efter strålningsbehandling vid de angivna doserna och överlevnadsfraktionen normaliserades för kontrollceller. ( b ) Kaplan – Meier överlevnadskurva gjordes för ortotopiska GBM-möss i fyra grupper (* P <0, 05); strålningsförbättringen av överlevnadstiden beräknades baserat på formeln: strålningsförbättring av överlevnadstid = den utökade överlevnadstiden / överlevnadstiden utan strålbehandling. ( c ) Den genomsnittliga tumörstorleken och de representativa MR-bilderna i varje grupp och representativa VCP-immunofluorescensbilder (röd) i xenotransplantat glioblastomavsnitt. ( d ) Korrelationsanalys av VCP-proteinnivåer med patientens överlevnad och de representativa VCP-immunohistokemi-bilderna i paraffinsektioner från glioblastompatienter. ( e ) Representativa bilder från varje grupp (Con: para-tumörvävnad)

Bild i full storlek

I den ortotopiska musmodellen injicerades U87-celler infekterade med tomma virus som kontroller och 48 möss injicerades totalt. Nio dagar efter injektionen delades möss som bär tumörer (39 möss) slumpmässigt i två grupper enligt MRI-avbildning, inklusive IR och icke-IR-bestrålning. Varje grupp innehöll kontroll- och knockdown-undergrupper (10 möss i varje undergrupp). 6 Gy av total strålning administrerades tre gånger under en vecka; schemat beskrivs i avsnittet Material och metoder. Överlevnadstiden för varje mus registrerades, och alla överlevnadstider i varje grupp analyserades med Kaplan-Meier-metoden. Våra data visade att strålbehandlingen förlängde mössens överlevnadstid i alla grupper. Med strålbehandling överlevde mössen i VCP-knockdown-gruppen under en kortare tid (38, 4 dagar, medianöverlevnadstid) än mössen i kontrollgrupper, vars överlevnadstid var 53, 8 dagar (figur 4b). Utan strålbehandling var överlevnadstiden i VCP-knockdown-gruppen något kortare än den i kontrollgruppen. Strålförbättringsförhållandet överlevnadstid i VCP-knockdown-gruppen var 2, 69%, mycket lägre än i kontrollgruppen (27, 1%); skillnaden var statistiskt signifikant ( P <0, 001) (figur 4b).

På grundval av MR-bilden av tumörer på den nionde dagen efter intrakraniell injektion skilde tumörstorleken i varje grupp sig, men inte signifikant, vilket framgår av de representativa bilderna i den mellersta grafiken i figur 4c. Som vi förväntat oss var tumörstorlekarna i VCP-knockdown-gruppen vid den 29: e dagen uppenbarligen större än hos samma mus på nionde dagen, som visas i de representativa bilderna i den högra kolumnen i mitten grafik (figur 4c). De genomsnittliga tumörvolymerna i varje grupp beräknades och visas i figur 4c. Tumörstorlekarna krympte mer (28, 9%) i kontrollgruppen än i VCP-knockdown-gruppen (6, 3%) efter strålbehandling. De representativa fluorescensimmunförstärkande bilderna av VCP-proteinnivåer i den xenograftade GBM visas i figur 4c.

För att ytterligare undersöka VCP-uttryck och dess effekter på strålningskänsligheten för GBM, VCP-proteinuttrycket i GBM-sektioner från patienter (astrocytom av grad IV) halvkvantifierades med mjukpapper IA för kvantitativ analys (Leica, Solms, Tyskland) och korrelationen med överlevnad tiden analyserades. Alla digitala bilder normaliserades till negativ kontroll. Poäng mindre än 10% ansågs vara '-'; poängen större än 10% och mindre än 25% ansågs vara '+'; och poäng mer än 25% ansågs vara "++". Data visade att VCP uttrycktes differentiellt i GBM-vävnaden och att VCP-expressionsnivån var positivt korrelerad med patientens överlevnadstid (R2 = 0, 5222, P <0, 05). Patienter som bär höga nivåer av VCP skulle överleva längre med strålbehandling (figur 4d). De representativa bilderna visas i figur 4e. Denna observation var förenlig med våra djuruppgifter.

Diskussion

Vi fann först att DNA-PKcs är ubikvitinerade och bundna till VCP; behandlingen med proteasominhibitor (MG132), men inte lysosominhibitor (klorookin), ökade proteinnivån för DNA-PKcs; VCP-knockdownen hade en synergistisk effekt med MG132-behandlingen på DNA-PKcs-proteinansamling. Som bärare binder VCP sig till polyubikitinerat protein och levererar det till proteasomsystemet för nedbrytning; sålunda ökade antingen proteasominhibering eller VCP-knockdown DNA-PKcs-proteinnivån, och kombinationen av båda synergistiskt ökade DNA-PKcs-proteinnivån. Dessa observationer visade att VCP reglerar DNA-Pkcs-proteinnedbrytning, vilket är ubikitin-proteasomberoende. Intressant nog ökade MG132-behandlingen även nivån av själva VCP-proteinet, vilket antyder att nedbrytningen av VCP också regleras av ubiquitin-proteasome systemet. Dessutom minskade klorokinbehandling oväntat proteinnivån för både DNA-PKcs och VCP i glioblastomceller, vilket indikerar att lysosominhibering kan förbättra proteasomnedbrytning eller endoplasmisk retikulumassocierad nedbrytning på ett kompensatoriskt sätt.

Även om DNA-PK tros vara ett nukleolusprotein antyder vår observation att DNA-PK, eller åtminstone dess katalytiska underenhet, också är belägen i cytoplasma, 21 och att VCP associerade med det och reglerade dess nedbrytning. Co-IP-experimentet identifierade att både den N-terminala domänen och D1-domänen i VCP-proteinet kunde binda till DNA-PK, vilket är förenligt med de senaste resultaten från co-IP- och biolagers interferometri-experiment med användning av en VIM-peptid av gp78; 30 denna slutsats överensstämde också delvis med tidiga data som visade att rhodopsin (P23H) -proteinet endast interagerar med p97ND1-domänen, men inte den isolerade p97N-domänen. 25 VCP ND2-domänen uppvisar emellertid ingen detekterbar bindning med DNA-PKcs, och D1D2-domänen försvagar också bindningsaffiniteten för Dl-domänen med DNA-PKcs. Dessa resultat indikerar att VCP-associering med målproteinet påverkas av konformationella förändringar, som kan induceras av ATP-bindning / hydrolys eller hierarkisk bindning. Vidare rapporterades att en enda aminosyrasubstitution (R155H) vid gränssnittet mellan den N-terminala domänen och den angränsande AAA-domänen (D1) av VCP resulterar i en reducerad affinitet för ADP. 31 Även om de tidigare data visade att VCP fosforylerades av DNA-PK som svar på DNA-skada, är det inte klart om denna fosforylering av VCP påverkar dess bindning med DNA-PK eller reglerar VCP-aktivering.

Dessutom har biokemiska och strukturella studier visat att flera kofaktorer som erkänns av VCP (p97) innehåller den ubiquitin-regulatoriska X (UBX) -domänen som finns i UBX-proteinfamiljen eller den ubiquitinliknande domänen till NPL4. 30 Utöver det faktum att VCP är fosforylerat vid Ser 784, innehåller DNA-PKcs också VIM-motivet för 'AAXXR' (figur 1a), som bevaras hos däggdjur och är i överensstämmelse med föregående resultat. 30 Våra data visade också att DNA-PKcs är ubikvitinerad och dess nedbrytning är ubiquitin-proteasomberoende; emellertid har det specifika ubiquitylerade stället (er) för DNA-PKcs och dess motsvarande E3-ligas ännu inte upptäckts och kommer att behandlas i våra framtida studier.

DSB är en mest dödlig typ av DNA-skada; om cellen inte kan fixa denna skada kan de ombearbetade DSB: erna leda till celldöd. Som en central komponent i NHEJ styr DNA-PK processen för DSB-reparation och upprätthåller genomets stabilitet. Förändringar i DNA-PK-aktiviteter eller mängder av DNA-PKcs-proteinet kommer sannolikt att förändra cellernas känslighet för genotoxisk stress, såsom strålning. Det är välkänt att DNA-PKcs - / - möss är överkänsliga för strålning och genomgår ATM- och p53-beroende apoptos. 32, 33, 34 Men data från TCGA och vår grupp antyder att det inte finns någon signifikant skillnad i DNA-PKcs-proteinnivåerna mellan normal glialvävnad och GBM-tumörvävnad, även om immunohistokemi-analys i vissa fall visade att tumörceller uttrycker mer DNA -PKcs än intilliggande normal vävnad, 35 vilket kan bero på vävnadsspecificiteten.

För att undvika potentiella biverkningar orsakade av DNA-PK-hämmare är riktning mot DNA-PK-regulatoriska proteiner som är uppreglerade i strålningsresistenta glioblastomceller en alternativ strategi för radiosensitationsbehandling. Vi har tidigare funnit att proteinfosfatas PP6 reglerar strålningskänsligheten för GBM-celler genom DNA-PK, och att genom att slå ner PP6c ökar överlevnadstiden för möss; PP6c överuttryckades dessutom i 44, 7% (17 av 38 fall) av GBM-patienter. 21, 22, 36, 37, 24

I den här studien orsakade inte nedslagning av VCP bara ackumulering av DNA-PKcs-proteinet, utan det höjde också DNA-PK-aktiviteten och främjade effektiviteten för reparation av DNA-skador i GBM-celler. Även om VCP-knockdown påverkade rekryteringen av 53BP1 till DNA-skadeställena och tycktes öka strålningskänsligheten för U2OS-celler och nematod, visade 15, 16 våra data att ansamlingen av DNA-PK ökade effektiviteten för reparation av DNA-skador i GBM-celler, vilket kan vara ett resultat av p53-oberoende vägar och en annan cellulär roll för VCP i olika typer av celler. 38 Vår in vivo- studie bekräftade att VCP-knockdown minskade radiosensitiviteten och förkortade överlevnadstiden för möss i en GBM-ortotopmodell. De kliniska uppgifterna stödde också denna slutsats. Därför kan de små molekylerna som selektivt riktar sig till VCP-proteinet påverka strålningskänsligheten genom att reglera DNA-PK-proteinnivån. Dessa observationer antyder att DNA-PK-regulatoriska proteiner är potentiella mål för behandling med radiosensitering.

Ordlista

VCP

valosininnehållande protein

DNA-PK

DNA-beroende proteinkinas

ER

endoplasmatiska retiklet

ERAD

ER-associerad proteinnedbrytning

DSB

DNA-dubbelsträngsbrott

VIM

VCP-interagerande motiv

NHEJ

icke-homolog slutförening

ATR

ATM-Rad3-relaterat protein

bankomat

ataxia telangiectasia-muterat protein

CPT

kamptotecin