Utpa och utpb chaperone nascent pre-ribosomal rna och u3 snorna för att initiera eukaryot ribosommontering | naturkommunikation

Utpa och utpb chaperone nascent pre-ribosomal rna och u3 snorna för att initiera eukaryot ribosommontering | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • chaperones
  • ribosomen
  • Supramolekylär montering

Abstrakt

Tidig eukaryot ribosombiogenes involverar stora multiproteinkomplex, som ko-transkriptionellt associerar med pre-ribosomalt RNA för att bilda den lilla underenhetsprocessomen. De exakta mekanismerna genom vilka två av de största multiproteinkomplexen - UtpA och UtpB - interagerar med den framväxande pre-ribosomala RNA förstås dåligt. Här kombinerade vi biokemiska och strukturella biologiska tillvägagångssätt med ensembler av RNA – protein-tvärbindningsdata för att belysa de väsentliga funktionerna i båda komplexen. Vi visar att UtpA innehåller ett stort sammansatt RNA-bindande ställe och fångar 5'-änden av pre-ribosomalt RNA. UtpB bildar en utökad struktur som binder tidiga pre-ribosomala mellanprodukter i närheten av arkitektoniska platser såsom en RNA-duplex bildad av 5 'ETS och U3 snoRNA samt 3'-gränsen för 18S rRNA. Båda komplexen fungerar därför som vitala RNA-chaperoner för att initiera eukaryot ribosommontering.

Introduktion

Eukaryotisk ribosommontering involverar de samordnade funktionerna av> 200 icke-ribosomala faktorer, som är involverade i ett stort antal reaktioner från transkriptionella händelser i kärnan till slutliga kvalitetskontrollsteg i cytoplasma 1 . Medan betydande framsteg har gjorts när det gäller att bestämma de sena stadierna av den lilla underenheten 2, 3 och den stora underenhetens mognad 4, 5, 6, 7, är relativt lite känt om de tidiga samtranskriptionshändelserna under vilka stora ribosommonteringsfaktorer förknippas med begynnande -ribosomalt RNA (pre-rRNA) för att bilda processen för liten subenhet (SSU) 8, 9 .

SSU-processomen har identifierats som den tidigaste ribosomaggregatet mellanprodukt under mognad av den lilla ribosomala underenheten. Inom detta komplex klyvs det uppstigande pre-rRNA-transkriptet på platserna AO, Al och A2, vilket resulterar i frisläppandet av 20S pre-rRNA. SSU-processom är en jättepartikel som består av många ribosommonteringsfaktorer, inklusive UtpA-, UtpB-, UtpC- och Mpp10-komplexen, U3: s små nukleolära ribonukleoprotein (snoRNP) och många enskilda proteiner 8, 10 . Vi har nyligen analyserat SSU-processombildning som en funktion av transkription och identifierat en 2-MDa-partikel associerad med den 5'-externa transkriven distansen (5 'ETS). Förutom 700-nukleotid 5 'ETS pre-rRNA innehåller denna partikel 26 proteiner, inklusive alla kända komponenter i UtpA-, UtpB-, Mpp10- och U3-snoRNP-komplexen 11 .

UtpA och UtpB är multiproteinkomplex med sju respektive sex underenheter, respektive 12, 13, 14 . Att klargöra deras biokemiska funktioner under ribosomsyntes har hindrats av deras stora storlek, den övergående naturen hos pre-ribosomer och frånvaron av uppenbara enzymatiska aktiviteter. Båda komplexen innehåller huvudsakligen p-propeller och a-spiralformade upprepade strukturer, vilket antyder att de bildar en strukturell ram under tidig ribosommontering 3, 15, 16, 17, 18 . Depletionsexperiment indikerar att UtpA initierar pre-ribosommontering genom att binda till det begynnande pre-rRNA och rekryterar sedan UtpB och U3 snoRNP 9, 19 . U3-snoRNP kan fungera som en RNA-chaperon genom basparning med och sammanförande av flera sekvenser i 5'-ETS och 18S rRNA 20, 21, 22 . De exakta pre-rRNA-bindande platserna och mekanismerna genom vilka UtpA och UtpB fungerar under tidiga stadier av eukaryot ribosommontering in vivo har ännu inte fastställts.

De pre-rRNA-bindande platserna för flera individuella ribosommonteringsfaktorer har belysats med användning av UV-tvärbindning och analys av cDNA (CRAC) 23, 24, 25 . Med molekylvikter på 660 respektive 525 kDa står UtpA och UtpB för ungefär hälften av massan för 5 'ETS-partikeln 11 . UtpA och UtpB har ett kombinerat antal av 13 distinkta subenheter och har troligen mer komplexa och / eller sammansatta pre-rRNA-bindande platser, som vi bestämde med användning av en systematisk analys av ensembler av RNA-proteintvärbindningsdata från flera underenheter.

Här rapporterar vi arkitekturen, funktionen och exakta pre-rRNA-bindande platser för dessa komplex med RNA – protein och protein – protein-tvärbindningsdata i kombination med elektronmikroskopi (EM).

Resultat

Molekylära arkitekturer av UtpA och UtpB

För att bestämma molekylstrukturer och interaktioner mellan UtpA och UtpB, renade vi båda komplexen från jäst med användning av nanobodies riktade mot fluorescerande proteiner, såsom tidigare beskrivits 11, 26 (fig 1 och 2). UtpA är ett heptameriskt komplex som består av Utp4, Utp5, Utp8, Utp9, Utp10, Utp15 och Utp17 (Nan1). Det endogena komplexet renades till homogenitet via ett proteas-klyvbart Utp10-GFP-fusionsprotein (fig. La, b) och användes för tvärbindning och masspektrometri-experiment. För att testa stabiliteten och saltkänsligheten hos UtpA isolerades det heptameriska komplexet under lågsaltbetingelser (200 mM NaCl) och inkuberades därefter med buffertar med ökande saltkoncentrationer. Vid 400 mM NaCl, separerades Utp4 från de andra sex underenheterna (fig. 1c) och vid 800 mM NaCl var endast Utp17 fortfarande bunden till den immobiliserade Utp10-GFP (fig. 1d). Detta resultat antyder att de stora proteinerna Utp10 (200 kDa) och Utp17 (101 kDa) bildar ett komplex, med vilket de återstående fem mindre underenheterna associerar 14 . Det indikerar vidare att Utp4 är den mest saltkänsliga underenheten av de fem mindre underenheterna.

( a ) Kromatogram av storleksuteslutning av endogent UtpA och ( b ) motsvarande visualisering av huvudtoppfraktionen med 4–12% SDS-PAGE och Coomassie-blå färgning. Samuteluerande Utp-proteiner som innefattar UtpA (Utp4, Utp5, Utp8, Utp9, Utp10, Utp15, Utp17) är märkta med deras respektive nummer till vänster. ( c, d ) SDS-PAGE-analys av UtpA-subkomplex som är resultatet av rening med buffertar med olika jonstyrkor. Märkta UtpA (Utp10-3C-GFP och Utp15-TEV-mCherry) renades vid 200 mM NaCl på anti-GFP sepharose och inkuberades med buffertar innehållande antingen 400 mM NaCl, vilket gav UtpAΔUtp4 ( c ) eller 800 mM NaCl, vilket gav Utp10 -Upp 17 dimer ( d ). 10 * märker en nedbrytningsprodukt från Utp10. TEV- och 3C-proteaser (grått) användes för eluering och avlägsnande av mCherry (grått). ( e ) SDS-PAGE-analys av den huvudsakliga toppfraktionen av samuteluerande Utp5, Utp8, Utp9 och Utp15 på kromatografi för storleksuteslutning. Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 och Utp15-TEV-mCherry överuttrycktes i jäst och affinitetsrenas. Utp4 dissocierades från komplexet under kromatografi med storleksuteslutning vilket resulterade i eluering av den visade heterotetrameren. ( f ) Schematisk framställning av intersubunit DSS-tvärbindningar (grå linjer) mellan UtpA-subenheter (cirklar färgade i olika gröna nyanser). Tjockleken på linjerna som förbinder underenheter återspeglar antalet tvärbindningar som delas mellan underenheterna.

Bild i full storlek

( a ) Kromatogram för storleksuteslutning av endogent UtpB och ( b ) motsvarande visualisering av huvudtoppfraktionen med 4–12% SDS-PAGE. Samuteluerande Utp-proteiner som innefattar UtpB (Utp1, Utp6, Utp12, Utp13, Utp18 och Utp21) är märkta med deras respektive nummer till vänster. * indikerar att Utp21-3myc-TEV-mCherry-Flag användes som affinitetsreningstagg och innehåller 3 C-terminala myc-taggar efter TEV-klyvning. ( c - f ) Renade rekombinanta subkomplex av UtpB uttryckt i bakterier och analyseras på en 4–12% SDS-PAGE gel. ( c ) Huvudtoppfraktionen av en kromatografi med storleksuteslutningskörning med samuttryckt och renat Utp12 och Utp13. ( d ) 3C-proteaseluering av Utp6 / Utp18-neddragningsreglaget som visas i tilläggsfiguren 3c. ( e ) Huvudtoppfraktion av en kromatografikörning med storleksexkludering av samuttryckt och renat Utp12 / Utp13 / Utp21 / Utp1. (S-21 indikerar StrepII-Sumo-Utp21). * indikerar en GroEL-förorening. ( f ) 3C-proteaseluering av samuttryckt heterotetrameriskt Utp6 / Utp18 / Utp21 / Utp1 renat genom tandemaffinitetsrening via His14-3C-Utp21 och mCherry-3C-Utp6. ( g ) Schematisk representation av intersubunit DSS-tvärbindningar (grå linjer) mellan UtpB-underenheter Utp12, Utp13, Utp21 och Utp1 (cirklar färgade i olika blåskuggor). Tjockleken på linjerna som förbinder underenheter återspeglar antalet tvärbindningar som delas mellan underenheterna. Hela linjer representerar DSS-tvärbindningar bestämda i denna studie. Streckade linjer indikerar underenheter Utp6 och Utp18 som inte inkluderades i tvärbindningsanalysen.

Bild i full storlek

För att klargöra om de fem mindre subenheterna kan bilda ett subkomplex i frånvaro av Utp10-Utp17 heterodimer, var Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 och ett proteas-klyvbart Utp15-mCherry-fusionsprotein överuttryckt i jäst. Efter affinitetsrening var alla fem subenheterna närvarande (kompletterande figur 1), men Utp4 dissocierades från Utp5, Utp8, Utp9 och Utp15-mCherry under det efterföljande storleksuteslutningssteget (Fig. 1e). Förlusten av Utp4 i buffertförhållanden med lågt salt under kromatografi för uteslutning av storlek föreslår antingen en svag koppling av Utp4 med de andra underenheterna eller nödvändigheten för Utp10 och / eller Utp17 för dess stabila integration inom UtpA.

För att undersöka protein-protein-interaktioner inom UtpA vidare utförde vi tvärbindning och masspektrometri av renat nativt taggad UtpA (fig. 1a, b och f). Ett tätt nätverk av tvärbindningar identifierades mellan Utp10, Utp5, Utp15, Utp8 och Utp17, vilket tyder på att dessa ligger i närheten av UtpA. Som förväntat delar Utp10 tvärbindningar med Utp17 men delar också ett stort antal tvärbindningar med Utp5 och Utp8. Utp4 var inte starkt tvärbundet med andra underenheter av UtpA och delade bara få tvärbindningar med Utp8, Utp9 och Utp15 (Fig. 1f och kompletterande Fig. 2a). Sammantaget antyder dessa observationer en molekylär organisation av UtpA där Utp10 och Utp17 bildar en stabil dimer som har rumslig närhet till Utp5, Utp8 och Utp15 och i mindre utsträckning till Utp9 och det saltlabbala Utp4 (fig. 1d – f) .

UtpB är ett hexameriskt komplex som består av Utp1 (Pwp2), Utp6, Utp12 (Dip2), Utp13, Utp18 och Utp21. Det endogena komplexet renades med användning av ett proteas-klyvbart Utp21-mCherry-fusionsprotein och anti-mCherry nanobody-täckt sepharose-harts 26 . Affinitetsrening och proteasspjälkning följt av storleksuteslutningskromatografi bekräftar närvaron av alla sex underenheter som tidigare rapporterats vara en del av UtpB 13 (Fig. 2a, b), vilket ytterligare bekräftades med masspektrometri (data visas inte).

Vi avser att rekonstituera subkomplex av UtpB i bakterier för att identifiera vilka underenheter som interagerar direkt med varandra inom UtpB. Flera subkomplex erhölls genom heterolog samuttryck och rening av UtpB-subenheter från bakterier (fig. 2c – f). Super-stökiometriska mängder av märkt Utp6 observerades i vissa experiment (fig. 2d, f), vilket indikerar återhämtning av monomert märkt protein utöver det stökiometriska komplexet. Utp12 och Utp13 co-eluerar vid kromatografi för storleksuteslutning och interagerar således direkt för att bilda ett stabilt heterodimert komplex (fig. 2c, kompletterande fig. 3a, b). På liknande sätt ger samuttrycket av Utp6 och Utp18 en stabil heterodimer (fig. 2d). Dessa två heterodimera subkomplex av UtpB överbryggs via Utp21 och Utp1, eftersom samuttrycket av Utp21 / Utp1 med antingen Utp12 / Utp13 eller Utp6 / Utp18 resulterar i ett tetrameriskt komplex (Fig. 2e, f). Dessutom interagerar det heterodimera Utp6 / Utp18 inte direkt med Utp12 / Utp13 utan bara med det tetrameriska Utp12 / Utp13 / Utp1 / Utp21-komplexet, vilket antyder att heterodimeren Utp21 / Utp1 är lokaliserad mellan de andra två dimererna (kompletterande figur 3c ). Sammantaget antyder dessa data att UtpB kan delas upp i tre heterodimerer varav Utp12 / Utp13-subkomplexet (fig. 2c, kompletterande fig. 3a, b) samverkar via den centrala Utp21 / Utp1-dimern (fig. 2e) med Utp6 / Utp18 (fig. 2e) 2d, f, kompletterande figur 3c).

Vi undersökte protein-protein-interaktioner inom heterotetramer innehållande Utp12, Utp13, Utp21 och Utp1 genom tvärbindning och masspektrometri. Resultaten bekräftade att detta komplex består av ett par heterodimerer med starka tvärbindningar mellan Utp12 och Utp13, såväl som Utp21 och Utp1 (Fig. 2g).

Kombinerat med tidigare tvärbindning och biokemisk data från UtpB antyder detta att två heterodimerer bildade av Utp12 och Utp13, eller Utp21 och Utp1 kan interagera för att bilda ett centralt kärnkomplex 14, 16, 17 . Utp6 och Utp18 visade sig tidigare bilda ett separat element i komplexet, med begränsade tvärbindningar till de andra fyra subenheterna 14, 17, 27 .

Utp12, Utp13, Utp21 och Utp1 har en gemensam arkitektur med en N-terminal tandem-p-propeller följt av en a-spiralformad region. Det finns många intra-protein-tvärbindningar (kompletterande fig. 2b), vilket antyder en sammanflätad arkitektur av tandem-B-propeller av Utp1 och Utp13 liknande den som tidigare observerats för Utp21 (ref. 16).

UtpB har en utökad struktur med separata moduler

För att förstå den strukturella grunden för den tvärbindande masspektrometri-analysen utförde vi negativfärgad EM för UtpA och UtpB. Medan UtpA visade en mängd olika konformationer och inte var lämplig för 3D-rekonstruktion (kompletterande fig. 4), analyserades endogena UtpB från Saccharomyces cerevisiae ytterligare genom slumpmässig konisk tilt 3D-rekonstruktion (fig. 3). För att stabilisera UtpB utfördes försiktig glutaraldehyd-tvärbindning på kolonnen (kompletterande fig. 5), vilket ökade antalet intakta partiklar för efterföljande studier som tidigare observerats för andra stora multiproteinkomplex 28, 29 .

( a ) Representativa ISAC 30 2D-klassvärden som visar en tetramerisk långsträckt kropp med en mycket mobil domän som kan ta prov på ett stort antal konformationer. ( b ) Jämförande ISAC 2D-klassmedelvärden för endogent UtpB och rekombinant UtpB som saknar Utp6 och Utp18. ( c ) Olika vyer av en slumpmässig konisk lutningsrekonstruktion av UtpB (EMD-8223) visar den långsträckta strukturen hos den tetrameriska kärnan och svag densitet för den flexibla domänen vid fotspetsen. Den manuellt dockade dubbel-p-propelleren från Utp21 (pdb-kod 4nsx (ref. 16)) visas som tecknad representation i rött i fotområdet för UtpB.

Bild i full storlek

Analysen av 2D-klassmedelvärden erhållna genom iterativ stabil inriktning och klustering (ISAC) 30 avslöjade närvaron av en långsträckt strukturell kärna, som är ansluten i ena änden till en andra, mindre modul (fig. 3a och kompletterande fig. 6a). Läget för den mindre modulen i förhållande till kärnan varierade mellan olika klassmedelvärden, vilket antyder att den är bunden till kärnan genom en flexibel länk. För att identifiera positionen för Utp6 och Utp18, använde vi negativfärgad EM för att analysera ett rekombinant uttryckt 400 kDa heterotetrameriskt komplex bestående av Utp12, Utp13, Utp21 och Utp1. De resulterande medelvärdena för 2D-klass visade att Utp12, Utp13, Utp21 och Utp1 är tillräckliga för bildandet av den strukturella kärnan i UtpB, vilket antyder att den mobila andra modulen motsvarar Utp6 och Utp18 (fig. 3b och kompletterande figur 6b). Vi kan oberoende visa genom kromatografi med storleksuteslutning att Utp18 krävs för stabil förening av Utp6 med kärnan i UtpB (kompletterande figur 3c och 7). Dessa data antyder att en flexibel länk som motsvarar N-terminalregionen i Utp18 (kompletterande figur 7d) ansluter den strukturella kärnan i UtpB, som består av Utp12, Utp13, Utp1 och Utp21, till en andra modul sammansatt av p-propellen av Utp18 och HAT-upprepningen av Utp6 (Fig. 3 och Kompletterande Fig. 7). Denna modell överensstämmer också med tidigare publicerade data som visar en direkt interaktion mellan den N-terminala regionen i Utp18 (resterna 100 till 190) med den N-terminala tandem-p-propellen från Utp21 (ref. 16).

För att erhålla 3D-strukturell information om det konformationellt flexibla UtpB, skaffade vi oss en stor EM-tilt-par-datauppsättning med negativa fläckar (Kompletterande Fig. 8a, b). 2D-klassificering i 50 klasser resulterade i 2D-genomsnitt motsvarande flera olika konformationer av UtpB, som representerar olika böjningsgrader (kompletterande fig. 8c). En dominerande konformation kan emellertid tydligt identifieras från dessa klasser (kompletterande figur 8d, grupper 8, 13, 19, 33 & 47). Slumpmässiga koniska lutningsrekonstruktioner av dessa klasser resulterade i liknande volymer som visade en långsträckt struktur med cirka 230 Å i längd och 90 Å i bredd (Kompletterande Fig. 8d, blå volymer). I de flesta rekonstruktioner observerades liten eller ingen densitet för mobildomänen i ena änden av UtpB. För att erhålla den slutliga volymen kombinerade vi partiklarna från de lutade proverna av dessa klasser med 10% av de motsvarande partiklarna från det tilltade provet och utförde vinkelförädling i SPIDER 31 (fig. 3c och kompletterande fig. 9). Den slutliga rekonstruktionen har en upplösning av 28 Å (kompletterande bild 9a). Svag, utökad densitet kan observeras för mobilmodulen, som består av Utp6 / Utp18 (fig. 3c och kompletterande fig. 9c). Topologiskt definieras kärnstrukturen i UtpB av en huvudmodul, som är ansluten till resten av partikeln via ett krökt axelområde. Den nedre delen av strukturen består av två lobar, som vi kallar arm- och fotregioner (fig. 3c). Fotregionen fungerar vidare som anslutning till den flexibla modulen, som består av Utp6 / Utp18. Olika konformationer observeras för den flexibla modulen, som kan prova nästan hela området runt spetsen på fotstrukturen (fig. 3a). Sedan tidigare biokemiska experiment har visat att tandem-p-propellerdomänen i Utp21 direkt kan interagera med ett N-terminalsegment inklusive rester 100 till 190 från Utp18 (ref. 16) har vi tentativt tilldelat de N-terminala tandem-p-propellerdomänerna av Utp21 till fotregionen av strukturen. Denna placering tillåter N-terminalregionen i Utp21 att interagera med Utp6 / Utp18-modulen, medan C-terminalregionen i Utp21 kan interagera med de andra tre underenheterna. På grundval av vår tidigare biokemiska karaktärisering antyder den nära interaktionen mellan Utp21 och Utp1 att Utp1 bidrar till den täthet som observeras i den nedre delen av strukturen medan Utp12 och Utp13 troligen bidrar till toppen av strukturen.

Detta tentativa uppdrag överensstämmer med iakttagelsen att Utp12 och Utp13 samt Utp21 och Utp1 bildar heterodimerer. Det är vidare i mycket bra överensstämmelse med proteintvärbindningsdata som avslöjade att Utp21 lättast är tvärbunden med Utp1, mindre till Utp12 och mycket mindre till Utp13 (fig. 2g, kompletterande fig. 2b och 9c).

UtpA och UtpB binder olika platser för pre-rRNA och U3 snoRNA

För att bestämma de in vivo pre-rRNA-bindande platserna för både UtpA och UtpB, använde vi CRAC. En trepartsetikett bestående av en polyhistidin-etikett, ett TEV-klyvningsställe och ett protein A-tagg (HTP) infördes vid de genomiska loci-kodande underenheterna för UtpA- och UtpB-komplexen, under kontroll av de endogena promotorerna. Efter ultraviolett tvärbindning in vivo i aktivt växande celler utsattes kovalent bundna RNA-proteinkomplex för flerstegsrening. Komplex renades initialt genom bindning till IgG Sepharose följt av TEV-proteaseluering. Bundna RNA digererades sedan delvis följt av två denaturerande reningssteg; nickelaffinitetsrening i närvaro av 4 M guanidinium-HCl och SDS-PAGE. Dessa steg väljer specifikt RNA som var kovalent tvärbundet till den taggade proteinsubenheten, som identifierades genom RT-PCR och Illumina-sekvensering. Följaktligen identifieras endast direkta RNA-proteininteraktioner för en enda proteinsubenhet i ett enda experiment. Genom att rikta in sig på flera subenheter av varje komplex erhölls ensembler av CRAC-profiler som visar karakteristiska mönster för varje komplex (fig. 4). Påfallande visade alla sju underenheter av UtpA övervägande tvärbindning i det 5'-proximala området i 5'-ETS (fig. 4a), i överensstämmelse med en nyckelroll i initieringen av ribosommonteringsprocessen. Vildtypskontrollen visade endast en framträdande topp i 25S rRNA, som har sett i många experiment och representerar en vanlig förorening 6, 23, 32 .

( a ) Sekvenser erhållna från CRAC-experiment med alla UtpA-subenheter (i gröna nyanser, duplikat i ljusgrönt), utvalda UtpB-subenheter (i nyanser av blått, duplikat i ljusblått) och den icke-taggade kontrollen (i grått, duplikat i ljusgrå) anpassades till rDNA-lokuset (RDN37) och plottades som återhämtningsfrekvens (träff per miljon kartläsade läsningar) vid varje nukleotidposition (indikerat ovanför alla paneler). Enskilda skalor för återhämtningsfrekvensen visas till höger om varje underenhetspanel. 35S för-rRNA kodat av RDN37 visas schematiskt under spåren med klyvningsställen (A0, Al, D, A2, A3, E, C2, C1, B2, B0), interna och externa avståndsregioner (ITS1, ITS2, 5 ′ ETS, 3 ′ ETS) och ribosomalt RNA (18S, 5, 8S, 25S) indikerade. ( b ) Utökad vy av CRAC-bibliotekets träffar på 5 ′ ETS (nukleotiderna 1–700 från RDN37). Positioner för U3-snoRNA-basparparningsställen (3 'gångjärn, 5' gångjärn) och för-rRNA-klyvningsställen (A0, Al) visas på en schematisk representation av 5'-ETS nedan.

Bild i full storlek

Utvidgning av 5'-ETS-regionen (fig. 4b) visar skillnader i de högsta tvärbindningsställena för olika komponenter, vilket antyder förväg för pre-rRNA genom komplexet. Utp9 hade den mest 5 ′ proximala positionen med stark tvärbindning endast inom de första 40 nt av 5 ′ ETS. Utp8 och Utp17 binder också inom 5–40 nt men visade ytterligare tvärbindning runt +90. Utp4 visade endast toppen vid +90, medan Utp15 var tvärbunden på denna plats och ytterligare 3 'runt +250, nära bindningsstället för U3 snoRNA 3' gångjärnregionen. Det stora Utp10-proteinet visade topp tvärbindning runt +110, med svagare bindning vid platser från 5'-änden till cirka +500, vilket tyder starkt på att det interagerar med pre-rRNA i en utökad konformation. Slutligen sågs toppen av Utp5-tvärbindning omkring +130. Sammantaget avslöjar dessa data att UtpA-komplexet innehåller 5 ′-änden av det begynnande pre-rRNA, med omfattande interaktioner upp till cirka +150.

För UtpB-komplexet var C-terminal-taggning misslyckad för Utp12 och Utp6, medan märkta Utp21 inte var signifikant tvärbunden med RNA (data visas inte). Avläsningar erhölls för de återstående tre UtpB-subenheterna, Utp1, Utp13 och Utp18, som antingen är en del av kärnan i UtpB (Utp1 och Utp13) eller mobilmodulen (Utp18) (fig 3 och 4). Utp18 bundet runt +90 i mitten av kärnan UtpA bindande region. Utp1 tvärbindes huvudsakligen runt U3-snoRNA-bindningsstället vid +280 medan Utp13 visade topp tvärbindning kring klyvningsstället D vid 3'-änden av 18S rRNA. Dessa bindningsställen indikerar att det långsträckta och konformationellt flexibla UtpB-komplexet förenar funktionellt viktiga ställen som är spridda i pre-rRNA-sekvensen.

Dessutom visade flera proteiner, särskilt Utp5, Utp15 och Utp18, toppar av tvärbindning kring +1 200 nt i 35S (+500 inom 18S rRNA). I den sekundära strukturen 18RRNA ligger denna plats nära den "centrala pseudoknoten", ett viktigt strukturellt drag i den lilla ribosomala underenheten, och kan också vara nära belägen i tidiga pre-ribosomer.

Pre-rRNA-tvärbindningsdata placerar UtpA- och UtpB-komplexen i närheten av bindningsställen för U3-snoRNA och vi analyserade därför också läsningar som motsvarar detta RNA (fig. 5a). Notera att alla UtpA- och UtpB-komponenter visade U3 snoRNA-tvärbindning som var väsentligen (> 10 gånger) högre än den negativa kontrollen. Men tvärbindningen av Utp10 och Utp1 till U3 snoRNA var mer än tio gånger högre än för andra UtpA- eller UtpB-subenheter. Eftersom läsnumren i fig. 5 uttrycks som träff per miljon kartlagda läsningar, återspeglar detta relativt stark tvärbindning av dessa proteiner till U3-snoRNA jämfört med pre-rRNA (topphöjder i fig. 4 och 5).

( a ) CRAC-bibliotekssekvenser av UtpA (i gröna nyanser, duplikat i ljusgrönt), UtpB (i nyanser av blått, duplikat i ljusblått) och den icke-taggade kontrollen (i grått, duplikat i ljusgrått) mappade till skarvad SNR17A (kodande U3-snoRNA) plottas som återhämtningsfrekvens (träff per miljon kartlagda läsningar) vid varje nukleotidposition (indikerat ovanför alla paneler). Enskilda skalor för återhämtningsfrekvensen visas till vänster om varje underenhetspanel. Underenhetspaneler beställs av proteinkomplex och vidare av deras respektive antal träffar per miljon avlästa läsningar. Positionerna för 3 ′ och 5 ′ gångjärnen som basparar med 5 ′ ETS anges under spåren. ( b ) Schematisk sekundärstruktur av U3 snoRNA (svart) med basparade 5 'ETS (lila) och CRAC-baserade bindningsställen för U3 snoRNP-proteinerna Rrp9, Nop1, Nop56 och Nop58 i olika nyanser av brunt, såsom bestämts tidigare 33, bindande webbplatser för Utp10 (grön) från UtpA och Utp1 (blå) från UtpB. Helices är märkta med H och de konserverade rutorna B / C / C ′ / D-sekvenselement är markerade med sin enskilda bokstav respektive.

Bild i full storlek

U3 snoRNP har en uttalad domänstruktur, med en stor, mycket strukturerad 3'-domän som binder kärn-snoRNA-proteinerna inklusive Nop56, Nop58, Nop1 (fibrillarin) och Rrp9 33 . 5'-domänen är relativt ostrukturerad och innehåller pre-rRNA-basparringsregioner, inklusive 5'- och 3'- gångjärnsregionerna och ruta A (fig. 5b) 20, 21, 22 . Utp10 tvärbundet övervägande till 3'-domänen i U3-snoRNA, intill huvudbindningsställen för snoRNP-proteinerna (fig. 5b). Däremot tvärbinds Utp1 endast över 3 'gångjärnregionen i 5'-domänen i U3 snoRNA (Fig. 5b). Detta överensstämmer med den specifika bindningen av Utp1 med pre-rRNA-målet för U3-snoRNA-basparning (fig. 4b). En andra UtpB-subenhet, Utp18, visade en låg nivå av tvärbindning till 3 ′-gångjärnet i U3-snoRNA (fig. 5a och kompletterande fig. 10).

Andra Utp-proteiner hade alla låga nivåer av läsningar inom den stora terminalstammen av U3 snoRNA 3-domänen; antingen på 5 ′-sidan (Utp17) eller 3 ′-sidan (Utp4, Utp5, Utp8, Utp13, Utp15, Utp18) (Kompletterande bild 10b, c). Noterbart sågs ingen signifikant tvärbindning till de andra experimentellt bekräftade pre-rRNA-bindande ställena i 5'-regionen av U3-snoRNA; 5 ′-gångjärnet och rutan A 20, 21, 22 .

Sammantaget föreslår dessa data en roll för Utp10 inom UtpA-komplexet vid rekrytering av U3-snoRNP, medan Utp1 i UtpB-komplexet därefter interagerar med båda RNA-strängarna i basparad U3-snoRNA - pre-rRNA-interaktion vid +280 i 5 'ETS .

Diskussion

Här tillhandahåller vi första detaljerade insikter om strukturen och funktionen hos de stora, flera underenhets proteinkomplexen UtpA och UtpB. Genom att kombinera biokemiska och strukturella biologiska tillvägagångssätt med ensembler av RNA-protein-tvärbindningsdata bestämde vi den molekylära organisationen av båda komplexen, deras viktiga RNA-proteinkontakter in vivo och arkitekturen för UtpB.

Frånvaron av strukturell information med hög upplösning för många komponenter i UtpA och UtpB har hittills begränsat vår förståelse för dessa komplex. Här visar vi att användningen av proteintvärbindning och masspektrometri i kombination med biokemi tillät att den allmänna arkitekturen för UtpA och UtpB dekrypterades. Medan huvuddelen av inter-protein-tvärbindningar av UtpB ingår i de C-terminala domänerna i fyra UtpB-subenheter, observeras en bredare distribution av inter-protein-tvärbindningar för underenheter av UtpA (kompletterande figur 2).

RNA-proteininteraktioner identifierade av CRAC motsvarar en population av temporala tillstånd. Tidigare EM-analyser av "Miller" -kromatinspridningar och analyser av metabolisk märkning indikerar emellertid starkt att tidig pre-ribosommontering sker samtranskriptionellt 34, 35 . Därför, även om vi inte kan skilja sekventiella RNA-bindande händelser för enskilda UtpA- eller UtpB-subenheter, verkar det troligt att platsen 5 ′ till 3 of för tvärbindningsplatser åtminstone delvis återspeglar bindningsordningen. I fig. 6 presenterar vi en modell för potentiell, sekventiell RNA-bindning av UtpA- och UtpB-subkomplex. Vid de tidigaste stadierna av transkription binder tre underenheter av UtpA (Utp8, Utp9 och Utp17) till den framtida pre-rRNA vid mycket 5 ′ änden medan de återstående fyra subenheterna (Utp10, Utp4, Utp5 och Utp15) interagerar med nukleotider längre nedströms i 5 ′ ETS (Fig. 6a). Den långsträckta och flexibla strukturen för UtpB antyder att detta komplex är idealiskt lämpligt för att överbrygga distinkta RNA-bindande ställen. Efter en initial bindning till 5 ′ ETS via den flexibla modulen som innehåller Utp18 (fig 3 och 6b), samverkar kärnan i UtpB med båda RNA-strängarna i duplexen som bildas av 5 ′ ETS och 3 ′ gångjärnet av U3 snoRNA via Utp1 (Fig. 6c). Under senare stadier av SSU-processommontering möjliggör slutförandet av 18S rRNA och resulterande strukturella förändringar Utp13 att interagera med 3'-gränsen för 18S rRNA (fig 6d, e). Denna modell är i god överensstämmelse med vår tidigare iakttagelse att en scenspecifik montering sker under SSU-processombildning 11, som nyligen oberoende bekräftades 36 .

( a ) RNA-polymeras I (rosa) syntetiserar 5 'ETS (mörkrött), som fångas med transkriptionellt av flera underenheter av UtpA (gröna nyanser). ( b ) Fler underenheter av UtpA och Utp18 i UtpB (nyanser av blått) binder till 5 ′ ETS. U3 snoRNP (orange) rekryteras till UtpA och UtpB. ( c ) U3 snoRNP (orange) är basparade vid 3 ′ gångjärnet med 5 ′ ETS och i närheten av Utp1. ( d ) Transkription fortsätter och fler delar av 18S rRNA (mörkgrå) genereras. ( e ) Slutförandet av SSU-processomen med ett i stort sett vikta 18S gör det möjligt för Utp13 att binda i närheten av 3'-änden av 18S rRNA.

Bild i full storlek

Vår systematiska analys av tvärbindning av RNA-protein belyser att överlappande bindningsställen finns för olika underenheter av UtpA och UtpB både inom 5'-ETS såväl som U3-snoRNA (fig 4 och 5). Dessa kan antingen återspegla en nära rumslig närhet inom SSU-processom eller dynamiska strukturella förändringar inom den framväxande SSU-processomen. Noterbart verkar interaktioner mellan UtpA och UtpB med U3-snoRNA vara med specifika understrukturer av detta RNA, eftersom inga interaktioner observerades med spiral 1a, 5'-gångjärnet eller regioner som tidigare implicerats i Rrp9-bindning 33 . Denna observation stöder en temporär ordning av U3-snoRNA-bindning med distinkta platser i pre-rRNA, där den mest 5'-interaktionsplatsen, vid +280 i 5'-ETS, är bunden av U3-snoRNA före platserna vid +470 och inom 18S rRNA. The U3 snoRNA-5′ ETS interaction at +280 is required for subsequent pre-rRNA processing, but involves only a relatively short region of complementarity (11nt) 22 . We speculate that U3 snoRNP recruitment may be stimulated by UtpA via the Utp10-U3 snoRNA 3′ domain interactions, while specific U3 snoRNA-5′ ETS base-pairing may be facilitated by UtpB, via Utp1 bridging the interaction site.

Beyond the immediate early steps of eukaryotic ribosome assembly, the recent identification of Utp18 as an interaction partner of the RNA helicase and exosome cofactor Mtr4 suggests that Utp18 and hence UtpB could fulfil a dual role by both stabilizing the 5′ ETS and U3 snoRNA for productive ribosome assembly as well as recruiting Mtr4 for either degradation of 5′ ETS particles after A0/A1/A2 cleavage events or for degradation of defective ribosome assembly intermediates 37 . Intriguingly, early pre-ribosomal intermediates also contain Utp3/Sas10 and Lcp5—both of which carry putative exosome interaction domains based on their homology to Rrp47 (refs 11, 38).

In contrast to prokaryotic ribosome assembly, eukaryotic ribosome assembly is characterized by a largely expanded network of RNA chaperones and quality control factors. Many of these factors—including UtpA and UtpB subunits—contain β-propellers and α-helical repeats as building blocks. This suggests that these factors come together to assemble a very large structural framework. This structure may give rise to the 'terminal balls' long observed on the 5′ termini of the nascent pre-rRNA in 'Miller spreads' of rDNA chromatin. We speculate that this framework allows the large-scale organization—and reorganization—of the maturing pre-ribosomal particles 3 .

Methods

Strains and media

All yeast strains are derived from (BY4741, MATa; his3Δ1 ; leu2Δ0 ; met15Δ0 ; ura3Δ0 ). Standard techniques were used to integrate C-terminal affinity tags and integration of galactose-driven genes. Strains used are listed in Supplementary Data 1.

Growth of cultures and cell lysis (UtpA and UtpB)

Yeast strains used for endogenous complex purifications, YSK43 or YSK47 (UtpB) and YSK32 (UtpA), were grown to saturation in YPD medium and collected by centrifugation at 4, 000 g . Cell pellets were washed twice with ice-cold water and once with a volume of water supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64) equal to the weight of each pellet. The final cell paste was flash-frozen as 'noodles' by pushing it through a syringe into liquid nitrogen. Cell disruption was performed by cryo-milling using a Retsch Planetary Ball Mill PM 100, and the cryo-ground powder was stored at −80 °C until further use.

To overexpress Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 and Utp15-3myc-TEV-mCherry-3FLAG, a pre-culture of YSK122 was grown overnight in YP medium containing 2% (w/v) glucose at 30 °C. The pre-culture was used to inoculate a larger volume of YP medium supplemented with 2% (w/v) raffinose. Cells were grown at 30 °C in raffinose-containing medium until OD 600 =0.9. Expression of proteins under galactose promoters was induced by the addition of 2% (w/v) galactose overnight at 30 °C, and cells were collected and lysed as described above.

Purification of endogenous UtpA for protein cross-linking

30 grams of cryo-milled powder from strain YSK32 were resuspended in 30 ml of binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNaseA. The solution was incubated on ice for 30 min and cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. The cleared lysate was incubated with 500 μl of anti-GFP nanobody-coupled sepharose for 4 h at 4 °C on a nutator and washed six times with binding buffer. Bound protein complexes were eluted by incubation with TEV and 3C protease for 150 min at 4 °C. Eluted protein complexes were further purified by size-exclusion chromatography (Superose 6 10/300 GL, GE Healthcare) in binding buffer lacking glycerol and DTT.

Purification of subcomplexes of UtpA

UtpAΔUtp4, Utp10-Utp17 . 11 grams of cryo-milled YSK32 powder were resuspended in 44 ml binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64). The lysate was cleared for 30 min at 40, 000 g , 4 °C. 560 μl of anti-GFP nanobody-coupled sepharose was added to the supernatant and incubated for 3.5 h at 4 °C. Beads were washed twice with binding buffer and distributed in 14 tubes (40 μl of beads each). The aliquots were washed and incubated with binding buffer lacking glycerol and containing concentrations of NaCl ranging from 200 mM to 800 mM in 100 mM steps (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200–800 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) for 7 h at 4 °C. Protein complexes were eluted by 3C protease cleavage overnight at 4 °C. Elutions were spun at 15, 000 g for 6 min and supernatants were analysed on a 4–12% SDS-PAGE gel by Coomassie-blue staining.

UtpAΔUtp4ΔUtp10ΔUtp17 . 20 grams of cryo-milled YSK122 powder were resuspended with 80 ml of binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNaseA. The lysate was cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. 800 μl of anti-mCherry nanobody-coupled sepharose were added to the supernatant and incubated for 4 h at 4 °C. Beads were washed six times with binding buffer. The protein complex was eluted by TEV cleavage at 4 °C for 150 min. Endogenous UtpA was removed through Utp10-sbp-H14-3C-GFP by incubating the elution with anti-GFP nanobody-coupled sepharose for 30 min. The flow through was stored overnight at 4 °C and centrifuged for 10 min at 15, 000 rpm at 4 °C before injection on a Superose 6 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare) equilibrated with 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA.

Purification of UtpB for random conical tilt reconstruction

21 grams of cryo-milled powder from strain YSK43 were resuspended with 42 ml of buffer K (100 mM CHES-NaOH pH 9 (4 °C), 300 mM potassium acetate, 5 mM EDTA, 1 mM DTT) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNAseA. The solution was incubated on ice for 10 min and then cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. The cleared lysate was incubated with 666 μl anti-mCherry nanobody-coupled sepharose for 4 h at 4 °C on a nutator and washed four times with buffer K. Protease cleavage was performed in 600 μl of 50 mM HEPES-NaOH pH 7.8 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA and 2 μM TEV protease for 2 h on a nutator. The supernatant was collected, centrifuged for 15 min at 15, 000 rpm at 4 °C before injection on a Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare).

On-column glutaraldehyde cross-linking

The complex was on-column glutaraldehyde cross-linked 28 in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA as follows: 500 μl of a 0.25% glutaraldehyde solution was pre-injected onto a size-exclusion column (Superose 6 Increase 10/300 GL, GE Healthcare) and run for 20 min at a flow rate of 0.25 ml/min. The run was paused, the injection loop vigorously washed, UtpB injected, and the run was continued at the same flow rate. The on-column cross-linking procedure was optimized with UtpB purified using affinity tags on different subunits (YSK43 and YSK47, Supplementary Data 1). UtpB from both strains exposed to the pre-injected glutaraldehyde bolus exhibited the same elution behaviour as the non cross-linked complex (Supplementary Fig. 5a) and the protein complex eluted at 13.14 ml.

Purification of UtpB and subcomplexes from bacteria

Standard techniques were used to clone genes of UtpB subunits from Saccharomyces cerevisia BY4741 genomic DNA into pRSFDuet1- or pETDuet1-derivatized expression plasmids. Constructs used for bacterial expression of UtpB are listed in Supplementary Data 2. The plasmid-containing His14-3C-Utp12/Utp13/StrepII-Sumo-Utp21/Utp1 was derived by combining plasmid pSKA048 (backbone, cut with AgeI) with a PCR amplified insert from pSKA052 via compatible NgoMIV/AgeI sites (The PCR introduced NgoMIV sites in front of T7 and after T7 terminator). This resulted in a construct containing His14-3C-Utp12/Utp13/StrepII-Sumo-Utp21/Utp1.

All constructs were expressed in E. coli RIL plasmid-containing cells. For co-expression of pSKA041-His-3C-Utp21/Utp1 with pSKA056-mCherry-3C-Utp6/Utp18 competent E. coli RIL cells were prepared with a pre-transformed plasmid pSKA041. Protein expression was induced by addition of 1 mM IPTG at an OD 600 between 0.6 and 1.0. Cells were grown overnight at 20 °C, collected and flash-frozen as cell pellet or used immediately. Cell pellets were resuspended in Lysis and Wash buffer consisting of 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl supplemented with protease inhibitors (PMFS, Pepstatin A, E64), DNAse and Sumo protease in the case of pSKA061 (no second affinity step was required). Cell lysis was performed using a cell disruptor (TS5, Constant Systems), and the cell lysate was cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 60 min. The cleared lysate was passed through a 5-ml HisTrap column (GE Healthcare) and washed by increasing the imidazole concentration to 70 mM. Proteins were eluted in 250 mM imidazole and fractions containing protein were pooled, supplemented with 3C protease and dialyzed overnight against 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM DTT. To remove uncleaved protein and the cleaved affinity tag, the solution was passed once more over the 5-ml HisTrap column. The flow through was concentrated and further purified on a HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare) in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Proteins were supplemented with 10% glycerol, flash-frozen and stored at −80 °C.

Analytical size-exclusion chromatography

Size-exclusion chromatography analysis of bacterial subcomplexes of UtpB (Supplementary Figs 3a and 7a) was performed in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA using a Superose 6 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare) at a flow rate of 0.5 ml/min. 500 μl samples of 2 μM UtpBΔUtp6ΔUtp18 were injected either alone, with 4 μM Utp6/Utp18 or with 4 μM Utp6. For the Utp12/Utp13 size-exclusion chromatography run, 500 μl of 0.25 μM Utp12/Utp13 were injected. Peak fractions were analysed on 4–12% SDS-PAGE and Coomassie-blue staining (Supplementary Figs 3b and 7b, c).

UtpB pull-down experiments

The pull-down assay (Supplementary Fig. 3c) was performed using Nickel Sepharose 6 fast flow beads (GE Healthcare). His-tagged Utp6 was used as bait either alone or co-expressed with Utp18. Proteins were pre-incubated at a concentration of 1 μM in 100 μl for 10 min on ice in buffer PD (50 mM Hepes-NaOH, pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 70 mM Imidazole) and applied on 20 μl of washed and dried beads. After 20 min incubation on ice, beads were washed 5 times with buffer PD and carefully dried. Proteins were eluted with 45 μl buffer PD supplemented with 2 μM 3C protease. The supernatant was removed and analysed by 4–12% SDS-PAGE and Coomassie-blue staining.

DSS cross-linking of UtpA

Peak fractions of size-exclusion chromatography-purified UtpA (in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA) were pooled (total volume 2 ml) and split into 200 μl cross-linking reactions. To each 200-μl aliquot 0.8 μl of DiSuccinimidylSuberate (DSS; 50 mM, 1:1 molar ratio mixture of DSS-H12 and DSS-D12, Creative Molecules Inc.) was added to yield a final DSS concentration of 0.2 mM. Samples were incubated at 25 °C for 30 min with 400 rpm constant shaking. The cross-linking reaction was quenched with 50 mM ammonium bicarbonate. Cross-linked samples were precipitated by adding methanol to a final concentration of 90% and overnight incubation at −80 °C. Precipitated cross-linked UtpA was collected in one tube by repeated centrifugation of the precipitated solution at 21, 000 g , 4 °C for 15 min. The resulting pellet was washed once with 1 ml cold 90% methanol, air-dried and resuspended in 50 μl of 1X NuPAGE LDS buffer (Thermo Fisher Scientific, #NP0007).

DSS cross-linking of UtpBΔUtp6ΔUtp18

The cross-linking reaction of UtpBΔUtp6ΔUtp18 (size-exclusion purified in buffer 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA) was performed in a total reaction volume of 150 μl at room temperature using different DSS concentrations (0.2, 0.4 and 0.8 mM 1:1 molar ratio mixture of DSS-H12 and DSS-D12, Creative Molecules Inc.) at a protein concentration of 0.2 mg/ml. The reaction was stopped after 30 min with 50 mM ammonium bicarbonate and supplemented with NuPAGE LDS (1X final). 10 μl of the reaction was analysed by 4–12% SDS-PAGE.

Mass spectrometry analysis of UtpA and UtpBΔUtp6ΔUtp18

DSS tvärbundna UtpA- eller UtpB-komplex i LDS-buffert reducerades med 25 mM DTT, alkylerades med 100 mM 2-kloroacetamid, separerades med SDS-PAGE med användning av flera banor med en 4-12% Bis-Tris gel och färgades med Coomassie- blå. Gelområdet motsvarande de tvärbundna komplexen skivades och digererades i gel över natten med trypsin för att generera tvärbundna peptider. Efter spjälkning surgjordes peptidblandningen och extraherades från gelén som tidigare beskrivits 39, 40 . Analyser med LC-ESI-MS utfördes antingen direkt på de extraherade peptiderna eller efter fraktionering genom kromatografi med storleken-exkludering eller kromatografi med hög pH-omvänd fas. Peptider laddades på en EASY-spray-kolonn (Thermo Fisher Scientific, antingen ES800: 15 cm × 75 mikrometer ID, PepMap C18, 3 mikrometer eller ES801: 15 cm × 50 mikrometer ID, PepMap RSLC C18, 2 mikrometer) via en EASY- nLC 1000. MS- och MS / MS-analyser utfördes på en Q Exactive Plus-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific). MS / MS-analyser av de 8 bästa prekursorerna i varje full scan använde följande parametrar: upplösning: 17 500 (vid 200 Th); AGC-mål: 2 × 10 5 ; maximal insprutningstid: 800 ms; isoleringsbredd: 1, 4 m / z; normaliserad kollisionsenergi: 29%; laddning: 3–7; intensitetströskel: 2, 5 × 10 3 ; peptidmatch: av; dynamisk uteslutningstolerans: 1 500 mmu. Tvärbundna peptider identifierades från massspektra med pLink 17 . Alla spektra som rapporterats här var manuellt verifierade 39, 40 .

Alla tvärbindningar som hittades för UtpA och UtpB visas i kompletterande data 3 och kompletterande data 4. Siffrorna framställdes med användning av xiNET 42 (fig 1f och 2g, och kompletterande figur 2).

Ultraviolett tvärbindning och hög genomströmningsanalys av cDNA (CRAC)

Jäststammar som aktivt växte i SD-TRP-medium vid 30 ° C med ett OD 600 av 0, 5 bestrålades vid 254 nm UV under 100–110 s såsom beskrivits 24 . Rening av RNA-proteinkomplex och RT-PCR-amplifiering av associerade RNA-fragment utfördes såsom beskrivits 33 . cDNA-bibliotek sekvensbestämdes på en Illumina HiSeq2500 vid Edinburgh Genomics, University of Edinburgh. Illumina-sekvenseringsdata anpassades till jästgenomet med användning av Novoalign (//www.novocraft.com). Bioinformatikanalyser utfördes enligt beskrivning med användning av PyCRAC 43, 44 .

Negativfärgad EM-analys av UtpA

Renat UtpA applicerades på glödutmatade hemgjorda kolbelagda koppargaller och färgades negativt med 0, 75% uranylformiat såsom beskrivits tidigare 45 . Bilder inspelades på en Philips CM10 som drivs med en accelerationsspänning på 100 kV utrustad med en XR16-ActiveVu (AMT) kamera med en nominell förstoring på 52 000 × och en kalibrerad pixelstorlek på 2, 8 Å vid provnivån.

Negativfärgad EM-analys av UtpB saknar Utp6 och Utp18

Rekonstituerad UtpB som saknade Utp6 och Utp18 var tvärbunden på kolonnen som endogen UtpB, applicerades på glödutsläppt kolbelagt 200 mesh koppargaller (Electron Microscopy Sciences, CF200-Cu) och färgades med 2% uranylacetat. 98 mikrografer samlades vid en nominell förstoring av 49 000 vid en defokus på -1, 6 mikrometer på en Tecnai G2-anda som opererades vid 120 kV och en resulterande pixelstorlek på 2, 17 Å vid provnivån. 8 171 partiklar valdes manuellt med användning av e2boxer.py och fönstrades in i bilderna med 230 × 230 pixlar. Partiklarna utsattes för ISAC, vilket specificerade 50 bilder per grupp och en pixelfeltröskel på 0, 7. 23 generationer gav 171 klasser, svarande för 3 343 partiklar (41% av hela datauppsättningen; Kompletterande figur 6b).

Negativfärgad EM- och 3D-rekonstruktion av UtpB

Endogent UtpB applicerades på glödutmatade hemgjorda kolbelagda koppargaller och färgades negativt med 0, 75% uranylformiat såsom beskrivits tidigare 45 . Bilder inspelades på en Tecnai T12 som drivs med en accelerationsspänning på 120 kV. Vipppar registrerades med en Gatan 4k CCD-kamera under lågdosförhållanden vid en kalibrerad förstoring av 57 555 × och en resulterande pixelstorlek av 2, 61 Å vid provnivån. Totalt samlades 420 lutningsparamikrografer vid ett defokus på -1, 6 μm (mikrografpar 1–159 vid lutningsvinklar på 50 ° och 0 °, de återstående paren i lutningsvinklar på 60 ° och 0 °).

26 510 partikelpar valdes manuellt med användning av e2RCTboxer.py 46 och lutningsvinklar bestämdes med användning av tiltpicker 47 . Partiklar fönstrades in i 192 × 192 pixlar och normaliserades. Partikelbilderna från de tilltänkta proverna utsattes för ISAC, vilket specificerade 50 bilder per grupp och ett pixelfeltröskelvärde på 0, 7. 14 generationer gav 598 klasser, svarande för 9 077 partiklar (34% av hela datauppsättningen; kompletterande fig. 6a). Parallellt justerades partikelbilderna roterande och translationellt och underkastades 10 cykler av multireferensinriktning med hjälp av SPIDER 31 . Varje runda med multi-referensinriktning följdes av K-medel klassificering som specificerade 50 utgångsklasser (kompletterande figur 8c). De referenser som användes för den första multi-referensinriktningen valdes slumpmässigt från partikelbilderna. För utvalda klasser beräknades sedan 3D-rekonstruktioner med partikelbilderna från det lutade provet med användning av backprojektions- och bakprojektionsförädlingsprocedurerna i SPIDER (kompletterande figur 8d). Den slutliga volymen av UtpB (fig. 3c, kompletterande fig. 9b) erhölls genom att kombinera 5 klasser (grupper 8, 13, 19, 33 och 47, kompletterande fig. 8d: blå volymer), och med användning av vinkelförädlingsproceduren i SPINDEL. Denna täthetskarta inkluderade 3 517 partiklar valda från bilder av det lutade provet och 319 partiklar från bilder av det tills lutade provet. Alla volymer filtrerades med låg passning till 20 Å och bruset som omger volymen avlägsnades med hjälp av automatisk maskprocedur i e2proc3d.py (ref. 46).

Data tillgänglighet

Den negativa fläck-EM-kartan för Saccharomyces cerevisiae UtpB-komplexet har deponerats i Electron Microscopy Data Bank under anslutningskoden EMD-8223. All sekvensdata har deponerats i databasen Gene Expression Omnibus (GEO) (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under anslutningsnumret GSE79950. Uppgifterna som stöder resultaten från denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

Ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln: Hunziker, M. et al . UtpA och UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA och U3 snoRNA för att initiera eukaryot ribosommontering. Nat. Commun. 7: 12090 doi: 10.1038 / ncomms12090 (2016).

anslutningar

Elektronmikroskopidatabank

  • EMD-8223

Genuttryck Omnibus

  • GSE79950

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer och referenser

    Kompletterande figur 1-11 och kompletterande referenser

  2. 2.

    Peer Review File

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

    jäststammar

  2. 2.

    Kompletterande tabell 2

    plasmider

  3. 3.

    Kompletterande tabell 3

    UtpA CL-MS-data

  4. 4.

    Kompletterande tabell 4

    UtpB CL-MS-data

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapens riktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.