Urinprasasin hos normotensiva individer: korrelation med aldosteron till reninförhållande och urinnatrium | hypertoni forskning

Urinprasasin hos normotensiva individer: korrelation med aldosteron till reninförhållande och urinnatrium | hypertoni forskning

Anonim

ämnen

  • Hormonterapier
  • hypertension
  • Njure
  • Steroidhormoner

Abstrakt

Prostasin, en glykosylfosfatidylinositol (GPI) -ankrad serinproteas, aktiverar epitelialatrium (Na) -kanalen (ENaC), och prostasin frisätts i extracellulära vätskor, inklusive urin. Tidigare data har föreslagit en direkt associering mellan urinprostatin och aktiveringen av en aldosteron-driven väg, men en kvantitativ associering har aldrig visats i normotensiva personer. På liknande sätt har fysiologiska förhållanden med natriuresis eller möjliga köns- eller kvinnliga hormonrelaterade förändringar i urinprostatasinkoncentrationer aldrig undersökts. Vi mätte urinprasasin genom enzymbunden immunosorbentanalys hos 43 friska normotensiva personer med liknande ålder med olika Na-nivåer i urin och hos 15 kvinnor under menstruationscykeln och efter oral öst-progestinisk preventivmedelsterapi (OC). Exosomalt urinprotasin uppskattades också genom western-blotting av prover från sex friska personer två gånger under morgonen. Urinprostasin presenterade ett stort antal värden (från 0, 5 till 18, 9 n M) utan könsskillnader. Det var positivt korrelerat med aldosteron till renin-förhållandet (ARR) men inte med cirkulerande aldosteron eller renin individuellt. Urinprasasin korrelerades direkt med U-Na-nivåer (upp till 200 nmol Na), medan det minskade för högre Na-koncentrationer. Hos kvinnor observerades inga signifikanta förändringar av prostasinkoncentrationen under menstruationsfaser. Efter OC-behandling ökade prostasin (från 2, 37 ± 1, 27 till 4, 85 ± 5, 28 n M), även om ökningen inte var statistiskt annorlunda ( P = 0, 07). Prostasin var detekterbart i exosomer i urinen och uppvisade ett mönster som liknade prostasin i urin i förhållande till urin Na. Sammanfattningsvis korrelerar urinprostatin med ARR, och det moduleras fysiologiskt av natriuresis hos normotensiva individer.

Introduktion

Aldosteron, det viktigaste mineralokortikoidhormonet hos människor, har en viktig roll för att bibehålla natrium (Na), upprätthålla balans i vattenkroppen och i slutändan i att reglera blodtrycket (BP) främst genom modulering av Na-reabsorption på njurnivån. I synnerhet leder en aldosteron-driven väg till aktiveringen av den epiteliala Na-kanalen (ENaC) vid den distala tubulen och uppsamlingskanalnivån, vilket slutligen främjar cell Na-inträde för kalium (K) -utgång i ekvimolära proportioner. ENaC är ett membrankomplex lokaliserat inte bara i njurarna utan också i flera andra vävnader och organ som är involverade i underhåll av Na (det vill säga luftvägar, hud, kolon och salivkörtlar). Kanalen består av tre homologa subenheter (a, p och y) 1 som är funktionellt komplementära för att aktivera ENaC genom en sekventiell samarbetsmekanism. Dessa underenheter är endast delvis igenkända och karakteriserade. 2

Under de senaste åren har stor uppmärksamhet ägnats specifikt åt proteolytiska mekanismer som kan aktivera ENaC genom att avlägsna hämmande peptider på p- eller y-kedjorna. Ett av de mest intressanta proteinerna som undersöktes i detta sammanhang är prostasin, ett 40-kDa serinproteas som först upptäcktes i prostatakörteln och spermvätskan. 3, 4

Prostasin aktiverar ENaC när det uttrycks i oocyter, och tillsatsen av aldosteron till odlade musuppsamlingskanaler ökar ENaC-aktiviteten genom att öka prostasinsekretion, mRNA och proteinuttryck. 5, 6 Sammanfattningsvis antyder de för närvarande tillgängliga data konsekvent att aldosteron inducerar aktiveringen av prostasin och, i samarbete med andra proteas (er), såsom furin, klyver (på en eller flera platser) y-underenheten för ENaC, vilket bidrar till avlägsnandet av en hämmare-peptid och ökar sannolikheten för kanalöppningen. 7, 8 Prostasin är också av intresse eftersom det är ett glykosylfosfatidylinositol (GPI) -försett protein, som utsöndras i extracellulära vätskor såsom urin, 9 och mängden frisatt i urin verkar vara starkt proportionell till graden av ENaC-aktivering. 6 Narikiyo et al. 6 var de första som visade ett överuttryck av prostasin i urinen hos tre patienter som drabbades av Conns adenom, vilket dramatiskt minskade efter binjurekirurgi, vilket således antydde en koppling mellan onormal aldosteronsekretion och frisättningen av prostasin i urinen.

I en tidigare studie, 10, visade vi, för första gången, att prostasin är detekterbart i urinen hos friska försökspersoner av båda könen (det vill säga, oavsett närvaron av en prostata). Vidare visade vi att efter anti-aldosteronbehandling med spironolakton minskade urinprostatin hos personer med lågt Na-intag (där renin – aldosteronaxeln aktiverades), medan den var oförändrad hos personer med högt Na-intag. Vi antog att det finns en basal mängd prostasin, konstitutivt frisatt i urin oavsett Na-intag och hormonaktivering, och en 'aldosteron-responsiv' alikvot, strikt påverkad av aldosteron och Na-balans.

Dessa preliminära resultat, som baserades på immunblottingmetoder, gav emellertid inte en exakt kvantifiering av den absoluta prostasinkoncentrationen. Detta uppnåddes för första gången 2009 av två oberoende grupper som beskrev en nyutvecklad radioimmunologisk metod för att analysera prostasin i mänsklig urin; 11, 12 finns dock för närvarande begränsade data om fysiologisk variation och reglering av prostasinfrisättning i urin.

Det är välkänt att hos kvinnor är könshormonfluktuationer under menstruationscykeln associerade med motsvarande variationer av renin – aldosteronaxeln. 13 I en nyligen genomförd studie visade vi att både naturliga och farmakologiska kvinnliga hormoner, såsom de som finns i orala p-piller, påverkar aldosteron- och reninkoncentrationer och påverkar den diagnostiska upparbetningen av primär aldosteronism. 14 Det har nyligen rapporterats att prostasin uttrycks på en relativt hög nivå i trofoblaster hos mänskliga placenta under tidiga graviditetsveckor, vilket ytterligare stödjer en möjlig korrelation med könshormoner.

Eftersom fysiologiska cykliska variationer av kvinnliga hormoner förändrar Na-balansen och påverkar saltretention, antar vi att urinprostatin kan följaktligen moduleras under olika faser av menstruationscykeln och / eller efter OC-terapi. Exosomer är små (20–100 nm) membranvesiklar som har sitt ursprung som inre vesiklar i multivesikulära kroppar och frigörs i den extracellulära miljön (inklusive urin) genom fusion av multivesikulära kroppens yttre membran med plasmamembranet. Därför representerar exosomer en bra källa till proteiner med tubulärt cellurs ursprung. 16

Baserat på alla dessa överväganden planerade vi denna studie med följande syften:

  1. att definiera möjliga könsspecifika skillnader i urinprostasinkoncentrationer mellan män och kvinnor i liknande ålder för att definitivt utesluta påverkan av eventuellt spill från prostatakörteln, den viktigaste källan till prostasin hos människor;

  2. att studera förhållandena mellan koncentrationen av urinprostasin, natriuresis och aktiveringsmarkörerna för renin – aldosteron;

  3. att bedöma koncentrationen av urinprotein hos friska kvinnor under de olika faserna i menstruationscykeln för att utvärdera möjliga förändringar parallellt med aldosteron- och reninvariationer; och

  4. att på liknande sätt utforska OC-terapin effekterna på prostasinkoncentration.

Slutligen, för att bekräfta data som erhållits från urinen, undersöktes natriures-associerade förändringar av "cell" -prostatin också i urin exosomer. I överensstämmelse med en nyligen genomförd studie av djurmodeller rapporterade av van der Lubbe et al. 17 prostasin var påvisbart i humana urin exosomer.

metoder

Friska ämnen

Vi registrerade 43 normotensiva individer (15 kvinnor och 28 män) bland de friska frivilliga Center of Clinical Research på 'Azienda Ospedaliero-Universitaria Integrata' i Verona, Italien. De frivilliga konsumerade en obegränsad kost, hade ingen personlig eller familjell historia av hypertoni eller andra betydande sjukdomar och presenterade normala BP-värden; ett kriterium för inskrivning var dessutom att försökspersonerna hade preliminära rutinblodtest (inklusive serumkreatinin) inom det normala intervallet. Kvinnliga patienter måste ha ett negativt graviditetstest och regelbundna, förutsägbara, cykliska menstruationer för att undvika menstruationsblödning under studieperioden (48 timmar). Efter att informerat samtycke erhölls ombads varje individ att samla in sin första morgonurin. Nivåer av Na +, K +, kreatinin, aldosteron och aktiv renin analyserades i venösa blodprover som tagits efter fastnat över natten.

Friska bördiga kvinnor på fri menstruationscykel

Femton unga friska normotensiva kvinnor, utan sjukdomshistoria och som hänvisades för preventivmedelsrådgivning till en enda läkare vid avdelningen Obstetric and Gynecology vid University of Verona, deltog i studien. Urin- och blodprov samlades in i follikelfasen i deras menstruationscykler (mellan den 14: e och den 16: e dagen), i lutealfasen (mellan den 20 och 22: e dagen) och efter 2 månaders OC-terapi. Alla patienter ordinerade samma tredje generationens piller, som består av 0, 075 mg gestoden och 0, 02 mg östradiol. Vid var och en av de tre tidspunkterna mättes BP och medelvärdena registrerades.

Protokollet godkändes av vår institutionella granskningskommitté, och skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne före inledningen av studien.

Systoliskt och diastoliskt BP mättes noggrant i alla registrerade studiepersoner. BP utvärderades två gånger i båda armarna, varvid personen var kvar i sittande position under 5 minuter och patienten undvikte kaffeintag och rökning under de föregående 30 minuterna. Ytterligare mätningar (vid behov) utfördes om skillnaderna i BP-värden var were5 mm Hg.

Prostasinanalys

En komplett proteasinhibitorcocktail (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) sattes till den nyligen samlade urinen och pH justerades till 7, 0 genom tillsats av 1 M NaOH efter behov. Urinprover centrifugerades vid 4 ° C och filtrerades sedan och koncentrerades slutligen (se nedan). Proverna lagrades vid -30 ° C fram till användning.

Ett konkurrerande enzymbundet immunosorbentanalys (ELISA) test inrättades genom att utnyttja kaninsvaret mot en specifik, mycket immunogen, prostasinpeptid (aminosekvens: AHQLDSYSEDAKVSTLKDI). Polyklonala antikroppar erhölls från kaniner ympade enligt metoden som tidigare beskrivits av Koda et al. 11 I korthet genererades antiserum i en kanin med hjälp av en lymfkörtelinjektionsteknik. Efter 2 veckor drogs blod och serumet separerades och förvarades. Efter specifik rening neutraliserades, lyofiliserades och rekonstruerades antikroppen; 11 demonstrerades ingen korsreaktivitet med kallikrein, renin, angiotensin-omvandlande enzym, prostaglandiner och steroider av antikroppen. 11 Analysdetaljerna är också en del av ett patent (US2009 / 0170126A1, 2 juli 2009). I korthet belades mikrotiterplattor med renade specifika anti-prostasinantikroppar löst i beläggningslösning (2 mg ml-1-antikropp, 100 ul per brunn) genom inkubation under 16 timmar vid 4 ° C. Varje platta tvättades tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning med Tween-20 (PBST; Tween 0, 5%) och blockerades med bovint serumalbumin (1%) under 2 timmar vid rumstemperatur. Seriella utspädningar av prostasinpeptid och alikvoter av urinproverna (50 ul per brunn) tillsammans med biotinylerad prostasinpeptid (2, 5 ng ml −1, 50 ul per brunn) fördelades i den belagda plattan och inkuberades under 1 timme på en roterande skakor vid rumstemperatur. Därefter tvättades plattan tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning med Tween-20, och avidinperoxidas-konjugat (1/20 000 med utspädningsmedel, 100 ul per brunn) tillsattes. Detta steg följdes av inkubering i 1 timme på en roterande skakare i rummet vid rumstemperatur. Plattorna tvättades sedan igen såsom beskrivits ovan. Substratlösningen (Neogen Corporation, Lexington, KY, USA, K-Blue TMB-substrat) tillsattes (100 ul per brunn), och plattan inkuberades sedan under 30 minuter på en roterande skakrör vid rumstemperatur. Den enzymatiska reaktionen stoppades genom tillsats av lämplig lösning (1 NH2S04, 100 ul per brunn), och absorbansvärdena avlästes vid 450 nm. En kubisk regressionsekvation användes för att passa på standardkurvan genererad genom ELISA-analysen. Provkoncentrationen av prostasin beräknades genom extrapolering. Inter-analysen och intra-analysens variationskoefficient för metoden var <9% respektive <11%; analysens känslighetsgräns var en prostasinkoncentration .50, 5 ng ml −1 . Kalibreringskurvorna var ganska bra, och återhämtningstester indikerade hög prestanda (i termer av% återhämtning både i buffert eller i urinmatriser).

Urin exosomer: isolering och analys

Urin från sex normotensiva individer uppsamlades vid två olika tidpunkter under dagen (tidigt och sent på morgonen) och behandlades för exosom extraktion. Urin Na kvantifierades i den uppsamlade urinen med användning av en rutinmetod. Urin exosomer extraherades med hjälp av en nanomembrankoncentratorprocedur enligt protokollet beskrivet av Cheruvanky et al. 18 med mindre ändringar. Kortfattat, efter omfattande virvelbildning, centrifugerades urinprover vid 13 000 × g under 40 minuter vid 4 ° C. 25 milliliter supernatant laddades i fosfatbuffrad saltlösning, förkonditionerade, sterila nanomembrankoncentratorer (Vivaspin-koncentratorer, Sartorius, Goettingen, Tyskland) och centrifugerades vid 3500 g och 4 ° C tills hela urinen filtrerades. Flödet genom kastades. Exosomer inom filtren utvanns med användning av 2x Laemmli-buffert.

Kvaliteten på mikrovesikelpreparat bedömdes med elektronmikroskopi och Aquaporin Western immunblotting (se kompletterande material). Proteinkoncentrationerna uppskattades med användning av en bicinchoninsyraanalys.

Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och western blotting

Exosomfraktioner i urin användes för prostasinbestämning med användning av en specifik antikropp. Alikvoter med samma totala proteininnehåll (25 μg) laddades på 12% T natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgeler. Gelerna kördes och överfördes sedan till ett polyvinylidendifluoridmembran såsom tidigare beskrivits. 10 Kortfattat undersöktes membranen med en prostasin primär antikropp (BD Biosciences, Milan, Italien) och anti-Aquaporin 2 primär antikropp (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) vid lämpliga utspädningar (1: 250 och 1: 2000) i 1% icke-fett torkad mjölk, 0, 05% Tween-20 Tris-buffrad saltlösning under 3 timmar vid rumstemperatur. Flotten inkuberades sedan 45 minuter vid rumstemperatur med lämplig pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp (1:10 000 utspädning; GE Healthcare Europe GmbH, Milan, Italien). Immunkomplexen detekterades genom kemiluminescens (ECL, GE Healthcare Europe GmbH). Membranen färgades med Amido Black Stain för normaliseringsändamål, och filmerna skannades och bearbetades med användning av Quantity One-programvara version 4.4 (GelDoc, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Biokemisk analys

Patientens blodprov samlades in efter en fasta över en natt. Alla biokemiska tester, inklusive urinkreatinin, utfördes i laboratoriet för klinisk kemi vid universitetet i Verona. Aldosteron- och direkta aktiva reninnivåer bestämdes med kommersiellt tillgängliga metoder (DiaSorin Diagnostics, Turin, Italien) och uttrycktes i pg ml −1 .

Statistisk analys

Statistiska analyser utfördes med SPSS 16.0 för Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). De kvantitativa värdena uttrycktes som medel ± sd Vid behov applicerades logaritmisk transformation för att erhålla en normal fördelning, och variabiliteten hos data uttrycktes som 95% konfidensintervall. Studentens t- test för parade data utfördes genom att jämföra data från samma försökspersoner. Korrelationer testades genom enkel bivariat korrelationsanalys.

Resultat

Hos normotensiva individer ( n = 58) presenterade proteiner i urin ett stort antal värden (intervall 0, 5–18, 9 n M) utan skillnader relaterade till kön (betyder 3, 89 ± 4, 38 n M hos män, n = 28 och 5, 19 ± 5, 18 n M hos kvinnor, n = 30). Urin-prostasinnivåer var positivt korrelerade med aldosteron-till-renin-förhållandet (ARR; r = 0, 363, P = 0, 02) men inte med cirkulerande aldosteron- eller reninnivåer individuellt (data visas inte). Ingen statistisk korrelation var tydlig med andra biokemiska parametrar.

Med tanke på gruppen med 58 friska individer som helhet (43 friska frivilliga från både kön och 15 kvinnor före OC-terapi) klassificerades alla försökspersoner enligt fördelningsprocentilerna av prostasin för att utvärdera de specifika egenskaperna associerade med olika koncentrationer av serin proteas. Den mest ökade urinkoncentrationen (den övre tertilen i distributionen) var associerad med både den högsta ARR och den högsta utsöndringen av prostasin per enhet Na (tabell 1). Med undantag för något högre serumkaliumnivåer observerades inga andra relevanta skillnader inom undergrupperna med en låg mellanliggande koncentration av prostasin (tabell 1).

Full storlek bord

Eftersom aldosteron-medierad Na-reabsorption starkt påverkas av Na-intaget i kosten och med antagande att Na-urin kan fungera som en fullmakt för ett sådant intag, undersöktes också möjliga samband mellan denna senare parameter och urinprostatin. Sammantaget korrelerades koncentrationen av serinproteaset med U-Na på ett komplext sätt, såsom beskrivs av plottet som rapporterats i figur 1. Sammanfattningsvis ökade urinprostatasinnivån linjärt upp till koncentrationsgränsen på cirka 200 mmol l-1 Na (under detta värde korrelerades båda variablerna linjärt med R = 0, 40, P <0, 05), medan det minskade för högre U-Na-koncentrationer (figur 1).

Förhållandet mellan urin (U) -prostasinkoncentration (n M) och U-Na (mmol l −1 ) hos friska försökspersoner. Urinprasasin ökar linjärt upp till koncentrationsgränsen på cirka 200 mmol l1-natrium (Na) och minskar för mer förhöjda U-Na-koncentrationer. En fullfärgsversion av denna siffra finns tillgänglig i tidskriften Hypertension Research online.

Bild i full storlek

För att bekräfta de erhållna urinuppgifterna undersöktes natriures-associerade förändringar av 'cellprostasin' också i urin exosomer från sex olika friska personer (tre män och tre kvinnor). Exosomkvaliteten i urinen bedömdes genom elektronmikroskopi och västlig immunblotting av AQ2 (kompletterande material). För att utvärdera de möjliga interindividuella variationerna utfördes prostasinimmunblotting hos samma individ på exosomer som samlats in två gånger under morgonen (figur 2). Som observerats i hel urin var koncentrationen av exosom prostasin också högre hos personer med högre natriurese (U-Na-värden <200 mmol l −1 ), medan den minskade när U-Na-halterna var> 200 mmol l −1 .

Western immunblotting ( a ) och grafisk representation av urinnatrium (U-Na) utsöndring ( b ) i enlighet med exosomala prostasinband intensiteter. Vid U-Na> 200 mmol l −1 sjönk prostasinvärdena. Värdena för prostasin extraherades från exosom prostasinimmunblotting vid två tidpunkter under morgonen hos sex personer. En lika stor mängd av totalt exosomalt proteinekstrakt urin laddades per spår (25 μg) och triplikatförsök utfördes. AU, godtyckliga enheter. En fullfärgsversion av denna siffra finns tillgänglig i tidskriften Hypertension Research online.

Bild i full storlek

Hos fertila kvinnor bekräftade jämförelsen mellan follikulära och luteala faser aktiveringen av aldosteron-reninaxeln under menstruationscykeln, med upphöjda luteala aldosteron- och reninkoncentrationer men utan konkorda ändringar av deras förhållande (aldosteronintervall 167 ± 90 till 341 ± 175 pg ml-1, P <0, 01; reninområde 12 ± 8, 3 till 20 ± 12, 4 pg ml -1, P = 0, 05; ARR-intervall 17, 4 ± 11, 3 till 20, 7 ± 11, P = NS). I likhet med ARR varierade nivån på prostasin i urin inte väsentligt i luteal jämfört med follikelfasen (prostasinområdet 2, 97 ± 3, 58 till 2, 35 ± 1, 23 n M; data visas inte).

Efter OC-terapi minskades aldosteron- och reninvärdena signifikant (aldosteronområdet 341, 0 ± 175, 5 till 201, 0 ± 99, 7 pg ml −1 ; reninområdet 19, 7 ± 12, 5 till 6, 9 ± 3, 3 pg ml −1 ), medan ARR ökade (från 20, 7 ± 11, 0 till 33, 7 ± 18, 3). Urinprasasin tenderade också att öka (2, 37 ± 1, 27 till 4, 85 ± 5, 28 n M) konsekvent med ARR (se ovan); denna ökning var dock inte statistiskt signifikant ( P = 0, 07; tabell 2).

Full storlek bord

Diskussion

Ett viktigt resultat av denna studie är den kvantitativa utvärderingen av urinprostatin med ELISA, en analys som kan ge en mer exakt definition av graden av serinproteasfrisättning i urin jämfört med den semikvantitativa informationen från tidigare verk som använde immunblottingmetoder.

ELISA-analysen baserades på prostasinigenkänning genom antikroppar som specifikt reagerade mot en immunogen peptid av prostasin, vilket resulterade i en god korsreaktion med hela det rekombinanta proteinet som användes som en standardreferens i preliminära experiment och i kalibreringskurvor. Metodens noggrannhet var ganska bra med intra- och inter-analysskoefficient för variationer <11% och en lägre detektionsgräns på .50, 5 ng ml −1 prostasin. Metoden som beskrivs här är en modifiering av analysen som tidigare publicerats av Koda et al. 11 och utnyttjar samma process för produktion, identifiering och rening av samma anti-prostasinantikroppar.

Endast två tidigare artiklar, av Koda et al. 11 och Zhu et al., 12 har kvantitativt uppmätt koncentrationen av prostasin i urinen hos människor. I rapporten från Koda et al. , 11 26 friska normotensiva personer utvärderades tillsammans med 121 hypertensiva patienter. Således var det inte lätt att dra slutsatsen att de fysiologiska mekanismerna som reglerar frisläppandet av urinprostatin med tanke på att Na-njurhantering hos hypertensiva patienter sannolikt kommer att skilja sig från den hos normotensiva personer.

Zhu et al. 12 syftade till att utvärdera det natriuretiska svaret på ett väldefinierat stresstest hos svarta ungdomar, men prostasinkoncentrationen mättes inte innan början av en Na-kontrollerad diet. Därför, som fallet med Koda-gruppen, tillät den experimentella designen inte forskarna att dra slutsatser om den fysiologiska regleringen av prostasin frigjord i urin som svar på natriures-variationerna.

De försökspersoner som valts ut för denna studie var friska normotensiva individer som gick på en fri diet, hade urinjonnivåer som var kompatibla med den vanliga västra diet och presenterade normala koncentrationer av aldosteron och renin. I detta sammanhang var vi intresserade av att klargöra hur urinproteinkoncentrationen förändrades i förhållande till fysiologisk natriures för att få insikt i de naturliga mekanismerna som kontrollerar frisättningen av prostasin i urinen.

De flesta tillgängliga fynd från cellkultur in vitro och djurstudier 6, 19 stödjer uppfattningen att losning av prostasin från glykosylfosfatidylinositol (GPI) -ankret representerar ett obligatoriskt steg och / eller konsekvensen av den proteolytiska klyvningen för att aktivera ENaC. Hos människor har det aldrig visats att frisättning av prostasin in vivo speglas linjärt av den funktionella aktiveringen av ENaC. I en gnagarmodell följdes adenovirusmedierad human prostasingenleverans av ökad urinutskillelse urin trots aldosteronstimulering och BP-förhöjning. 19 Dessa resultat stod i kontrast till den förväntade Na-retentionen.

Resultaten av denna studie ger experimentella bevis på att det fysiologiska sambandet mellan ENaC-aktivitet och urinprostatin är bimodalt och att prostasin är negativt associerat med U-Na (som teoretiskt förväntat) endast under höga Na-intagstillstånd. Frisättningen av urinprostatin ökade linjärt upp till koncentrationsgränsen på cirka 200 mmol l-1 U-Na, medan det minskade över denna U-Na-tröskel (se figur 1 och 2). Fenomenet observerades i ett stabilt tillstånd av normotension, det vill säga adekvat renal Na-hantering och BP-natriuresis-samband. Om man antar en direkt proportionalitet med frisläppande av prostasin i urin tyder dessa resultat på att ENaC-medierad Na-reabsorption hämmas fysiologiskt endast vid U-Na-koncentrationer över 200 mmol, medan den fortfarande förekommer vid lägre koncentrationer. Med beaktande av den nödvändiga försiktigheten på grund av de olika experimentella metoderna, är resultaten av denna studie också i överensstämmelse med in vitro- fenomenet känt som "självhämning av ENaC", där det har visats att intracellulär Na hindrar ENaC-klyvning och på så sätt minska Na-transporten. 20

Våra tidigare resultat erhållna med ett annat tillvägagångssätt, baserat på västerländsk immunblotting, indikerar dessutom en minskning av urinprostatin hos normotensiva individer efter Na-belastning och farmakologisk aldosteronblockad. 10 Med tanke på den halvkvantitativa naturen hos dessa resultat utför vi ytterligare experiment för att upprepa och bekräfta våra tidigare resultat i en större uppsättning prover. Dessutom är våra preliminära ELISA-data om urinprostatin (normaliserade med urinkreatinin) överens med den observerade minskande trenden (data visas inte).

För att ytterligare stödja våra resultat studerade vi urin exosomer som möjliga "direkta" cellkällor för prostasin. Exosomer frigörs i urinrummet genom en process med fusion av det multivesikulära kroppens yttre membran med det apikala plasmamembranet. Det exosomala uttrycket av prostasin överensstämde med resultaten erhållna från total urin (figur 2), det vill säga prostasin ökade med en U-Na-koncentration lägre än 200 mmol l −1 och minskade för högre koncentrationer. Med hänsyn till den uppenbara begränsningen av en immunblottingmetod i fråga om kvantifiering och det begränsade antalet försökspersoner bekräftar dessa resultat att prostasin finmoduleras med Na-urin på membranen i de rörformiga cellerna.

Den andra intressepunkten för arbetet härrör från iakttagelsen att en del av de normotensiva individerna utsöndrade mer prostasin, antingen som absolut koncentration eller uttryckt per Na-enhet, trots förekomsten av normal total natriuresis, ett normalt U-Na / UK-förhållande och normala aldosteron- och reninkoncentrationer. Det enda kännetecknande för dessa försökspersoner var en ökad ARR, vilket återspeglar börvärdet för det funktionella tillståndet i renin – angiotensin – aldosteronsystemet. Även om systemets enskilda komponenter (aldosteron, renin) kan variera på olika sätt och i olika utsträckningar, bör deras ömsesidiga förhållande förbli relativt konstant under fysiologiskt reglerade förhållanden (det vill säga faktorer som Na- och kaliumintag, uttorkning, hypervolemi och døgnvariation). Intressant nog uppvisade normotensiva individer med högre nivåer av prostasin per Na-enhet en högre koncentration av aldosteron per renin-enhet. Detta antyder det troliga behovet av att påskynda systemet för att upprätthålla Na-jämvikten. Det är spännande att observera att en ökad ARR har indikerats som en pålitlig prediktor för efterföljande hypertoni i framtida studier på normotensiva populationer. 21, 22 Det kan spekuleras att under hypertensiva och patologiska Na-hanteringsförhållanden, kännetecknade av ökat ARR och förhöjt Na-intag, kan urinprostatasin också vara relativt förhöjd eller inte tillräckligt hämmad. Det fanns emellertid överlappning av ARR mellan de låga och höga tertilerna av prostasin, så inget avskärningsvärde kan ställas in. Därför återstår förhållandet att koppla renin – angiotensin – aldosteronaxeln, Na och prostasin hos hypertensiva individer att klarläggas.

I överensstämmelse med tidigare resultat var 10 prostasin närvarande i urinen hos alla försökspersoner utan signifikanta skillnader relaterade till kön. Detta resultat stärker hypotesen att prostasin frigörs konstitutivt i mänsklig urin oavsett potentiell störning från prostatakörteln. Detta resultat är inte sekundärt eftersom det stöder sannolikheten för att urinprostasin kan tjäna som en markör för renalt ursprung utan att förväxla bidrag från alternativa källor.

Hos friska kvinnor förändrades inte prostasin-nivån, till skillnad från aldosteronnivån, väsentligt efter menstruationscykelfasen. Även om fluktuationer av sexuella hormoner verkligen kan påverka koncentrationerna av aldosteron och renin, verkar frisättningen av prostasin i urin inte vara tillräckligt känslig för dessa variationer eller, speciellt, förändras inte ENaC-aktivitet på ett betydande sätt.

Estro-progestinisk terapi hade en större förmåga att förändra en sådan balans. Trots milda förändringar i aldosteron- och reninnivåerna (båda minskade) ökade faktiskt ARR och urinkoncentrationen av prostasin, men ökningarna nådde inte statistisk betydelse. Även om BP-värdena inte nådde patologiska nivåer ökade de avsevärt efter OC-terapi och åtföljde en signifikant ökad U-Na.

Sammanfattningsvis, hos friska försökspersoner, finns urinprostatin på samma sätt i båda könen, och det påverkas inte av de olika faserna i menstruationscykeln. Prostasin moduleras av Na-urin, och prostasinnivåerna verkar vara korrelerade med ARR snarare än med individuella aldosteron- eller reninnivåer. Även om ett urinöverskott av prostasin verkar vara förknippat med ARR, vilket är kännetecknet för tillstånd som lågreninhypertoni och primär aldosteronism, förtjänar det exakta sambandet som kopplar renin – angiotensin – aldosteronaxeln, Na och prostasin hos hypertensiva patienter ytterligare undersökning .

Kompletterande information

Powerpoint-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Hypertension Research webbplats (//www.nature.com/hr)