Onaturliga aminosyror ökar känsligheten och tillhandahåller utformningen av mycket selektiva kaspasunderlag | celldöd & differentiering

Onaturliga aminosyror ökar känsligheten och tillhandahåller utformningen av mycket selektiva kaspasunderlag | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • apoptos
  • Kombinatoriska bibliotek
  • proteaser
  • Syntetisk biologi

Abstrakt

Traditionella kombinatoriska peptidylsubstratbibliotekstrategier använder vanligtvis naturliga aminosyror, vilket begränsar användbarheten av detta verktyg för att generera selektiva substrat för proteaser som delar liknande substratspecificitetsprofiler. För att ta itu med denna begränsning syntetiserade vi ett Hybrid Combinatorial Substrate Library (HyCoSuL) med den allmänna formeln för Ac-P4-P3-P2-Asp-ACC, och testade tillvägagångssättet på en familj av nära besläktade proteaser - de mänskliga kaspaserna. Kravet i detta bibliotek för kaspasdiskriminering sträcker sig långt bortom traditionell PS-SCL-metod, eftersom vi förutom 19 naturliga aminosyror också använde 110 olika onaturliga aminosyror som mer omfattande kan utforska det kemiska utrymmet som representeras av kaspasaktiva platser. Med hjälp av detta tillvägagångssätt identifierade vi och använde peptidbaserade underlag som gav utmärkt diskriminering mellan enskilda kaspaser, vilket tillät oss att samtidigt lösa det individuella bidraget från den apikala kaspas-9 och exekveraren caspase-3 och kaspas-7 i utvecklingen av cytokrom- c - beroende apoptos för första gången.

Huvudsaklig

Apoptos, den mest välkända formen för programmerad celldöd, är en mycket reglerad process som kontrolleras och genomförs av proteolytiska enzymer som kallas kaspaser. Den apoptotiska processen är något hierarkisk och caspaser kan tilldelas som initiatorer (2, 8, 9 och 10) och exekverare (3, 6 och 7). 1, 2, 3 Apoptos kan triggas extrinsiskt via ligering av en dödsreceptor av dess kognata ligander, vilket leder till aktivering av kaspas 8 och 10, eller i sig efter frisättningen av cytokrom c från mitokondrier med bildning av ett kaspas 9-aktiveringskomplex som apoptosomen. 3, 4, 5 Mekaniskt visar kaspaser en nästan absolut preferens för aspartat vid P1-läget för deras substrat. Dessutom kräver de en minimal substratlängd på fyra aminosyror N-terminal för den scissile bindningen. Thornberry et al. 6, 7 använde ett kombinatoriskt bibliotek av fluorogena substrat för att profilera nio mänskliga kaspaser vid P4 – P2-regionen, vilket visade att kaspaserna tenderade att ha specificitetsprofiler som möjliggjorde gruppering baserat på substratpreferenser. 6, 7 Detta arbete gav en stor inblick i kaspasigenkänningsmönster och öppnade dörren för andra att bedriva små molekylsonder för kaspasundersökningar.

Hittills har olika typer av substrat och hämmare utvecklats och biologiskt utvärderats mot caspaser. 2, 8, 9, 10, 11 Tyvärr saknar de flesta selektivitet och kan inte användas för att selektivt rikta in eller analysera specifika enzymer i komplexa biologiska miljöer. 12, 13, 14, 15 Detta beror helt på överlappande specificiteter hos kaspaserna på deras föredragna naturliga aminosyrasekvenser. För att hantera detta problem designade och syntetiserade vi en Hy brid Co mbinatorial Substrate L ibrary (HyCoSuL) innehållande 19 naturliga aminosyror (utelämnande cystein) och 110 onaturliga aminosyror. Vi föreslår att en så stor och varierad uppsättning kemiska strukturer ger ett utmärkt verktyg för att undersöka kaspaser och skilja mellan dem. I detta arbete dissekerade vi de kinetiska profilerna av sex humana apoptotiska rekombinanta caspaser genom HyCoSuL-screening. Vi designade och syntetiserade sedan nya kaspasunderlag med förmågan att urskilja dessa enzymer inom en grupp. För att ytterligare testa specificiteten och användbarheten för de konstruerade hybridsubstraten utförde vi en serie experiment i en cellfri modell av apoptos där flera caspaser aktiveras.

Resultat

HyCoSuL-syntesstrategi och dess tillämpning

Vårt mål var att utnyttja ett kemiskt verktyg som skulle kunna användas för att utveckla mycket selektiva och känsliga korta peptidbaserade underlag för kaspaser. Vi ansåg att användningen av ett stort antal onaturliga aminosyror skulle göra det möjligt för oss att utforska kemiska rymden som omfattas av den kaspasaktiva platsen klyftan, och för detta ändamål syntetiserade vi ett hybridkombinatoriskt bibliotek med den allmänna formeln för Ac-P4-P3- P2-Asp-ACC (figur 1). Baserat på detta strukturella ställning fixerade vi asparaginsyra i P1-läget (ett väsentligt krav för kaspas 6, 16, 17 ) och syntetiserade tre underbibliotek (P4, P3 och P2) för att dissekera kaspaspreferenser i S4 – S2-regionen. Som en reportergrupp valdes en fluorofordel av ACC (7-amino-4-karbamoylmetyl-kumarin) för bekvämlighet vid syntes av fast fas. 18 Varje sublibrär innehöll en av 129 aminosyror fixerade vid antingen P4-, P3- eller P2-positionerna. Dessa aminosyror bestod av 19 aminosyror (18 naturliga, cystein utelämnades och metionin ersattes med norleucin) och 110 onaturliga aminosyror, där vi definierar onaturliga aminosyror som de som inte är kodade i proteiner. Varje pool innehöll totalt 129 × 19 × 19 = 46 569 möjliga tetrapeptidsekvenser så att det totala antalet möjliga tetrapeptidkombinationer som kan göras med hjälp av detta bibliotek är 129 × 129 × 129 = 2 146 689, och detta är betydligt större än i tidigare publicerad strategi (20 × 20 × 20 = 8000). 6

Image

Allmänt schema för HyCoSuL-design och dess användning för upptäckten av selektiva och känsliga underlag för kaspaser. HyCoSuL består av tre underbibliotek som innehåller 129 enskilda naturliga och onaturliga aminosyror. Screeningsresultat avslöjar identiteten hos rester som bidrar till aktivitet vid en specifik position för varje caspase. I exemplet i de färgade staplarna representerar den mest selektiva återstoden jämfört med andra caspaser (visas inte i denna illustration). Ibland, men inte alltid, är den mest selektiva resten också den mest aktiva. Således är HyCoSuL användbar inte bara för utformning och syntes av känsliga kaspasunderlag, utan också för upptäckten av kaspasunderlag med hög selektivitet

Bild i full storlek

Vi valde kommersiellt tillgängliga onaturliga aminosyror med olika fysikalisk-kemiska egenskaper för att täcka ett brett spektrum av möjliga substrat-enzyminteraktioner: sura och basiska, små och stora, hydrofila och hydrofoba, med definierad stereokemi ( L eller D ) eller saknar stereokemi (dehydroaminosyror) ). Efter screening av sex humana rekombinanta caspaser var vi beväpnade med data som tillät oss att designa och syntetisera nya substrat med ett mycket högt selektivitetsindex. Den allmänna arkitekturen för HyCoSuL och dess användning för upptäckt av selektiva och känsliga kaspasunderlag presenteras i figur 1. De mest selektiva substraten kan användas i cellbaserade analyser samt fungera som byggnadsställningar för selektiv hämmarkonstruktion. Å andra sidan kan de flesta aktiva substrat (de högsta katt / Km- värdena) användas i regelbundna kinetiska studier på rekombinanta caspaser.

Substratspecificitetsbestämning

Var och en av P4-, P3- och P2-sublibrarierna screenades vid 50 μM slutlig total substratblandning, med kaspas-koncentrationer i området 10–200 nM. Koncentrationen av varje kaspas i analysen valdes i preliminära experiment för att ge en optimal fluorescensavläsning (se Material och metoder). De initiala hydrolyshastigheterna registrerades som relativa fluorescensenheter (RFU: er) över tid och normaliserades genom inkludering av minst tre referenssubstratblandningar. Varje kaspas screenades minst tre gånger ( n = 3-5) och medelvärdet för RFU / s (uttryckt som% normaliserat till det bästa underlaget) presenteras som en specificitetsmatris. Alla substratspecificitetsprofiler för varje testad caspase finns i avsnittet Kompletterande data; men vi har destillerat deras väsen i tabell 1.

Full storlek bord

Selektivitetsöversikten som presenteras i tabell 1 bekräftar att vissa caspaser delar vanliga preferenser vid en viss underplats och att dessa preferenser utvidgas väsentligt i flera fall genom att införa onaturliga aminosyror i peptidylsubstraten. Men tillsammans med de förväntade preferenser kommer några oväntade, och vi har sammanfattat dessa nedan. Vi föreslår att förståelse av aminosyrapreferenser vid varje position, och kanske viktigare, de begränsade aminosyrorna vid varje position, skulle möjliggöra utformning av mycket selektiva substrat.

P4-läget

P4-positionen är den mest utmärkande karaktäristiska urskiljande substratselektiviteten i kaspasfamiljen. 6, 19 I allmänhet följde våra observerade P4-preferenser etablerade regler, med caspaser 3 och 7 som gynnade Asp, och caspases 6, 8, 9 och 10 gynnade alifatiska rester. 6, 19 Caspase 3 och 7 är mycket nära besläktade enzymer som delar 57% sekvensidentitet och mycket liknande substratspecificitet. 20 Vid P4-läget gynnade caspas 3 Asp ∼ 10-faldigt framför andra aminosyror men kaspas 7 var mer katoliskt, och föredrog Asp men tolererade även asparaginsyra-metyl-, cyklohexyl- och bensylestrar, och även histdinbensylester, tioprolin. Den bredare toleransen för caspase 7, också sett vid P3-positionen (se nedan), är det viktigaste skiljefunktionen mellan de nära besläktade paralogerna caspases 3 och 7. Skillnader mellan caspases i P4-positionen kan också hittas via negativt val. Caspases 3 och 7 tar emot mycket få aminosyror från vårt bibliotek, förutom Asp och några andra som nämnts tidigare. Caspases 6 och 10 har också stränga preferenser vid P4-positionen. Den enda gruppen som inte tolereras av caspase 8 vid P4-positionen är basiska aminosyror. Det mest promiskuösa är caspase 9 som känner igen nästan alla kemiska strukturer vid P4. Vi upptäckte bara några få aminosyror som ignorerades fullständigt av detta enzym.

P3-läget

P3-positionen ger minst diskriminering mellan caspaser. Denna position är intolerant mot D- aminosyror och sekundära aminosyror och föredrar generellt Glu. Intressant nog tolererades Glu-estrar också i denna position, särskilt för kaspaser 7 och 10. I tillgängliga kristallstrukturer bildar y-karboxylatet av P3 Glu vanligtvis ett jonpar med Arg-341 som är absolut bevarat i alla mänskliga kaspaser, 21 och man kan därför förvänta sig att jonparet var nödvändigt för substratigenkänning. Emellertid tyder toleransen för Glu-estrar såväl som alifatiska rester av kaspas 7 och 9 att detta jonpar inte är nödvändigt för optimal P3-beläggning. Mest troligt krävs konservering av Arg-341 för interaktion med P1 Asp, till vilken det också gör ett jonpar. Substratsspecificiteten för caspase 9 vid P3 var ovanlig, varvid tert- Leucin och valin dominerade över glutaminsyra.

P2-läget

P2-positionen ansågs inte tidigare ge en hög grad av diskriminering, 6 men analys av P2 HyCoSuL-sublibrären avslöjade dock några oväntade preferenser. Vi fann att den bäst erkända aminosyran i denna position för kaspas 3, 6 och 7 var treoninbensylester, vilket avslöjade att S2-fickan är tillräckligt stor för att rymma den skrymmande bensylgruppen. Andra aminosyror som tolererades väl i P2-position var prolin-derivat (oktahydroindol-2-karboxylsyra (Oic), pipecolinsyra (Pip) och 1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline-3-karboxylsyra (Tic)), och detta är också ganska oväntat baserat på kanoniska naturliga aminosyrapreferenser. 6 Subsite-preferenser antydde att caspase 6 S2-subplatsen är tillräckligt stor för att acceptera ännu större volymer än de andra exekverande kaspaserna. Caspase 9 visade väsentligen exklusiv selektivitet för His, N (im) -bensyl-histidin (His (Bzl)) och Tic. Caspase 10 känner igen stora och hydrofoba aminosyror (serinbensylester (Ser (Bzl)), homofenylalanin (hPhe), homocyklohexylalanin (hCha) samt små och basiska aminosyror. Denna preferens skiljer caspase 10 från dess nära paralog caspase 8. Caspases 3, 6 och 7 rymmer inte basiska aminosyror och caspase 8 har ett mycket liknande "negativt mönster", men det kan rymma basiska aminosyror. Caspase 9 är ultraselektiv vid P2 och> 95% av de testade aminosyrorna är förbjudna vid denna position. Av alla testade caspaser visade endast caspase 10 en bred tolerans vid P2, vilket inte accepterade endast D- och dehydro-aminosyror.

Design av de mest känsliga caspasesubstraten genom HyCoSuL-screening

Beväpnade med substratspecificitetsprofiler av sex mänskliga kaspaser fortsatte vi att syntetisera nya underlag som visade förbättrad känslighet över befintliga underlag. De bästa substraten för kaspas 3 och 7 (MPP41 och MPP42) innehåller treonin-O-bensylester (Thr (Bzl)) vid P2-läget som tycktes förbättra utforskningen av S2-kemiska rymden. Vi märkte också att glutaminsyra vid P3 framgångsrikt kan ersättas av många andra aminosyror (som 2-tienyl Ala) med endast en liten minskning av den totala aktiviteten. De bästa underlagen för caspases 3 och 7 är två gånger bättre än de baserade på DEVD-sekvensen (figur 2). För caspase 6 fann vi att Val vid P4 och Glu vid P3 är obligatoriska för underlag; emellertid tolereras vid P2 några skrymmande aminosyror (som Thr (Bzl) eller hPhe). Dessa underlag (MPP48 och MPP49) är 4-5 gånger bättre än referensanordningen (Ac-VEID-ACC). En analys av caspas 8-substratspecificitet avslöjade att det mest aktiva substratet (MPP46) innehåller tre onaturliga aminosyror: tert- leucin (Tle) vid P4, homoglutaminsyra (2-aminohexandiosyra (Aad)) vid P3 och treoninbensylester ( Thr (Bzl)) i P2-läget. Katt / KM för detta substrat är ∼ 5, 5 gånger högre än för referens Ac-IETD-ACC-substrat. För caspase 9 upptäckte vi att byte av Glu vid P3 med det onaturliga tert- leucinet (Trt) resulterade i en tredubbelt ökning av aktiviteten (MPP47). Caspase 10 är det enda enzymet som vi inte fick förbättrad aktivitet för. Ersättningen av histdin vid P2 för serinbensylester (Ser (Bzl)) resulterade i en liten ökning av aktiviteten (∼ 20%) (MPP43). Därför, trots att vi kunde förbättra katalytiska hastigheter för peptidhydrolys genom att införliva onaturliga aminosyror, kan förstärkningsgraden betraktas som måttlig.

Image

Några exempel på nya högkänsliga kaspas-ACC-substrat som innehåller onaturliga aminosyror

Bild i full storlek

Design av kaspasselektiva underlag

De vanligt använda caspas-substraten som endast innehåller naturliga aminosyror saknar selektivitet (figur 3). För att övervinna dessa begränsningar beslutade vi att utforska om en HyCoSuL-strategi, som sträcker sig långt utöver traditionellt positionsskanningssubstratskombinatorbibliotek (PS-SCL), skulle kunna ge förbättrad selektivitet - det vill säga kan vi generera enskilda substrat som visade dramatiskt förbättrad selektivitet för enskilda caspaser. Vårt första mål var att upptäcka nya fluorogena substrat med förmågan att urskilja kaspaser i ett virtuellt experiment där alla kaspaser finns i samma koncentration. Det är uppenbart att det inte är möjligt att uppnå absolut selektivitet, och därför syftade vi till att ge bästa möjliga selektivitet, visad som relativ katalytisk effektivitet. Detta " proof of concept " -experiment visade att våra förväntningar för nästan alla caspases uppfylldes. Vi kunde inte producera ett substrat som effektivt diskriminerade kaspas 3 och 7, men vi fann att ersättning av Glu från DEVD-sekvensen med 2, 3, 4, 5, 6-pentafluorofenylalanin, Phe (F5) (förening MPP39) visade utmärkt diskriminering av caspaser 3 och 7 jämfört med andra caspaser. Det mest selektiva caspase 6-substratet är MPP36 som innehåller treonin vid P4, glutaminsyra vid P3 och neo- pentylglycin (NptGly) vid P2. MPP30, det mest selektiva caspas 8-substratet, innehåller tre onaturliga aminosyror, med D- homofenylalanin ( D- hPhe) vid P4, Aad vid P3 och Thr (Bzl) vid P2. För att skilja caspase 9 från andra enzym syntetiserade vi MPP8 som har Oic (ett cyklohexyl-prolin-derivat) vid P4, Tle vid P3 och His vid P2. Slutligen hittade vi för caspase 10 flera selektiva underlag, bland vilka MPP52 visade det högsta katt / KM- selektivitetsindexet bland alla testade substrat. Detta substrat innehåller 2-amino-6-bensyloxyhexansyra (Nle ( O- Bzl)) vid P4, 2, 4-diaminobutyric acid (Dab) vid P3 och norleucin vid P2. I figur 3 presenterar vi våra bästa träffar, och en detaljerad kinetisk analys för dessa (och flera andra) underlag finns i avsnittet Kompletterande data. Vi var mycket glada över att hitta substrat som skilde var och en av de apikala apoptotiska kaspaserna (8, 9 och 10) från varandra och från andra kaspaser.

Image

Jämförelse av vanligt använda och HyCoSuL-härledda caspasesubstrat. Sex ACC-substrat med kommersiellt tillgängliga sekvenser testades mot sex rekombinanta humana kaspaser (vänsterpaneler). För varje substrat bestämdes alla tre kinetiska parametrarna (se avsnittet om kompletterande data). Här presenterar vi bara k cat / K M- värden (× 10 4 M −1 s −1 ). Jämförelse med de mest selektiva substraten härledda från HyCoSuL-screening avslöjar användbarheten med denna metod vid utveckling av mycket selektiva tetrapeptidsubstrat

Bild i full storlek

Bestämning av kaspasselektiva substrat för cellbaserade analyser

En av de huvudsakliga drivprinciperna i denna studie var att utveckla substrat som kan användas för att bedöma rollen för enskilda kaspaser i komplexa blandningar, ett mål som tidigare har förblivit svårt. 12 HyCoSuL-strategin gjorde det möjligt för oss att designa nya, mycket selektiva kaspasunderlag, mätt med specificitetskonstanten k cat / K M. I många biokemiska experiment för att erhålla en mätbar fluorescerande avläsning används emellertid ofta substrat i en koncentration signifikant över deras KM- värden, och således beror hastigheten på deras hydrolys endast på kattparametern. Ett sådant exempel är kaspasdetektering i cytosoliska extrakt. Hittills finns det inga kommersiella substrat som kan visa selektivitet i denna typ av analys, eftersom alla beskrivna substrat uppvisar målreaktivitet, speciellt med kaspas 3. Tyvärr kunde vi inte mäta kattvärden för alla substrat för alla kaspaser som vissa av dessa substrat, som var mycket selektiva av ett caspase, känns mycket dåligt av andra caspases. För det andra var deras KM- parametrar för vissa substrat över deras löslighetsindex. Men eftersom vi trodde att denna analys skulle ha ett betydande värde, beslutade vi att utvärdera våra mest selektiva underlag genom att screena dem vid en slutlig koncentration av 100 μM , långt över KM- värden för de bästa substraten, och jämförde dem med kommersiella underlag under samma villkor (tilläggstabell 5). Genom detta experiment visar vi att nästan alla våra underlag med bästa k cat / K M- selektivitetsindex också kan användas för analyser som körs under "högt substratkoncentrationsförhållanden", där ett individuellt substrat skulle uppvisa den lägsta grad av selektivitet för olika caspaser . Således skulle reducering av substratkoncentrationer resultera i ännu mer selektivitet, men till priset av lägre fluorescensutbyten. Dessutom, förutom de underlag som beskrivs i föregående avsnitt, hittade vi några andra strukturer som lovar i detta experimentella paradigm (se avsnittet Kompletterande data).

Samtidig upptäckt av kaspas 3 och 9 vid cellfri apoptos

För att validera våra resultat och bedöma användningen av de selektiva substraten testade vi enskilda underlag i ett komplext system där flera kaspaser är aktiva och där de fungerar i det som närmar sig en naturlig miljö. På grund av osäkerheten kring cellulär penetration undvikte vi intakta celler och valde istället en modell av cytokrom c programmerad in vitro apoptos som ofta har använts i litteraturen. 22, 23, 24 I denna modell läggs cytokrom c till cytosoliska extrakt av mänskliga celler där det utlöser bildningen av en löslig aktiveringsplattform känd som apoptosomen, som driver caspase 9-aktivering. 25 Aktiv kaspas 9 aktiverar sedan kaspaser 3 och 7 som är ansvariga för apoptosutförande. Caspase 9 visar liten aktivitet på tidigare rapporterade peptidbaserade syntetiska substrat, vilket gör det omöjligt att oupplösligt mäta sin aktivitet i komplexa system där flera caspaser är aktiva (särskilt caspase 3 som är känt för att hydrolysera befintliga caspase 9-substrat).

Vi jämförde först klyvningen av kaspas 3-referenssubstratet Ac-DEVD-AFC med det mest selektiva kaspas 9-substratet MPP8. En del cytosoliska extrakt förekvilibrerade med 100 μM av båda substraten aktiverades genom tillsats av 10 μM cytokrom c och 1 mM dATP vid 37 ° C. För att undvika oönskad proteolys som stör vår analys, tillsatte vi också MG132 (en proteasom-hämmare) till det cytosoliska extraktet. Eftersom MPP8 innehåller ACC-fluoroforen kunde vi analysera den oberoende klyvningen av varje substrat, samtidigt, i samma reaktion genom att utnyttja de distinkta excitations- och emissionsspektra för ACC (355 och 460 nm) och 7-amino-4-trifluormetylkoumarin ( AFC; 400 och 505 nm; figur 4).

Image

Caspase-aktiveringstidskurs. Cytosoliska extrakt behandlades med cytokrom c och kaspasaktivitet övervakades samtidigt vid olika våglängder av det caspase-9-selektiva substratet MPP8 som initierar efter 1 minut tillsats av cytokrom c , medan aktivitet rapporterad av Ac-DEVD-AFC uppvisar en fördröjning av ∼ 2–3 min innan full aktivitet uppnås. Så småningom tappas Ac-DEVD-AFC-underlag (∼ 6 min) och kurvan slappnar av till fullständig uttömning av substratet. Eftersom MPP8 klyvs långsammare än Ac-DEVD-AFC tappas inte substratet inom tiden. "Skuret" under de första 40–60 sekunderna beror på växelverkan mellan ACC-substratet och cytokrom c genom en mekanism som vi ännu inte förstår, men är oberoende av proteolytisk aktivitet, som det observeras i kontroller och inte är observeras för AFC-underlaget. Alla substrat användes vid 250 μM och vi kunde upptäcka aktivitet vid 50 μM med spektrofluorimeter som användes i denna studie

Bild i full storlek

Aktivitet på Ac-DEVD-AFC uppvisade en typisk fördröjningsfas som tidigare rapporterats, 26 men aktivitet mot det optimerade caspase 9-substratet MPP8 dök upp tidigare. Detta överensstämmer med kravet från caspase 9 för att aktivera caspase 3 på ett hierarkiskt sätt. Även om dessa data överensstämmer med selektiviteten för MPP8 för caspase 9, är det möjligt att de olika känsligheterna för substraten på något sätt maskerade nonspecificitet. För att testa detta analyserade vi kaspasaktivitet i de cytokrom c- aktiverade cytosoliska extrakten i närvaro av mycket specifika proteininhibitorer av kaspaserna. Vi valde BIR2 (baculovirusinhibitor av apoptosproteinupprepning) -domänen för human X-länkad hämmare av apoptosprotein (XIAP), som är strängt selektiv för caspaser 3 och 7, och BIR3-domänen i XIAP, som är strängt selektiv för caspase 9 21 Vi använde också den kommersiellt tillgängliga LEHD-sekvensen som säljs som ett caspase 9-substrat utöver MPP8 och Ac-DEVD-ACC. Cytosoliska extrakt förinaktiverades genom tillsats av 10 μM cytokrom c och 1 mM dATP vid 37 ° C under 10 minuter innan tillsats av substrat och BIR-domäner efter behov (figur 5).

Image

Detektion av kaspas 3 och kaspas 9 i cytosoliska extrakt med användning av syntetiska underlag. Cytosoliska extrakt inkuberades med cytokrom c under 10 minuter vid 37 ° C före mätning av aktivitet med MPP8, Ac-LEHD-ACC eller Ac-DEVD-ACC. Aktiverade cytosoliska extrakt lämnades antingen obehandlad (ingen hämmare) eller behandlades med de angivna koncentrationerna av BIR2 eller BIR3 (μM). Som kontroll immundepleterades caspas 9 från extrakt före tillsats av cytokrom c

Bild i full storlek

Den kinetiska analysen visade att både Ac-LEHD-ACC och Ac-DEVD-ACC-substrat behandlas extremt snabbt, medan MPP8 klyvs dåligt. Detta är bevis på att LEHD och MPP8 företrädesvis klyvs av olika enzymer i aktiverade cytosoliska extrakt eftersom båda substraten har jämförbara kinetiska värden för rekombinant kaspas 9. Viktigare upphävdes MPP8-aktivitet av BIR3 och inte av BIR2, i överensstämmelse med en utsökt selektivitet av detta substrat för caspase 9. I motsats till detta hämmades både aktivitet på Ac-DEVD-ACC och Ac-LEHD-ACC av BIR2 och inte BIR3. Detta är ett starkt bevis på att aktiviteten mot Ac-DEVD-ACC beror på caspaser 3 och 7, som förväntat, och att aktiviteten som observerats med det antagna caspase 9-substratet Ac-LEHD-ACC i cytosoliska extrakt främst beror på caspases 3 och 7, och inte caspase 9. Caspase 9-immunutfällningskontrollen bekräftar att aktivitet på substraten är kaspasberoende, eftersom endast kaspas förväntas aktiveras i detta system - se kompletterande figur 13B för validering av kaspas 9-utarmning. Tillsats av rekombinant kaspas 9 såväl som dess klyvningsplatsmutant D330A rekapitulerade aktivitet på MPP8 (kompletterande figur 13–15) validerar in vitro caspasaktiveringsparadigmet.

Diskussion

Kaspaser är viktiga reglerande enzymer i apoptos och inflammation. Utvecklingen av selektiva och känsliga biokemiska verktyg för undersökning av deras aktivering och reglering in vivo är obligatoriska för att förstå deras biologiska funktioner i både normala celler och patofysiologiska tillstånd. Syntesen och den biokemiska utvärderingen av det första kombinatoriska substratbiblioteket som är inriktat på caspaser för mer än 15 år sedan hade en stor inverkan på förståelsen av deras substratpreferenser och förutsagda funktioner. Tyvärr saknar nästan alla caspasesubstrat specificitet och kan därför inte användas för att övervaka deltagandet av enskilda caspaser i ett komplext system. Vi visar att HyCoSuL är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka nya, mer selektiva och känsligare kaspasunderlag. Användningen av ett brett spektrum av onaturliga aminosyror gjorde det möjligt för oss att utforma selektiva underlag som kan skilja mellan alla testade apoptotiska kaspaser, med de anmärkningsvärda undantagen från de nära besläktade exekverande kaspaserna 3 och 7. Vi noterar en förbehåll för vår strategi, eftersom den direkta omvandlingen av information som erhållits genom HyCoSuL-screening (såväl som från traditionell PS-SCL) till utformningen av specifika underlag inte är enkel. Detta beror på att kaspaser, i likhet med många andra proteaser, troligen uppvisar samarbete på webbplatser. Bindning av speciell aminosyra till dess kognata underplats är inte alltid en oberoende process och kan påverkas (stöds eller störs) av angränsande aminosyror. 27 Med hänsyn till detta måste resultaten från båda metoderna (HyCoSuL och PS-SCL) valideras genom resyntes och kinetisk analys. Följaktligen användes ett urval av de bästa träffarna från HyCoSuL-skärmarna för att informera syntesen om ett urval av substrat, och från dessa enskilda substrat bestämde vi de optimala och mest selektiva substraten för varje caspase.

Den biologiska användbarheten av detta tillvägagångssätt sträcker sig till förmågan, för första gången, att observera aktiviteten hos enskilda caspaser under cytokrom- c- utlöst apoptos. Vi har ännu inte försökt att observera värdet av de selektiva substraten i intakta celler, främst på grund av cellpenetrationsproblem, men detta är helt klart en plats för framtida utforskning. Dessutom föreslår vi att kaspasselektiva substrat som hittas genom HyCoSuL-screening ger ett utmärkt ställning för syntes av mycket selektiva aktivitetsbaserade prober för att studera kaspasaktivitet och aktivering under apoptos. Vi förutspår att detta nya tillvägagångssätt kan säkerställa en mycket mer grundlig förståelse av apoptotisk kaspasreglering och möjligen leda utformningen av nya föreningar med förbättrad specificitet för terapeutisk användbarhet.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

Ordlista

HyCoSuL

Hybrid Combinatorial Substrate Library

ACC

7-amino-4-carbamoylmethylcoumarin

RFU

relativ fluorescensenhet

PS-SCL

positionskombinationsbibliotek för skanningssubstrat

Badda

2, 4-diaminobutyric acid

D -hPhe

D- homofenylalanin

Ser (Bzl)

serinbensylester

hCha

homocyclohexylalanine

AFC

7-amino-4-trifluormetylkumarin

XIAP

X-kopplad hämmare av apoptosprotein

BIR-domän

baculovirusinhibitor av apoptosproteinupprepning

Phe (2-Cl)

2-klorfenylalanin

Pip

pipekolinsyra

hTyr

homotyrosin

OIC

oktahydroindol-2-karboxylsyra

Tic

1, 2, 3, 4-tetrahydroisokinolin-3-karboxylsyra

His (Bzl)

N (im) -bensyl-histidin

HPhe

homofenylalanin

Thr (Bzl)

treonin-O-bensylester

Phe (F5)

2, 3, 4, 5, 6-pentafluorofenylalanin

Aad

2-aminohexandiosyra

Nle ( O- Bzl)

2-amino-6-bensyloxyhexansyra

NptGly

neo -pentylglycin

Kompletterande information åtföljer detta dokument på Cell Death and Differentiation-webbplatsen (//www.nature.com/cdd)