Trpv4-kanalaktivitet moduleras genom direkt interaktion mellan ankyrin-domänen till pi (4,5) p2 | naturkommunikation

Trpv4-kanalaktivitet moduleras genom direkt interaktion mellan ankyrin-domänen till pi (4,5) p2 | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Ionkanaler
  • Molekylärbiologi

Abstrakt

Mutationer i ankyrin repetitionsdomänen (ARD) för TRPV4 är ansvariga för flera kanalopatier, inklusive Charcot – Marie – Tand sjukdom typ 2C och medfödd distal och scapuloperoneal spinal muskelatrofi. Emellertid förblir den molekylära patogenesen medierad av dessa mutationer svårfångade, främst på grund av begränsad förståelse av TRPV4 ARD-funktionen. Här visar vi att fosfoinositidbindning till TRPV4 ARD leder till undertryckande av kanalaktiviteten. Bland fosfoinositiderna binder fosfatidylinositol-4, 5-bisfosfat (PI (4, 5) P2) mest kraftfullt till TRPV4 ARD. Kristallstrukturen för TRPV4 ARD i komplex med inositol-1, 4, 5-trisfosfat, huvudgruppen av PI (4, 5) P2 och molekyldynamik-simuleringarna avslöjade PI (4, 5) P2 -bindande aminosyrarester. TRPV4-kanalaktiviteterna ökades genom titrering eller hydrolys av membran PI (4, 5) P2. Särskilt avskaffade sjukdomsassocierade TRPV4-mutationer som orsakar en fenomen av förstärkning av funktionen PI (4, 5) P2-bindning och PI (4, 5) P2-känslighet. Dessa fynd identifierar TRPV4 ARD som en lipidbindande domän där interaktioner med PI (4, 5) P2 normaliserar kanalaktiviteten i TRPV4.

Introduktion

Den icke-selektiva katjonkanalen TRPV4 är en medlem av vanilloid-underfamiljen för den transienta receptorpotentialen (TRP) -kanaler. TRPV4 har flera reglerande webbplatser och aktiveringssätt, vilket gör det möjligt att svara på olika stimuli. TRPV4 aktiveras av fysiska stimuli, inklusive måttlig värme, cellsvullnad och skjuvspänning, av endogena kemikalier, såsom anandamid, arakidonsyra (AA) och dess cytokrom P450-härledda metaboliter (epoxyeikosatrien-syror, EET) och av många exogena kemiska ligander såsom 4a-phorbol-12, 13-didecanoate (4a-PDD) 1, 2 . Känsligheten hos TRPV4 för cellsvullnad och skjuvspänning förmedlas av aktiveringen av fosfolipas A2 (PLA 2 ) och den efterföljande produktionen av AA och EETs 2, 3 . Nyligen genomförda studier med Trpv4- knockout-möss har föreslagit den funktionella betydelsen av TRPV4 i centrala nervsystemet, nociception och benbildning 1 .

Aminosyra (N) - och karboxi (C) -terminala cytoplasmatiska regioner av TPRV4 innehåller en mängd funktionella domäner 1 . Till exempel har N-terminalen i TRPV4 en karakteristisk ankyrinupprepningsdomän (ARD), bestående av sex ankyrinupprepningar. Den prolinrika regionen precis uppströms om den första ankyrinupprepningen interagerar med PACSIN3, som associerar med cytoskeletala proteiner 4 . TRPV4 C-terminal svans innehåller ytterligare funktionella domäner, såsom en TRP-låda, ett kalmodulinbindande ställe och ett bindningsställe för cytoskeletala proteiner. För närvarande finns inga kristallografiska eller kärnmagnetiska resonansdata tillgängliga som kan belysa atomstrukturen i funktionell TRPV4. Strukturen hos TRPV4 från råtta analyserades emellertid med en upplösning på 3, 5 nm med kryo-elektronmikroskopi 4, och ARD tycktes ligga på membranet i en sned riktning.

Mutationer i TRPV4 är associerade med ett brett spektrum av ärftliga sjukdomar. Senare rapporter har identifierat TRPV4-mutationer som den direkta orsaken till främst autosomala dominerande neuropatier och skelettdysplasi, såsom medfödd distal spinal muskelatrofi (CDSMA), scapuloperoneal spinal muskulär atrofi (SPSMA) och Charcot – Marie – Tooth sjukdom (CMT) typ 2C) CMT2C) 1, 2 . CMT är den vanligaste ärvda neuromuskulära störningen, som drabbar minst 1 av 2500 personer, och är en genetiskt heterogen störning med vanliga kliniska fenotyper, såsom distal muskelsvaghet och atrofi, sensorisk förlust och fotdeformiteter 5, 6 . Mutationerna i TRPV4 är den senaste identifierade CMT-subtypen, i termer av genetiskt lokus 1, 2 . Tidigare studier har föreslagit att förstärkningen av funktionsmutationerna av TRPV4 i dessa sjukdomar, som uppvisar ökad basal och maximal Ca2 + -kanalaktivitet, är grupperade inom TRPV4 ARD och påverkar argininrester, särskilt vid R232C, R269C / H, R315W, R316C / H positioner 7, 8, 9, 10 . Den ökade Ca 2+ -inflödet och efterföljande Ca2 + -belastning associerad med dessa mutationer tros vara orsaken till celldöd, och har föreslagits som en mekanism för perifer axonal degeneration i TRPV4-beroende neuropatier 9, 10 . Emellertid har molekylmekanismen som ligger bakom den ökade aktiviteten hos dessa mutanter förblivit okänd. Därför är belysning av TRPV4 ARD-reglering på molekylnivå avgörande för att förstå mekanismerna för sjukdomar associerade med TRPV4-mutationer.

Under de senaste två decennierna har den molekylära basen för CMT blivit tydligare, med identifiering av mer än 30 orsaka gener 11 . Ny forskning om den genetiska basen och de molekylära sjukdomsmekanismerna hos CMT har lyfts fram fosfoinositider som viktiga reglerande molekyler i olika CMT-undertyper 12 . Fosfoinositider är väsentliga komponenter i membranlipider och reglerar grundläggande biologiska processer, inklusive celltillväxt, membranhandel och cytoskeletaldynamik, genom bindning till effektorproteiner 13, 14, 15 . Fosfoinositider fungerar också som föregångare för andra budbärare, såsom inositol-1, 4, 5-trisfosfat (IP 3 ) och diacylglycerol (DAG), som båda produceras genom hydrolys av fosfatidylinositol-4, 5-bisfosfat (PI (4, 5) P2) med fosfolipas C (PLC) isoformer 16 . Det finns fosfoinositidbindande domäner i flera proteiner kopplade till CMT, inklusive dynamin2 (ref. 17), KIF1Bp 18, neurofilament (NEFL) 19, Pleckstrin homology (PH) domän som innehåller, familj G-medlem 5 (PLEKHG5) 20 och Frabin / FGD 21, 22 . Noterbart har mutationer i PI (4, 5) P2-bindande domäner för dynamin2 (ref. 17) och PLEKHG5 (ref. 20) identifierats som orsakerna till CMT. Dessutom förekommer flera olika CMT-subtyper på grund av mutationer i fosfoinositid-specifika fosfataser 12, inklusive MTMR2, MTMR13 och FIG4. Således stödjer ökande bevis de nära förhållandena mellan CMT-orsakande proteiner och fosfoinositid-signalering. Det är möjligt att fosfoinositider är involverade i CMT2C. CMT2C-mutationerna av TRPV4 finns huvudsakligen i ARD. Även om ARD i allmänhet är ansvarig för protein-protein-interaktioner, fick dessa studier som kopplade sambanden mellan CMT2C och fosfoinositider oss att undersöka interaktionen mellan TRPV4 ARD och fosfoinositider.

I denna studie visar vi att ARD för TRPV4 bäst bindes till PI (4, 5) P2. Våra strukturanalyser och funktionella analyser tyder på att TRPV4 ARD interagerar med inositolhuvudgruppen för PI (4, 5) P2, vilket negativt reglerar TRPV4-kanalaktiviteten. Det är anmärkningsvärt att majoriteten av de sjukdomsassocierade mutanter som uppvisar en fenotyp av vinst-av-funktion visar minskad bindning och känslighet för PI (4, 5) P2, vilket ger en korrelation mellan PI (4, 5) P2-känsligheten och sjukdomens fenotyper.

Resultat

Membranlipidbindande förmåga hos TRPV ARD: er

Vi undersökte förmågan hos TRPV4 ARD att binda till en serie membranlipider, inklusive fosfoinositider. ARD för TRPV4 bunden till fosfoinositider och en relativt stark affinitet till PI (4, 5) P2 avslöjades genom liposom-samsedimentationsanalysen (Fig. La). TRPV1 ARD bundet till lipider; emellertid observerades den specifika bindningen av TRPV1 ARD till speciella lipider (fig la).

( a ) Liposomsamsedimentationsanalys. ARD: erna för TRPV1 och TRPV4 framställdes och deras lipidbindning undersöktes. Närvaron av protein i pelleten (ppt) indikerade proteinbindning. Kontrollexperiment utan liposomer utfördes också. De bundna proteinerna visas som medelvärde ± sem ( n = 5). P- värden i förhållande till PI (4, 5) P2 visas. PA, fosfatidinsyra; PC, fosfatidylkolin; PE, fosfatidyletanolamin; PI, fosfatidylinositol; PI (3) P, fosfatidylinositol 3-fosfat; PI (4) P, fosfatidylinositol 4-fosfat; PI (5) P, fosfatidylinositol 5-fosfat; PI (3, 4) P2, fosfatidylinositol 3, 4-bisfosfat; PI (3, 5) P2, fosfatidylinositol 3, 5-bisfosfat; PI (4, 5) P2, fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfat; PI (3, 4, 5) P3, fosfatidylinositol 3, 4, 5-trisfosfat; PS, fosfatidylserin. PI-fosfat, PI-bisfosfat och PI-trisfosfat inkluderades i 5, 5, 5 eller 4, 5 mol-% eller 9 vikt-%. ( b ) Liposom flytande analys. Bindningen av TRPV1 och TRPV4 till PI (4, 5) P2-innehållande liposomer undersöktes. Alla fraktioner undersöktes, och utseendet på protein i den övre fraktionen indikerar protein-lipidinteraktion. ( c ) Bestämning av dissociationskonstanten. Den bundna liposomen i den flytande analysen plottades mot mängden PI (4, 5) P2. 1 / [% bundet TRPV4 ARD] och 1 / [PI (4, 5) P2] är också ritade med deras korrelationskoefficienter ( r ). Mängden PI (4, 5) P2 i totala lipider ökades i denna analys från 0 till 15% (75 μM, hälften av den totala PI (4, 5) P2 på grund av lipid-tvåskiktet). Dissociationskonstanten bestämdes från skärningen och lutningen av 1 / [% bundet TRPV4 ARD] och 1 / [PI (4, 5) P2] ( n = 3, 2, 4, 1 och 2 för 8, 75, 17, 5, 35, 50 respektive 75 μM PI (4, 5) P 2 ). Datapoäng är medelvärde ± sem

Bild i full storlek

Liposombindningen till TRPV-proteinerna bekräftades vidare genom en samflytande analys, i vilken det liposominnehållande mediet med låg densitet flyter upp efter centrifugering. Således kan den samflytande analysen användas för att undersöka instabila proteiner, som fälls ut genom centrifugering efter deras aggregering. Samexistensen av ett protein med de flytande liposomerna indikerar liposom-proteininteraktion. Bindningen av TRPV1 och TRPV4 ARD till lipider i membranet bekräftades med användning av liposomer innehållande PI (4, 5) P2 (fig. Ib). Dissociationskonstanten för TRPV4 och PI (4, 5) P2 bestämdes till 14 mikrometer ( r = 0, 985) med den liposomflytande analysen (fig. 1c) och 43 mikrometer ( r = 0, 995) med en Surface Plasmon Resonance (Fig. 1c) SPR) -analys (kompletterande figur 1). Dessa två värden anses ligga inom variationen på grund av skillnaderna i metoderna.

ARD · IP 3- komplexets kristallstruktur

För att identifiera PI (4, 5) P2-bindningsstället beredde vi kristaller av kycklingen TRPV4 ARD och utsatte dem för en lösning innehållande IP 3, huvudgruppen för PI (4, 5) P2. Kristallstrukturen hos kycklingens TRPV4 ARD (resterna 133–382, motsvarande humana rester 147–396) i komplex med IP 3 bestämdes vid 1, 9 Å-upplösning med molekylersättningsmetoden, med användning av den rapporterade kyckling-TRPV4 ARD-strukturen (PDB ID: 3JXI 9 ) som sökmodell (fig. 2a – c, kompletterande fig. 2 och tabell 1). Kyckling ARD-strukturen utan IP 3 bestämdes också med 2, 0 Å-upplösning, för jämförelse.

( a ) Kristallstruktur för kyckling TRPV4 ARD · IP 3- komplex. IP 3 visas som en sfärmodell. De konstgjorda införda regionerna, den N-terminal initierande Met och den C-terminala Ala 3- länken följt av His 6- taggen är färgade grå. Muterade rester identifierade i de ärvda sjukdomarna är röda. Den nedre panelen visar de elektrostatiska ytpotentialerna, där rött och blått representerar sura respektive basiska egenskaper. ( b ) IP 3- bindande webbplats. Aminosyraresterna är märkta med människans / kycklingnummer. Förmodade vätebindningar visas som streckade linjer. ( c ) Utelämnad F O - F C- karta (3, 0 sigma-nivå) för IP 3 visas i ett grått nät. ( d ) De överlagrade rördiagrammen över nuvarande och rapporterade kristallstrukturer av TRPV4 ARD. Kyckling ARD i komplex med IP 3, ARD utan ligand (detta arbete), utan ligand (PDB ID: 3JXI 9 ) och i komplex med fosfatjon (PDB ID: 3JXJ 9 ) är färgade respektive blå, grön, magenta och orange. Som jämförelse är den humana ARD utan ligand (PDB ID: 4DX1 (ref. 23) och i komplex med ATP (PDB ID: 4DX2 (ref. 23)) färgad cyan respektive grå. Kedjan En molekyl från varje kristallstruktur är representerade.

Bild i full storlek

Full storlek bord

TRPV4 ARD består av sex ankyrinupprepningar (Ank1–6; fig. 2a och kompletterande fig. 3). Proteinstrukturen för ARD · IP 3- komplexet är nästan identisk med den nuvarande och rapporterade kyckling-TRPV4 ARD-strukturen utan en ligand 9 (fig. 2d), vilket indikerar att IP3-bindning inte påverkar den totala strukturen av ARD. Å andra sidan skiljer sig finger 3-konformationen från kycklingens TRPV4 ARD i komplex med fosfatjon och den humana TRPV4 ARD utan en ligand 9, 23 (fig. 2d). Konformationsförändringen i finger 2 observeras vid ATP-bindning till den humana TRPV4 ARD 9 (fig. 2d).

IP 3 är belägen bredvid Ank4-upprepningen och interagerar med resterna från Ank3–5 via dess fosfatgrupper (P1, P4 och P5; Fig. 2b, c). P1 interagerar med sidokedjorna för N296 / N282 (antalet mänskliga / kycklingsrester) i Ank4 och K344 / K330 i Ank5, medan P4 och P5 interagerar med R249 / R235 sidokedjor i Ank3 och H299 / H285 huvudkedjan NH i Ank4. Vidare bildar P4 en vattenmedierad interaktion med K251 / K237 sidokedjan i Ank3.

Vi undersökte också skillnaderna mellan TRPV4 ARD och TRPV1 ARD (PDB ID: 2NYJ 24 ). Ytan på TRPV1 ARD är positivt laddad, men de positiva laddningarna är inte klusterade, jämfört med de i TRPV4 ARD (kompletterande fig. 4), vilket kan förklara den lägre lipidbindande selektiviteten för TRPV1 (fig. 1a).

Dockningsimuleringar av ARD

För att ytterligare undersöka interaktionen mellan TRPV4 ARD och membranet testade vi olika fosforylerade inositoler, huvuden för fosfoinositider, för ARD-bindning i silikon (fig. 3a). Slumpmässigt placerade inositoler bedömdes för bindningen. Det kandidatbindande stället kan uppskattas med två beräknade värden, klusterstorleken och den bindande energin. Storleken på klustret indikerar populationen av inositoler bundna till den platsen. Även om exakt uppskattning av den bindande fria energin för mycket laddade rester är utmanande, förväntas den bindande energin korrelera med dissociationskonstanten, där lägre energi indikerar starkare bindning. Noterbart är myo-inositol 1, 4, 5-trisfosfat (IP 3 ), huvudet för PI (4, 5) P2 och myo-inositol 1, 3, 4, 5-tetrafosfat, huvudet för PI (3, 4, 5) P3, uppvisade relativt lägre bindande energier till IP3-bindningsstället i kristallen. Klusterstorlek kan inte användas för kvantitativ jämförelse mellan olika ligander, men det kan föreslå ett mer plausibelt bindningsställe för en given ligand. Klusterstorleken på IP 3- bindningsstället var den största bland alla andra kluster som observerades i denna studie (fig. 3a), vilket kan innebära att IP3 är mer benägna att binda till den position som finns i kristallen. Dessa data tycktes vara förenliga med den relativt starka bindningen av PI (4, 5) P2 till ARD (fig. La).

( a ) Bindningssätten för fosforylerade myo-inositoler, fosfoinositidhuvudena, till TRPV4 ARD förutsades av AutoDock 4.2. Resultaten visas tillsammans med IP 3 (grå) i kristallen. De lägsta energibindande lägena för de tio största klusterna representeras av bubblor, motsvarande storleken på klustret. Storleken på klustret anses grovt korrelera med möjligheten att binda. Den uppskattade energin för bindningen beräknas också (kcal mol −1 ). ( b ) Tabellen visar medelbindande energier, de lägsta bindande energierna och storleken på de fem bästa klusteren vid dockningen av IP 3 till ARD. I a och b anger färgkoderna ordningen på klusterstorlekarna. ( c, d ) Snapshots av simuleringarna av molekylär dynamik av ARD med PI (4, 5) P2-innehållande membran. Bindningen av ARD på ytan modellerades, baserat på IP 3- bindningsstället i kristallen ( c ) och det andra bindningsstället identifierat i dockningsimuleringarna ( d ).

Bild i full storlek

Det finns emellertid flera kluster av IP 3- bindning på motsatt sida av IP3-bindningsstället i kristallen i ARD, även om storleken på klusterna är mycket mindre än för platsen i kristallen (fig. 3a, b ). Därför testade vi bindningen av ARD på båda ytorna av PI (4, 5) P2-innehållande membran i silikon (fig. 3c, d). ARD placerades i endera orienteringen, och stabiliteten hos associeringen till membranet undersöktes. När IP 3- bindningsstället i kristallen placerades på membranet, var aminosyraresterna, såsom R216, K251, R249 och H299, lokaliserade i närheten av PI (4, 5) P2 i silico , bärande idén att IP 3- bindningsstället i kristallen också används som PI (4, 5) P2-bindningsstället (Fig. 3c). När ARD emellertid placerades med motsatt yta mot membranet, visade sig ARD associeras med PI (4, 5) P2-innehållande membranet i silikon , där aminosyraresterna, såsom R224, R269, R315 och R316 var belägna i närheten av PI (4, 5) P2 (fig. 3d). Denna yta är också positivt laddad (kompletterande figur 4), och därför kan den också vara ett potentiellt membranbindande ställe om ARD är bundet till membranet, vilket är situationen för ett kanalprotein.

Identifiering av aminosyrarester som är ansvariga för PI (4, 5) P2-bindning i TRPV4 ARD

Vi bekräftade sedan experimentellt IP 3- bindningsstället med en punktmutationsanalys. Först testade vi N296D-H299P human TRPV4 ARD-mutant, i vilken två rester för interaktioner med P1 respektive P5 är muterade. H299 ersattes med prolin, eftersom huvudkedjan NH interagerade med P5 och svängen av prolin tycktes vara identisk med den som H299 gjorde i strukturen. N296D-H299P-mutanten ARD visade svagare bindning till liposomer innehållande PI (4, 5) P2 än TRPV4 ARD (fig. 4a), och dissociationskonstanten för N296D-H299P-mutanten ARD bestämdes vara 163 μM ( r = 0, 989) med en SPR-analys (kompletterande figur 1). Det är viktigt att H299P enbart var tillräcklig för minskningen av bindningen. Detta resultat är rimligt eftersom N296 tycktes interagera med Pl-stället för IP3, vilket vanligtvis inte är involverat i bindningen av PI (4, 5) P2 till bindningsproteinet. Konsekvent reducerade K344E-mutationen i Pl-stället inte PI (4, 5) P2-bindning (fig. 4a). Sammantaget tycktes inte interaktionen mellan IP 3 och P1 vara väsentlig för IP 3 / PI (4, 5) P2-bindning. Å andra sidan reducerade K251E-mutanten för den vattenmedierade interaktionen med P4 inte heller PI (4, 5) P2-bindning (fig. 4a). R249E-mutanten för P4 uttrycktes inte, förmodligen på grund av att R249 samverkade med andra aminosyrarester för korrekt proteinvikning.

( a ) Liposom flytande analys. Bindningen av TRPV4 ARD (vildtyp: WT) och dess mutanter till PI (4, 5) P2-innehållande liposomer undersöktes. Liposomer utan PI (4, 5) P2 användes som en negativ kontroll för TRPV4 ARD. Utseendet på protein i toppfraktionen indikerar en protein-lipidinteraktion. ( b ) Proteinstabilitetsanalys. Halveringstiderna ( t 1/2 ) för WT ARD och mutanterna vid 37 ° C (fysiologiska förhållanden) och 50 ° C (denatureringsbetingelser) undersöktes. P- värden i förhållande till WT visas. Datapoäng är medelvärde ± sem ( n = 3–6).

Bild i full storlek

Vi undersökte sedan bindningen av mutationerna R232C, R269H, R315W och R316H, identifierade i CMT2C och andra sjukdomar 7, 8, 9, 25 . Alla dessa mutanter, med undantag för R232C, visade signifikant minskning av bindning till PI (4, 5) P2-innehållande liposomer (fig. 4a). Dissociationskonstanten för R315W-mutanten ARD bestämdes till 232 mikrometer ( r = 0, 876), vilket är mycket svagare än för TRPV4 ARD, med en SPR-analys (kompletterande fig 1). R269 / R255, R315 / R301 och R316 / R302-mutationerna är belägna på en annan yta än IP 3- bindningsstället i kristallstrukturen (fig. 2a), men vid en potentiell PI (4, 5) P2-bindning plats i dockningsimuleringen (fig. 3d).

Storleken på klustret nära ytan där de sjukdomsassocierade mutationerna är belägna var emellertid mindre än den nära ytan bestämd som ett IP 3- bindningsställe av kristallstrukturen (fig 3a, b). Vidare är identifieringen av bindningsställena på ARD genom en dockningsimulering inte lika tillförlitlig jämfört med den som identifierats med kristallstrukturen. Därför undersökte vi en annan möjlighet, proteinutvecklingen, för den minskade PI (4, 5) P2-bindningen av ARD på grund av de sjukdomsassocierade mutationerna. Bindningen av färgämne till hydrofoba aminosyrarester användes för att avslöja proteinutveckling. Det är viktigt att de strukturbaserade mutationerna på IP 3- bindningsstället, H299P och N296D-H299P, inte påverkade den utsträckta halveringstiden (fig. 4b). Emellertid destabiliserade R269H-, R315W- och R316H-mutationerna proteinstrukturen, vilket demonstreras av de kortare halveringstiderna för dessa mutanter än vildtyp (WT) ARD, såsom rapporterats tidigare (fig. 4b) 23 . Däremot destabiliserade inte R232C-mutationen strukturen 23 .

I kristallstrukturen bildar R269 / R255 och R315 / R301 en saltbro med D313 / D299 respektive E286 / E272 (fig. 5a). För att bekräfta att R269H- och R315W-mutationerna påverkar proteinstabiliteten utförde vi molekylär-dynamiska simuleringar. Vi gjorde R269H- eller R315W-mutationen i WT ARD i silikon , och sedan beräknades atomerna hos atomerna för 100 ns. Mutationerna påverkade avståndet mellan dessa par aminosyrarester som bildar en saltbro i WT ARD (Fig. 5b). Därför föreslås sjukdomsmutationerna att påverka den totala strukturen av ARD, från både stabilitetsanalysen och molekylär dynamiksimuleringar.

( a ) Saltbroarna vid R269 och R315. Interaktionerna mellan R269 och R315 med de angränsande aminosyraresterna, E286 respektive D313. ( b ) Avståndet mellan R269 och E286 och R315 och D313 beräknades för 100 ns, och resultaten visas i tabellen.

Bild i full storlek

Undertryckande av TRPV4-aktivitet genom PI (4, 5) P2-bindning

För att utforska de funktionella rollerna för fosfoinositider i TRPV4-aktiviteten, mätte vi jonströmmar i mänsklig embryonal njure (HEK) 293 celler som uttrycker humant TRPV4 genom helcells patch-clamp-inspelning. Hela cellströmmar framkallade av TRPV4-agonisten, 4a-PDD 26, undertrycktes genom tillsats av PI (4, 5) P2 och i något mindre utsträckning genom tillsats av PI (3, 4, 5) P3 via en patch-pipettlösning (Fig. 6a, b). Däremot påverkade inte PI (3, 4) P2 och PI (3, 5) P2 inte TRPV4-aktiviteten. Dessa känsligheter för fosfoinositider tycktes överensstämma med de lipidbindande specificiteterna (fig la och 3a). Eftersom koncentrationen av PI (3, 4, 5) P3 i allmänhet antas vara mycket lägre än för PI (4, 5) P2, även i stimulerade celler 27, fokuserade vi på PI (4, 5) P2 och undersökte dess effekter på kanalaktiviteter i detalj. Intressant nog inträffade början av strömmen inducerad av 4a-PDD tidigare genom tillsats av PI (4, 5) P2 än i dess frånvaro (kompletterande figur 5). Manipuleringen av PI (4, 5) P2 verkade fungera bra, eftersom diffusionen av PI (4, 5) P2 från pipetten in i cellen och de ökade PI (4, 5) P2-nivåerna i plasmamembranet (PM) bekräftades av den fluorescerande märkta BODIPY FL-märkta PI (4, 5) P2 och med den GFP-smälta PH-domänen för PLC δ1 (PLCδ1PH), som binder specifikt till PI (4, 5) P2 och IP 3 (ref 28, 29; Kompletterande figur 6).

( a ) Representativa I – V- förhållanden för helcellsströmmar före och efter exponering för 1 μM 4a-PDD i TRPV4-uttryckande HEK293-celler, dialyserade mot 20 μM PI (3, 4) P 2, 20 μM PI (3, 5 ) P 2, 20 μM PI (4, 5) P2 eller 20 μM PI (3, 4, 5) P 3 genom en patchpipett. ( b ) Basströmtäthet och 4a-PDD-framkallade strömrespons (Δ I ) av TRPV4, i närvaro av PI (3, 4) P2, PI (3, 5) P2, PI (4, 5) P 2 eller PI (3, 4, 5) P 3, vid −100 mV ( n = 6–12). ( c ) Representativa I – V- förhållanden mellan helcellsströmmar före och efter exponering för 1 μM 4a-PDD i TRPV4-uttryckande HEK293-celler samtransfekterade med antingen en tom vektor eller PLCδ1PH-expressionsvektorn. ( d ) Basströmtäthet och 4a-PDD-framkallade strömrespons (Δ I ) av TRPV4 vid −100 mV ( n = 7–9). ( e ) Representativa I – V- förhållanden för helcellsströmmar före och efter exponering för 1 μM 4a-PDD i TRPV4-uttryckande HEK293-celler, dialyserad mot 1% PI (4, 5) P2-antikropp (PI (4, 5) P2 Ab) eller 30 μM IP 3 genom en patchpipett. ( f ) Basströmtätheter och 4a-PDD-framkallade strömresponser av TRPV4-konstruktioner, i närvaro av PI (4, 5) P2 Ab eller IP 3 vid −100 mV ( n = 8-12). ( g ) Representativa I – V- förhållanden mellan helcellströmmar före och efter exponering för 1 μM 4a-PDD, i HEK293-celler som uttrycker Δ1–398, Δ1–398 PLCδ1PH-fusion eller Δ1–398 PLCδ1PHMut-fusion. ( h ) Basströmtäthet och 4a-PDD-framkallade strömresponser av TRPV4-konstruktioner vid −100 mV ( n = 7–9). Datapoäng är medelvärde ± sem

Bild i full storlek

För att bekräfta den undertryckande effekten av PI (4, 5) P2 på TRPV4-aktivitet minskade vi därefter PI (4, 5) P2-nivåerna i PM och undersökte kanalaktiviteterna. Överuttrycket av PLCδ1PH-domänen tros vara sequester PI (4, 5) P2 (och IP 3, som finns på mycket lägre nivåer än PI (4, 5) P2 i ostimulerade celler) 29, 30 . Konsekvent förhöjde överuttrycket av PLCδ1PH-domänen basalströmmarna och de maximala strömmarna vid 4a-PDD-behandling (fig. 6c, d). Dessutom ökades basströmmarna och de maximala strömmarna vid 4a-PDD-behandling genom tillsats av en anti-PI (4, 5) P2-antikropp 31 eller IP 3 genom en patch-pipettlösning (fig 6e, f). Intressant nog försenades TRPV4-svar på 4a-PDD något genom att tillsätta PI (4, 5) P2-antikroppen eller IP 3 (kompletterande figur 5). De minskade nivåerna av PI (4, 5) P2 i PM genom tillsats av anti-PI (4, 5) P2-antikroppen eller IP 3 (ref. 29) bekräftades med GFP-PLCδ1PH (kompletterande fig 6) ). Hela cellströmmar framkallade av hypo-osmotiska och värmespänningar 1, 2 dämpades också genom tillsats av PI (4, 5) P2, men förbättrades genom tillsats av PI (4, 5) P2-antikroppen eller IP 3 i TRPV4- som uttrycker HEK293-celler (kompletterande figurer 7 och 8), vilket indikerar att PI (4, 5) P2 undertrycker TRPV4-aktiviteter oavsett typ av stimuli.

Den positiva effekten av IP 3 på TRPV4-kanalfunktion rapporterades tidigare 32 . Med tanke på att IP 3 är huvudgruppen för PI (4, 5) P2, kan IP 3 tävla med PI (4, 5) P2 för ARD-bindning 33 . I överensstämmelse med denna uppfattning dämpades 4a-PDD-framkallade strömmar genom TRPV4 genom tillsatsen av de längre acylkedjorna av PI (4, 5) P2 (diC8-PI (4, 5) P2 och diC16-PI (4, 5) P2), men förstärktes genom tillsats av de kortare acylkedjorna av PI (4, 5) P2 (diC4-PI (4, 5) P2) (kompletterande figur 9). Eftersom hydrofiliciteten hos diC4-PI (4, 5) är P2 högre än diC8-PI (4, 5) P2 och diC16-PI (4, 5) P2, diC4-PI (4, 5) P 2 kan enkelt tas bort från membranet och kan förhindra ARD-membranassociation och öka kanalaktiviteten, på liknande sätt som IP 3 .

Slutligen, för att undersöka vikten av PI (4, 5) P2-bindning vid den N-terminala regionen av TRPV4, raderade vi nästa N-terminal ARD (Δ1–398) eller ersatte den med PLCδ1PH (Δ1-398 PLCδ1PH-fusion) eller med en PLCδ1PH-mutant som bär R40D-mutationen 28 för att minska interaktionen med PI (4, 5) P2 (Δ1-398 PLCδ1PH-Mut-fusion), och jämförde svaren från dessa mutanter med TRPV4-agonister (fig. 6g, h och Kompletterande bild 10). Dessa mutanter uppvisade liknande lokaliseringsmönster i PM, men expressionsnivåerna i PM var något nedsatt i jämförelse med TRPV4 i full längd, vilket avslöjades genom mikroskopi av total intern reflektionsfluorescens (TIRF), som endast belyser det subcellulära området från ytan till ett djup på mindre än 100 nm från täckglasens yta och med biotinyleringsmärkningsmetoden (tilläggsfigur 11). Δ1-398-mutanten kunde fortfarande framkalla betydande svar på 4a-PDD och hypo-osmotisk stress, men inte till värmestress, som tidigare rapporterats 34 (fig. 6g, h och kompletterande fig. 10b, c). I synnerhet, i överensstämmelse med idén om undertryckandet av TRPV4 genom PI (4, 5) P2-bindning vid dess N-terminus, minskade närvaron av PH-domänen (Δ1-398 PLCδ1PH-fusionsmutant) TRPV4-responserna till 4a-PDD och hypo-osmotisk stress, medan PH-domänmutanten (Δ1-398 PLCδ1PH-Mut-fusionsmutant) visade jämförbara kanalaktiviteter med Δ1-398-mutanten (fig. 6g, h och kompletterande fig. 10b, c). Således utövar PI (4, 5) P2-bindning till N-terminalen av TRPV4 en hämmande effekt på kanalaktiviteten.

PI (4, 5) P2-okänslighet hos sjukdomsassocierade TRPV4-mutanter

Därefter mätte vi strömmarna av TRPV4-mutanter med försämrad PI (4, 5) P2-bindning. R269H-, N296D-H299P-, H299P-, R315W- och R316H-mutanterna, som visade nedsatt PI (4, 5) P2-bindning (fig. 4a), uppvisade förhöjda basalaktiviteter och högre respons på TRPV4-agonister (fig. 7 och kompletterande fig. 7), 8 och 12). De förbättrade aktiviteterna för dessa mutanter kan inte hänföras till förändrat membranuttryck, eftersom mutanterna visade intakt PM-uttryck liknande TRPV4 (kompletterande fig 11). Den undertryckande effekten av PI (4, 5) P2 och den förstärkande effekten av PI (4, 5) P2-antikroppen och IP 3 på TRPV4-aktiviteterna observerades inte med dessa mutanter (fig. 7 och kompletterande fig. 7 och 8 ). Däremot svarade R232C, K251E och K344E-mutanterna, som visade PI (4, 5) P2-bindning (fig. 4a), PI (4, 5) P2, PI (4, 5) P2-antikroppen och IP 3 (fig. 7). Hela cellströmmarna via K251E- och K344E-mutanterna under basala och 4a-PDD-stimulerade tillstånd liknade de via TRPV4 (fig 6 och 7). R232C-mutanten uppvisade marginellt ökade strömmar, trots det minskade membranuttrycket (kompletterande fig. 11a). Intressant nog lokaliserades R232C i en prickliknande struktur i PM, medan TRPV4 och de andra mutanterna var lokaliserade i filamentliknande strukturer i PM (kompletterande figur 11b).

Effekter av intracellulär PI (4, 5) P2 och IP 3 på aktiviteterna för R232C, R251E, R269H, N296D-H299P, H299P, R315W, R316H och K344E. ( a ) Representativa I – V- förhållanden för helcellsströmmar före och efter exponering för 1 μM 4a-PDD i TRPV4 konstruktionsuttryckande HEK293-celler, dialyserade mot 20 μM diC8-PI (4, 5) P2, 1% PI ( 4, 5) P2 Ab eller 30 μM IP 3 genom en patchpipett. ( b ) Basströmtätheter och 4a-PDD-framkallade strömresponser av TRPV4-konstruktioner, i närvaro av diC8-PI (4, 5) P2, PI (4, 5) P2 Ab eller IP 3 vid −100 mV ( n = 5–17). Datapoäng är medelvärde ± sem

Bild i full storlek

De flesta patienter som lider av TRPV4-kanalopatier har en normal TRPV4 och en mutant allel av TRPV4. Vi undersökte därför PI (4, 5) P2-känsligheten för TRPV4-strömmar med HEK293-celler som uttrycker TRPV4 och mutanterna (kompletterande fig. 13). HEK293-celler som samuttryckte TRPV4 och antingen R269H, R315W eller N296D-H299P-mutanten visade förhöjda basala aktiviteter och högre respons på 4a-PDD (kompletterande fig. 13b, c). In addition, these currents were insensitive to PI(4, 5)P 2, the PI(4, 5)P 2 antibody and IP 3 (Supplementary Fig. 13b, c). We immunoprecipitated TRPV4 with the co-expressed R269H, R315W or N296D-H299P mutant (Supplementary Fig. 13a), and the results suggested that hetero-multimeric channels may be causing the disease phenotype.

To verify the functional impacts of PI(4, 5)P 2 on the TRPV4 activity under physiological conditions, we measured Ca 2+ mobilization in HEK293 cells expressing TRPV4 or the mutants upon PLC activation, by stimulating G-protein-coupled receptors with ATP 32 . The 4α-PDD-induced Ca 2+ responses of TRPV4 were potentiated by 10 μM ATP (Fig. 8a, b and Supplementary Fig. 14), suggesting that PI(4, 5)P 2 hydrolysis by PLC increases the TRPV4 activity. Notably, ATP-induced enhancement of channel activity was not observed with the R269H, R315W and N296D-H299P mutants (Fig. 8a, b and Supplementary Fig. 14), which instead showed elevated basal activities and enhanced responses to 4α-PDD in the absence of ATP (Fig. 8a, b and Supplementary Fig. 14). Consistently, the overexpression of the PLCδ1PH domain 30 elevated the basal intracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] i ), enhanced the Ca 2+ responses of TRPV4 to 4α-PDD, and suppressed the responses to ATP (Fig. 8a, b and Supplementary Fig. 14). Under these conditions, both Ca 2+ influx through TRPV4 and Ca 2+ release from the endoplasmic reticulum in the presence of 10 μM ATP were negligible, as compared with the potentiating effect of the same concentration of ATP on 4α-PDD-induced Ca 2+ influx (Supplementary Fig. 15).

( a, b ) The effects of 10 μM ATP on 1 μM 4α-PDD-evoked [Ca 2+ ] i responses in TRPV4 construct-expressing HEK293 cells transfected with vector or PLCδ1PH. Averaged time courses ( a ) and maximal [Ca 2+ ] i increases (Δ[Ca 2+ ] i ) ( b ) in 4α-PDD-responding cells are shown ( n =9–23). ( c ) Quantification of cell death in TRPV4 construct-expressing HEK293 cells transfected with a GFP-marker plasmid (pEGFP) together with vector or PLCδ1PH. Representative fluorescence images of propidium iodide (red) and GFP (green) and percent cell death are shown. Data are averaged from three independent experiments. The bar indicates 100 μm. Data points are mean±sem

Bild i full storlek

All of these results strongly support the conclusion that TRPV4 activities are suppressed through the ARD-PI(4, 5)P 2 association, which upon perturbation causes TRPV4 to adopt a gain-of-function phenotype.

Loss of PI(4, 5)P 2 binding confers susceptibility to cell death

Intracellular Ca 2+ signals are crucial for diverse cellular processes such as survival and death; therefore, cells expressing the TRPV4 mutants might struggle to maintain [Ca 2+ ] i at non-toxic levels. Indeed, propidium iodide uptake experiments revealed that the expression of the N296D-H299P mutant, as well as the R269H and R315W mutants 9, 10, caused a marked increase in cell death (Fig. 8c). Furthermore, the co-expression of PLCδ1PH with TRPV4 resulted in a remarkable increase in cell death, whereas co-expression with the TRPV4 mutants did not (Fig. 8c). These results suggested that defective PI(4, 5)P 2 binding contributes to the increased activity of certain disease-associated TRPV4 mutants that cause cellular toxicity and increased cell death.

Diskussion

In this study, we found that the TRPV4 ARD binds to phosphoinositides, especially PI(4, 5)P 2, which suppress TRPV4 activities. TRPV4 channel activities and cell death were increased by the hydrolysis of membrane PI(4, 5)P 2 . Site-directed mutagenesis of the PI(4, 5)P 2 -binding residues, identified in the ARD·IP 3 structure, increased the TRPV4 channel activities and cell death. These findings demonstrated that the loss of PI(4, 5)P 2 binding results in increased TRPV4 activities and elevated cell death. Notably, the disease-associated R269H, R315W and R316H mutations abolished the PI(4, 5)P 2 binding and PI(4, 5)P 2 sensitivity. Thus, defective PI(4, 5)P 2 binding to the TRPV4 ARD and consequent intracellular cation/Ca 2+ deregulation might contribute to cellular toxicity in some diseases, including CMT2C, CDSMA and SPSMA.

The suppressive effect of PI(4, 5)P 2 on TRPV4 activity is reasonable, in the context of the intracellular signalling events that regulate TRPV4 activities. PI(4, 5)P 2 hydrolysis by PLC produces IP 3, which sensitizes TRPV4 activity 32, and DAG. The sensitizing effect of IP 3 is considered to be mediated by the association between TRPV4 and IP 3 receptor 32, although the detailed mechanisms remain elusive. Our findings of direct binding of IP 3 and PI(4, 5)P 2 to the TRPV4 ARD and the loss of channel regulation by PI(4, 5)P 2 and IP 3 in mutants at the IP 3 -binding site suggested that IP 3 competes with PI(4, 5)P 2 for ARD binding, to relieve TRPV4 inhibition. With regard to DAG, it is proposed to stimulate AA synthesis through the activation of protein kinase C 35, 36 and is further metabolized to a TRPV4 agonist AA by DAG lipase 37 . Therefore, DAG also might exert a positive effect on the TRPV4 activity. However, the level of AA production induced by DAG appeared to be insufficient to increase the TRPV4 activities, at least under our experimental conditions, because 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol, a membrane-permeable DAG analogue, neither activated TRPV4 directly nor enhanced the 4α-PDD-stimulated responses of TRPV4 (Supplementary Fig. 16). Therefore, the observed enhancement of TRPV4 activity by ATP receptor stimulation (Fig. 8a, b) is thought to be achieved by decreasing PI(4, 5)P 2 and by increasing IP 3 production, but not by producing DAG. It will be interesting to explore further the functional coupling between the PLC-PI(4, 5)P 2 hydrolysis-IP 3 and PLA 2 -AA-EET pathways, in the context of TRPV4 activation.

The onset of TRPV4 responses to 4α-PDD was somewhat accelerated by adding PI(4, 5)P 2, in spite of the dramatic decrease in the total changes of current densities (Supplementary Fig. 5). Interestingly, such a change in the kinetics of the TRPV4 currents has also been shown for a change in the extracellular Ca 2+ concentration 38, 39 . TRPV4 responses to 4α-PDD were reported to be accelerated but rapidly decayed, and the amplitudes of the evoked currents were small at high extracellular Ca 2+ concentrations, whereas the amplitudes increased and the decay was markedly delayed at lower Ca 2+ concentrations 38, 39 . Therefore, PI(4, 5)P 2 and Ca 2+ may play multiple functional roles, probably in an activation state-dependent manner.

Recently, the high-resolution structure of tetrameric TRPV1 was reported 40, 41 . In this structure, the TRPV1 ARD appeared to be located apart from the membrane. However, our molecular dynamics simulation study implied that the PI(4, 5)P 2 could reach and interact with the ARD of TRPV1 (Supplementary Fig. 17). The TRPV1 structures reported by Liao et al. and Cao et al. were solved in lipids without PI(4, 5)P 2 . PI(4, 5)P 2 generally has longer acyl-chains, and thus its head group might be able to come closer to the binding site in the ARD than those of other lipids.

When the TRPV4 ARD was superimposed on the full-length TRPV1 structure, the IP 3 -binding site faced the cytoplasm, and did not overlap with the contact site of the linker region that connects each subunit (Supplementary Fig. 18). However, our data, including the experiments with the mutant TRPV4 where the ARD was substituted with the PH domain of PLCδ1, which specifically binds to PI(4, 5)P 2, supported the suppressive role of PI(4, 5)P 2 binding to the ARD. We therefore speculate that the geometry of the TRPV4 ARD might be slightly but significantly different from that of the TRPV1 ARD in the full-length structure embedded in the PI(4, 5)P 2 -containing membrane. This hypothesis is supported by lines of evidence from structural and functional points of view. The cryo-electron microscopic studies of TRPV1 indicated the relatively vertical orientation of the ARD, whereas those for TRPV4 suggested that the ARD sat on the membrane in an oblique orientation 4, 42 . Notably, amino-acid residues 404–407 of rat TRPV1, which are located in the linker region between the ARD and transmembrane region, are not conserved in the human TRPV4. In particular, the counterpart of P407 in the rat TRPV1 is E444 in the human TRPV4. A proline residue creates a structural constraint, because its side chain cyclizes back to the backbone amide. Considering that Pro407 is located immediately beneath the pre-transmembrane S1 helix 43, it is reasonable to suppose that Pro407 may determine the angle and flexibility of the N-terminal cytoplasmic region, including the TRPV1 ARD. The importance of the linker region in the TRPV4 function has been demonstrated, using a TRPV4 variant lacking the linker region 43 .

With regard to the structure of the ARD, positively charged amino acids (Lys, Arg and so on) are clustered at and near the binding site for the head group of PI(4, 5)P 2 in TRPV4, whereas they are not concentrated in the corresponding area of TRPV1 (Supplementary Fig. 4). This suggests that the positively charged cluster of the TRPV4 ARD stabilizes the binding site of the ARD on the surface of the PI(4, 5)P 2 -containing membrane. It must be noted that the regulatory factors of the TRPV4 channels (activation triggers, inhibitors and interacting proteins) are very different from those of the TRPV1 channels. Thus, the structural characteristics of TRPV4 are not completely comparable with those of TRPV1, but have rather diverged.

Alternatively, it is possible that the other surface of the TRPV4 ARD might interact with the negatively charged membrane including PI(4, 5)P 2 . To assess this idea, we ran the molecular-dynamics simulation and found that the ARD placed on the membrane with the opposite surface also appear to stably associate with it. Interestingly, the association on this 'opposite' surface is mediated by the amino-acid residues that are mutated in diseases (Fig. 3d). In addition, TRPV4 has a sequence of consecutive basic amino-acid stretches within the N-terminal tail 44, which could function as a binding site for acidic lipids. In these cases, IP 3, which is diffusible, might bind to both the PI(4, 5)P 2 -binding and IP 3 -binding sites. This could not only relieve TRPV4 from inhibition by PI(4, 5)P 2 but also induce global conformational changes in the TRPV4 protein, through neutralization of the surface charge to directly affect the channel activity, although the isolated ARD structure itself was not largely influenced by IP 3 binding (Fig. 2d). Another possibility is that the TRPV4 protein is inserted into the PM as a monomeric form through the interaction between PI(4, 5)P 2 and the ARD. Given this situation, the TRPV4 proteins might only form a functional tetrameric channel after the hydrolysis or sequencing of PI(4, 5)P 2 . Furthermore, we cannot exclude the possibility that the TRPV4 ARD interacts with PI(4, 5)P 2 localized in the inner membrane 45 . Thus, the structural basis of the PI(4, 5)P 2 -induced suppression of TRPV4 channel activities is still unknown. To understand it, further studies, including the determination of the high-resolution structure of TRPV4, are needed.

If the IP 3 -binding surface determined by our crystallographic study faces the membrane, then the reason for the lack of PI(4, 5)P 2 binding by the disease mutants, such as R269H, R315W and R316H, may result from the destabilization of the overall protein structure, as shown in Figs 4 and 5. Given this situation, we cannot exclude the possibility that the gain-of-function phenotype of these mutants is attributable to an alteration in interactions with other regulatory factors, caused by protein instability. Indeed, the loss of ATP binding becasuse of protein instability has been reported for the R269H mutant protein 23, although there is no correlation between the disease phenotype and the ATP binding, as intracellular ATP sensitizes TRPV4 activities 39 . However, the H299P and N296D-H299P mutants, which carry one or more mutation(s) in the IP 3 -binding site determined by our crystallographic study, retained intact protein stability (Fig. 4b), indicating that the decreased PI(4, 5)P 2 binding results in the loss of PI(4, 5)P 2 -mediated channel regulation and the augmentation of channel activity. This finding strongly suggests that the gain-of-function phenotypes of the R269H, R315W and R316H mutants are at least in part becasuse of decreased PI(4, 5)P 2 binding. To clarify this, further identification of regulatory factors and their relationships to the PI(4, 5)P 2 binding will be necessary.

Bland de sjukdomsassocierade ARD-mutationer som vi testade, påverkade endast R232C-mutationen inte PI (4, 5) P2-känsligheten och proteinstabiliteten. Detta innebär att R232C-mutationen framkallar en fenotyp av vinst-av-funktion genom PI (4, 5) P2-oberoende mekanismer. Intressant nog var R232C-mutanten lokaliserad i en prickliknande struktur i PM, i motsats till lokaliseringen av TRPV4 och dess mutanter som bär R269H-, R315W- eller R316H-mutationen i filamentliknande strukturer (kompletterande fig. 11b). Därför kan R232C-mutationen störa sambandet med cytoskeletala proteiner, såsom mikrofilamentassocierat protein 7 (ref. 46). Alternativt är N-terminalen av TRPV4 (aminosyrarester 40–235) känd för att interagera med OS-9, vilket underlättar korrekt vikning av TRPV4 och ytterligare bildning av tetramer i det endoplasmiska retikulum 47, vilket antyder involvering av OS-9 i CMT2C-fenotypen av R232C. Därför kommer den molekylära patogenesen för R232C-mutationen att vara ett intressant ämne för framtida studier.

Trots våra data som tyder på PI (4, 5) P2-medierad reglering av TRPV4, kan patogenesen av sjukdomar med TRPV4-mutationer induceras av andra störningar förutom den defekta PI (4, 5) P2-bindningen vid ARD, såsom föreslogs av R232C-mutationen. Ett stort antal andra dominerande missense TRPV4- mutationer utanför ARD har identifierats i olika ärftliga sjukdomar 1 . Exempelvis har P799R- eller T701I-mutationen rapporterats för olika sjukdomar, inklusive CMT2C, CDSMA och SPSMA, även om det förblir okänt om dessa mutationer framkallar en fenotyp av vinst-av-funktion 1 . Det bör emellertid noteras att majoriteten av CMT2C-, CDSMA- och SPSMA-associerade mutanter som är kända för att uppvisa en förstärkning av funktionen fenotyp uppvisade försämrad PI (4, 5) P2-känslighet, vilket upprättar en korrelation mellan PI (4, 5) P2-känsligheten och sjukdomen fenotyp. För att erhålla direkt bevis på betydelsen av den defekta PI (4, 5) P2-bindningen i sjukdomarna kommer generering och karakterisering av knock-in-möss som bär en mutation i PI (4, 5) P2-bindande domän av TRPV4 nödvändig.

Nyligen har Garcia-Elias et al. rapporterade att PI (4, 5) P2 underlättar TRPV4-svar på hypo-osmotiska och värmespänningar 44 . Intressant nog visade våra resultat att TRPV4-responsen på 4a-PDD förbättras något av PI (4, 5) P2 under de första 20 sekunderna efter applicering av stimuli (kompletterande fig. 5). Det är möjligt att TRPV4-strömmarna som inträffade endast omedelbart efter behandlingen med stimuli observerades i den tidigare studien. Dessutom utvärderades effekterna av diC8-PI (4, 5) P2 med olika experimentella metoder: skurna lappmätningar i den tidigare studien och hela cellkonfigurationen i den aktuella studien. Eftersom intracellulära faktorer går förlorade i skärade lappmätningar, är det också möjligt att vissa andra faktorer och PI (4, 5) P2 kumulativt kan påverka TRPV4-aktiviteter i intakta celler.

Föreliggande studie är den första demonstrationen av lipidbindande förmågan hos ARD. I grund och botten visar fosfoinositidbindande proteiner två typer av bindningssätt: "ospecifik" elektrostatisk komplementaritet och specifik bindning till särskilda huvudgrupper 13, 14, 15, 48 . Den "ospecifika" bindningen inträffar med klustret av basladdade aminosyrarester till sura fosfoinositider, som kan observeras med både ostrukturerade sträckor av basladdade aminosyrarester, såsom N-WASP och små GTPaser, och strukturerad vikning, t.ex. av BAR-domäner. Den specifika bindningen inträffar med PH-domäner, FYVE-domäner, C2-domäner och flera andra domäner, som har bindningsfickor för speciella fosfolipider. Som vi har visat här verkar ARD: er anpassa båda interaktionssätten till fosfoinositider.

Det är möjligt att lipidbindningsförmågan delas av vissa andra ARD: er. ARD finns i mer än 500 humana proteiner, med olika bindningsspecificiteter och affiniteter 49 . Detta kännetecken för ARDs anses baseras på den stora mångfalden på deras ytor på grund av olika antal och kombinationer av ankyrinupprepningar 50 . Konsekvent kan konstgjorda ankyrinupprepade proteiner (DARpin) väljas för inriktning på specifika proteiner från ett bibliotek med konstgjorda ARD, men har inte utformats rationellt 51 . Detta kännetecken för ARD är jämförbart med antikroppar, i det att antikroppar kan genereras mot lipider, inklusive PI (4, 5) P2 (ref. 52). Därför kan ARD: s mycket varierande egenskaper stödja deras förmåga att känna igen en mängd olika molekyler, inklusive lipider.

metoder

Framställning av TRPV ARD-proteinet

Genen som kodar för kycklingen TRPV4 ARD (resterna 133–382) klonades in i Nde I- och Sal I-ställena i pET22b-vektorn (Novagen) med en C-terminal His 6- tagg för kristallisation. Escherichia coli- stammen Rosetta 2 (DE3) (Stratagene) transformerades med expressionsplasmiden och cellerna odlades i LB-medium. Proteinet överuttrycktes genom induktion med 1 mM isopropyl-P-D-1-tiogalaktopyranosid över natten vid 20 ° C.

De uppsamlade cellerna suspenderades i lysbuffert (20 mM Tris-HCl (pH 8, 0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazol (pH 8, 0) och 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid), innehållande 0, 1% Triton X-100, 0, 2 mg ml -1 lysozym, 50 μg ml −1 RNas A och 25 μg ml −1 DNas I och stördes med en ultraljudshomogenisator. Efter centrifugering laddades supernatanten av lysatet på en Ni Sepharose 6 Fast Flow-kolonn (GE Healthcare), som eluerades med 50 och 200 mM imidazol (pH 8, 0) i lysbuffert. Fraktionen innehållande proteinet dialyserades mot 20 mM Tris-HCl-buffert (pH 8, 0), innehållande 70 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT) och 10% glycerol, och laddades på en Resource S-kolonn (GE Healthcare). Proteinet eluerades med en linjär gradient av 0-2 M NaCl. Det renade proteinet dialyserades ytterligare mot 20 mM Tris-HCl-buffert (pH 8, 0), innehållande 300 mM NaCl, 1 mM DTT och 10% glycerol, och koncentrerades till 10, 5 mg ml-1.

För bindningsanalyser till liposomer uttrycktes WT eller mutanter hos den humana TRPV1 eller TRPV4 ARD som glutation- S- överföringsfusionsproteiner med användning av pGEX6P-1-vektorn (GE Healthcare). Proteinerna renades sedan och glutation- S- transferas avlägsnades genom Prescission-proteas-spjälkning.

Liposombindande analys

Bindningen av TRPVl- och TRPV4-ARD: erna till fosfoinositidinnehållande liposomer undersöktes med en samsedimentationsanalys. Liposomerna innehöll fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, kolesterol, fosfoinositider och rododmärkt PE (Avanti Polar Lipids), i ett viktförhållande av 10: 2: 8: 2: 0, 7. Rhodamine-PE införlivades för att underlätta visualisering av liposomfraktionen. Lipiderna löstes först i kloroform / metanol / 1 N HCl (80: 80: 1) för fosfoinositider eller kloroform / metanol (1: 1) för andra lipider, blandades och torkades under kvävgas, följt av under vakuum. De torkade lipiderna suspenderades på nytt för att bilda liposomer under 1 timme vid 37 ° C i en koncentration av 2 μg μl −1 (total lipid) i Tris-buffrad saltlösning (TBS), innehållande 10 mM Tris – HCl (pH 7, 5) och 150 mM NaCl och utsattes för fem fryscykler (vätska N2) och upptining (37 ° C vattenbad). ARD-proteinet (0, 5 μg μl −1 ) och liposomer (1 μg μl 11) blandades i buffert innehållande 10 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA och 5% glycerol. Efter en 25-minuters inkubation vid rumstemperatur fälldes liposomerna ut genom centrifugering vid 100 000 rpm under 30 minuter i en TLA100-rotor (Beckman Coulter). Pelleten och supernatanten undersöktes med SDS – polyakrylamidgelelektrofores (SDS – PAGE) och visualiserades genom Simply Blue-färgning (Invitrogen), vilket motsvarar Coomassie Brilliant Blue-färgning (kompletterande fig. 19). Representativa data från tre oberoende experiment visas i figuren.

Bindningen av TRPV1 och TRPV4 ARD till liposomer undersöktes med en flytande analys, på grund av instabiliteten hos TRPV4 ARD vid en fysiologisk jonisk koncentration. Liposomerna innehöll fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, kolesterol, PI (4, 5) P2 och rodamin-PE, i ett viktförhållande av 10: 2: 8: 0, 7: 0, 25. ARD-proteinet (0, 5 μg μl −1 ) och liposomer (1 μg μl 101) blandades i TBS innehållande 10% glycerol och 40% Nycodenz / Histodenz (Sigma) och inkuberades under 15 minuter vid rumstemperatur. En 200-alikvot av blandningen överlagdes med 350 ul TBS innehållande 10% glycerol och 30% Nycodenz / Histodenz, följt av 70 ul TBS innehållande 10% glycerol. De skiktade lösningarna centrifugerades sedan vid 48 000 rpm under 4 timmar i en SW50-rotor (Beckman Coulter). Liposomerna steg upp och fraktioner (100 ul vardera) analyserades med SDS – PAGE.

SPR-experiment med nanodisk innehållande PI (4, 5) P2-membran

Membranställningsprotein (MSP) D1 är känt för att linda in lipidmembran i små partiklar. Dessa partiklar som innehåller lipidmembran kallas "nanodiscs" och tros fungera som lösliga molekyler. Således kan nanodiscs användas för att mäta lipid-protein-interaktioner i lösning 53 . För att framställa nanodiskar uttrycktes MSP1D1-proteinet och renades såsom beskrivits tidigare 53 . 1-Palmitoyl-2-oleoylfosfatidylkolin (POPC) och PI (4, 5) P2 solubiliserades i 100 mM kolat i ND-buffert (20 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 100 mM NaCl) till slutliga koncentrationer av 50 och 1, 27 mM, respektive. MSP1D1-proteinet tillsattes i ett molförhållande av MSP1D1: POPC: PI (4, 5) P2 = 1: 80: 0 eller 1:70:10. Lipid-proteinblandningen roterades försiktigt i 30 minuter vid 28 ° C. Därefter tillsattes 0, 8 g ml-1 av BioBeads SM-2 (Bio-Rad) jämviktad med ND-buffert till 100 ul av protein-lipidblandningen för att avlägsna kolat, och suspensionen placerades på en orbitalskakare i 1 timme vid 28 ° C Pärlorna avlägsnades genom sedimentering och supernatanten dialyserades mot ND-buffert under 12 timmar. Nanodiskerna efter dialys renades genom gelfiltrering på Superdex 200 10/300 (GE Healthcare) med användning av SPR-löpande buffert (10 mM HEPES (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA). I det sista steget koncentrerades nanodiskerna med ett Amicon Ultra 10K-filter (Merck Millipore).

SPR-bindande analyser utfördes vid 25 ° C på en BIAcore 2000 (GE Healthcare). BSA, kyckling TRPV4 ARD, kyckling TRPV4 R301W och kyckling TRPV4 N282D-H285P kopplades till ett sensorchip CM5 (GE Healthcare) genom aminkoppling. Bindningsanalyser utfördes med en flödeshastighet av 5 | il min -1, med användning av en buffert innehållande 10 mM HEPES (pH 7, 5), 150 mM NaCl och 3 mM EDTA. Varje körning bestod av på varandra följande injektioner av analyt (PI (4, 5) P2-inkorporerade nanodiskar). Associerings- och dissocieringsfasema mättes under 7 respektive 5 minuter. Bindning undersöktes vid tre olika proteinkoncentrationer. Signalerna (responsenhet) ökades om bindningen mellan nanodiscs och TRPV4 inträffade på ett koncentrationsberoende sätt. Denna koncentrationsberoende ökning observerades med PI (4, 5) P2 innehållande nanodiskar, men inte med nanodiskar som saknade PI (4, 5) P2. Därför beräknades Kd (= k diss / k ass ) -värden framgångsrikt från kurvpassning endast för PI (4, 5) P2-innehållande nanodiskar. Den uppenbara parametern för associering ( k on ) beroende på koncentrationen plottades, och lutningen och skärningen av k gav k ass respektive k diss- värden. Mätningen utvärderades med en korrelationskoeffektiv för montering.

Kristallisation, IP 3- blötläggning och datainsamling av diffraktion

Den sittande droppånga-diffusionsmetoden användes för kristallisation. Diffraktionskvalitetskristaller erhölls vid 4 ° C, genom att blanda 1 ul proteinlösning och 1 ul reservoarlösning innehållande 110-120 mM natrium MES-HCl-buffert (pH 6, 5), 1-2% polyetylenglykol 4000, 11-12 % 2-metyl-2, 4-pentandiol och 55–60 mM KH2PO4. Kristaller överfördes till den kryo-skyddande lösningen (50 mM natrium MES-HCl-buffert (pH 6, 5), 6, 0% polyetylenglykol 4000, 12% 2-metyl-2, 4-pentandiol, 10% glycerol och 100 mM NaCl) och flash -kyldes vid 90 K. För IP3-blötläggning överfördes kristaller till den kryo-skyddande lösningen innehållande 10 mM IP3 och inkuberades vid 4 ° C under 50 minuter, innan snabbkylning. Diffraktionsdatauppsättningarna uppsamlades vid 90 K vid Photon Factory NW12A (Tsukuba) med en våglängd av 1 000 Å. Datauppsättningarna behandlades med användning av HKL2000-programmet 54 (tabell 1).

Strukturbestämning och förfining

Kristallstrukturerna för kyckling TRPV4 ARD (med och utan IP 3 ) löstes med molekylersättningsförfarandet med Phaser-programmet 55 med användning av koordinaterna för den rapporterade kyckling TRPV4 ARD-strukturen (PDB ID: 3JXI 9 ) som sökmodell. Strukturen förfinades mot data genom iterativa cykler av positions- och temperaturfaktorförfining med Phenix-programmet 56 och manuell modellbyggnad och revision med Coot-programmet 57 .

Samma reflektioner valdes som testuppsättningens reflektioner (2% av data) för förfining av kristallstrukturerna med och utan IP 3 . Modellen för IP 3 ingick inte i det tidigare fasen av förfining. Det placerades i motsvarande intensiva F O - F C elektron täthet karta i senare omgångar. Flera förfiningsrunder efter plockning av vattenmolekyler tillät omvandlingen av R- faktorerna (tabell 1). I den slutliga modellen för IP3-komplexet fanns 97, 1% av alla rester i de föredragna regionerna i Ramachandran-tomten, 2, 4% var i de tillåtna regionerna och 0, 5% var outliers baserade på valideringen i Coot-programmet. I strukturen utan IP 3 fanns 96, 1% i de föredragna regionerna, 3, 5% var i de tillåtna regionerna och 0, 4% var outliers.

Dockningsimulering

Bindningssätten för fosforylerade myo-inositoler till ARD förutses med den molekylära dockningsprogramvaran, AutoDock4.2 (ref. 58). Totalt utfördes 250 oberoende dockningsimuleringar för varje myo-inositol, och de sålunda erhållna 250 bindningssätten grupperades i 27–41 kluster med 2, 0 Å-kriterium. De lägsta energibindande lägena för de tio bästa klustren visas i fig. 3. Platsen för IP 3 i toppklustret, som består av 95 av de 250 förutsagda strukturerna (40%), är mycket nära den i X -kristallstruktur (färgad grå i fig. 3), validerar platsen för IP 3 bestämd i denna studie.

Molekylär dynamik simulering

Simuleringssystem för WT och två mutanter, R255H och R301W, av ARD i TRPV4 i lösning (totalt ~ 43 000 atomer inklusive vatten och joner) bereddes, baserat på den kristallstruktur som erhölls i denna studie och simulerades för 100 n.

Modellering av PI (4, 5) P2-bundet ARD med membran initierades genom alstring av ett jämviktigt lipid-tvåskiktssystem innehållande 288 diarachidonylfosfatidylkolin (DAPC) molekyler. Sedan ersattes en av DAPC-huvudgrupperna av PI (4, 5) P2. Två modeller genererades genom att ställa in de relativa positionerna för PI (4, 5) P2 till ARD identiskt med kristallstrukturen i denna studie eller till det näst bästa bindningsläget i dockningsimuleringarna. Simuleringar av båda systemen (totalt ~ 145 000 atomer) genomfördes under 100 ns under semi-isotropisk tryckreglering, i vilket trycket längs membrannormalen är oberoende av trycket längs de andra riktningarna.

För att sätta upp simuleringssystemet för TRPV1-tetramer i membranet överlagrades TRPV1-tetramer (PDB ID: 3J5P 40, 41 ) på ett jämviktigt lipid-tvåskiktssystem i lösning innehållande 648 DAPC, så att TRPV1-transmembranets masscentrum regionen passar med den för lipid-dubbelskiktet. Därefter avlägsnades 182 DAPC och lösningsmedelsmolekyler som överlappade med TRPV1-tetramer. Tjugo huvudgrupper av DAPC i varje broschyr valdes slumpmässigt och ersattes med PI (4, 5) P2. 200-ns-simuleringarna (~ 350 000 atomer) utfördes med användning av ovannämnda halvisotropa tryckkontroll.

Alla molekylära dynamikssimuleringar utfördes med användning av NAMD 2.9 (ref. 59), med användning av periodiska lådor med luckor fyllda med vatten och 150 mM KCl. Kraftfältet CHARMM 22 (ref. 60) med CMAP 61 användes för proteinet och KCl, och TIP3P (CHARMM) -modellen användes för vattenmolekyler. Kraftfältet CHARMM 36 för lipider 62 användes för DAPC och svansgruppen för PI (4, 5) P2, och den för karbonyl 63 användes för PI (4, 5) P2-huvudgruppen. Bindnings-, vinkel- och dihedrala parametrar för atomerna som förbinder den fosforylerade inositolen och svansgruppen erhölls från lipidparametrarna. Systemen fördes till termodynamisk jämvikt vid 300 K och 1 atm med användning av en Langevin-termostat och barostat. Motionsekvationer integrerades med ett tidsteg på 2 fs. Den långväga Coulomb-energin utvärderades med användning av partikelnätet Ewald-metoden.

Proteinstabilitetsanalys

Stabiliteten för TRPV4 ARD-proteinet (3, 6 mg ml-1, i 20 mM Tris-HCl-buffert (pH 8, 0) innehållande 300 mM NaCl, 1 mM DTT och 10% glycerol) övervakades genom en färgbindningsanalys 64 . PSA-färgämnet (PSA200K; ProFoldin) användes enligt tillverkarens instruktioner, vid 37 ° C (fysiologiska förhållanden) eller 50 ° C (denatureringsförhållanden), med excitation vid 550 nm och emission övervakades vid 610 nm, med användning av en spektrofluorometer (FP6500 ; JASCO). Proteinernas halveringstid beräknades med användning av följande formel för kurvpassning: F = FN + [FU × t / (t 1/2 + t)], där t är proteinets inkubationstid vid den valda temperaturen; F är fluorescensen för provet vid tiden t ; FN är fluorescensen för det ouppvärmda provet ( t = 0); t 1/2 är halveringstiden och FU är den maximala fluorescensen av kurvan som representerar fluorescensen för det fullständigt utfoldade proteinet vid platån. Data från mer än fem experiment visas tillsammans med standardfelet för medelvärdet (sem).

Plasmidkonstruktion för expression i däggdjursceller

Human TRPV4 (hTRPV4) märktes C-terminalt med mCherry genom att införa hTRPV4- genen i pmCherry-N3-vektorn, i vilken EGFP i pEGFP-N3-vektorn (Clontech) ersattes med mCherry. Aminosyrasubstitutioner infördes med ett QuikChange-mutagenes-kit (Stratagene). Mutanten Δ1–398, märkt med EGFP vid N-terminalen, infördes i pmCherry-N3-vektorn. PLCδ1 PH-domänen och R40D PLCδ1 PH-domänen, i vilken aminosyran ansvarig för PI (4, 5) P2-bindning är muterad 28, infördes mellan EGFP och Δ1-398 för att konstruera Δ1-398 PLCδ1 PH-fusionen respektive Δ1–398 PLCδ1 PHMut-fusion.

Cellodling och cDNA-uttryck

HEK293-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 30 U ml-1 penicillin och 30 ug ml-1 streptomycin, under en 95% luft-5% CO2-atmosfär vid 37 ° C. För de elektrofysiologiska och [Ca2 + ] i- mätningarna och celldödanalysen transfekterades HEK293-celler med rekombinanta plasmider och pEGFP-F (Clontech) som en transfektionsmarkör med användning av SuperFect Transfection Reagent (Qiagen). HEK293-celler pläterades på poly-L-lysinbelagda glasskyddsglas 24 timmar efter transfektion och utsattes för elektrofysiologiska och [Ca 2+ ] i- mätningar, cellytemärkningsförsök, TIRF-avbildning, samimmunoprecipitationsanalyser och celldödanalyser 8 –30 timmar efteråt.

elektro~~POS=TRUNC

Strömmar från celler registrerades vid rumstemperatur (22–25 ° C), med användning av helcellsläge-klämtekniker med en EPC-9 patch-klämförstärkare (Heka Electronics), som tidigare beskrivits 65 . Patchelektroderna framställdes av borosilikatglaskapillärer och hade en resistans av 2–4 MΩ. Nuvarande signaler filtrerades vid 5 kHz med ett fyrpoligt Bessel-filter och digitaliserades vid 10 kHz. Programvaran PatchMaster (Heka Electronics) användes för kommandopulskontroll, såväl som datainsamling och analys. Seriemotstånd kompenserades (till 70–80%) för att minimera spänningsfel. Cellerna hölls vid −30 mV, och strömmarna framkallades av långsamspänningsramper (från −100 mV till +100 mV, 0, 6 s varaktighet). Standard extracellulär (bad) lösning innehöll 100 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1, 5 mM CaCl2, 10 mM glukos och 10 mM HEPES (pH 7, 38 justerat med NaOH, och osmolalitet justerad till 300 mmol kg-1 med sackaros) 7 . Standard intracellulär (pipett) lösning innehöll 140 mM CsCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 2 mM Na2 ATP, 0, 1 mM NaGTP och 10 mM HEPES (pH 7, 28 justerat med CsOH, och osmolalitet justerad till 298 mmol kg −1 med sackaros) 7 .

För hypo-osmotisk stress överlagrade vi celler med en lösning innehållande 95 mM NaCl, 6 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 1, 5 mM CaCl2, 10 mM glukos och 10 mM HEPES (pH 7, 38 justerat med NaOH och osmolalitet justerad till 210 mmol kg −1 med sackaros) 66 . Iso-osmolaritet uppnåddes genom att tillsätta sackaros till denna lösning för att nå 315 mmol kg −1 . Den intracellulära (pipett) lösningen innehöll 20 mM CsCl, 100 mM aspartat, 1 mM MgCl2, 4 mM Na2 ATP, 10 mM BAPTA, 2, 93 mM CaCl2 och 10 mM HEPES (pH 7, 28 justerat med CsOH och osmolalitet justerad till 300 mmol kg −1 med sackaros) 66 . Den fria Ca2 + -koncentrationen för denna lösning var 50 nM. För att förhindra aktivering av den volymreglerade anjonströmmen dialyserades cellerna med en pipettlösning innehållande 10 mM BAPTA 67 .

Dessa pipettlösningar innehöll också diC4-PI (4, 5) P2 (Echelon Biosciences); diC8-PI (4, 5) P2 (Echelon Biosciences); diC16-PI (4, 5) P2 (Echelon Biosciences); diC16-PI (3, 4) P2 (Echelon Biosciences); diC8-PI (3, 5) P2 (Echelon Biosciences); diC8-PI (3, 4, 5) P3 (Echelon Biosciences); BODIPY FL-märkt PI (4, 5) P2 (Echelon Biosciences); en mus-monoklonal PI (4, 5) P2-antikropp (Abcam, dialyserad med Slide-A-Lyzer Dialys Cassettes 10K MWCO, Thermo Fisher Scientific) eller IP 3 (Dojindo). Multipelfosforylerade fosfoinositider lagrades som 2 mM stamlösningar i den intracellulära lösningen och sonikerades före användning. Såvida inget annat anges användes diC8-PI (4, 5) P2 för att härma den endogena PI (4, 5) P2. Registrering av strömmar startades minst 5 minuter efter membranbrott, för att låta föreningarna som applicerades genom patch-pipetten diffundera genom hela cellen (tilläggsfiguren 6) 31, 68 . De 4a-PDD- eller hypo-osmotiska stress-framkallade strömmarna erhölls genom att subtrahera basdensiteten för hela cellens inåtströmmar från den som registrerades under 4a-PDD-behandling eller hypo-osmotisk spänning vid –100 mV.

Cellytemärkningsexperiment

Cellytuttryck av GFP-märkta TRPV4-konstruktioner mättes genom biotinylering, såsom tidigare beskrivits 65 med modifieringar. Cellerna inkuberades med 0, 5 mg ml -1 Sulfo-NHS-SS-Biotin (Thermo Scientific) i PBS under 30 minuter vid 4 ° C. Cellerna tvättades med PBS innehållande 100 mM glycin tre gånger för att stoppa biotinyleringsreaktionen och för att avlägsna det fria biotinet. Cellerna lyserades sedan i RIPA-buffert (pH 8, 0) innehållande 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0, 5% natriumdeoxikolat, 0, 1% SDS och 50 mM Tris. Efter centrifugering uppsamlades supernatanten och inkuberades med streptavidin-agarospärlor (Thermo Scientific) under 2 timmar vid 4 ° C. Pärlorna tvättades med RIPA-buffert sex gånger. Proteinerna eluerades i SDS-provbuffert innehållande 50 mM DTT under 30 minuter vid rumstemperatur. Proteinerna analyserades med 7, 5% SDS – PAGE och western blotting, med användning av en anti-GFP-antikropp (Clontech).

TIRF-mikroskopi

TIRF-bilder förvärvades med användning av ett TIRF-belysningssystem (IX2-RFAEVA-2, Olympus) monterat på ett inverterat mikroskop utrustat med ett autofokussystem (IX81-ZDC2; Olympus). En diodpumpad fast tillstånd 488-nm laser (kyma488, 10 mW; Melles Griot) användes för total fluorescensbelysning och ett 510-nm långpassfilter användes som ett emissionsfilter. Bilderna fångades med en högkänslig EM-CCD-kamera (ImagEM; Hamamatsu Photonics) som användes med MetaMorph-mjukvaran (Molecular Devices). HEK293-celler som uttrycker GFP-märkta TRPV4-konstruktioner pläterades på poly-L-lysinbelagda täckglas (Iwaki) och placerades i en specialdesignad kammare med HEPES-buffrad saltlösning (HBS) -lösning vid rumstemperatur.

Samimmunutfällningsanalys

Vid 30 timmar efter transfektion lyserades HEK293-celler i RIPA-buffert. Celllysatet immunutfälldes med den monoklonala M2-antikroppen mot Flag (Sigma) i närvaro av protein A Sepharose-pärlor (GE Healthcare) med gungning under 4 timmar vid 4 ° C. Immunkomplexen tvättades tre gånger med RIPA-buffert och återsuspenderades i SDS-provbuffert innehållande 50 mM DTT under 30 minuter vid rumstemperatur. Proteinerna analyserades med 7, 5% SDS – PAGE och western blotting med användning av en anti-GFP-antikropp (Clontech).

Mätning av [Ca 2+ ] i förändringar

Fura-2 fluorescens mättes i HBS, innehållande 107 mM NaCl, 6 mM KCl, 1, 2 mM MgS04, 2 mM CaCl2, 11, 5 mM glukos och 20 mM HEPES (pH justerat till 7, 4 med NaOH) 65, 69 . Fluorescensbilder av cellerna registrerades och analyserades med ett videobildsanalyssystem (Aquacosmos; Hamamatsu Photonics), enligt tillverkarens instruktioner. Förhållandet 340: 380 nm fluorescens bestämdes från bilderna, på en pixel-för-pixel-basis. Fura-2-mätningar utfördes vid 21 ± 1 ° C i HBS. Förhållandena 340: 380 omvandlades till Ca2 + -koncentrationer genom kalibrering in vivo med användning av 5 mikrometer jonomycin, såsom beskrivits tidigare 65 .

Analys av celldöd

Cellerna inkuberades med 2 ug ml-1 propidiumjodid (Sigma) i HBS-lösning. Fluorescensbilder av cellerna registrerades och analyserades med ett konfokalt laserskanningsmikroskop (FV500; Olympus), med användning av 488 nm-linjen i en argonlaser för excitation och antingen ett 505–525-nm bandpassfilter (GFP) eller en 560-nm långpassfilter (propidiumjodid) för utsläpp.

Statistiska analyser

Alla data uttrycks som medelvärden ± sem. Data för varje tillstånd erhölls från minst tre oberoende experiment. De statistiska analyserna utfördes med hjälp av studentens t- test. Ett värde av P <0, 05 ansågs vara signifikant.

Ytterligare information

Anslutningskoder: Atomkoordinater och strukturfaktorer har deponerats i Protein Data Bank (//www.pdb.org/) under anslutningskoder 3W9F (IP 3- komplex) och 3W9G (utan IP 3 ).

Hur man citerar denna artikel: Takahashi, N. et al. TRPV4-kanalaktivitet moduleras genom direkt interaktion av ankyrindomänen till PI (4, 5) P2. Nat. Commun. 5: 4994 doi: 10.1038 / ncomms5994 (2014).

anslutningar

Proteindatabank

  • 3W9F
  • 3W9F 3d-vy
  • 3W9G
  • 3W9G 3d-vy

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer

    Kompletterande figur 1-19

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.