Transmembraninföring av tvillingargininsignalpeptider drivs av tatc och regleras av tatb | naturkommunikation

Transmembraninföring av tvillingargininsignalpeptider drivs av tatc och regleras av tatb | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Proteintranslokation

Abstrakt

Den två-arginintranslokaliseringsvägen (bakterier och växtkloroplaster) medierar transmembrantransporten av vikta proteiner, som har signalsekvenser med ett bevarat tvillingargininmotiv. Många Tat-translokaser innefattar de tre membranproteinerna TatA, TatB och TatC. TatC visades tidigare vara involverat i igenkänning av tvillingargininsignalpeptider. Här visar vi att bortom igenkännande medierar TatC transmembraninföringen av en tvilling-argininsignalsekvens, varigenom signalens sekvensspjälkningsplats översätts över tvärskiktet. I frånvaro av TatB kan detta leda till avlägsnande av signalsekvensen även från ett translokationsinkompetent substrat. Därför motverkar interaktion mellan tvillingargininsignalpeptider och TatB deras för tidiga klyvning utan koppling från translokation. Denna kapacitet för TatB delas inte av det homologa TatA-proteinet. Sammantaget tyder våra resultat på att TatC är ett insertas för tvillingargininsignalpeptider och att igenkänningsspråkig signalsekvensigenkänning kräver den samordnade handlingen av TatC och TatB.

Introduktion

Två-arginin (Tat) -specifika proteintranslokationsmaskiner finns i bakterier, archaea och växtkloroplaster. Tat-maskiner har den anmärkningsvärda egenskapen att transportera helt vikta proteiner över cellulära membran. Dessa proteiner riktas specifikt till Tat-vägen av signalpeptider som har ett konserverat S- R - R- xFLK-sekvensmotiv (RR-signalpeptider). Den nuvarande kunskapen om Tat-vägen har genomgripande granskats 1, 2, 3, 4, 5 .

I gramnegativa bakterier och växtkloroplaster består Tat-maskiner av tre membranproteiner som i bakterier benämns TatA, TatB och TatC. TatA omfattar ett enda transmembrandomän och en cytosoliskt belägen amfipatisk spiral 6, 7 som följs av en ostrukturerad C-terminus. Trots motstridiga rapporter under de senaste 8, 9, 10 bekräftar de senaste rapporterna en N-orientering av transmembranhelixen hos TatA 11, 12 . Den homologa men ändå funktionellt distinkta TatB-subenheten har samma förutsagda struktur som TatA. TatC å andra sidan har sex förutspådda transmembranhjälmar med N- och C-terminalen av proteinet som vetter mot cytoplasma. I E. coli uttrycks TatA vid cirka 25- och 50-faldigt högre nivåer än TatB respektive TatC, men kan vara mycket mindre rikligt i växtkloroplaster 13 . Två huvudkomplex som består av de tre Tat-underenheterna har beskrivits i E. coli : ett 360–700 kDa-komplex som består av oligomerer av en 1: 1 TatB / TatC-kärnenhet med varierande mängder TatA-associerade 14, 15, och ett oligomeriskt TatA-komplex som består av varierande antal TatA-protomerer (100–700 kDa) 15, 16, 17, 18 .

TatBC-komplexet är involverat i bindning av RR-signalpeptider såsom visas med flera experimentella strategier, såsom (1) interferens av prekursorbindning till Tat-translokaset av antikroppar riktade mot TatB och TatC 19, (2) komigrering av prekursor med ett TatBC-komplex på Blue-native-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) 20, (3) sampolifiering av prekursor, TatB och TatC vid membransolubilisering 16, 21, (4) kemisk och platsriktad tvärbindning 22, 23, 24 och (5) identifiering av TatBC-suppressormutationer av exportdefekta Tat-signalpeptider 25, 26 .

Identifieringen av bindningsställen både på TatBC såväl som på RR-signalpeptider har varit föremål för flera rapporter. Således har tvärbindningsstudier upprepade gånger avslöjat en närhet mellan konsensus RR-motivet och TatC 23, 24, 27 . Dessa signalpeptid-TatC-tvärbindningar kvarstår även i frånvaro av TatB 23 som pekar mot TatC som det primära igenkänningsstället för RR-signal-sekvenser. I överensstämmelse med denna uppfattning befanns fusioner mellan RR-signalpeptider och PhoA omdirigeras till Sec-translokonet, om TatC saknades 28 . Användning av platsspecifik fototvärbindning av signalpeptidbindningsstället för TatC mappades nyligen till dess cytosoliska N-terminus och den första cytosoliska slingan 29 . I full överensstämmelse med dessa tvärbindningsstudier kartlägger suppressormutationer i TatC som delvis lindrar transportblocket för KQ- och KK-mutanta prekursorer exakt till samma två domäner av TatC 25, 30 . Således tillhandahåller TatC en ytlig exponerad plats för igenkänning av prekursorer.

Det homooligomera TatA-komplexet bildar porliknande strukturer 31, i vilka transmembranhelixerna hos TatA är anordnade som ringar 32 . Dessa fynd gav upphov till en aktuell modell, enligt vilken TatA-komplexen representerar individuellt formmonterande transmembranledningar för vikta Tat-underlag. I denna modell skulle en RR-föregångare som följer dess bindning till TatBC-komplexet initiera den anpassade rekryteringen av TatA, en process som också kräver protonmotivkraften (PMF). Huruvida TatA endast rekryteras från membranintegrerade TatA-protomerer eller också från en löslig pool av TatA är fortfarande en fråga 33 .

Trots dessa insikter finns det ett antal oroliga frågor. Således kan vissa Tat-riktade substrat interagera med membranets tvåskikt innan de binds till TatBC 34, 35, 36 . Vidare visade sig att Tat-transporten fortsatte även under förhållanden, vid vilka Tat (A) BC- och TatA-komplexen som nämnts ovan inte kunde återvinnas till detekterbara nivåer, vilket visade att de två komplexen var verkliga korrelat för funktionella händelser under Tat-beroende transport 37 . På liknande sätt innehåller enterobacteria en extra paralog av TatA, kallad TatE, som funktionellt kan ersätta TatA även om den bildar mycket mindre komplex än TatA 38 .

Enligt ovanstående modell förutspås TatA och TatB att uppfylla ganska olika funktioner. I själva verket visar enstaka tatA- och tatB- knockout-mutanter av E. coli båda en tatfenotyp trots en 20% sekvensidentitet mellan båda proteinerna. Tvärtom, många grampositiva bakterier uttrycker naturligtvis bara TatA- och TatC-ortologer. Detta antyder att TatA i dessa organismer har funktionella roller för både TatA och TatB, vilket verkligen skulle kunna verifieras experimentellt 39 . I överensstämmelse med naturliga bifunktionella TatA-proteiner har TatA-varianter som förändrats vid deras extrema N-terminaler isolerats som kan undertrycka en TatB-brist i E. coli 40 . Här utnyttjade vi experimentellt en TatB-brist för att upptäcka den oförutsedda förmågan hos TatC att fungera som ett membraninsättning av Tat-signalpeptider.

Resultat

Korrekt klyvning av RR-föregångare i frånvaro av TatB

Med användning av modell Tat-substratet TorA-MalE isolerades tidigare distinkta N-terminala mutationer i tatA , som kan undertrycka en fullständig brist på TatB i E. coli- celler. Dessa mutationer gör TatA till en bifunktionell TatA / B-komponent 37, 40, ungefär som i Gram-positiva bakterier som naturligtvis inte uttrycker en TatB-underenhet 41 . Vi kunde inte upptäcka den undertryckande fenotypen av dessa tatA- varianter in vitro , förmodligen på grund av den relativt låga totala omlokaliseringseffektiviteten i vårt cellfria system. Vid genomförandet av dessa experiment märkte vi emellertid att E. coli- membranvesiklar som endast innehöll TatC och TatA ändå ledde till en proteolytisk bearbetning av TorA-MalE-föregångaren.

Detta visas i fig la som visar den radiomärkta prekursorn TorA-MalE335 efter in vitro- syntes i frånvaro eller närvaro av TatABC- och TatAC-innehållande membranvesiklar. MalE är det periplasmatiska maltosbindande proteinet från E. coli, som naturligtvis exporteras genom Sec-translocon men kan dirigeras till Tat-systemet, om dess Sec-signal-sekvens ersätts av RR-signalen från Tat-substratet TMAO-reduktas (TorA ) 42 . Här använde vi fusionsproteinet TorA-MalE335 innehållande en C-terminalt trunkerad MalE-enhet som saknar det inneboende proteasresistensen hos full storlek MalE och därmed möjliggör för oss att övervaka dess transport till membranblåsor via proteasskydd. Således spjälkades TorA-MalE335 när den syntetiserades genom in vitro- transkription / translation fullständigt med externt tillsatt proteinas K (PK; fig. La, jämför spår 1 och 2). Efter syntes i närvaro av inre och inre membranvesiklar (INV) framställda från en TatABCD-överproducerande E. coli- stam (Tat + -INV), behandlades en betydande mängd TorA-MalE335 till en mindre art (spår 3). Bearbetningsprodukten var resistent mot PK (spår 4) vilket antydde att den hade translokaliserats till vesiklarnas lumen och att den härstammar från klyvning av den vesikelburen signalpeptidas (ledarpeptidas). Som vanligt observerats för INV 43, kopplades translokation inte strikt till klyvning, eftersom en del av föregångaren till TorA-MalE335 också visade sig vara PK-resistenta (spår 4). Detta material var emellertid något kortare än den icke PK-behandlade föregångaren (jämför spår 3 och 4; se också figurerna nedan). Vi antar att denna förändring i molekylmassa berodde på ett PK-medierat avlägsnande av några N-terminala aminosyror före RR-konsensusmotivet från den annars membranskyddade TorA-signalpeptiden.

( a ) Den radiomärkta prekursorn TorA-MalE335 syntetiserades in vitro genom kopplad transkription / translation i frånvaro eller närvaro av TatABC- och TatAC-innehållande invändig INV. Prover digererades med PK för att visualisera proteasresistent, det vill säga translokaterad, föregångare (p) och mogen (m) form av TorA-MalE335. Prover separerades med SDS – PAGE och visualiserades genom fosforimaging. Tat + -INV framställd från en TatABCD-överproducerande E. coli- stam visar bearbetning av föregångaren till TorA-MalE335 och gör dess mogna del och någon föregångare av något reducerad storlek resistent mot PK. I motsats härtill uppvisar TatAC-INV framställda från en TatAC-överproducerande A tat E. coli- stam som saknar TatB ett komplett block i translokation, eftersom inget PK-resistent material erhölls. Trots detta bearbetar dessa TatAC-INV proteolytiskt TorA-MalE335 ett fragment med samma elektroforetiska rörlighet som mogna TorA-MalE335 visar efter dess omvandling till Tat + -INV: er. ( b ) De angivna vesiklarna löstes i SDS – PAGE-laddningsbuffert och Tat-komponenterna separerades med SDS – PAGE och visualiserades genom western-blotting med användning av polyklonala antikroppar mot TatA, TatB eller TatC. Observera att TatC-INV framställdes från en Δ tat- stam som uttrycker en His-märkt version av TatC. ( c ) TorA-MalE335 syntetiserades under 10 minuter. TatAC-INV tillsattes och inkubationerna stoppades vid de angivna tidpunkterna genom tillsats av TCA. Klyvning av TorA-MalE i frånvaro av TatB visade sig således vara en tidsberoende process. ( d ) Som i ( a ) med Tat-modellen föregångare TorA-mCherry. Som observerats för TorA-MalE, är de TatB-saknade TatAC-INV inte i stånd att translokera TorA-mCherry, även om de orsakar dess proteolytiska bearbetning.

Bild i full storlek

När istället användes INV som hade framställts från en stam som endast uttryckte TatA och TatC (fig. Ib, spår 4) erhölls inget PK-resistent material (fig. La, spår 6), vilket bekräftade ett fullständigt block i translokering när TatB komponenten saknades. Trots deras translokationsbrist ledde dessa vesiklar till en betydande proteolytisk bearbetning av TorA-MalE335 (Fig. 1a, spår 5). Spjälkning av TorA-MalE335 genom TatAC-INV var en tidsberoende process (fig. 1c) och var inte ett unikt drag för denna föregångare, men erhölls på liknande sätt för Tat-modellproteinet TorA-mCherry (fig. 1d, spår 5) och TorA-PhoA (se nedan Fig. 2c).

( a, b ) Syntese in vitro av de radiomärkta TorA-MalE335 och TorA-mCherry-föregångarna i frånvaro och närvaro av INV innehållande TatABC (Tat + ) eller TatAC. Transport och bearbetning av Tat + -INV avskaffas fullständigt om signalsekvenserna för båda prekursorerna bär KK-mutationen. På liknande sätt sker klyvning av TorA-prekursorerna av de TatB-bristna TatAC-vesiklarna inte när det autentiska RR-motivet muteras till KK. ( c ) Som i ( a, b ) att jämföra RR-föregångaren TorA-PhoA med dess icke-klyvbara variant ΔSP-TorA-PhoA. Som förväntat erhålls inte den bearbetade mogna formen av vildtyp TorA-PhoA-utvinning från Tat + -INV efter PK-behandling (m) för ΔSP-TorA-PhoA (jämför spår 4 och 10). Vidare är ingen bearbetad form av ΔSP-TorA-PhoA-föregångaren detekterbar i TatB-bristfälliga TatAC-vesiklar (jämför spår 5 och 11), vilket indikerar att klyvning kräver ett intakt signalpeptidas-klyvningsställe. Bandet märkt (i) är en translokationsintermediär som är unikt observerad för TorA-PhoA 27 .

Bild i full storlek

Bearbetning av TorA-prekursorerna med TatB-bristfälliga TatAC-vesiklar krävde ett intakt RR-konsensusmotiv (fig. 2a). Ersättning av de väsentliga RR-resterna av TorA-MalE335- och TorA-mCherry-fusionsproteinerna med par av lysiner resulterade i det förväntade blocket för translokering och bearbetning av båda prekursorerna med TatABC-innehållande membranvesiklar (Fig. 2a, jämför spår 3, 4 till 9, 10; Fig. 2b, spår 5–8). Det är viktigt att bearbetning av KK-mutanta TorA-prekursorer av TatAC-vesiklarna som saknade TatB också helt avskaffades (jämför i fig. 2a, spår 5 och 11; i fig. 2b, spår 9 och 11), vilket indikerar att erkännandet av den autentiska tvilling-argininmotiv av TatB-bristande TatAC-vesiklar var en förutsättning för att klyva oförändrade TorA-föregångare. Detta skulle inte vara fallet om behandlingen av föregångaren berodde på ospecifika proteaser.

För att testa om bearbetning av TorA-prekursorerna i frånvaro av TatB i själva verket genomfördes med signalpeptidas, använde vi en mutant TorA-PhoA-föregångare, vars signalpeptidspjälkningsställe hade inaktiverats genom att mutera dess sekvens från ATA-AQA till ATL-LQA 27 . Denna icke-klyvbara variant av TorA-PhoA bearbetades inte av TatAC-vesiklarna saknade TatB (fig. 2c, spår 5 och 11). Fynden som visas i fig. 2 antyder således att trots att det saknas TatB, känner TatAC-vesiklar igen tvilling-argininmotivet för TorA-signalpeptiden och medierar åtkomst till dess klyvningsplats för att signalera peptidas.

TatB förhindrar för tidig spaltning av signalpeptider

Tat-specifik transmembrantranslokation kräver PMF vid membranet. Följaktligen avskaffade protonofor-karbonylcyanid-m-klorofenyl-hydrazon (CCCP) fullständig translokation av TorA-MalE335 till TatABC-INV (fig. 3a, jämför spår 6 och 8). Observera att ingen signalsekvensspjälkning av TatABC-INV observerades i närvaro av CCCP (jämför banor 5 och 7), vilket indikerar att vildtypen Tat-translokas tillåter bearbetning av TorA-MalE335 endast i samband med translokation. Tvärtom, klyvning av signalsekvenser erhållna av TatAC-vesiklarna i frånvaro av TatB påverkades praktiskt taget av CCCP (jämför spår 9 och 11). I denna experimentella uppställning fortsätter följaktligen translokation av tvillingargininsignalpeptiden i sig , i motsats till den för det fullständiga prekursorproteinet utan PMF.

( a ) TorA-MalE335 syntetiserades i frånvaro eller närvaro av de indikerade vesiklarna, varvid en del var och en innehöll den frånkopplade CCCP vid 0, 1 mM, den andra endast lösningsmedlet dimetylsulfoxid. Medan CCCP helt blockerar translokering av TorA-MalE335 till Tat + -INV (spår 8) och därigenom också förhindrar bearbetning med signalpeptidas (spår 7), påverkas bearbetningen erhållen av de TatB-saknade vesiklarna genom att lägga till CCCP (spår 11). Följaktligen är för tidig behandling av TorA-MalE335 utan koppling från translokation av dess MalE-enhet uppenbarligen resultatet av en PMF-oberoende translokation av klyvningsplatsen för TorA-signalsekvens över membranet. ( b ) Efter syntes av TorA-MalE335 utan eller med den angivna INV behandlades prover med 0, 2 M Na2C03. Det mesta av den behandlade formen av TorA-MalE335 erhållen från Tat + -INV är karbonatresistent på grund av translokation till vesiklarna och därför sediment med INV (P, pellet). Däremot frigörs TorA-MalE335 som behandlats av TatAC-INV men inte translokeras på grund av brist på TatB i den karbonatlösliga fraktionen (S, supernatant).

Bild i full storlek

Bearbetning av signalpeptiden, där den mogna delen av TorA-MalE335 förblir otranslokerad, åberopar en hårnålliknande insättning av signalsekvensen och den tidiga mogna delen av TorA-MalE335 i membranet till TatAC-vesiklar. I överensstämmelse med ett sådant scenario kan den signalsekvenslösa MalE-enheten när den berövas dess membranankare genom bearbetningsaktiviteten för TatAC-vesiklarna till stor del extraheras med natriumkarbonat (fig. 3b, spår 5 och 6). Detta var i motsats till den bearbetade formen av TorA-MalE335 erhållen från TatABC- (Tat + -) INV (spår 3 och 4), i vilket fall translokering av MalE-delen gjorde det till största delen karbonatresistent. Dessutom antyder dessa fynd att i närvaro av ett intakt TatABC-translokas förhindras en meningslös klyvning av tvillingargininsignalpeptiden utan koppling från translokation av passagerarproteinet av närvaron av TatB. Denna egenskap verkar vara unik för TatB eftersom den inte delades av att TatA var närvarande i jämförbara mängder i TatAC- och TatABC-vesiklar (fig. 1b).

TatC förmedlar membraninsättning av en RR-signal-sekvens

Därefter beredde vi INV från en E. coli- stam som uttryckte TatC som den enda Tat-komponenten (fig. Ib, spår 3). Uppenbarligen möjliggjorde dessa TatC-INV ominskad bearbetning av TorA-mCherry och TorA-MalE335 jämfört med TatAC-vesiklar (fig. 4a, jämför spår 5 och 7). Denna signalsekvensspjälkning av TatC-endast INV promotades faktiskt av TatC, demonstrerades genom en direkt jämförelse mellan TatC-INV och de som framställts från en total tat- borttagningsstam. Även om dessa atTat-vesiklar gav upphov till vissa nedbrytningsprodukter från båda prekursorerna (och alla andra testade), komigrerade ingen av dessa fragment med de signalföljande mindre mogna formerna bearbetade av TatAC- och TatC-INV (jämför banor 5 och 7 till 9 ). Dessa resultat skulle vara förenliga med TatC fungerar som ett insertas av en tvilling-argininsignalpeptid och därmed förmedla dess exponering för signalpeptidas (Fig. 4b, till vänster).

( a ) TorA-mCherry och TorA-MalE335 syntetiserades i frånvaro och närvaro av de indikerade vesiklarna. TatC-INV framställdes från en Δ tat- stam som endast uttrycker TatC, medan AT-INV inte innehåller någon Tat-komponent. Vesiklar som endast innehåller TatC tillåter samma bearbetning av TorA-mCherry och TorA-MalE335 som TatAC-INV. Som förväntat observeras emellertid korrekt signal-sekvensspjälkning för vesiklar framställda från en total tat- deletionsstam. Anledningen till den partiella instabiliteten hos båda föregångarna i närvaro av AT-INV är inte klart. ( b ) Modell av möjliga TatC / TatB-signal-sekvensinteraktioner. Den gula stapeln representerar lipid-dubbelskiktet. TatC-molekylen avbildas av sex transmembrane helices (blå). Fyra TatB-monomerer visas (gröna cylindrar) efter en ny rapport 45 . TatB och TatC bildar komplex 1: 1 14 . För tydlighetens skull har den främre TatC-molekylen utelämnats. Tvillingargininsignalsekvensen (++) representeras av en svart linje och den vikta mogna delen av en RR-föregångare med en svart ellips. TatC fungerar som ett insertas av en tvillingargininsignalpeptid och förmedlar därigenom dess exponering för signalpeptidas (SPase). Inbäddning av signalsekvensen i en TatBC-bindande ficka stör en för tidig klyvning med signalpeptidas.

Bild i full storlek

Strukturella krav för för tidig klyvning

Situationen som visas i fig. 4b (vänster) kräver att både signalsekvensen som föregår klyvningsstället och det tidiga mogna området hos föregångaren tillåter slingan att sträcka sig ut på signalpeptidas. För att bevisa detta använde vi också de två naturliga E. coli Tat-substraten SufI (FtsP) och AmiC. Såsom visas i fig. 5a, även om både in vitro- syntetiserade prekursorer translokaliserades till och samtidigt spjälkades av TatABC-INV (spår 3 och 4), erhölls ingen proteolytisk bearbetning med TatAC-INV utan TatB (spår 5), vilket är klart i kontrast till TorA-föregångarna som beskrivs ovan. Detta resultat utesluter definitivt möjligheten att klyvning av TorA-prekursorerna av TatAC-INV berodde på någon förorening av högersidan ut vesiklar som utsatte signalpeptidas på utsidan. Antagande att bristen på bearbetning av pSufI och pAmiC med TatAC-vesiklar härstammade från arten av signalpeptiderna hos dessa två RR-föregångare, ersatte vi den autentiska signalsekvensen för Sufi med den av TorA, och skapade ett TorA-SufI-fusionsprotein. Figur 5b illustrerar att detta TorA-SufI-modellprotein bearbetades lika effektivt av och omlokaliserades till funktionell TatABC-INV som vildtyp pSufI (jämför spår 3, 4 och 9, 10). Emellertid behandlades bara TorA-SufI med TatAC-vesiklar (jämför spår 5 och 11). Följaktligen blev TatC-medierad transport och bearbetning observerad i frånvaro av TatB endast manifest för TorA-signalpeptiden.

( a ) Sufi och AmiC syntetiserades i frånvaro och närvaro av Tat + -INV och TatAC-INV. Båda prekursorerna translokeras till och bearbetas av Tat + -INV, men i motsats till TorA-prekursorer, bearbetas inte av TatAC-INV saknar TatB. ( b ) För att skapa TorA-SufI-fusionsproteinet ersattes den autentiska signalsekvensen för Sufi med den av TorA. TorA-SufI behandlas lika effektivt av och omlokaleras till funktionell TatABC-INV som pSufI. Emellertid behandlas endast TorA-SufI av TatAC-INV utan TatB. ( c ) Jämförelse av de olika Tat-signalsekvenserna som används. Konsensusmotiven är tryckta med djärva bokstäver och de sex amino-flankerna som varje klyvningsplats är understrukna. Rester från de tidiga mogna regionerna i varje föregångare anges med kursiv bokstäver. TorA-signalsekvensen fusionerades till de olika passagerarproteinerna via en 10 aminosyralång länk som består av åtta rester härrörande från mogna TorA (kursiv med stora bokstäver) och två aminosyror kodade av nukleotider som hade införts av kloningsskäl (kursiv med små bokstäver) brev). I TorA-SufIΔLinker avlägsnades detta linkerregion nu och ansluter de första resterna av SufI (AGQ) direkt till TorA-signalsekvensen. För att erhålla effektivare bearbetning ändrades de C-terminala ATA-resterna av TorA-signalpeptiden till det SufI-härledda ASA-motivet. ( d ) För att definiera de funktioner som gör TorA-signalsekvensen klyvbar i närvaro av TatC, avlägsnades länken nedströms klyvningsstället från TorA-SufI-konstruktionen (TorA-SufIΔLinker) och signalföljden för SufI förlängdes med sex aminosyror (SufI-ss-ex, jfr ( c )). Jämfört med TorA-SufI bearbetas TorA-SufIΔLinker mindre effektivt av TatB-saknade TatAC- och TatC-INV, medan SufI-ss-ex jämfört med SufI fick förmågan att bearbetas. ( e ) NapG är en E. coli RR-föregångare vars FeS-kofaktor inte är införlivad av vårt in vitro- system. In vitro syntetiserad NapG behandlas därför varken eller translokeras av Tat + -INV. Trots att den är translokationsinhabil, bearbetas NapG-föregångaren av TatB-saknade TatAC- och TatC-INV vilket ger en klyvningsprodukt av storleken på den signalföljdslösa mogna NapG.

Bild i full storlek

Figur 5c jämför TorAs signalsekvens med de från Sufi och AmiC. Uppenbarligen skiljer de sig i längd, särskilt i avståndet mellan konsensusmotivet (med fetstil) och klyvningsplatsen (understruket). Dessutom innehåller alla hittills använda TorA-fusioner en länkarsekvens konstruerad mellan TorA-signalsekvensen och respektive passagerarprotein. Det kunde därför tänkas att i fallet med TorA-signalpeptiden, både den jämförelsevis långa hydrofoba sekvensen uppströms om klyvningsstället och nedströmslänksekvensen skulle underlätta exponering för signalpeptidas.

Vi tog därför bort länken från TorA-SufI-fusionen. Den resulterande konstruktionen (fig. 5c, TorA-SufIΔLinker) klyvdes effektivt av och omplacerades till Tat + -INV (fig. 5d, spår 3, 4) men bearbetades endast dåligt av de TatB-saknade vesiklarna (jämför spår 3 och 5) föreslår att närvaron av länkarsekvensen i själva verket underlättar åtkomst till signalpeptidas.

För att separat undersöka påverkan av avståndet mellan RR-konsensusmotivet och spaltningsstället för signalpeptider på bearbetningen av de TatB-saknade vesiklarna, förlängde vi också signalsekvensen för SufI genom att duplicera aminosyrastreck AGAVPL och därmed generera den längre föregångaren SufI-ss-ex (Fig. 5c). Exakt som förväntat gjorde denna förlängning nu signalsekvensen för SufI till ett mycket bättre underlag av signalpeptidaset i frånvaro av TatB (jämför fig. 5d, spår 11 med fig. 5b, spår 5).

Dessutom testade vi också det naturliga Tat-substratet NapG för bearbetning med TatB-bristfälliga vesiklar. Signalsekvensen för NapG uppvisar ungefär samma totala längd och avstånd mellan konsensusmotivet och klyvningsstället som för TorA (fig. 5c). NapG är ett FeS-innehållande periplasmiskt protein 44 . På grund av oförmågan hos vårt cellfria system att införliva FeS-kluster, bearbetades eller omlokalerades den in vitro syntetiserade NapG varken med Tat + -INV (fig. 5e, jämför spår 1, 2 med 3, 4). Trots att det var en translokationsinkompetent RR-föregångare, bildades en klyvningsprodukt av pNapG av de TatB-saknade TatAC- och TatC-endast vesiklarna (spår 5 och 7, mNapG), som efter storlek motsvarar 20, 5 kDa-signalsekvensen -lös form av NapG.

Slutligen undersökte vi om TatC också kunde in vivo visas förmedla åtkomst av RR-prekursorer till signalpeptidaset. För detta ändamål jämförde vi vildtyp E. coli BL21 (DE3) -celler som uttrycker TatC tillsammans med TatAB från det kromosomala tat- operonet (fig. 6a, TatABC-celler, spår 3) med ett isogent ΔTat-derivat (spår 4) och med den atTat-mutanten uttrycker TatC unikt från en arabinosinducerbar plasmidburen tatC- gen (TatC-celler, spår 1 och 2). Dessa tre stammar transformerades vardera med plasmider som kodar en av RR-prekursorerna pSufI, pNapG eller TorA-mCherry. Celler odlades i minimala medier, inducerade för syntes av respektive RR-föregångare och märktes med 35 [S] -metionin / cystein. Som förväntat befanns föregångaren till SufI behandlas av TatABC-celler vilket antydde att det exporterades till periplasm, men förblev ospalt i atTat-celler, eftersom bristen på TatABC förhindrade någon Tat-specifik omlokalisering (Fig. 6b, övre panel, spår 1 2). I överensstämmelse med de resultat som erhölls in vitro (fig. 5a), tillät celler som uttryckte endast TatC inte klyvning av signalsekvensen för pSufI (fig. 6b, övre panel, spår 3).

( a ) E. coli BL21 (DE3) -celler som används för puls / jaktmärkning av RR-prekursorer uttryckte antingen TatC från araBAD- promotorn i frånvaro av TatA och TatB (TatC-celler) eller TatABC från den kromosomala tat- operon (TatABC -celler) eller saknade hela Tat-underenheten (AT-celler). Motsvarande mängder celler blottades mot anti-TatC-antikroppar (aTatC). ( b ) Celler av de angivna stammarna märktes puls / jakt såsom specificerades i metodavsnittet och märkta Sufi, NapG och TorA-mCherry-arter renades via Ni-affinitetskromatografi. Observera behandlingen av NapG- och TorA-mCherry-föregångarna när cellerna bara uttryckte TatC.

Bild i full storlek

I slående kontrast tillät samma celler, som noterar sig från de isogena AT-cellerna endast genom det isolerade uttrycket av TatC, bearbetning av NapG-föregångaren till en produkt med storleken på mogna NapG (fig. 6b, mittpanel, spår 3). Vi kunde emellertid inte återfå samma art av NapG från de TatABC-uttryckande celler som visar bearbetning av Sufi (fig. 6b, spår 1). En möjlig förklaring till detta misslyckande är att alla bearbetade, det vill säga translokerade NapG i TatABC-innehållande celler är instabila när de uttrycks i frånvaro av membranproteinet NapH, till vilket NapG föreslås bindas efter transport in i periplasm 44 . I överensstämmelse med detta antagande leder prematur klyvning av NapG-prekursorn genom celler som endast uttrycker TatC (fig. 6b, mittpanel, spår 3) till en stabil form av moget NapG skyddad mot nedbrytning med periplasmiska proteaser, eftersom i frånvaro av TatA och TatB -signalsekvensspjälkning kopplas inte från export till periplasm. Med andra ord kan återhämtning av bearbetade NapG från celler som endast uttrycker TatC tas som en ledtråd att till och med in vivo TatC translokerar klyvningsstället för lämpligt storlek RR-signalpeptider, såsom den för NapG, över membranet. För att ytterligare bekräfta denna uppfattning utförde vi pulsmärkning också med celler som uttrycker TorA-mCherry (fig. 6b, nedre panel). Liksom pSufI hittades TorA-mCherry återigen bearbetat av TatABC-celler (spår 1). Observera att samma klyvningsprodukt bildades i endast TatC-celler (spår 3) vilket antydde att den TatC-medierade för tidiga klyvningen av TorA-signalpeptiden från denna RR-föregångare också inträffade in vivo .

Sammanfattningsvis antyder våra resultat starkt att TatC kan infoga och placera Tat-signalsekvenser i en transmembranorientering (fig. 4b). Förutsatt att sekvensförhållandet uppströms och nedströms om klyvningsstället möjliggör tillräcklig konformationell flexibilitet kan detta till och med leda till för tidig klyvning med signalpeptidas, som under fysiologiska förhållanden emellertid skulle motverkas av TatB.

Diskussion

Experimenten som beskrivs här antyder att TatC, som hittills huvudsakligen har karakteriserats som en del av en Tat-specifik signalsekvensreceptor, dessutom verkar fungera i genereringen av transmembranorienteringen av RR-signal-sekvenser. Denna signalpeptid-insertasaktivitet för TatC kräver varken TatB eller TatA. Såsom visas i modellen i fig. 4b skulle TatC således driva en hårnålliknande inbäddning av RR-prekursorproteiner i målmembranet. Under normala förhållanden, det vill säga i närvaro av TatB, skulle den TatC-medierade insättningen leda till att Tat-signalsekvensen är placerad i en bindningsficka som tillsammans bildas av TatC och TatB. Eftersom tidigare studier har avslöjat en oligomer sammansättning av TatB 21 i synnerhet vid interaktion med RR-prekursorer 45, avbildade vi i modellen i fig. 4b TatB som det tetrameriska komplexet som tidigare föreslogs efter en cystein-tvärbindningsanalys 46 . Modellen antyder vidare att fixering av Tat-signal-sekvensen mellan TatC och TatB hjälper till att förhindra en exponering av signalsekvensspjälkningsstället för signalering av peptidas före translokation av den mogna delen av prekursorproteinet. Denna idé härleds från de fynd som beskrivs här att ett Tat-translokas som saknar TatB kan tillåta bearbetning av en translokationsinkompetent RR-föregångare (fig. 5e, spår 5, 7) och den för tidiga avlägsnandet av signalsekvensen även från en annars translokations- skickligt Tat-underlag (fig. 3a, spår 11).

En hårnålliknande införing av RR-prekursorer i TatBC skulle vara en följd av den N-proximala delen av en Tat-signalpeptid som fångas vid membranets cytosoliska sida. Such a precursor topology is consistent both with a superficially exposed precursor binding site provided by TatC 29 and the protease accessibility demonstrated for RR-precursors bound to the thylakoidal Tat translocase 47, 48 . Similarly all TorA-fusions analysed in here were found to become slightly shortened by PK added after their translocation into Tat + -vesicles (Fig. 1a, lane 4; Fig. 1d, lane 4; Fig. 2c, lane 10; Fig. 5b, lane 10). This phenomenon became manifest because membrane vesicles as used here usually fail to process all translocated precursor molecules by their resident signal peptidase. As uncleaved precursor molecules remain membrane-anchored they consequently constitute a target for externally added proteases.

The presumed insertase activity of TatC would position the signal sequence and, depending on the depth of insertion, some amino acids of the early mature region of an RR-precursor into a membrane-embedded binding pocket, which the model of Fig. 4b suggests to be formed by TatC and TatB. A deep loop-like insertion of an RR-precursor between TatB and TatC is experimentally supported by (1) suppressor mutations located near the trans -sided N-terminus of TatB that compensate the translocation defect of mutant TorA-precursors 25, 26 ; (2) crosslinking of the same area of TatB to the precursors of TorA and SufI 45 ; (3) preferential crosslinking of the hydrophobic part of Tat signal peptides located downstream of the RR-consensus motif to TatB 23, 24, 27 ; (4) site-specific crosslinking between transmembrane helices of TatC and TatB 49 .

If TatC catalyses the transmembrane insertion of Tat signal peptides it would function in a similar way as the YidC protein insertase present in bacterial cytoplasmic membranes, which is involved in the insertion process of α-helical membrane proteins 50 . Similar to TatC, members of the YidC/Oxa1/Alb3 family, which are also found in mitochondria and chloroplasts, harbour five to six predicted transmembrane domains and are believed to form a platform for the insertion of the hydrophobic transmembrane helices of their substrates. Whereas YidC clients in general are released into the lipid bilayer after they adopted their transmembrane orientation, RR-signal peptides seem to remain attached to TatC even after translocation of the entire mature domain 24 .

In summary, the model shown in Fig. 4b proposes that after recognition of the RR- consensus motif by TatC at the cytosolic surface of the Tat translocase, the proposed insertase activity of TatC inserts and accommodates the signal peptide in a concerted TatBC-binding groove, a process that most likely also involves reorientation events that might depend on the function of TatB and the presence of the PMF 47, 51 . Recent data obtained with the E. coli Tat machinery suggest that monomeric TatA might be recruited at this early stage in a PMF-sensitive manner 52 . Before the start of translocation a single precursor molecule has been found in contact with more than one TatB molecule 45 . Whether this stage simply reflects the interaction of an RR-precursor with preformed oligomeric TatBC structures 21, 22, 53 or results from a precursor-mediated oligomerization of TatBC units is not known. An oligomeric TatB structure formed around a TatC-anchored precursor could then serve as the nucleation point for the recruitment of numerous TatA protomers and even the formation of higher-order oligomeric TatABC complexes eventually allowing the transmembrane passage of the precursor. Assembly of TatA on a TatB-based scaffold would allow a lateral access of the substrate to the protein-conducting structure rather than having to invoke a transfer event between a receptor complex and a pore structure. During all these assembly steps the RR-precursor would remain fixed via its signal sequence to its initial TatC-binding site. It is even conceivable that such a stable association of the Tat signal peptide with TatC is a prerequisite for forming and maintaining the Tat-specific protein conduit in the membrane. Completion of translocation, which in fact can proceed without removal of the signal sequence 24, 54, would then lead to cleavage of the RR-precursor by signal peptidase and a subsequent dissociation of the signal peptide from TatBC would be the trigger for the dissociation of the Tat translocase.

metoder

plasmider

Plasmids were all verified by DNA sequencing. Plasmid pPJ7 (pET22b+/NapG) was constructed by PCR using total DNA of E. coli Top10 cells as template and the primers 5-NapG NdeI and 3-NapG XhoI (Supplementary Table S1). PCR was performed with Quick-Load Taq 2x Master-Mix (New England Biolabs). The PCR product was digested with Nde I/ Xho I and ligated into pET22b+ cut with the same restriction enzymes.

Plasmid pPJ8 (pKSM/SufI-ss-ex) was generated by inverse PCR as described for plasmid pPJ6 ( 29 ) using the primers SufI ss ex. for and SufI ss ex. rev and pKSMSufI-RR 23 as template.

To construct plasmid pPJ9 (pASK-IBA33plus/SufI), the SufI-encoding DNA sequence was amplified via PCR using Pfu Polymerase (Fermentas), pKSMSufI-RR 23 as template and the primers SufI IBA3 for and SufI IBA3 rev. The PCR fragment and the recipient vector pASK-IBA33plus were digested with Bsa I and ligated.

To construct plasmid pPJ10 (pBAD33/TatC), the TatC-encoding DNA sequence was amplified via PCR using Pfu Polymerase, plasmid p8737 as template 55 and the primers 5′-SacI TatC and 3′-BglII TatC. The PCR fragment and the recipient vector pBAD33 were digested with Sac I and Bgl II and ligated following dephosphorylation of the vector by antarctic phosphatase (New England Biolabs). To add a Shine-Dalgarno sequence upstream of TatC, the resulting plasmid was linearized with Sac I, followed again by dephosporylation. It was then incubated for 5 min at room temperature with the phosporylated oligos P-SacI pBAD for and P-SacI pBAD rev that encode the Shine-Dalgarno sequence present in pET22b+ and finally re-ligated. Owing to the cloning strategy, two additional amino acids were added to the C-terminus of TatC.

Plasmid p8737-tatAC was constructed to generate a tatAC expression vector with a tatA upstream region that is similar to the tatABCD expression vector p8737 using a 'crossover'-PCR method. First the tatA upstream region from p8737 was amplified by using the forward primer LacI_int_vorne_for and the reverse Primer Co_p8737_AC_rev with p8737 serving as template. Next, the tatAC operon was amplified by using the forward primer Co_AC_p8737_for, which has a 5′-extension that is complementary to the 3′-end of the first PCR product, and the reverse primer TatC_Ende_NdeI_rev with pHSG-TatAC 40 as template. Both fragments were purified and used as a template in a crossover PCR using primers LacI_int_vorne_for and TatC_Ende_NdeI_rev. The obtained PCR fragment was digested with XbaI and Nde I and ligated into the Xba I/ Nde I digested p8737 plasmid backbone, resulting in plasmid p8737-tatAC. All PCR reactions were carried out using the Expand High Fidelity PCR system (Roche).

Plasmids pKSMSufI-RR encoding SufI 23, pET28aTorA-PhoA and pET28aTorA-PhoAΔSP encoding TorA-PhoA and a non-cleavable variant of it 27, pPJ1 encoding TorA-MalE335 lacking the 35 C-terminal residues of MalE 52, pPJ2 encoding TorA(KK)-MalE335 ( 29 ), pPJ3 encoding TorA-mCherry 52, pPJ4 encoding SufI 29, pPJ5 encoding TorA(KK)-mCherry 52, pPJ6 ( 29 ) encoding TorA-SufIΔLinker, which is a linker-less version of TorA-SufI encoded by pPJ4, pTF1 encoding AmiC 29, p8737 containing an T7-dependent tatABCD operon 55, and pFAT588 encoding a hexa-histidine-tagged version of TatC 56 have been described previously.

In vitro reactions

S-135 cell extracts were obtained from E. coli strains SL119 ( 57 ) and Top10 (Invitrogen). Cells were grown and S-135 cell extracts were prepared as described 43 .

Coupled transcription/translation of the different precursor proteins from plasmid DNAs was performed as described 43 . Tat-dependent translocation of TorA-PhoA requires oxidizing conditions 27 . Those were established by the addition of 5 mM oxidized glutathione (GSSG) at the start of synthesis.

Membrane vesicles were added 10 min after starting the synthesis reaction and incubated for 25 min at 37 °C. For assaying translocation of precursors into INV, 15 μl of each reaction were treated with 15 μl 10% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) and 30 μl were incubated with PK according to Moser et al. 43 Where appropriate, CCCP was added at 0.1 mM final concentration together with INV.

For sodium carbonate extraction, a 50 μl reaction was treated with 50 μl freshly prepared, ice- cold 0.4 M Na 2 CO 3 . After 30 min at 4 °C, samples were centrifuged for 30 min at 70, 000 rpm in a Beckman TLA100 ultracentrifuge (Beckman-Coulter) using a TLA 100.3 rotor. Afterwards supernatants were precipitated with 100 μl 10% (w/v) TCA and resuspended in SDS–PAGE loading buffer. The pellets were solubilized directly in 30 μl SDS-PAGE loading buffer.

Preparation of membrane vesicles

INV were prepared as described previously 43 from E. coli strain BL21(DE3)ΔTat (B. Ize and T. Palmer, personal communication) transformed with plasmid p8737 (Tat + -INV), p8737-tatAC (TatAC-INV) and pFAT588 (TatC-INV). Expression of tat genes was induced with 1 mM isopropyl β- D -thiogalactopyranoside during the growth of cells from an optical density (OD) at 600 nm of 0.5 up to 2.0.

In vivo labelling of Tat precursors

Strains BL21(DE3), BL21(DE3)ΔTat (see above) and BL21(DE3)ΔTat containing plasmid pPJ10 (TatC) were transformed with plasmids pPJ9, pPJ3 and pPJ7 each. M63 minimal media supplemented with 10 mg l −1 thiamine hydrochloride, 100 μM each of 18 amino acids except methionine and cysteine, and the appropriate antibiotics were inoculated with overnight cultures of the respective strains to give an OD at 600 nm of 0.1. After growth at 37 °C to an OD 600 of 0.25–0.3, cells-harbouring plasmid pPJ10 (TatC) were induced with 0.1% arabinose. At an OD 600 of 0.5–0.6, 250 μl of cell cultures expressing pSufI, and 500 μl of cell cultures expressing TorA-mCherry and pNapG were each transferred to microfuge tubes and placed in an Eppendorf Thermomixer set at 37 °C. Cells were pulsed with 4 μl ml −1 35 [S]-methionine/cysteine (11–15 μCi/μl) and simultaneously treated with either 200 ng ml −1 anhydrotetracycline dissolved in dimethylsulphoxide to induce synthesis of pSufI from pPJ9 or with at least 1 mM β- D -thiogalactopyranoside to induce synthesis of TorA-mCherry from plasmid pPJ3 and pNapG from plasmid pPJ7, respectively. After 5 min of pulse time in the case of pSufI and after 15 min in the case of TorA-mCherry and pNapG, cells were chased with non-labelled methionine and cysteine (500 μg ml −1 final concentration) for 60 min. Reactions were stopped by the addition of 5% TCA (final concentration) and incubation on ice for 30 min. TCA precipitates were collected, dissolved in dithiothreitol-free SDS–PAGE loading buffer, treated with 8 M urea and applied to Ni-Sepharose as described 58 in order to isolate His-tagged SufI, TorA-mCherry and NapG species.

Diverse

For western blotting, 4 μl INV (A 280 ~40 μ ml −1 ) were each dissolved in 96 μl SDS–PAGE loading buffer. Of this solution, 5 μl were used for SDS–PAGE and western transfer, when blots were decorated with anti-TatA antibodies, and 20 μl when using anti-TatB and anti-TatC antibodies. Polyclonal antibodies against TatA, TatB and TatC were raised in rabbits as described 23, 55 . The second antibody was goat anti-rabbit IgG coupled to alkaline phosphatase (Sigma). Detection was performed using NBT/BCIP Stock Solution (Roche) following the manufacturer's instructions. SDS–electrophoresis using 10% polyacrylamide gels was performed as described previously 43 .

Ytterligare information

How to cite this article : Fröbel, J. et al. Transmembrane insertion of twin-arginine signal peptides is driven by TatC and regulated by TatB. Nat. Commun. 3:1311 doi: 10.1038/ncomms2308 (2012).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande tabell S1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.