Överföring av kolhydrataktiva enzymer från marina bakterier till japansk tarmmikrobiota | natur

Överföring av kolhydrataktiva enzymer från marina bakterier till japansk tarmmikrobiota | natur

Anonim

ämnen

  • Enzymmekanismer
  • Marin mikrobiologi
  • mikrobiota
  • polysackarider

Abstrakt

Tarmmikrober förser människokroppen med energi från dietpolysackarider genom aktiva kolhydrater, eller CAZymes 1, som saknas i det mänskliga genomet. Dessa enzymer riktar sig till polysackarider från markväxter som dominerade kosten under hela människans utveckling 2 . Uppsättningen av CAZymes i tarmmikrober är mycket mångsidig, exemplifierad av den mänskliga tarmsymbolen Bacteroides thetaiotaomicron 3, som innehåller 261 glykosidhydrolaser och polysackaridlyaser, såväl som 208 homologer av susC och susD- gener kodande för två yttre membranproteiner involverade i stärkelse användning 1, 4 . En grundläggande fråga som, till vår kunskap, ännu inte har tagits upp är hur denna mångfald utvecklades genom att förvärva nya gener från mikrober som bor utanför tarmen. Här karaktäriserar vi de första porfyranaser från en medlem av de marina Bacteroidetes, Zobellia galactanivorans , som är aktiva på den sulfaterade polysackaridporfyran från marinrödalger av släktet Porphyra . Vidare visar vi att gener som kodar för dessa porfyranaser, agaraser och tillhörande proteiner har överförts till tarmbakterien Bacteroides plebeius isolerade från japanska individer 5 . Våra jämförande tarmmetagenomanalyser visar att porfyranaser och agaraser är frekventa i den japanska befolkningen 6 och att de saknas i metagenomdata 7 från nordamerikanska individer. Tångar gör ett viktigt bidrag till den dagliga kosten i Japan (14, 2 g per person per dag) 8, och Porphyra spp. (nori) är den viktigaste näringstång som traditionellt används för att förbereda sushi 9, 10 . Detta indikerar att tång med tillhörande marina bakterier kan ha varit den väg genom vilken dessa nya CAZymer förvärvades i humana tarmbakterier, och att kontakt med icke-steril mat kan vara en allmän faktor i CAZyme-mångfalden i humana tarmmikrober.

Huvudsaklig

Marina alger innehåller sulfaterade polysackarider 11 som saknas i markväxter. Dessa unika polymerer används som kolkälla av marina heterotrofa bakterier som producerar specifika CAZymes 12 . I jämförelse med den ackumulerade kunskapen om nedbrytning av växtpolysackarider 13, är lite känt om enzymer som verkar på polysackarider från marina ätbara alger såsom Porphyra (nori), Ulva ( havssallad ) eller Undaria (wakame). Denna brist på kunskap om marina glykosidhydrolaser, vilket hindrar deras identifiering i metagenomiska studier, var den första grunden för vår sökning efter nya glykosidhydrolaser i Z. galactanivorans . Denna marina Bacteroidetes isolerades från den röda algen Delesseria sanguinea för sin förmåga att nedbryta agar och karragenaner 14, 15, 16, 17 . Den senaste genomanalysen av Z. galactanivorans (TB et al. , Manuskript under beredning) visade förekomsten av fem proteiner (Zg1017, Zg2600, Zg3376, Zg3628 och Zg3640) som är avlägsna släktingar till p-agaraser och K-karrageenaser (i genomsnitt 23% identitet med AgaA och CgkA). Alla dessa sekvenser har den katalytiska signaturen EXDXXE typisk för glykosidhydrolasfamilj 16 (GH16) (kompletterande figur 1), men har inte de kritiska resterna som krävs för igenkänning av agaros eller K-karrageenan 12 .

För att identifiera deras substratspecificitet klonade vi och uttryckte dessa fem GH16-gener i Escherichia coli . Emellertid uttrycktes endast Zg1017 och den katalytiska modulen i Zg2600 som lösliga proteiner och kunde analyseras ytterligare (kompletterande figur 2). Såsom förutsagt hade dessa proteiner ingen aktivitet på kommersiell agaros (kompletterande fig. 3) eller K-karrageenan. Följaktligen screenade vi deras hydrolytiska aktivitet mot naturliga polysackarider extraherade från olika marina makrofyter (data visas inte). Zg2600 och Zg1017 befanns vara aktiva endast på extrakt från de agarofytiska röda algerna Gelidium , Gracilaria och Porphyra , såsom visas genom frisättningen av reducerande ändar (fig la). Dessa enzymatiska aktiviteter korrelerar med ökande mängder av 4-länkade a-l-galaktopyranos-6-sulfat (L6S) i de extraherade polysackariderna, såsom visas med 'H-NMR (fig. Ib) 18 . Denna monosackarid är typisk för porfyran, som idealiskt består av alternerande L6S och 3-länkade P-d-galaktopyranosenheter (G) 19 (fig. La och kompletterande fig. 4a). Ibland ersätts L6S-enheter av 4-länkade 3, 6-anhydro-a-l-galaktopyranosenheter (LA), som finns i agaros 20 . Eftersom den extraherade porfyran innehöll ungefär två tredjedelar av L6S – G och en tredjedel av LA – G-motiv (fig. 1b), renades denna polysackarid från LA-G-motiv med P-agarasförbehandling. Zg2600 och Zg1017 uppvisade högsta aktivitet på den renade porfyran, medan agaraser var inaktiva. 1H-NMR-analys av de renade reaktionsprodukterna visar att den huvudsakliga slutprodukten av båda porfyranaser är disackariden L6S – G (kompletterande figur 5 och 6), vilket indikerar klyvning av p-1, 4-glykosidbindningen (kompletterande figurer 4b och 6). Därför är Zg2600 och Zg1017 de första p-porfyranaser som hittills beskrivits - benämnda PorA respektive PorB - och de representerar en ny klass av glykosidhydrolaser.

a, PorA och PorB screenades på råa algextrakt och jämfördes med AgaA; arterna på vilka enzymerna var aktiva visas. Stängerna visar mängden producerad glukosreducerande slutekvivalenter ( n = 3, felstänger representerar medelvärde ± sd). Aktiviteten på råa extrakt jämförs med den på ren porfyran (topp) och agaros (botten). b, 1H-NMR-spektra från motsvarande substrat i en show att den enzymatiska aktiviteten korrelerar med mängden L6S-enheter. Aktiviteten hos PorA och PorB är högst på ren porphyran (> 95% L6S – G).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Vi löst kristallstrukturerna hos PorB och en inaktiverad mutant av PorA i komplex med en porfyrantetrasackarid, vilket möjliggjorde identifiering av nyckelrester för porfyranigenkänning. De strukturella skillnaderna i ß-porfyranaser som bestämmer substratigenkänning gäller främst undersidan -2, som binder en L6S-enhet i PorA och en LA-enhet i AgaA (Protein Data Bank-anslutning 1URX). L6S-enheten är omgiven av W56 (W67, PorB) på ena sidan, R133 på motsatt sida och av R59 (R70, PorB) ovan (fig. 2a). Medan W56 staplar till ena sidan av L6S-enheten, bildar R59 en bidentat vätebindning med hydroxylgruppen på kol 2 i L6S-enheten och a- (1, 3) -glykosidbindnings-syre. L6S-enhetens sulfatgrupp är orienterad mot klyvans inre och sticker ut i en positivt laddad och hydrofob ficka (fig. 2b). Kritisk för porfyranigenkänning lämnar denna ficka utrymme för den skrymmande sulfatgruppen substituerad med kol 6. I motsats härtill sätter icke-anpassade glykosidhydrolaser, såsom β-agaraser, höga steriska begränsningar vid denna position (kompletterande fig. 7a) som gör produktiv bindning omöjligt, vilket återspeglas av den biokemiska aktiviteten hos AgaA, som inte kan försämra ren porfyran.

a, En aktiv platsmutant av PorA genererades genom polymeras-kedjereaktionsmutagenes (PCR) -mutagenes och samkristalliserades med den renade porfyrantetrasackariden som visade nyckelresterna för porfyranigenkänning. Fyra sockerenheter definieras av elektrondensitet. Den negativa laddningen av sulfatgruppen neutraliseras med saltbroar från sidokedjorna i H53 och R133. b, Ytrepresentation av substratets bindningsställe, vinkelrätt mot vyn i a, och framhäver fickan som specifikt rymmer sulfatgruppen i L6S-enheten bunden till bindningsstället -2. Fickan upptas av en tyrosinrest i p-agaraser (Y69 i AgaA), som är belägen i den mycket divergerande aminoterminala regionen. I båda panelerna representeras den slutliga raffinerade elektrondensiteten ( 2F o - Fc ; grå rutnät) som omger sockerenheterna och de angränsande aminosyrorna på en nivå i 1. Figuren framställdes med PyMol.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Denna strukturella information utnyttjades sedan för databearbetning av porfyranaser i sekvensdatabaser. Sex potentiella p-porfyranaser identifierades i den icke-redundanta databasen GenBank, med identitet som sträckte sig från 35% till 55% med PorA och PorB. Strukturbaserad sekvensinriktning indikerar att de avgörande resterna för porfyranigenkänning är väl bevarade i alla dessa GH16-enzymer (kompletterande figur 1). Dessutom bekräftar fylogenetisk analys att dessa sex proteiner, tillsammans med Zg3376, Zg3628, Zg3640, PorA och PorB, utgör en monofyletisk grupp (clade 2) som skiljer sig från p-agaras- och κ-karrageenas-subfamilierna (fig. 3; för detaljer se kompletterande Tabell 2). Därför förutsägas alla dessa ytterligare proteiner med säkerhet att vara p-porfyranaser och clade 2 kan definieras som en ny underfamilj inom GH16. Generna som kodar för Zg3376, Zg3628 och Zg3640 från Z. galactanivorans benämnes således porC , porD respektive porE .

GH16-enzymer som är specifika för rödalgsulfaterade galaktaner kluster i tre klader: clade 1, p-agaraser; clade 2, p-porfyranaser; och clade 3, K-karrageenaser. Marinbakterier använder dessa enzymer för nedbrytning av röda alg-galaktan. Det icke-marina undantaget är den mänskliga tarmbakterien B. plebeius , som innehåller ett ß-porfyranas och ett ß-agaras (vita cirklar) som påminner om det porfyranolytiska systemet för Z. galactanivorans (svarta diamanter).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Alla ortologerna av p-porfyranaser som vi upptäckte genom spränganalys i GenBank kodas av marina bakteriegenom, med undantag för Bp1689 (36%, 35% och 52% identitet med PorA, PorB respektive PorE) som härstammar från den mänskliga tarmen bakterie Bacteroides plebeius . Hittills beskriver litteraturen sex olika stammar av denna art, som alla isolerades från tarmmikrobiota hos japanska individer 5 och typstammen sekvenserades som en del av Human Microbiome Project (HMP, //genome.wustl.edu/ genomen). Noterbart innehåller B. plebeius också ett förmodat p-agaras från GH16, Bp1670 (53% identitet med AgaB, fig. 3). I motsats härtill innehåller ingen av de 24 andra Bacteroides- genomsekvenserna som finns tillgängliga vid US National Center for Biotechnology Information (NCBI) några P-porfyranas- eller P-agarasgener. Bland dessa ytterligare arter isolerades tio arter från västerländska individer (åtta nordamerikanska och två franska) och sex från östasiatiska individer (fem japanska och en japansk Hawaiian). De återstående stammarna är okarakteriserade och valdes av HMP (se kompletterande tabell 5). Analys av B. plebeius- genomet visar att Bp1670 och Bp1689 är omgivna av andra CAZyme-gener (fig. 4): två glykosidhydrolasfamilj 86 (GH86) p-agaraser ( Bp1693 och Bp1694 ), två glykosidhydrolasfamilj 2 (GH2) p -galaktosidaser ( Bp1672 och Bp1673 ) och ett sulfatas ( Bp1701 ). Denna genomiska region innehåller också en gen som kodar ett kolhydratbindande modulfamilj 22 (CBM22) -protein (Bp1696), föregående av en susD- liknande gen ( Bp1697 ) och dess associerade TonB-beroende receptorgen ( susC- liknande, Bp1698 ). Alla dessa kolhydratrelaterade gener har sina närmaste ortologer i marina bakterier (identitet mellan 48% och 69%), medan homologa gener från andra tarm Bacteroides- arter är mycket mer avlägsna (∼ 30% identitet). Sex av dessa gener ( Bp1670 , Bp1671 , Bp1689 , Bp1693 , Bp1694 och Bp1696 ) har dessutom ingen homolog i andra Bacteroides- genom. Generna Bp1696 , Bp1697 och Bp1698 delar också synteny med två polysackaridanvändningsplatser (PUL) från Z. galactanivorans , som inkluderar antingen agaB ( Zg3573 ) eller porE ( Zg3640 ). Blandade dessa gener delade med marina bakterier finns gener välbevarade med andra tarmbakteroider (kompletterande tabell 3), vilket visar att B. plebeius är en vanlig tarmsymbiont som fick en ovanlig uppsättning gener troligen genom horisontell genöverföring (HGT) från en marin bakterie. Den möjliga mekanismen för HGT identifierades genom att analysera regionen nedströms Bp1670 , som innehåller gener som kodar för konserverat relaxas / mobiliseringsproteiner (Bp1662 och Bp1663 / Bp1665), som krävs för konjugativ DNA-överföring 21 . Intressant nog är p-agaraset Ms116 och det förmodade p-porfyranaset Ms132 från Microscilla sp. PRE1 (fig. 3) kodas av en plasmid som innehåller en relaxasgen ( Ms155 ) homolog med Bp1662 22 . Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att B. plebeius förvärvade ett porphyran användningsplats som härstammar från en förfäderporfyranolytisk marinbakterie, relaterad till de befintliga marina Bacteroidetes Z. galactanivorans och Microscilla sp. PRE1.

Visas är sekvensidentiteten mellan B. plebeius , Microscilla sp. PRE1 och Z. galaktanivorans proteiner. Sex av dessa gener ( Bp1670 , Bp1671 , Bp1689 , Bp1693 , Bp1694 och Bp1696 ) bevaras med marina bakterier, men är frånvarande i genom från andra tarmbakteroider.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

För att utvidga dessa fynd sökte vi efter homologer av PorA, PorB och Bp1689 i metagenomiska data tillgängliga på NCBI. Inget porfyranas hittades i prover med terrestriskt ursprung. Metagenome datauppsättningar erhållna genom provtagning av öppet hav innehöll inte heller porfyranasgener, men detta förklaras antagligen av bristen på röda makroalger i det "öppna havet". Porfyranasfördelningen är alltså väsentligen begränsad till kustvatten och till tångassocierade bakterier. För att testa om porfyranaser är vanliga i japanska tarmmikrober, analyserade vi tarmmetagenomdata erhållna från 13 japanska volontärer (total läslängd, 726 907 479 baspar (bp); genomsnittlig längd, 840 bp) 6 . Sju potentiella porfyranaser identifierades entydigt i mikrobiomema hos fyra personer (mellan 31% och 42% identitet med PorB, mellan 83% och 100% med Bp1689; se tabell 1). Sex förmodade p-agaraser (GH16) detekterades också hos fyra japanska individer (mellan 51% och 59% identitet med AgaB, mellan 96% och 99% med Bp1670). Intressant nog, hos en japansk familj, hade modern och hennes oönskade babyflicka en mikrobiota innehållande porfyranas- och agarasgener, vilket tyder på att porfyranolytiska tarm Bacteroides- stammar kan överföras mellan släktingar. Däremot, vid analys av tarmmetagenomdata för 18 nordamerikanska individer (total läslängd, 1 830 767 417 bp; genomsnittlig längd, 223 bp) 7 upptäcktes inga porfyranas- eller agarasgener, även om denna datamängd är 2, 5 gånger större än den japanska datauppsättning (nästan tiofaldigt med tanke på genomsnittlig läslängd) 6 . Den genomsnittliga läslängden är dock kortare i den amerikanska datauppsättningen. För att testa om denna skillnad kan påverka sannolikheten för att detektera porfyranaser och agaraser, sökte vi efter homologer av genen som kodar för a-amylaset SusA från B. thetaiotaomicron , som är väl bevarat i Bacteroides- genomer. Med hjälp av följande kriterier ( E- värde < 10-15, poäng> 50, identitet> 50%) hittade vi 34 respektive 306 homologer i de japanska respektive amerikanska datamängderna, vilket bekräftar att det inte finns någon förspänning på grund av läslängden . Att tillämpa Fischers exakta test 23 på respektive CAZyme-räkning ger ett P- värde av P = 1, 68 × 10-6, vilket indikerar en statistiskt signifikant förening mellan populationer och förekomsten av porfyranas-sekvenser i tarmmikrobiota. Sammantaget visar analyser av tillgängliga genomiska och metagenomiska data att porfyranas- och agarasgener specifikt uppträder i japanska tarmbakterier och troligen saknas i mikrobiomet hos västerländska individer.

Full storlek bord

Detekteringen av denna HGT var möjlig på grund av två gynnsamma faktorer: P-porfyranaser är frånvarande i markbundna mikrober, och överföringen var relativt ny jämfört med miljoner år av utveckling av däggdjurens mikrobiom. Detta stöds av den höga sekvensidentiteten för porfyranas och associerade gener i B. plebeius med gener som finns i marina bakteroideter. Däremot inträffade förvärv av terrestriska växtspecifika CAZyme-gener troligen tidigt i utvecklingen av växtätande / allätande däggdjur, och sådana horisontellt förvärvade gener skulle vara svåra att skilja från förfäder, vertikalt överförda gener. Tidpunkten för en sådan HGT-händelse är emellertid svår att uppskatta 24 . Frågan uppstår då hur generna som beskrivs här förvärvades av japanska tarmbakterier. Skattjournaler från åttonde århundradet visar tång som betalningar till den japanska regeringen 9, vilket visar att de hade en viktig roll i japansk kultur. Diät tang är därför den mest troliga vektorn för kontakten med marina mikrober som ledde till HGT, eftersom den enda porfyrankällan i människors näring är nori. Traditionellt rostas inte nori och därmed främjas kontakt med tillhörande marina mikrober genom japansk sushi 9 . Följaktligen är konsumtionen av mat med tillhörande miljöbakterier den mest troliga mekanismen som främjade denna CAZyme-uppdatering till den mänskliga tarmmikroben.

Metoder Sammanfattning

Porphyra umbilicalis alger uppsamlades våren 2008 nära Roscoff i mellantidssonen. Hundra gram torrviktmaterial användes för polysackaridekstraktionen 25 . Denna polysackarid kallas porfyran. För att avlägsna LA – G-motiv spjälkades porfyran med ett överskott av ß-agaras B (AgaB) 17 . Den resistenta fraktionen separerades från oligosackarider genom gelfiltrering. Denna fraktion kallas ren porfyran.

Enzymaktivitetsanalyser genomfördes såsom tidigare beskrivits för p-agaraser 16 men vid 30 ° C, med en porfyranaskoncentration av 5 nM och en porfyranlösning av 0, 125% (vikt / volym). Oligosackariderna som producerades under enzymatisk spjälkning av alla polysackarider från olika algarter uppmättes genom en reducerande sockeranalys kalibrerad mot en glukoskoncentrationskurva och presenterades som glukosreducerande slutekvivalenter 26 .

PorA och PorB producerades genom rekombinant uttryck i E. coli (se metoder). Alla enzymkonstruktioner bifogas genom en His 6- tagg för proteingrening efter standardaffinitets- och storleksuteslutande vätskekromatografimetoder (HPLC). Kristallstrukturen i PorA löstes genom multivavellängd anomal diffraktion (MAD) på ett guldderivat med användning av programmet HKL2MAP 27 . Ett standardmutagenespaket från Qiagen användes för att införa E139S-mutationen i PorA (för primers, se kompletterande tabell 4). En komplex struktur erhölls genom samkristallisation med renad porfyrantetraoligosackarid. Förfining utfördes med REFMAC 28 och modellbyggnad med Coot 29 . Kristallstrukturen hos PorB löstes genom molekylersättning och med användning av PorA som en sökmodell. Alla datauppsättningar samlades in på European Synchrotron Strålningsanläggningar.

Reningen av porfyranoligosackarider utfördes genom flera efterföljande vätskekromatografisteg. ' H-NMR-spektra registrerades och signalerna tilldelades fullständigt med användning av en komplett uppsättning av korrelationsspektra (COZY, HMBC och HMQC). Detaljer för fylogeny-analysen beskrivs i avsnittet Metoder.

Online-metoder

Aktivitetsscreening på algextrakt

Arter av arter ( Ectocarpus siliculosus , Delesseria sanguinea , Zostera marina , Porphyra umbilicalis , Gracilaria gracilis , Gelidium spinosum , Chondrus crispus och Laurencia pinnatifida ) samlades alla vid lågvatten nära Roscoff, tvättades omfattande med färskt vatten, chockfryst med flytande kväve och mald i en mortel tills ett fint pulver erhölls. Hundra gram torrviktmaterial användes för polysackaridekstraktionen 25 . Algpulvret behandlades med 80% etanol, centrifugerades och supernatanten kastades. Etanol-extraktion upprepades tills supernatanten förblev färglös. Den erhållna fasta alginfraktionen pelleterades, frystes och torkades därefter genom lyofyllisering. För testen med enzymatisk aktivitet återsuspenderades 50 mg algpulver i 1 ml destillerat vatten och extraherades under 1 timme vid 98 ° C. Suspensionen centrifugerades under 5 minuter vid 3000 g och supernatanten överfördes till ett nytt rör. Denna extraktion upprepades två gånger och de tre extraktionssupernatanterna kombinerades slutligen. Den torkade massan utvanns för varje extrakt för att beräkna den normaliserade enzymaktiviteten och för att registrera 1H-NMR-spektra.

Hundra mikroliter algextrakt inkuberades med 1 | ig enzym vid 30 ° C i 300 mM NaCl och 10 mM natriumacetat, 16 mM tri-natriumcitrat (pH 7, 2) tills fullständig digerering kunde erhållas. Fullständig matsmältning övervakades genom ytterligare tillsats av enzym och ommätning av mängden frisatta oligosackarider. Proverna centrifugerades under 30 minuter vid 3 000 g för att spinna ned icke-digererade gelpartiklar och återjämviktades under 20 minuter vid 20 ° C. Lösliga reaktionsprodukter i supernatanten kvantifierades genom en reducerande sockeranalys 26 . Mängden reducerande ändar producerad av enzymerna beräknades med en glukoskalibreringskurva och de erhållna resultaten presenteras som glukosreducerande slutekvivalenter (fig 1). De slutliga värdena beräknades genom subtraktion av kontrollnivåer mätt för lösningar utan tillsatt enzym (data visas inte). Kalibreringskurvan med 50–300 ug ml -1 glukos användes för att beräkna mängden reducerande ändar som glukosreducerande slutekvivalenter.

Kloning och uttrycksstrategi för medell genomströmning

De fem nya GH16-enzymerna från Z. galactanivorans valdes för rekombinant expression. Två enzymer (Zg2600 och Zg3628) är multimodulära och består av katalytiska moduler bifogade av kolhydratbindande moduler (CBM) 30 eller moduler med okänd funktion. Från dessa multimodulära enzymer förstärktes endast de katalytiska modulerna med PCR och klonades därefter. Kloningsstrategi och primers av alla mål ges i tilläggstabell 4.

Alla mål förstärktes parallellt med PCR med en uppsättning av framåtriktade och omvända primrar som beräknades ha en smälttemperatur av 70 ° C. Renade PCR-produkter digererades med en blandning av motsvarande restriktionsenzym / buffertsystem (NEB) under 3 timmar vid 37 ° C. Efter spjälkning renades PCR-produkterna igen med ett standard-DNA-reningskit och eluerades slutligen med 25 | il H20. PCR-produkterna ligerades med en lika digererad pET15b-härledd plasmid (gåva från M. Cygler), som dessutom defosforylerades. För transformationen användes kemiskt kompetenta DH5a E. coli- celler enligt standardförfaranden.

Det rekombinanta lösliga uttrycket av de olika konstruktionerna screenades först i liten skala. De erhållna klonerna transformerades till rekombinanta Bl21 (DE3) -celler och användes sedan för att ympa en 3 ml Luria-Bertani-buljong-förkultur, kompletterad med 100 | ig ml-1 ampicillin i djupbrunnsformat. Förkulturen inkuberades över natten vid 37 ° C och 10 | il överfördes för ympning av 2 ml ZYP-5052 medium (ampicillin, 100 | ig ml-1) 31 . Uttryckstestkulturerna inkuberades vid 20 ° C under tre dagar och skördades genom centrifugering. Cellerna lyserades med 500 | il lysbuffert sammansatt av 50 mM Tris, pH 8, 300 mM NaCl, 1 mg ml-1 lysozym och DNas. Celllysatet centrifugerades och supernatanten separerades för satsaffinitetsrening med hypercel-nickelharts. Den återstående cellpelleten, som innehöll den olösliga uttryckta fraktionen, extraherades med 6 M urea under 30 minuter och centrifugerades. Supernatanten lagrades för SDS – polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) -analys. Celllysatsupernatanten användes för satsaffinitetsrening och 50 pl nickelladdat hypercelharts tillsattes supernatanten. Efter inkubering i 20 minuter kasserades supernatanten och pelleten tvättades med 500 | il buffert (lysbuffert utan lysozym och DNas) följt av ytterligare centrifugering. De bundna proteinerna eluerades genom tillsats av 500 mM imidazollösning. Fraktioner av inklusionskroppar, lösligt celllysat och satsrenade proteiner analyserades på 12% SDS – PAGE (data visas inte). Expressionsförfarandena uppskalades sedan till 1 liter kulturer för proteinproduktion före strukturell och biokemisk analys.

Kristallisations- och strukturlösning

PorA kristalliserades med hängtroppsmetoden i 18-20% PEG 4 000, 0, 2 M ammoniumsulfat och 0, 1 M natriumacetat, pH 4, 6, vid 20 ° C. Droppar innehöll 2 pl 2, 6 mg ml-1 proteinlösning plus 1 pl kristallisationslösning och ekvilibrerades mot 500 pl kristallisationslösning. Ett tungt derivat derivat erhölls genom blötläggning av en nativ kristall i 24 timmar i moderlut, kompletterad med 5 mM kaliumtetra-klorururat (III) och 5% glycerol. Före blixtfrysning vid 100 K blöts kristallen tillbaka i moderlut med 10% glycerol under 1 minut. MAD-data samlades in på strålning ID23I. Fyra datauppsättningar samlades från en tung atomderivatkristall, runt LIII-guldabsorptionskanten. Anomala data behandlades med XDS och skalades med XSCALE 32 . Den tunga atomunderkonstruktionslösningen bestämdes med SHELXD 33 följt av densitetsmodifiering med SHELXE som en del av HKL2MAP 27 och den resulterande elektrondensitetskartan förbättrades genom lösningsmedelsutplattning med programmet DM (CCP4) 34 . Kristallisationsbetingelserna för den komplexa strukturen PorA_E139S anpassades från det nativa proteinet och 5-10 mM neo-porfyrotetraos tillsattes. För dessa kristaller utfördes datainsamlingen på strålning BM30A. Data behandlades med Mosflm 35 och SCALA (CCP4) 34 . Förfining utfördes med REFMAC 28 och modellbyggnad med Coot 29 .

PorB kristalliserades inom en till två veckor med sit-drop-metoden med en kristallisationslösning sammansatt av 33–35% PEG 1 000, 0, 4 M litiumsulfat och 0, 1 M MES buffert vid pH 6, 0. De sittande dropparna bildades genom blandning av 2 | il proteinlösning (5, 6 mg ml-1) och 1 | il kristallisationslösning och ekvilibrerad mot en 500 | il kristallisationslösning vid 20 ° C). För kryokonservering fördes kristaller till 10% glycerol i 5% steg i kristallisationslösningen. Efter lösning av faserna genom molekylersättning, utfördes modellbyggnaden och förfining enligt beskrivningen för PorA. För alla datauppsättningar flaggades 5% av observationerna som fria och användes för att övervaka förädlingsförfaranden och en sammanfattning för datainsamling och slutlig förfiningsstatistik ges i tilläggstabell 1.

Rening av oligosackariderna genom preparativ kromatografi för uteslutning av storlek

Materialet för rening av oligosackarid erhölls genom inkubering vid 30 ° C av porfyran med 2, 6 ug ml-l PorA i vatten.

Rening av porfyranoligosackarider utfördes genom preparativ kromatografi med uteslutning av storlek med tre Superdex 30 (26/60) kolonner i serie, integrerade i en HPLC-system vätskeinjektor / uppsamlare (Gilson). Den frystorkade hydrolysprodukten löstes i avjoniserat vatten i en koncentration av 4% (vikt / volym). Efter filtrering injicerades 4 ml prov och eluerades med 50 mM ammoniumkarbonat med en flödeshastighet av 1, 5 ml min -1 . Fraktioner av oligosackarider som kunde tilldelas olika toppar uppsamlades, slogs samman och analyserades med HPLC (data visade inte) och fluoroforassisterad PAGE och fraktionerna frystorkades genom lyofyllisering för ytterligare analyser med kärnmagnetisk resonans (kompletterande fig 6) .

Fluoroforassisterad kolhydratelektrofores

Fraktioner erhållna efter separering av oligosackarider analyserades med fluorofor-kolhydrat – SIDA 36 . Alikvoter av 100 | il var märkta med 2 | il AMAC (2-amnoacridon) -lösning eller med 2 | il ANTS (8-aminonaftalen-1, 3, 6-trisulfonat) -lösning. Efter upplösning av oligosackaridpelletsen tillsattes 5 | il av en 1 M natriumcyanoborhydrid i dimetylsulfoxid (DMSO) och blandningen inkuberades under 16 timmar vid 37 ° C. Proverna analyserades på en 30% polyakrylamidkörningsgel med en 4% stapelgel.

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi

Alla prover solubiliserades i D20 och byttes två gånger innan de analyserades på en Bruker 500 MHz NMR-spektrometer. För polysackariderna extraherade från alger som användes som substrat för enzymatiska analyser registrerades 1H-NMR-spektra vid 70 ° C med användning av 64 skanningar. För oligosackarider registrerades 1H-NMR-spektra vid 25 ° C med användning av 16 skanningar (kompletterande figur 6). Kemiska förändringar uttrycks i ppm med hänvisning till en extern TSP (trimetylsilylpropionsyra). NMR-signalerna för de renade oligosackariderna tilldelades fullständigt med användning av en fullständig uppsättning av korrelationsspektra: COZY (dubbelkvantum-filtrerad korrelationsspektroskopi), HMBC (heteronukleär multipelbindningskorrelation) och HMQC (heteronukleär enkelkvantkorrelation).

Sekvens- och fylogenieanalyser

Flera sekvensinställningar genererades med användning av MAFFT med den iterativa förfiningsmetoden och poängmatrisen Blosum62 37 . Den strukturbaserade multipla inriktningen av p-porfyranaser visades med användning av programmet ESPript 38 . För fylogenyanalyser av GH16-enzymerna valdes sekvenserna från CAZY-databasen. MAFFT-inriktningen av dessa sekvenser förfinades manuellt med användning av Bioedit (T. Hall), på basis av superpositionen av strukturen för k-karrage-naset av Pseudoalteromonas carrageenovora 39, p-agaraset AgaA 17 och p-porfyranaserna PorA och PorB från Z. galactanivorans . Filogenetiska träd härleddes från denna raffinerade inriktning med användning av metoden för maximal sannolikhet med programmet PhyML 40 . Träarnas tillförlitlighet testades alltid genom bootstrap-analys med 100 resamplings av datauppsättningen. Träden visades med MEGA 3.1 41 .

anslutningar

Primära anslutningar

Proteindatabank

  • 3ILF
  • 3ILF 3d-vy
  • 3JUU
  • 3JUU 3d-vy

Insättningar av data

Atomkoordinater och strukturfaktorer har deponerats i Protein Data Bank under anslutningskoder 3ILF (PorA_E139S) och 3JUU (PorB).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Denna fil innehåller kompletterande anmärkningar A - C med referenser, kompletterande tabeller 1-7 och kompletterande figur 1-18 med legender.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.