Transkriptionella och antagonistiska svar från pseudomonas fluorescens pf0-1 till fylogenetiskt olika bakteriekonkurrenter | isme journal

Transkriptionella och antagonistiska svar från pseudomonas fluorescens pf0-1 till fylogenetiskt olika bakteriekonkurrenter | isme journal

Anonim

ämnen

  • Bakterie
  • Gemenskapens ekologi
  • Genexpression
  • Mikrobiell ekologi

Abstrakt

Jordbakteriens förmåga att framgångsrikt konkurrera med en rad andra mikrobiella arter är avgörande för deras tillväxt och överlevnad i den näringsbegränsade markmiljön. I det aktuella arbetet studerade vi beteende och transkriptionella svar från jordbeboande Pseudomonas fluorescens stam Pf0-1 på näringsfattig agar för konfrontation med stammar av tre fylogenetiskt olika bakteriegener, det vill säga Bacillus , Brevundimonas och Pedobacter . Konkurrensen om näringsämnen var uppenbar eftersom alla tre bakteriegener hade en negativ effekt på tätheten av P. fluorescens Pf0-1; denna effekt var mest stark under interaktionen med Bacillus . Microarray-baserade analyser indikerade starka skillnader i transkriptionella svar från Pf0-1 till de olika konkurrenterna. Det var högre likhet i genuttryckssvaret av P. fluorescens Pf0-1 till de Gram-negativa bakterierna jämfört med den Gram-positiva stammen. De gramnegativa stammarna utlöste också produktionen av ett okänt bredspektrumantibiotikum i Pf0-1. Mer detaljerad analys indikerade att uttryck av specifika Pf0-1-gener involverade i signaltransduktion och sekundär metabolitproduktion påverkades starkt av konkurrenternas identitet, vilket tyder på att Pf0-1 kan skilja mellan olika konkurrenter och finjustera sina konkurrensstrategier. Resultaten som presenteras här visar att P. fluorescens Pf0-1 visar ett artsspecifikt transkriptionellt och metaboliskt svar på bakteriekonkurrenter och tillhandahåller nya ledningar i identifieringen av specifika ledtrådar i interaktioner mellan bakterier och bakterier och nya konkurrensstrategier, antimikrobiella egenskaper och gener.

Introduktion

Jord mikrobiella samhällen representerar världens största reservoar av biologisk mångfald hittills känd (Curtis et al., 2002; Torsvik och Ovreas, 2002). De mest kända jordbakterierna är organotrofer, det vill säga de erhåller energi för tillväxt från assimilering av organiska föreningar. Emellertid är tillgängligheten eller tillgängligheten för nedbrytbara organiska föreningar begränsad i de flesta jordar (Alden et al., 2001; Demoling et al., 2007). Dessutom finns det en hög grad av överlappning i metaboliska förmågor hos organotrofa bakterier (Strickland et al., 2009). Detta innebär att en viss bakterieart troligen kommer att möta många taxonomiskt olika konkurrenter i olika mikrositer i jordens ekosystem.

Bakterier utforskar deras biotiska och abiotiska miljöer genom att avkänna och svara på en mängd olika kemiska stimuli (Taga och Bassler, 2003; Ryan et al., 2008; Shank och Kolter, 2009; Straight och Kolter, 2009) och möjligen ge dem information om identiteten på närmaste konkurrent (er). Nya studier avslöjade faktiskt att bakterier förändrar deras genuttryck när de konfronteras med en annan bakterieart (Garbeva och de Boer, 2009; Tai et al., 2009).

De mest karakteriserade bakterierna har flera tvåkomponents signaltransduktionssystem som möjliggör koppling av en mängd olika anpassningsbara svar på angränsande makro- och mikroorganismer och till abiotiska miljöförändringar (Gao et al., 2007). Pseudomonas- arter, som ofta isoleras från komplexa miljöer, såsom jord och rhizosphere, har ett intervall av tvåkomponent signaltransduktionsproteiner (till exempel 212 i Pseudomonas fluorescens Pf0-1, 223 i P. fluorescens Pf-5, 179 in P. putida KT2440 och 203 i P. syringae DC3000 (//genomics.ornl.gov/mist)), som tros möjliggöra snabba svar på miljöförändringar (Heeb och Haas, 2001; Dubuis et al., 2007; Humair et al. al., 2010). I dessa komplexa naturliga miljöer existerar Pseudomonas- arter tillsammans med många andra bakteriearter. Vi antar att signaltransduktionssystem delvis kan ha en roll i att finjustera sina svar mot den närmaste konkurrerande mikroben och för att optimera deras konkurrensbeteende.

Bland generna som är uppreglerade under interspecifika bakteriella interaktioner är ofta generna involverade i produktionen av antibiotika, vilket antyder att antibios kan vara en vanlig defensiv eller stötande strategi i mikrobiella interaktioner (Fong et al., 2001; Harrison et al., 2008; Garbeva och de Boer, 2009). Dessutom befanns gener som ger resistens mot toxiner också vara uppreglerade under konkurrerande interaktioner, vilket tyder på skydd mot självförgiftning eller mot toxiner producerade av andra medlemmar i mikrobiellt samhälle (Dantas et al., 2008; Martinez 2008, 2009). Huruvida uppreglering av gener som är involverade i denna "kemiska krigföring" förbättrar konkurrensframgången beror på konkurrentens känslighet för antibiotika (erna) och resistensen av den intressanta belastningen för konkurrentens toxiner. Därför är det troligt att både toxinproduktion och resistens kan behöva anpassas eller anpassas till konkurrentens identitet. Förutom toxinproduktion och resistens kan modulering av andra gener och cellprocesser också krävas för att upprätthålla en population i en dynamisk, konkurrenskraftig miljö. Hittills har dock inga rapporter dokumenterat variationen i transkriptionella svar från bakterier till olika konkurrenter.

I det nuvarande arbetet undersökte vi förmågan hos jordbebyggande P. fluorescensstam Pf0-1 att hantera olika konkurrenter under näringsfattiga förhållanden. Vi undersökte beteende och transkriptionella svar från Pf0-1 under interaktion med stammar av tre fylogenetiskt olika bakteriegener, det vill säga Bacillus , Brevundimonas och Pedobacter . Resultaten visar att P. fluorescens Pf0-1 kan skilja mellan olika konkurrenter. Vanliga transkriptionella svar identifierades också, inklusive uppreglering av kryptiska gener i Pf0-1, vilket vi visar att det är viktigt för produktion av en antimikrobiell förening.

Material och metoder

Bakteriekulturer och odlingsförhållanden

De bakteriestammar som användes i denna studie sammanfattas i tabell 1.

Full storlek bord

Dessa inkluderar P. fluorescens Pf0-1, Pedobacter sp. V48, Brevundimonas sp. V52 och Bacillus sp. V102. P. fluorescens Pf0-1 isolerades från en jordbruksskumjord i Sherborn (MA, USA), medan de andra stammarna isolerades från en kustdynplats i Nederländerna (Compeau et al., 1988; de Boer et al., 2003, 2007). Denna sanddynjord innehåller också pseudomonader som är nära besläktade med P. fluorescens Pf0-1 (de Boer et al., 2007). Stammarna förodlades från frysta glycerollager på 1/10 styrka Tryptic Soy Broth-agar.

Interaktionsexperimenten utfördes med användning av det kolbegränsade vatten-agarmediet (WA-N), som har använts i en tidigare studie (Garbeva och de Boer, 2009). Detta medium innehöll 20 gl −1 av Agar, 5 gl −1 av NaCl, 1 gl −1 av KH 2 PO4 och 0, 1 gl −1 av (NH4) 2 SO 4 . PH justerades till 6, 5 före autoklavering. (Garbeva och de Boer, 2009). WA-N-agarplattorna (8, 5 cm i diameter) delades upp i två zoner (tilläggsinformation Figur S1): zon Bl, hamnar P. fluorescens Pf0-1; och zon B2 innehåller en av de konkurrerande bakterierna. Zonerna Bl och B2 separerades 1, 5 cm från varandra och alla stammar ympades med lika täthet. Bakterieinokulor, bestående av 20 ul tvättade cellsuspensioner i en 10 mM fosfatbuffert (pH 6, 5) och innehållande 107 celler per ml, spriddes i den lämpliga zonen. Alla plattor inkuberades vid 20 ° C under 5 dagar. På den femte dagen uppsamlades bakterieceller för uppräkning (se nedan), medan P. fluorescens Pf0-1 också uppsamlades för RNA-extraktion.

Uppräkning av bakterier

Två agarskivor (1 cm diameter) skars från bakteriezonerna på WA-N-plattor och skakades i 10 mM fosfatbuffert (pH 6, 5) under 90 minuter. Seriella utspädningar pläterades på 1/10 Tryptic Soy Broth agarplattor. Plattor inkuberades vid 20 ° C och kolonier räknades efter 48 timmar.

Microarray-experiment, RNA-isolering och cDNA-syntes

Totalt RNA extraherades från P. fluorescens Pf0-1 växande på WA-N-plattor med eller utan (kontroll) närvaro av konkurrerande bakterier. För total RNA-extraktion skars WA-N-agarzonen som bär P. fluorescens Pf0-1 från plattan (för att förhindra kontaminering av den konkurrerande typen under återvinning av celler) och cellerna suspenderades i 1, 5 ml sterilt fosfatbuffert. Alla suspensioner späddes i steril fosfatbuffert till samma optiska densitet (OD; 600 nm) för att erhålla lika stora mängder celler för RNA-extraktion. Cellerna centrifugerades vid 16 000 x g under 3 minuter. RNA extraherades från cellpelletsen med Artrum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, Veenendaal, Nederländerna katt nr 732-6820) enligt tillverkarens rekommendationer. Det extraherade totala RNA behandlades med TURBO-DNA-fritt kit för att avlägsna DNA (Ambion, Nieuwerkerk a / d lJssel, Nederländerna; katt nr 1907). Innan kompletterande DNA (cDNA) skapades kvantifierades RNA-koncentrationerna i proverna med en NanoDrop spektrofotometer (Isogen Life Science, IJssestein, Nederländerna). RNA-kvalitet verifierades med användning av Experion System (Bio-Rad).

Första sträng cDNA syntetiserades från 10 μg totalt RNA med slumpmässiga hexamerprimrar från Invitrogen (Breda, Nederländerna; katt nr. 48190-011) med användning av SuperScript dubbelsträngat cDNA-syntesutrustning (Invitrogen katt nr 11917-010). CDNA-syntesen utfördes enligt NimbleGen-protokollet för syntes av dubbelsträngat cDNA.

Microarray design och dataanalys

På basis av sekvens- och annotationsdata för P. fluorescens Pf0-1 designades och producerades högtäthet, multiplex (4 × 72 K) mikroarrayer av Roche NimbleGen (NimbleGen Systems of Island, Reykjavík, Island; kattnr. A7241 -00-01). Matriserna bestod av 60-merprober som täckte 5735 gener, 6 sonder per gen och 2 replikat. Märkning av cDNA med Cy3-färgämne och hybridisering utfördes av Roche NimbleGen.

På varje 4 x 72 K-format har två replikatinteraktioner och två replikatkontroller utförts. Listorna över differentiella uttryckta gener extraherades genom jämförelse av varje interaktion med kontrollen. De robusta mikroarrayanalys-normaliserade genuttrycksdata analyserades med Array Star 2-programvaran för mikroarray-analys (DNASTAR, Madison, WI, USA). Analys utfördes med tillämpning av falsk upptäcktsfrekvens (metoden Benjamin-Hochberg) och flera testkorrigeringar.

Kvantitativ realtid PCR

Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) utfördes på de ursprungliga RNA-extrakten för att verifiera genuttrycket detekterat genom mikroarray-analys. Första sträng cDNA erhölls såsom beskrivits ovan. En volym av 2 ul cDNA underkastades RT-PCR med användning av SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystem, Warrington, UK). För varje målgen (35 differentiellt uttryckta gener och 3 kontrollgener - icke differentiellt uttryckta) konstruerades framåtriktade och omvända primers (kompletterande informationstabell S1) med användning av Primer Express-programvara (PE, Applied Biosystem). Alla primrar som användes för PCR i realtid testades först med användning av konventionell PCR med DNA isolerat från P. fluorescens Pf0-1. PCR i realtid utfördes med användning av en Corbett Research Rotor-Gene 3000 termisk cykler (Westburg, Leusden, Nederländerna) med följande betingelser: initial cykel 95 ° C under 15 minuter och 40 cykler av: 95 ° C under 15 sekunder; 56 ° C under 50 s; och 72 ° C under 50 s. Införlivandet av SYBR Green i dubbelsträngat DNA tillät bestämning av tröskelcykeln, som identifierar momentet för PCR-cykeln vid vilken PCR-amplikoner överskrider detektionsgränsen. Standardkurvor fastställdes för varje cDNA-prov.

Extraktion av antimikrobiella föreningar

Extraktionen av antimikrobiella föreningar genomfördes enligt de metoder som beskrivs av Raaijmakers et al. (1999). I korthet avlägsnades WA-N-agarzonen som bär P. fluorescens Pf0-1 försiktigt från plattan och skars i små (1 cm diameter) bitar. Dessa bitar skakades kraftigt i 20 ml 80% (volym / volym) aceton under 1 timme vid rumstemperatur. Acetonlösningen centrifugerades under 10 minuter vid 4000 x g och acetonen indunstades under luftflöde. Vattenfraktionen surgjordes med trifluorättiksyra (0, 1% (v / v)), blandades med 2 volymer etylacetat och skakades kraftigt under 5 minuter.

Efter inkubering under natten vid -20 ° C överfördes den offrusen (etylacetat) fraktionen som innehåller de aktiva föreningarna försiktigt till en ny kolv och torkades under luftflöde. Det torkade extraktet löstes i 150 ul 50% (volym / volym) metanol och underkastades en omvänd fas vätskekromatografianalys.

Konstruktion och användning av Pf0-1-mutanter

På basis av mikroarray- och qRT-PCR-analyserna valdes flera genkluster för platsriktad mutagenes. Gener togs bort från P. fluorescens Pf0-1 genom genom SOE-PCR (Horton et al., 1989) och allelbyte med användning av självmordsplasmid pSR47s (Matthews och Roy, 2000) såsom beskrivits tidigare (Silby och Levy, 2004). Två av erhållna deletionsmutanter, Pfl01_3463-66 (baser 3947327-3952129) och Pfl01_3655-59 (baser 4136447-4143889) användes för jämförelse av antibiotikaproduktion med vildtypstammen. Varje borttagning bekräftades genom PCR-analys med användning av minst en primer som glödgades utanför de regioner som användes i det alleliska utbytet för att skapa deletioner.

Analys för testning av extraktets antimikrobiella aktivitet

Extrakten av antimikrobiell förening upplöst i metanol testades med avseende på aktivitet mot hyphal tillväxt av svamparna Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum , Trichoderma harzianum och Mucor hiemalis i 12-brunnars öppna kammarplattor (Cat No. 665180 Greiner bio-one, Frickenhausen, Tyskland ) med 250 ul WA-N-agar i varje brunn. Varje brunn inokulerades på en sida med agarskivor med 6 mm diameter innehållande svamphyfer. En volym av 10 ul av extrakten sattes till sterila filterpapperskivor (Whatman No.1, Whatman, Whatman Nederland BV, Hertogenbosch, Nederländerna; 6 mm diameter) och placerades på motsatt sida av brunnarna. 12-brunnsplattorna ympades under 48 timmar vid 20 ° C och kontrollerades för svampinhibering genom att mäta hyfalförlängning. Filterpapperskivor innehållande 10 ul 50% metanol användes som kontroll.

Effekten av den / de antimikrobiella föreningarna på Bacillus sp. V102, Pedobacter sp. V48 och Brevundimonas sp. V52-tillväxten testades genom att blanda 5 ul av extrakten med 25 ul bakteriecellsuspensioner innehållande 10 celler per ml och plätera omedelbart bakteriesuspensionen på 1/10 Tryptic Soy Broth agarplattor. Plattorna inkuberades vid 20 ° C och uppräkning genomfördes efter 72 timmar. Som kontroll tillsattes 5 ul 50% metanol till de 25 pl bakteriecellsuspensionerna.

Statistisk analys

För varje experiment användes replikat: två för mikroarray-experimenten och tre för alla andra experiment. Den statistiska analysen av mikroarray-data utfördes med Array Star 2-mjukvaran för mikroarray-analys (DNASTAR).

De statistiska analyserna av bakteriell uppräkning, antagonistiska tester och qRT-PCR-data utfördes med XLStat 2010 (Addinsoft, New York, NY, USA) med användning av en två-tailed t- test, under antagande av ojämlik variation mellan datasätt. Data ansågs vara statistiskt olika vid P0, 05.

Resultat

Effekt av interspecifika interaktioner på P. fluorescenspopulationer

Antalet bakterier som hade utvecklats i de olika zonerna (B1 och B2 se tilläggsinformation Figur S1) på WA-N-agar beräknades bekräfta att konkurrerande interaktioner inträffade mellan P. fluorescens Pf0-1 och de andra stammarna. Densiteten, uttryckt som kolonibildande enheter (CFU: er), av P. fluorescens Pf0-1 i ympningszonen Bl reducerades signifikant genom närvaron av en annan bakterieart (figur la). Celltätheten för Pf0-1 påverkades mest negativt av närvaron av Bacillus- stammen. Den senare var mer riklig än P. fluorescens Pf0-1 under interaktion medan antalet P. fluorescens Pf0-1 förblev högre än de från Brevundimonas och Pedobacter- stammarna. CFU för Brevundimonas och Pedobacter monokulturer (figur 1b) var signifikant högre än CFU för Brevundimonas och Pedobacter under interaktion med P. fluorescens Pf0-1. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan CFU för Bacillus monokultur och CFU för Bacillus som interagerade med P. fluorescens Pf0-1.

( a ) Antal bakteriekolonibildande enheter (CFU) producerade under konkurrerande interaktioner av Pseudomonas fluorescens Pf-01 med andra bakterier på näringsfattig agar: Pf0-1 × Pf0-1, interaktion med P. fluorescens Pf0-1; Pf0-1 × PdV48, interaktion med Pedobacter sp. V48; Pf0-1 × BrV52, interaktion med Brevundimonas sp. V52; och Pf0-1 × Bacil, interaktion med Bacillus sp. V102. Detaljer om experimentet ges i Material och metoder. Presenterade värden är medel för tre replikat, felfält indikerar sd och olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader ( P <0, 05) i Pf0-1 CFU. ( b ) Antal bakteriella CFU: er producerade av monokulturer av Pf0-1, P. fluorescens Pf0-1; PdV48, Pedobacter sp. V48; BrV52, Brevundimonas sp. V52; och Bacil, Bacillus sp. V102. * Indikerar signifikanta skillnader i CFU mellan monokultur och interaktion med P. fluorescens Pf0-1 ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Transkriptionella svar från P. fluorescens Pf0-1 till andra bakteriearter

Svaret från P. fluorescens Pf0-1 på olika bakteriekonkurrenter studerades genom att bestämma genuttrycksprofiler. Närvaron av fylogenetiskt olika jordbakterier i fysiskt separerade zoner på näringsfattig agar orsakade många förändringar i Pf0-1-genuttrycket (tabell 2). Tillämpning av falsk upptäcktsfrekvens (Benjamini – Hochberg-metoden) och flera testkorrigeringar avslöjade att varje konkurrerande stam orsakade signifikanta ( P <0, 05) transkriptionella förändringar av två gånger eller högre; qRT-PCR-analys av 35 utvalda differentiellt uttryckta gener bekräftade mikroarray-data (data visas inte). Närvaron av Bacillus sp. orsakade det högsta antalet (571) förändringar av genuttryck. Närvaron av Pedobacter sp. och Brevundimonas sp. orsakade förändringar i uttrycket av 422 respektive 325 gener (se kompletterande informationstabeller S2, S3 och S4 för kompletta listor).

Full storlek bord

Därefter sökte vi efter vanliga transkriptionella förändringar i Pf0-1 som svar på närvaron av de tre olika konkurrerande bakteriearterna. Trots det stora antalet gener som uttrycks differentiellt i varje interaktion, var endast 42 gemensamma för alla tre interaktioner, med förmodade funktioner i energiproduktion och omvandling (åtta gener), aminosyratransport och metabolism (sex gener), signaltransduktionsmekanismer ( sex gener), oorganisk jontransport och metabolism (fyra gener), nukleotidtransport och metabolism (fyra gener) och cellmotilitet och utsöndring (tre gener) (figur 2, tabell 3).

Venn-diagram som representerar antalet differentiellt uttryckta gener i P. fluorescens Pf0-1 under interspecifika konkurrensinteraktioner. Varje cirkel representerar antalet differentiellt uttryckta gener under interspecifik konkurrensinteraktion med en enda stam: grön cirkel, interaktion med Pedobacter sp. V48 (totalt 422 gener); blå cirkel, interaktion med Brevundimonas sp. V52 (totalt 325 gener); och lätt indigo cirkel, interaktion med Bacillus sp. V102 (totalt 571 gener). Kursiv och fetstil representerar de vanliga differentiellt uttryckta generna i alla två respektive tre interaktioner.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Jämförelse av interaktioner mellan P. fluorescens Pf0-1 och Pedobacter sp. och Bacillus sp. avslöjade att uttrycket av 92 gener påverkades av båda bakterierna (43 upp- och 49 nedreglerade), medan förändringar i 71 gener (43 upp- och 28 nedreglerade) var vanliga för interaktionen med Brevundimonas sp. och Bacillus sp. Det vanliga svaret på de två gramnegativa bakterierna var emellertid mycket större (figur 2), innefattande 184 gener (87 uppreglerade och 97 nedreglerade gener; kompletterande informationstabell S5).

Jämförelse av differentiellt uttryckta gener relaterade till signaltransduktion

Under interspecies-interaktion visade sig expression av flera gener relaterade till tvåkomponents signaltransduktionssystem förändras jämfört med monokultur (tabell 4), med sex gemensamma för alla tre interaktioner.

Full storlek bord

Det högsta antalet drabbade gener relaterade till tvåkomponents signaltransduktionssystem upptäcktes under interaktionen av Pf0-1 med Bacillus sp. (31 upp- och 5 nedreglerade). Närvaron av Pedobacter sp. och Brevundimonas sp. förändrat uttryck av 16 respektive 15 gener relaterade till tvåkomponents signaltransduktionssystem. Men bara sju av dessa var vanliga för båda interaktioner.

Differentialuttryck av ribosomala proteiner och fagrelaterade gener

I alla tre interaktioner observerades differentiell expression av gener som kodar ribosomala proteiner. Under interaktioner med Pedobacter sp. och Brevundimonas sp., en nästan identisk uppsättning av ribosomala proteingener visade förändrat uttryck, med liknande riktningar (uppreglering och nedreglering). Interaktionen med Bacillus sp. ledde till nedreglering av 13 ribosomala proteingener, varav endast två sågs i andra interaktioner (kompletterande informationsdiagram S2).

Under interaktionen med Bacillus sp. Noterades ökat uttryck av fagrelaterade gener. I synnerhet höjdes uttrycket av varje gen (bortsett från Pfl01_1136 och 1163) i den förmodade profetregionen Pfl01_1136 till Pfl01_1173 i intervallet 2.1–8.5, med det mesta av uttrycket ökat med minst fyrfaldigt (alla uppreglerade fagrelaterade gener indikeras med fetstil i tilläggstabell S2 i tilläggsinformation). Ingen av dessa förmodade profagener upp- eller nedreglerades under interaktionen med Brevundimonas sp. och Pedobacter sp.

Interspecies-interaktioner inducerar gener involverade i produktion av antimikrobiell förening i P. fluorescens Pf0-1

Under interaktion med Pedobacter sp. och Brevundimonas sp. flera gener uppreglerades i Pf0-1, vilket kan vara involverat i valin, leucin och isoleucin nedbrytningsväg. Två genkluster inom denna väg, Pfl01_3463-3466 och Pfl01_3655-59, beskrivs i figur 3. Genklusteret Pfl01_3463-3466 kan koda för komponenter i det förgrenade a-ketosyradehydrogenaskomplexet. I Streptomyces avermitilis är en grenad α-ketosyra-dehydrogenas-genkluster väsentlig för syntes av polyketid-ryggraden (Denoya, 1995; Yoon et al., 2004). Dessutom visades det att grenade aminosyror kan fungera som föregångare för typ II-polyketidsyntes genom vägar som är beroende av näringsämnen (Stirrett et al., 2009). Uppregleringen av detta genkluster observerades endast i Pf0-1-interaktioner med Brevundimonas och Pedobacter , men inte med Bacillus .

Grafisk representation av genkluster borttagna i icke-antibiotikaproducerande mutanter. ( a ) Pfl01_3463-3466 (Pfl01_3463 och Pfl01_3464, två förgrenade a-ketosyra-dehydrogenas El-komponenter; Pfl01_3465, grenad kedja a-keto-syradehydrogenas-subenhet E2; och Pfl01_3466, dihydrolipoamid-dehydrogenas). ( b ) Pfl01_3655-3659 (Pfl01_3655, AMP-bindande domänprotein; Pfl01_3656, isovaleryl-CoA-dehydrogenas; Pfl01_3657, propionyl-CoA-karboxylas; Pfl01_3658, y-karboxigeranoyl-CoA-hydratas; och Pfl01_c-karboxyl-metyl-karboxyl-3-metyl-3-metyl-3-metyl ). I båda panelerna indikerar streckade linjer det raderade området och siffrorna i rutorna avser nukleotidpositionen i Pf0-1-genomet.

Bild i full storlek

Rollen för uppreglerade grenade aminosyragraderingsgener i produktionen av antimikrobiell förening

Det första steget för att bestämma om antimikrobiella föreningar produceras av Pf0-1 under interaktioner med de konkurrerande bakterierna som är involverade i organiska extraktioner av agaren som omger Pf0-1 när de konfronteras med var och en av de tre bakteriestammarna, följt av analyser där de antimikrobiella effekterna av extrakten testades. Tätheterna för Pedobacter , Brevundimonas och Bacillus reducerades verkligen när de utsattes för extraktet erhållet från P. fluorescens Pf0-1 kokt med Pedobacter relativt extraktet från Pf0-1 monokultur (figur 4a). Därefter undersökte vi om den / de antimikrobiella föreningar som producerades under interaktionen av Pf0-1 med Pedobacter också hade aktivitet mot markburen saprofytiska och patogena svampar. Aktivitetsbioanalyser visade att extraktet hämmar mycelial tillväxt av flera svampar, inklusive Rhizoctonia solani, Mucor hiemalis och Trichoderma harzianum (figur 4b). Ingen sådan hämmande effekt observerades för extraktet producerat av Pf0-1 under interaktionen med Bacillus (figur 4c).

( a ) Effekt av extrakt från P. fluorescens Pf0-1-zoner på bakterietillväxt: Bacill, Bacillus sp. V102; BrV52, Brevundimonas sp. V52; och PdV48, Pedobacter sp. V48. Kontroll, extrakt från P. fluorescens Pf0-1 monokultur; Antimikrobiellt extrakt, extrakt från P. fluorescens Pf0-1-zon under interaktion med Pedobacter sp. V48. * Indikerar signifikanta skillnader inom kolonnpar ( P <0, 05). (Kompletterande figur 4) ( b ) Effekt av extrakt från P. fluorescens Pf0-1-zoner på tillväxt av svampar i, Rhizoctonia solani ; ii, Mucor hiemalis ; iii, Trichoderma harzianum . C, kontrollextrakt från P. fluorescens Pf0-1 monokultur; M, 50% metanol; och E, extrakt från P. fluorescens Pf0-1-zon under interaktion med Pedobacter sp. V48. ( c ) Effekt av extrakt från P. fluorescens Pf0-1-zoner på R. solani. C, kontroll 50% metanol; 1, extrakt från Pf0-1 monokultur; 2, extrakt från Pf0-1 som interagerar med Bacillus sp. V102; och 3, extrakt från Pf0-1 som interagerar med Pedobacter sp. V48.

Bild i full storlek

För att bestämma huruvida de uppreglerade generna i Pfl01_3463-3466 och Pfl01_3655-3659 kluster verkligen är involverade i produktionen av den observerade antimikrobiella aktiviteten raderades var och en av de två genklusterna i Pf0-1 genom platsriktad mutagenes (tabell 1 och figur 3). I motsats till extrakten erhållna från vildtypstammen Pf0-1 vid interaktion med Pedobacter , uppvisade inte extrakten från deletionsmutanterna Δ3463-66 och Δ3655-59 under samma interaktionsbetingelser aktivitet mot R. solani (figur 5). Efterföljande analys av dessa extrakt med högtrycksvätskekromatografi visade frånvaron av minst tre specifika toppar i extrakt av mutanterna som var närvarande i extrakt av vildtypstammen (kompletterande informationsfigur S3). Högtrycksvätskekromatografianalys följt av fotodiodesystemanalys av kromatogrammen (288 nm) visade vidare mycket likartade metabolitmönster för P. fluorescens Pf0-1-extrakt när kokt med odling av Pedobacter eller Brevundimonas . Däremot var metabolitmönstret för extrakt erhållna från P. fluorescens Pf0-1 samkulturerat med Bacillus annorlunda från det från extrakt erhållna från Pf0-1 som interagerar med de andra två stammarna (kompletterande informationsfigur S3). Metabolitprofilerna för alla extrakt skilde sig också från de som erhölls från kontrollextraktet, det vill säga extrakt erhållet från Pf0-1 monokultur.

Antagonistanalys mot Rhizoctonia solani med extrakt från: 1, P. fluorescens Pf0-1 monokultur; 2, P. fluorescens Pf0-1 interagerar med R. solani ; 3, P. fluorescens Pf0-1 interagerar med Pedobacter sp.V48; 4, P. fluorescens Pf0-1 -3655 interagerar med Pedobacter sp.V48; 5, P. fluorescens Pf0-1 - 3463 interagerar med Pedobacter sp.V48; och C, kontrollera 50% metanol.

Bild i full storlek

Diskussion

I jord- och rhizosfärmiljöer existerar Pseudomonas- arter tillsammans med många andra bakterier. Flera av dessa arter tävlar om samma ekologiska nisch- och näringsresurser (Demoling et al., 2007). Därför är förmågan att hantera förekomsten av en rad konkurrerande mikrobiella arter avgörande för tillväxt och överlevnad i jordens ekosystem. Resultaten av denna studie visade att identiteten hos den konkurrerande bakterien är en viktig bestämning för beteendemässigt och genetiskt svar hos P. fluorescens Pf0-1. Genomfattande mikroarrayanalyser avslöjade ett specifikt transkriptionellt svar från Pf0-1 till varje konkurrent eftersom endast en liten procentandel av de differentiellt uttryckta generna var vanliga för alla tre interaktioner. Både Brevundimonas och Pedobacter , men inte Bacillus , inducerade produktionen av antimikrobiella metaboliter i P. fluorescens Pf0-1, vilket ytterligare stödde den specifika karaktären av responsen från P. fluorescens Pf0-1 till olika konkurrenter.

De flesta bakterier, inklusive Pseudomonads, har tvåkomponents signaltransduktionssystem som hjälper dem att anpassa sig till fluktuerande miljöförhållanden (Gao et al., 2007). Uttrycket av flera P. fluorescens Pf0-1-gener involverade i tvåkomponent signaltransduktion ökade under interspecifik interaktion. Detta antyder ett adaptivt svar från P. fluorescens Pf0-1 på närvaron av icke-relaterade mikroorganismer. Bland de tvåkomponentreglerande generna som signifikant uppreglerades i alla tre interaktioner var den regulatoriska genen Pfl01_1534. Denna gen är en ortolog för fleR i P. aeruginosa , som är en regulator för gener för flagellabiologisk genos, kemotaxis, fimbrial biogenes och flera gener som är annoterade som 'hypotetiska' (Dasgupta et al., 2003). Förhöjd expression av denna regulator kan antyda att rörlighet och / eller kemotaxi är viktiga och allmänna komponenter i P. fluorescens- svaret på andra bakterier. Till skillnad från Pfl01_1534 var de flesta av de uttryckligt uttryckta "signaltransduktionsgenerna" specifika för en viss interaktion (endast sex var vanliga bland de tre interaktioner som studerats), vilket antyder att varje konkurrerande bakterieart kan producera specifika ledtrådar som uppfattas av P. fluorescens Pf0- 1, utlöser specifika svar utöver allmänna svar. Vid jämförelse av transkriptionella svar från P. fluorescens Pf0-1 med närvaron av de olika konkurrerande stammarna, hittades den högsta likheten för de två Gram-negativa bakterierna Brevundimonas och Pedobacter. Detta var fallet för alla gener inklusive de som var relaterade till tvåkomponents signaltransduktionssystem. Huruvida de Gram-negativa bakterierna som testades i denna studie uppvisar en högre grad av överlappning i specifika signaler jämfört med de som producerats av den Gram-positiva Bacillus- stammen återstår att testa.

De konkurrerande stammarna hade också specifika effekter på Pf0-1-gener som kodar ribosomala proteiner. Under interaktionen med Brevundimonas och Pedobacter, upp- eller nedreglerades en nästan identisk uppsättning ribosomala proteiner, medan endast nedreglerade ribosomala proteiner hittades under interaktionen med Bacillus (tilläggsinformation figur S2). Ribosomal proteins may have various functions apart from ribosome and protein synthesis (Wool, 1996). Downregulation of ribosomal proteins has been linked to various stress responses as well to a decrease of cellular growth (Ishige et al., 2003; Stintzi, 2003; Silberbach and Burkovski, 2006). Moreover, de Carvalho et al. (2010) recently reported antimicrobial activities of ribosomal proteins.

Growth of P. fluorescens Pf0-1 was most strongly reduced when confronted with Bacillus . Apart from the downregulation of ribosomal proteins also other stress-related genes were differentially regulated, such as the prophage genes in the cluster Pfl01_1136 to Pfl01_1173. This prophage region carries two genes annotated as Pyocin R2_PP, holin (Pfl01_1137) and Pyocin R2_PP, lytic enzyme (Pfl01_1172), which may be related to pyocin biosynthesis. Pyocins are proteinaceous, narrow-spectrum antibacterial bacteriocins that are generally effective against closely related species. Whether this prophage region is functional or degenerated in Pf0-1 is not known, but the induction of nearly all genes in this region during the interaction with Bacillus may be an indication of a response to a particular stress factor not encountered by Pf0-1 in the other two interactions. Prophage induction after exposure to DNA-damage-causing agents, oxidative stress, or to other stress factors like antibiotic treatment, heat and starvation has been well documented (Frye et al., 2005; Garcia-Russell et al., 2009), leading to our suggestion that Bacillus induces a specific stress response in Pf0-1.

Organic extracts contained antimicrobial activity when isolated from cultures where P. fluorescens Pf0-1 was interacting with Brevundimonas or Pedobacter , but not Bacillus . The observation that antibiotic production is only triggered during interspecific interactions suggests a cost-effective strategy whereby the antibiotic is produced only when needed, or a strategy to avoid adaptation of competitors to the antibiotic (Garbeva and de Boer, 2009). Evidence that gene clusters Pfl01_3463-66 and Pfl01_3655-59 are indeed involved in the production of an antimicrobial compound was obtained by site-directed mutagenesis followed by activity bioassays. A strain carrying a deletion of these gene clusters did not show antimicrobial activity when confronted with Pedobacter sp. or Brevundimonas sp. In addition, high pressure liquid chromatography analysis confirmed that the mutants Pfl01_Δ3463-66 and Pfl01_3655-59 are defective in the production of compound(s) specifically induced in the wild-type strain when cocultured with Pedobacter or Brevundimonas . The nature and identity of these antimicrobial compound(s) produced by P. fluorescens Pf0-1 are not yet known and will require large-scale extractions, purifications and extensive analytical-chemical analyses (for example, liquid chromatography-mass spectrometry and nuclear magnetic resonance). The observed inhibition of both bacterial and fungal growth suggests that these antimicrobial compound(s) produced by P. fluorescens Pf0-1 can be effective in competitive interactions with many different bacterial and fungal species. It is interesting to note that the antibiotic compound(s) were not produced by P. fluorescens Pf0-1 during confrontation with the Bacillus strain even though growth of Bacillus is affected when exposed to the extracted ccompound(s). This could point to the absence of appropriate cues produced by Bacillus to induce production of the antimicrobial compound(s) by Pf0-1 or to deregulation of its production.

This study did not reveal information on the identity of the cues that trigger the specific differential gene expression observed for P. fluorescens Pf0-1. However, these cues should either be diffusible or volatile metabolites as the differential expression occurred without direct cell–cell contact of P. fluorescens Pf0-1 with the competing strains. In an additional experiment (data not shown), a range of reporter constructs (responding to different N -Acyl Homoserine Lactones, Autoinducer-2 family compounds, or Diffusible Signal Factor compounds) were tested to resolve the putative nature of the signals produced by the interacting bacteria. Brevundimonas sp. was capable of triggering a positive response in a bioreporter strain that detects production of the Diffusible Signal Factor signal 2-dodecenoic acid. P. fluorescens Pf0-1 itself cannot produce Diffusible Signal Factor, but has the gene for perception (Pfl01_3253). Neither Pedobacter sp. nor Bacillus sp. stimulated a response from any of the tested bioreporters (unpublished data). This is again pointing at specificity in the response of P. fluorescens Pf0-1 to different competitors.

In the present work, we studied the response of P. fluorescens Pf0-1 to different bacterial competitors in a one-to-one confrontation. However, in natural environmental settings bacteria are likely to encounter several different competitors at the same time or in sequential events. In such situations, the production of a broad-spectrum antibiotic may be a beneficial strategy for Pf0-1 as it will target diverse competitors. It is even plausible that superior competitors, like Bacillus in the current study, can be inhibited by the antibiotic when it is triggered by another species in a microbial consortium. In this study, we investigated bacteria–bacteria interactions using an agar plate model system. Although these assays are somewhat artificial, they do allow an in-depth analysis of fundamental mechanisms and genes underlying microbial interactions. In addition, the experiments were performed under carbon-limiting conditions, which to some extent mimics the situation in most soils (Demoling et al, 2007; Rousk and Baath, 2007).

It is interesting to note that several of the differentially expressed genes during the inter-specific interactions have an unknown function. Some of these so-called orphan or cryptic genes are commonly found in all three interactions. For example, gene Pfl_1702 encodes a protein of unknown function (DUF989) that is upregulated in all three interactions. A related gene was also previously reported to be upregulated during inter-specific interactions in Pseudomonas sp. A21 (Garbeva and de Boer, 2009). Although our experiments did not reveal the functions nor the products of these genes, they do suggest that these genes have a role in the response to other microbes. It will be interesting in a further study to determine the precise function of such genes in bacterial interactions.

In summary, our results demonstrate that P. fluorescens Pf0-1 shows a species-specific transcriptional and metabolic response to bacterial competitors, which may provide new leads in the identification of specific cues in bacteria–bacteria interactions and of novel competitive strategies, antimicrobial traits and genes.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Supplementary Figure S1

  2. 2.

    Supplementary Figure S2

  3. 3.

    Supplementary Figure S3

  4. 4.

    Supplementary Figure S4

  5. 5.

    Supplementary Figures Legends

  6. 6.

    Supplementary Table S1

  7. 7.

    Supplementary Table S2

  8. 8.

    Supplementary Table S3

  9. 9.

    Supplementary Table S4

  10. 10.

    Supplementary Table S5

    Supplementary Information accompanies the paper on The ISME Journal website (//www.nature.com/ismej)