Spåra rörelser med 3d-picometer i enstaka nanopartiklar med elektroniska sonder med hög energi | vetenskapliga rapporter

Spåra rörelser med 3d-picometer i enstaka nanopartiklar med elektroniska sonder med hög energi | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Karakterisering och analytiska tekniker
  • Bildtekniker
  • nanometro
  • nano~~POS=TRUNC

Abstrakt

Vi observerade den höga hastigheten anisotropisk rörelse av en individuell guld nanopartikel i 3D på picometerskala med hjälp av en högenergi elektron sond. Diffraherad elektronspårning (DET) med användning av elektron-back-scattered diffraction (EBSD) -mönster av märkta nanopartiklar under våt-SEM gjorde det möjligt för oss att mäta den tidsupplösta 3D-rörelsen hos enskilda nanopartiklar under vattenhaltiga förhållanden. De mycket exakta DET-data motsvarade 3D-anisotropa log-normala gaussiska fördelningar över tid på millisekundskalan.

Introduktion

Enkelmolekylobservationstekniker med användning av fluorescerande prover med synlig våglängd är värdefulla för att besvara många grundläggande och viktiga frågor inom biologi och biofysik eftersom de tillhandahåller positionsinformationen för enstaka molekyler med noggrannhet långt över den optiska diffraktionsgränsen för halvvåglängden. De kan ge den centrala positionsinformationen för märkta molekyler med en noggrannhet av ungefär λ / 100 1, 2 . Genom att använda liknande spårningstekniker med röntgenstråle (λ ≈ 0, 1 nm) sonder har vi tidigare observerat picometerskala (λ / 100) Browniska rörelser av enskilda proteinmolekyler kopplade till guld nanokristaller 3 . Detta system för enmolekylobservation kallas diffrakterad röntgenspårning (DXT) 4 . I denna studie, i stället för att använda röntgenstrålar, använde vi elektronprober för att förbättra denna teknik för att utveckla ett laboratorieskaligt detektionssystem med en molekyl.

Våtscanningselektronmikroskopi (våt SEM) har nyligen använts för att undersöka cytoplasma hos hela celler med användning av en tunn membranpartition som skyddar provet från högvakuumförhållanden. Denna metod gör att bilder av levande celler kan tas med liten upplösningsförlust jämfört med standard SEM. Våt SEM kan också upptäcka den interna rörelsen för proteinmolekyldomäner i vattenhaltiga lösningar på sub-Angstrom-skalan med höga hastigheter för bildförvärv 5, 6 .

Eftersom guld-nanopartiklar är mycket elektronstäta är de idealiska för både transmissionselektronmikroskopi (TEM) och SEM. Kolloidalt guld har erkänts som en utmärkt markör för användning i cellbiologi och materialvetenskapstudier 7 . DXT möjliggör direkt observation av enskilda biomolekyler i realtid och i realrum 8, 9, 10 .

Figur 1 (a) visar arrangemanget av vårt nya dynamiska detekteringssystem med en molekyl. Vårt system använder våt SEM och tidsupplöst elektronbakspridningsdiffraktion (EBSD) från märkta guld nanopartiklar. Vi hänvisar till vår nya bildteknik som diffraherad elektronspårning (DET). En tvärsnittsvy av den våta cellen som används för DET visas i figur 1 (b). Vi kan mäta dynamiken hos både det övre skiktet av det adsorberade polymerreagenset och den märkta guld-nanopartikeln. Som ett preliminärt experiment adsorberades guld-nanokristaller direkt till kolytan för mätning med DET. Som ett resultat observerade vi inte förändringar i GET-nanokristall DET-data över tid. Snarare mätte vi i detta fall rörelsen hos beläggningspolymeren, som dikterade nanokristallrörelsen. Figur S1 visar en förstorad bild av ett provtvärsnitt. Eftersom guld-nanokristaller är något större (diameter = 40 nm), representerar deras rörelser inte enskilda enstaka molekylrörelser, utan anger snarare de genomsnittliga rörelserna för beläggningspolymerens nanoskala-domäner.

(a) Begreppsdiagram över Diffracted Electron Tracking (DET). Detta är arrangemanget av vårt nya dynamiska enstaka molekylära detekteringssystem med det tidsupplösta EBSD-mönstret från de märkta guld-nanopartiklarna på beläggningspolymerfilmen med våt-SEM. DET kan observera dynamiska 3D-rörelser för de märkta guld-nanopartiklarna i vakuumet och vattenhaltiga lösningar med millisekunders tidsskala. Längsriktning (LD), tvärriktning (TD) och en normal riktning (ND) tilldelas orienteringsrepresentation i guldgitter från EBSD. (b) Tvärsnittsvyen av våtcellen för DET-observationer. I detta fall kan vi observera de dynamiska rörelserna (varje pil) i beläggningspolymerfilm (gul) och märkt guld nanopartikel (vit). Eftersom 3D-dynamiken i den märkta guld-nanopartikel mäts utifrån EBSD-mönstret från den märkta nanopartikeln, kan vi extrapolera 3D-rörelse av det översta lagret i den adsorberade polymerfilmen. Här betyder vakuumtillståndet att ett vattenskikt inte finns i en cell. (c) Typiskt EBSD-mönster från guld-nanopartiklar (diameterstorlek = 40 nm) under vattenlösningen under den uppgraderade tiden på 60 ms. Eftersom ytkristalliniteten hos guldnanopartikeln är mycket bra, kan EBSD detektera guldnanopartiklar på kort integrerad tid från den vattenhaltiga lösningen. DET blir en stark fördel jämfört med DXT när man beaktar storleken och bekvämligheten som följer med en marknadsförd nanopartikelsond.

Bild i full storlek

Eftersom DXT använder röntgenstrålar kräver det en perfekt kristall. För DXT är det därför viktigt att använda guld nanokristaller istället för guld nanopartiklar (kolloidalt guld). Vi kan dock använda kommersiellt tillgängliga guld-nanopartiklar för DET eftersom elektronproben är känslig för deras ytstruktur. Vi bekräftade från elektrondiffraktionsdata att ytkristalliniteten hos guldnanopartiklarna var mycket bra. Såsom visas i figur 1 (c) kan EBSD-mönster för guld-nanopartiklar erhållas med en integrationstid på endast 60 ms.

DET-datainsamling är en enkel process. Först kontrollerar vi positionerna för den adsorberade guld-nanopartikeln med hjälp av SEM, som visas i figur 2. Därefter samlar vi in ​​tidslösta EBSD-mätningar. Riktningen för varje EBSD-mätning bestäms i tre dimensioner för varje tidpunkt. Orienteringsförskjutningarna vid varje tidpunkt kan erhållas genom att jämföra skillnader i EBSD från det första kristallografiska orienteringsmönstret.

DET-dataproceduren är en enkel process. (1) Först kontrollerar vi positionerna för den adsorberade guld-nanopartikeln med SEM. Individuell guld nanopartikel väljs i SEM-bilden. (2) Därefter samlar vi in ​​tidslösta EBSD-mätningar från den enskilda guld nanopartikeln. (3) Riktningen för varje EBSD-mätning bestäms i tre dimensioner för varje tidpunkt. Endast när CI (Confidence index) -värdet är 0, 2 eller mer, har vi räknat som DET-data. (4) Orienteringsförskjutningarna vid varje tidpunkt kan erhållas genom att jämföra skillnader i EBSD från det kristallografiska orienteringsmönstret framför en. I varje data dras det från uppgifterna framför en för att göra förskjutning. Dessa DET-förskjutningsdata uttrycks som spårningsdata (till exempel fig. 3), eller en statistisk behandling utförs såsom visas i fig. 4, 5 och 6).

Bild i full storlek

Resultat

3D-rörelserna (eller 3-axlarna) för enskilda adsorberade guld-nanopartiklar i ett vakuum visas i figur 3 (a). Rotationsrörelserna runt ß-axeln var något mindre än rotationsrörelserna runt α- och γ-axlarna. I vakuumet var rotationsrörelsens hastigheter runt a- och y-axlarna cirka 0, 05 rad / s.

(a) 3D-tidsupplöst spårning av de individuella märkta guld-nanopartiklarna på beläggningspolymerfilmen under vakuumförhållanden med a-, p- och y-axlar. (b) 3D-tidsupplösta rörelser av den märkta guld-nanopartikeln på beläggningspolymerfilmen i vattenhaltiga lösningar med a-, p- och y-axlar.

Bild i full storlek

3D-rörelsesdata för vattenlösningar visas i figur 3 (b). Browns rörelse hos de adsorberade guld-nanopartiklarna i vatten var mycket mer energisk än under vakuum. Rotationsrörelserna runt var och en av de 3 axlarna var i samma ordning. I vatten var rotationsrörelsens hastigheter runt α- och ß-axlarna cirka 0, 55 rad / s.

För att förstå rörelsen under vakuum och i lösning, analyserade och karaktäriserade vi slumpmässiga förskjutningar av enskilda guld nanopartiklar. Fördelningen av förskjutningsmätningarna som observerats med användning av ett 600 ms (tio 60 ms ramar) tidsintervall visas i figur 4 (a). Som visas i figur 4 (b) kan de lognormala fördelningarna karakteriseras av medelvärdet (μ) och standardavvikelsen (σ) för den symmetriska normala Gaussiska sannolikheten som uppnås när förskjutningarna är ritade på logaritmiska skalor 11 . Vi bekräftade att de log-normala fördelningarna var liknande vid olika tidsintervall (från 2 till 20 ramar).

(a) 3D-fördelningarna av de observerade förskjutningarna med 600 ms (= Δ10 ram) som tidsintervall. (b) En symmetrisk normal Gauss-fördelning med logaxlar kan användas för att karakterisera dessa log-normala fördelningar. Dessa fördelningar kännetecknas vanligen i termer av de logtransformerade förskjutningarna, med hjälp av medelvärdet, μ för dess distribution och standardavvikelsen, σ. Vi bekräftade att log-normalfördelningen gällde för många olika tidsintervall.

Bild i full storlek

Vi bestämde μ- och σ-värdena från våra fördelningar genom att anpassa de statistiska parametrarna med en Gauss-funktion som visas i figur 4 (b). Minsta värdet på μ under vakuum tilldelades ß-axeln. Detta innebär att under vakuumförhållanden var de totala rörelserna för guld-nanopartiklarna roterande, vilket således definierade den centrala axeln som LD-axeln (Fig. 1 (a)).

Nanopartikelrörelserna i vattenhaltiga lösningar var 5–7 gånger större än i vakuum. Vi kan anta att denna förbättrade rörelse berodde på kollisioner mellan vattenmolekylerna och guld-nanopartiklarna. Minsta värdet på μ under vattenförhållanden tilldelades γ-axeln. Detta innebär att under vattenförhållanden var de totala guldens nanopartikelrörelser roterande, vilket således definierade den centrala axeln som ND-axeln (Fig. 1 (a)).

Eftersom vi observerade rotation av p-axeln runt LD-axeln under vakuum räknades de dynamiska data från de observerade EBSD-mönstren som små p-rörelser. Rörelsekorrelationerna mellan de andra två axlarna (α och γ) ger tvådimensionella histogram (fig. 5). I figur 5 (a) ser vi från de tre korrelationskoefficienterna att ß-axeln under vakuumförhållanden är oberoende och har lägre rörlighet.

(a) och (b) 2D-korrelationshistogram och värdet på varje korrelationsfaktor (röd). Från de tre korrelationskoefficienterna för betingelser under vakuum kan vi se att ß-axeln har en unik oberoende rörlighetskarakteristik. I vattenlösningar kan vi se att y-axeln har en unik oberoende rörlighetskarakteristik. Varje inre axel innebär att våra observerade rotationsrörelser från EBSD-mönster ändrades till värdena för översättningsrörelser i beläggningspolymerytan. Enheten som för närvarande används är längden (Angstrom) till en ram (Angstrom / f). Det antas att polymerövningar i styv kropp vid denna tidpunkt. (c) 3D-histogram för den observerade förskjutningen med 600 ms (= =10 ram) som tidsintervall. Observationerna av 3D-orienteringsrörelser i en märkt nanopartikel kan realiseras med superhög känslighet.

Bild i full storlek

Rörelseegenskaperna i vattenhaltiga lösningar kan härledas från de tvådimensionella histogrammen som visas i figur 5 (b). Även om det inte är klart för vattenhaltiga förhållanden, innebär de tre korrelationskoefficienterna att den oberoende lägre rörligheten är närvarande i rotationsrörelsen runt y-axeln. Som visas i figur 5 (b) är det tydligt att båda y-riktningskoefficienterna är relativt små.

Diskussion

För att karaktärisera den bruna rörelsen använde vi diagram över medelkvadratförskjutningen (MSD) mot tidsintervallet. Figurerna 6 (a) och 6 (b) visar MSD-kurvorna för de observerade guld-nanopartiklarna som en funktion av tidsintervallet under t under vakuum och i lösning. För enkel brownisk diffusion är MSD-plotterna linjära med en lutning på 4 D , där D är diffusionskoefficienten. Dessa paraboliska MSD-diagram är emellertid en indikation på riktad diffusion 2 . Dessa data visar att guld nanopartiklar rör sig med en konstant drivhastighet v med en diffusionskoefficient D 12 . Men vi är bara bekymrade över storleken på D. Under vakuum uppstår de minsta rotationsrörelserna runt ß-axeln (Fig. 6 (a)). Under vattenförhållanden uppträder de minsta rotationsrörelserna runt y-axeln (Fig. 6 (b)).

MSD-kurvorna för den observerade guld-nanopartikeln som en funktion av tidsintervallet undert under två förhållanden (under vakuum (a) och i lösning (b)).

Bild i full storlek

Vi funderade också på varför de dynamiska rörelserna skilde sig åt mellan vakuum och vattenförhållanden. Figur 1 (b) visar arrangemanget av elektronstrålspositionen och en adsorberad guld-nanopartikel. Under vakuum inducerades små anisotropa rörelser av guld-nanopartiklarna av skillnaden mellan den primära elektronstrålens position och mitten av guld-nanopartikeln. Dessa anisotropa rörelser döljs av rörelser som uppstår på grund av kollisioner mellan vattenmolekyler och guld nanopartiklar. Dessa kollisioner förklarar också varför de adsorberade guld-nanopartikelrörelserna i vattenhaltiga lösningar är 5–7 gånger större än under vakuum. Dessutom är det uppenbart att stycket i det adsorberade polymerskiktet är helt annorlunda beroende på om det är under vakuum eller i en vattenlösning. Som ett resultat observerades isotropa 3D-rörelser av de adsorberade nanopartiklarna i vattenhaltiga lösningar.

Den rotationsrörelse som observerats av DET kan omvandlas till translationell rörelse genom att göra vissa antaganden, såsom visas i figur 7. Figur 1 (b) visar tvärsnittsvyen av DET-provet. De roterande guldens nanopartikelrörelser återspeglas direkt i EBSD-data. Om det adsorberade polymerskiktet på den tunna kolfilmen (dvs skiktet från silankopplingsmedlet) är styvt kan det överföra de lokala translationella rörelserna från den övre ytan av polymerfilmen, som visas med den gula pilen i figur 1 ( b). De överförda rörelsesbredderna visas i figurerna 5 (a) och 5 (b). Exempelvis är rörelsesområdet mellan 50 picometers per ram och 5 nanometer per frame. Eftersom detektionsgränsen för DET är ungefär 1, 0 mrad, uppskattar vi att de minsta detekterbara rörelserna för polymer- och guld-nanopartiklarna var mellan 10 och 50 bildpunkter.

Det är en utvidgning av vårt DET-prov. Den detekterade rotationsrörelsen kan ändras och betraktas som översättningsrörelse.

Bild i full storlek

DET kunde detektera den anisotropa rörelsen runt LD-axeln under vakuumförhållanden. Skillnaden i rörelseriktningen bekräftades från den anisotropa rörelsefördelningen i området 0, 1 till 5, 0 Å, såsom visas i figur 5 (a). DET tillät oss att för första gången mäta den känsliga förflyttningen av en adsorberad nanopartikel upphetsad av en elektronsond. Denna rörelse var inte från provskador av elektronstrålen. Den totala tjockleken på silankopplingsmedlet mellan den adsorberade guld-nanopartikeln och ytan på kolfilmen var ungefär 100 Å, därför kan de små förskjutningarna i området 0, 1 till 5, 0 Å inte tillskrivas skada.

Vi kunde samla in tidsupplösta, 3D, superexakta (picometerskala) rörelsespårningsdata på enstaka nanopartiklar under vakuum och i lösning med våta SEM- och EBSD-mönster. Vi mätte också lite upphetsade anisotropa rörelser från interaktioner mellan individuella guld-nanopartiklar (diameter = 40 nm) och den högenergiska elektronproben (30 keV). Denna ovanliga rörelse var så liten att den doldes av brownisk rörelse. Eftersom elektronstrålen som används för DET har en kort våglängd kan 3D-orienteringen för de märkta nanopartiklarna bestämmas med superhög känslighet, som visas i figur 8. När en guld-nanopartikel är kopplad till en enda proteinmolekyl (som i DXT), ett tidsupplöst, mycket noggrant, detekteringssystem med en molekyl som använder en elektronstråle kan produceras med användning av normal laboratorie-stor utrustning (SEM-utrustning), utan behov av en mycket stark röntgenstrålekälla som SPring-8, ESRF- eller APS-strecklinjer.

Figur 4 är lika med projektionerna till planet för detta 3D-histogram.

Bild i full storlek

metoder

Provberedningar för våt -SEM (DET)

En miljöcell (EC) för SEM designades för att observera prover i vattenmiljöer. EC monterades från ett speciellt trisslitsgitter (3 mm 2, 0, 2 mm tjockt) och en O-ring (innerdiameter 2, 0 mm, tjocklek 0, 45 mm) längst upp på EC-hållaren. Rutnätet utformades för att användas för DET i en 70 graders vinkel, såsom visas i figur 1 (b). Rasterna (0, 1 × 0, 3 mm) på rutnätet täcktes med en tunn koltätningsfilm (15–20 nm tjock) för att förhindra vätska eller gasläckage från EC. Ytan på koltätningsfilmen på rutnätet belades med merkaptosilanreagens (KBM-803, Shinetsu silikon, Japan) med användning av en ångavsättningsmetod (fig 1 (b)). En lösning innehållande 40 nm kolloidalt guld (Polyscience, USA) inkuberades på koltätningsfilmen under 1 timme före tvättning med destillerat vatten. För vattenhaltiga observationer gjordes nätet hydrofilt genom en glödutsläppsbehandling (HDT-400, JEOL, Japan). En volym av 200 nl avgasat destillerat vatten placerades sedan på koltätningsfilmen som uppbär det kolloidala guldet. Överskott av vatten avlägsnades genom att vika med filterpapper. Slutligen inneslutes cirka 50 till 100 nanoliters avgasat vatten i EG.

Mätvillkor för DET

För SEM-studier använde vi ett JSM-7001F-system (JEOL, Japan) utrustat med en Schottky-fältemissionselektronpistol. För att upptäcka EBSP-signalen använde vi en 30 kV accelerationsspänning, en 87 pA strålström och 17 mm arbetsavstånd i en 70-graders vinkel relativt EC-provsteget. EBSD-detektorn på JSM-7001F-systemet designades av TSL Solutions (DVC1412-FW-T1-EX, TSL, Japan). Detektorn inkluderade en bildförstärkare (V8070U-74, Hamamatsu Photonics, Japan), såsom visas i figur S2, vilket gav tio gånger högre intensitet än en normal detektor. Vi kunde inte få tydliga EBSD-data utan bildförstärkaren. Figur 2 visar spårning av de märkta guld-nanopartiklarna på polymersubstrat under vakuum och i lösning. För att mäta kristallorienteringen av guldnanopartiklarna erhölls EBSD-mönster från 1, 5 sek elektronstrålningsbestrålning vid en fast observationspunkt. EBSD-mönstret erhölls på fosforskärmen på detektorn, intensifierades och inspelades med en CCD-kamera med användning av en slutartid på 60 ms. Euler-vinklarna erhölls från EBSD-mönstren med användning av OIM-datainsamlingsprogramvara (EDAX, USA). Euler-vinklarna indikerar rotationsförhållandet mellan provstegskoordinatsystemet och kristallgitterkoordinatsystemet i det kolloidala guldet. Rotationsvinklarna a, P och y i de viktigaste grindvektorerna för nanopartikel beräknades mellan angränsande ramar från Euler-vinklarna, såsom visas i figur 1 (a).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande information

    Biograf1

  2. 2.

    Kompletterande information

    Biograf2

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.