Termodynamik av proteindenaturering vid temperaturer över 100 ° C: cuta1-mutanta proteiner substituerade med hydrofoba och laddade rester | vetenskapliga rapporter

Termodynamik av proteindenaturering vid temperaturer över 100 ° C: cuta1-mutanta proteiner substituerade med hydrofoba och laddade rester | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Proteinvikning
  • Termodynamik

Abstrakt

Även om termodynamiken för proteindenaturering vid temperaturer över 100 ° C är väsentlig för den rationella utformningen av mycket stabila proteiner, förstås det inte väl på grund av de tillhörande tekniska svårigheterna. Vi designade vissa hydrofoba mutantproteiner av CutA1 från Escherichia coli , som har denatureringstemperaturer ( Td ) som sträcker sig från 101 till 113 ° C och visar en reversibel värme denaturering. Med hjälp av en hydrofob mutant som mall utformade vi framgångsrikt ett hypertermostabelt mutantprotein ( Td = 137 ° C) genom att ersätta sex rester med laddade. Termodynamiska analyser av dessa mutanta proteiner indikerade att de hydrofoba mutanterna stabiliserades genom ackumulering av denatureringsentalpi (ΔH) utan entropisk förstärkning från hydrofob solvation runt 100 ° C, och att stabiliseringen på grund av saltbroar resulterade från både ökningen i in H från jonjoninteraktioner och den entropiska effekten av den elektrostatiska solvationen över 113 ° C. Detta är det första experimentella beviset som framgångsrikt har övervunnit de typiska tekniska svårigheterna.

Introduktion

De tertiära strukturerna hos proteiner, som är avgörande för deras fysiologiska funktioner, är relaterade till aminosyrasekvenser och stabiliserade med termodynamiska regler. För att belysa mekanismerna för proteinvikning och proteinstabilisering är det kritiskt viktigt att erhålla de termodynamiska parametrarna för proteindenaturering som en funktion av temperaturen. En svårighet för att studera stabiliseringsmekanismen för proteiner med denatureringstemperaturer över 100 ° C är att värmdenatureringen av proteiner vanligtvis är irreversibel vid temperaturer högre än 80 ° C 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, eftersom under dessa förhållanden aggregeras proteiner generellt efter värme denaturering. De termodynamiska egenskaperna hos proteinstabilisering vid temperaturer över 100 ° C förstås således inte. En viktig fråga inom detta område är om de hydrofoba interaktionerna som ger de största bidrag till proteinstabiliteten 9, 10, 11, 12, 13 fortfarande förekommer vid temperaturer över 100 ° C 14, 15 . Därefter är det nödvändigt att utföra termodynamiska analyser av saltbroar i proteiner som har denatureringstemperaturer över 100 ° C, eftersom många proteiner från hypertermofiler verkar stabiliseras av ett överflöd av jonpar bildade av laddade rester 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 . Termodynamik för proteindenaturering vid temperaturer över 100 ° C är också väsentligen viktig för en rationell utformning av hypertermostabla proteiner som skulle vara mycket användbara för industriella och bioteknologiska processer.

CutA1-proteinet från hyperthermophile Pyrococcus horikoshii ( Ph CutA1) har en ovanligt hög stabilitet, med en denatureringstemperatur ( Td ) på nästan 150 ° C vid pH 7, 0 och ett ovanligt högt innehåll av laddade rester 26, 27 . Stabiliteter och strukturer av CutA1-proteiner från arter med olika tillväxttemperaturer har också undersökts, inklusive de från Thermus thermophilus ( Tt CutA1) 28, Oryza sativa ( Os CutA1) 28, Homo sapiens (hjärna) ( Hs CutA1) 29 och Escherichia coli ( Ec CutA1) 30 . Deras Td- värden är också ovanligt höga i förhållande till tillväxttemperaturerna för varje art: 113, 9 ° C för Tt CutA1, 98, 9 ° C för Os CutA1, 96, 2 ° C för Hs CutA1 och 89, 9 ° C för Ec CutA1. Röntgenkristallstrukturen för Ph CutA1 liknar tydligt den hos andra CutA1-proteiner. Den monomera strukturen består av tre a-spiraler och fem p-strängar. Tre monomerer samlas i en trimer genom interaktioner mellan kanterna på tre p-strängar (kompletterande figur 1). Denna tätt sammanflätade interaktion bidrar till stabilisering av trimerstrukturerna för CutAl-proteinerna 26 .

Ec CutA1 och dess mutanter är inte värmeomvändbara 30 . Emellertid uppvisar andra CutA1-proteiner, såsom Tt CutA1 och Os CutA1, som har färre cysteinsulfhydryl (SH) -grupper, anmärkningsvärt värmeåterförbarhet 28 . Ec CutA1 har tre SH-grupper per underenhet. Därför designade vi en SH-fri Ec CutA1-mutant, kallad Ec CutA1_0SH (Cys16 → Ala, Cys39 → Ala, Cys79 → Ala), med målet att uppnå hög värmeåterförbarhet.

I den här studien använde vi Ec CutA1_0SH-proteinet, som har utmärkt värmeomvändbarhet, som en mall för att designa termostabiliserade mutanter. Först konstruerade vi hydrofoba mutanter från Ec CutA1_0SH, som var effektiva i vårt tidigare arbete 30 . För att uppnå en hypertermostabilitet som är jämförbar med Ph CutA1, designade vi joniska mutanter i vilka laddade rester infördes i en hydrofob mutant ( Ec CutA1_0SH_S11V / E61V) genom substitution. Vi beskriver vår användning av dessa Ec CutA1-mutanter för att bedöma de termodynamiska egenskaperna hos proteiner vid temperaturer över 100 ° C, med avseende på både hydrofoba och jon-joninteraktioner.

Resultat

Hydrofoba mutanter av Ec CutA1 utan SH-grupp

Vi konstruerade hydrofoba mutanter utan SH-grupper ( Ec CutA1_0SH_S11V, Ec CutA1_0SH_E61V, Ec CutA1_0SH_S11V / E61V), vilket vi förväntade oss öka stabiliteten 30 . Figur 1A visar typiska kurvor för differentiell avsökningskalorimetri (DSC) för Ec CutA1_0SH och dess hydrofoba mutant utan SH-grupper vid pH 9, 0. Såsom visas i fig. IB överensstämmer uppvärmningskurvan (andra skanning) av Ec CutA1_0SH helt med den första skanningen. De andra två proteinerna uppvisade också god reproducerbarhet. Dessa resultat indikerar att avlägsnandet av SH-grupper underlättar utmärkt reversibilitet av värme denaturering under dessa förhållanden och att vi pålitligt kan bestämma denaturerings entalpierna hos dessa proteiner. Denatureringstemperaturen ( Td ) för Ec CutA1_0SH minskade med 4, 3 ° C, relativt till (89, 9 ° C) för Ec CutA1 med SH-grupper, medan de för Ec CutA1_0SH_S11V och Ec CutA1_0SH_E61V var 103 respektive 101 ° C, vilka var anmärkningsvärt förbättrad relativt mallen. Vidare var Td för en dubbelmutant, Ec CutA1_0SH_S11V / E61V, 113 ° C, vilket är 28 ° C högre än mallen (tabell 1). Hädanefter förkortas Ec CutA1_0SH_S11V / E61V som Ec 0VV. Dessa förändringar i stabilitet beroende på de hydrofoba mutationerna var jämförbara med de som observerades i mutanta proteiner med SH-grupper 30 .

( A ) Typiska DSC-kurvor för fyra mutanter: Ec CutA1_0SH, Ec CutA1_0SH_S11V, Ec CutA1_0SH_E61V och Ec CutA1_0SH_S11V / E61V. Skanningshastigheterna var 60 ° C / h. ( B ) Vändbarhet för värmedenaturering av Ec CutA1_0SH, Ec CutA1_0SH_S11V och Ec CutA1_0SH_S11V / E61V. De röda kurvorna för tre proteiner är de andra körningarna av DSC, strax efter kylningssteget för den första körningen (de svarta kurvorna). Skanningshastigheterna för båda kurvorna var 60 ° C / h.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Joniska mutanter av Ec CutA1_0SH_S11V / E61V ( Ec 0VV)

För att undersöka de termodynamiska parametrarna för stabilisering genom jon-joninteraktion vid temperaturer över 100 ° C konstruerade vi flera mutanta proteiner innehållande substitutioner med laddade rester, med användning av Ec 0VV som mall. Joniska mutanter, vars denatureringstemperaturer förbättras och vars DSC-kurvor är lämpliga för termodynamisk analys, valdes från vår pool av stammutanter (tabell 1). Typiska DSC-kurvor och reversibilitetskurvor visas i fig. 2 respektive kompletterande figur 2. Även om T för en dubbelmutant, Ec 0VV_T17K / S48D, var lägre än mallen, valdes den eftersom Td var över 100 ° C och högre än de för de ursprungliga enstaka mutanterna ( Ec 0VV_T17K och Ec 0VV_S48D) (Bord 1). I fallet med Ec 0VV_A39D / S48K / H72K / S82K / Q87K / T88R, som förkortas Ec 0VV_6, var DSC-kurvan lämplig för analys (fig. 2), men reversibilitetskurvan kunde inte erhållas korrekt på grund av viss sida reaktioner som inträffade vid höga temperaturer. T för Ec 0VV_6 var 136, 8 ± 0, 9 ° C, förbättrad med 23, 6 ° C med införandet av sex laddade rester.

De sex mutanterna är Ec 0VV_T17 K / S48D, Ec 0VV_A39D / S48 K, Ec 0VV_S110R, Ec 0VV_H72 K, Ec 0VV_Q87 K / T88R och Ec 0VV_6. Skanningshastigheterna var 60 ° C / h.

Bild i full storlek

Vid surt pH bör negativt laddade rester av ett protein protoneras, vilket leder till en minskning av konformationell stabilitet. I fallet med CutAl från P. horikoshii , som stabiliseras av många joniska interaktioner, reduceras Td av 148, 5 ° C vid pH 7, 0 drastiskt till 75, 6 ° C vid pH 2, 5, medan Td för CutA1 från T. thermophilus förändras från 112, 8 ° C vid pH 7, 0 till 86, 6 ° C vid pH 2, 5 28 . För att bekräfta stabiliseringen resulterade från joniska interaktioner undersöktes stabiliteten hos joniska mutanter under sura förhållanden vid pH 2-3. Td- värdena för de joniska mutanterna minskade monotont när pH sänktes och nådde ett konstant minimum vid pH 2-2, 5 (kompletterande tabell 1). Vi planerade Td- förskjutningen ( Td- värdet vid pH 9, 0 mot pH 2, 0-2, 5) kontra Td- värdet vid pH 9, 0 för flera joniska mutanter (stängda cirklar i tilläggsfiguren 3). Klart blev Td- skiftet större när Td ökade. Dessa resultat antyder att de elektrostatiska interaktionerna dominerar termostabiliseringen av de joniska mutantproteinerna.

Temperaturberoende av denatureringsentalpi vid högre temperaturer

Denatureringsvärmekapaciteten (Δ Cp ) antas vanligtvis vara konstant vid temperaturer under 80 ° C 31, men den minskar gradvis vid högre temperaturer 14 . Därför är det viktigt att belysa temperaturfunktionen för Δ Cp vid högre temperaturer. För detta ändamål mätte vi Cp- värdena för Ec 0VV i det ursprungliga tillståndet med DSC vid temperaturer upp till 95 ° C (Y2 i kompletterande figur 4A). Tyvärr kunde temperaturberoendet av Cp- värden i denaturerat tillstånd inte bestämmas experimentellt på grund av den höga reversibiliteten för denaturerad Ec 0VV. Alternativt, antagande att värmekapacitetsbidraget av aminosyragrupper är additivt, kan värmekapaciteten för proteiner i denaturerat tillstånd beräknas utifrån deras aminosyrasammansättning 32 . Y1 i kompletterande figur 4A visar också temperaturfunktionen för värmekapaciteten för Ec 0VV i denaturerat tillstånd, vilket uppskattades från dess aminosyrasammansättning med hjälp av parametrarna i tabell II i Makhatadze och Privalov 33 . Därefter kunde vi uppskatta temperaturfunktionen för denatureringsvärmekapaciteten (Δ Cp ) för Ec 0VV från dessa nativa och denaturerade Cp- värden (Y3 i tilläggsfiguren 4A). Den temperaturfunktion som erhålls med Δ Cp kan expanderas runt Td som en andra ordning polynom:

Därefter kan temperaturfunktionerna för denatureringsentalpi (ΔH) och denatureringsentropin (ΔS) beräknas med följande ekvationer (2) respektive (3).

Figur 3A visar temperaturfunktionen för Δ H för Ec 0VV. H- värdena för Ec 0VV var högre än vid varje denatureringstemperatur för andra proteiner ( Ec CutA1_0SH, Ec CutA1_0SH_S11V och Ec CutA1_0SH_E61V). Om vi ​​antar att temperaturfunktionen för Δ Cp inte till stor del påverkas av proteinets sammansättning, indikerar denna observation att stabilisering av hydrofoba mutanter vid restpositionerna 11 och 61 huvudsakligen orsakas av entalpiska effekter.

( A ) Temperaturberoende av ΔH för hydrofoba Ec CutA1-mutanter vid pH 9, 0. Δ H- värden (stängda cirklar) för denaturering för Ec CutA1_0SH, Ec CutA1_0SH_S11V, Ec CutA1_0SH_E61V och Ec 0VV kommer från tabell 1. De svarta kurvorna representerar temperaturfunktionen för Δ H vid denaturering med temperaturfunktionen för Δ Cp för Ec 0VV erhållen från Y3 i den kompletterande fig. 4A. Den röda kurvan representerar TS för Ec 0VV. När det gäller Ec 0VV beräknades parametrarna A, B och C för Δ Cp (i kJ mol −1 K −1 ) i ekvation (1) till 7.61029, −0.26614 och −8.4434 × 10 −4, respektive. ( B ) Temperaturberoende av ΔH för joniska Ec 0VV-mutanter vid pH 9, 0. Δ H- värden (stängda cirklar) för denaturering för Ec CutA1-mutanter kommer från tabell 1. Svarta kurvor representerar temperaturfunktionen för Δ H vid denaturering med användning av temperaturfunktionen för Δ Cp för Ec 0VV_6 erhållen från Y3 i tilläggsfiguren 4B. Den röda kurvan representerar T ΔS för Ec 0VV_6. När det gäller Ec 0VV_6, beräknades parametrarna A, B och C för Δ Cp (i kJ mol −1 K −1 ) i ekvation (1) till 4.22658, −0.29835 och −10.0757 × 10 −4, respektive.

Bild i full storlek

Temperaturfunktionen för Δ Cp för Ec 0VV_6 bestämdes också med användning av de nativa Cp- värdena (kompletterande figur 4B), som mättes direkt upp till 110 ° C. Figur 3B visar temperaturfunktionen för ΔH för Ec 0VV_6 och denatureringsentalpi-värdena vid denatureringstemperaturerna för flera joniska Ec 0VV-mutanter. Denna figur indikerar att H- värdet för Ec 0VV liknar de för Ec 0VV_S110R och Ec 0VV_6 vid varje denatureringstemperatur, men anmärkningsvärt högre än de för andra mutanter härledda från Ec 0VV genom ytterligare tillsats av laddade rester.

De termodynamiska parametrarna för denaturering för Ec CutA1_0SH-mutanter vid denatureringstemperaturen (113, 2 ° C) för Ec 0VV är listade i tabell 2. Δ G- värdena, uppskattade med användning av Δ Cp- temperaturfunktionen erhållen från Ec 0VV, överensstämde väl med de från Ec 0VV_6, kring denatureringstemperaturen för Ec 0VV. Figur 4 visar också temperaturfunktionerna för Δ G , Δ H och T Δ S för Ec 0VV och Ec 0VV_6 över ett större temperaturområde (mellan 280 och 420 K), vilket indikerar att Δ G- värden för Ec 0VV_6 är positiva över ett brett temperaturintervall.

Full storlek bord

Temperaturfunktioner för ΔH och ΔS erhölls med användning av ekvationerna (2) respektive (3), i vilka varje temperaturfunktion för ΔCp användes för beräkningen av Ec 0VV och Ec 0VV_6. De gröna, röda och blå kurvorna representerar värdena för Δ G (= Δ H - T Δ S ), Δ H respektive T Δ S. Nummer 1 och 2 representerar Ec 0VV_6 respektive Ec 0VV. Öppna cirklar med felstaplar visar Δ H- värdet för varje protein vid denatureringstemperaturen, som anges i figuren.

Bild i full storlek

Diskussion

För fyrtio år sedan, Privalov et al. 14, 31 utvecklade högt kvalificerade adiabatiska differentiella mikrokalorimetrar för bestämning av de termodynamiska parametrarna för proteindenaturering. De rapporterade att specifika karaktärer av aminosyrarester försvinner under proteinutveckling nära 110 ° C, och att all den observerade entropin härrör från ökningen i konformationell frihet hos polypeptiden vid utfoldning, eftersom den specifika ΔH och ΔS utspelar sig för flera proteiner korsar varandra vid en enda punkt nära 110 ° C. Å andra sidan tillhandahåller termodynamiken för överföring av kolväten till vatten en modell för temperaturberoendet av den hydrofoba interaktionen vid proteinvikning. Baldwin 15 undersökte lösningens termodynamik för flera flytande kolväten i vatten. Han fann att de extrapolerade temperaturerna vid överföringen Δ S når noll, cirka 112, 8 ° C, var liknande för sex kolväten. Den extrapolerade temperaturen för överföringen ΔH är 22, 0 ° C. Detta betyder att vid 113 ° C förändras den hydrofoba interaktionen från att vara entropidriven vid 22 ° C till att vara entalpi-driven vid 113 ° C, och vattenbidraget till entropin av proteinutveckling (hydrofob hydrering) avlägsnas 15 . När det gäller dessa uppskattningar antas värmekapacitetsförändringen (Δ Cp ) vara konstant mot temperaturen. Senare rapporterade Makhatadze och Privalov 33, 34 att temperaturen vid vilken S är noll närmar sig 145 ° C när den minskande naturen av of Cp mot temperaturen beaktas, eftersom Δ Cp- värdet för kolvätehydratisering minskar med ökande temperatur.

I denna studie kunde värmekapaciteterna i de ursprungliga tillstånden för Ec 0VV och Ec 0VV_6 mätas direkt med DSC upp till 95 respektive 110 ° C, och temperaturfunktionerna för deras Δ Cp- värden uppskattades såsom visas i tilläggsfiguren. 4A respektive kompletterande figur 4B.

Hydrofoba effekter bidrar starkt till Δ H vid temperaturer runt 100 ° C

Temperaturfunktionen för H för Ec 0VV visas i fig. 3A. Med användning av samma temperaturfunktion som ΔCp beräknades ΔH-värdena för Ec 0VV, Ec CutA1_0SH_S11V, Ec CutA1_0SH_E61V och Ec CutA1_0SH till 1569, 1396, 1340 respektive 1175 kJ / mol vid 113, 2 ° C (tabell 2 ). Ökningen i ΔH (394 kJ / mol) av Ec 0VV ( Ec CutA1_0SH_S11V / E61V) överensstämmer väl med summan (386 kJ / mol) av ökningarna i ΔH för Ec CutA1_0SH_S11V (221 kJ / mol) och Ec CutA1_0SH_E61V ( 165 kJ / mol). Å andra sidan var T- S- värdena för Ec 0VV (den röda kurvan i fig. 3A) större än ΔH-värdet (= T ΔS vid Td ) vid varje Td av Ec CutA1_0SH_S11V, Ec CutA1_0SH_E61V och Ec CutA1_0SH, vilket indikerar att Ec 0VV är entropiskt ogynnsam jämfört med andra proteiner. Det vill säga Ec 0VV, som innehåller hydrofoba substitutioner för hydrofila rester i det inre av en molekyl, stabiliseras huvudsakligen av den enthalpiska förstärkningen vid substitutioner, men delvis destabiliseras av den entropiska förlusten, troligen på grund av störningen av den hydrofila solvationen i denaturerat tillstånd vid utbyten. Dessa resultat vid höga temperaturer runt 100 ° C strider mot den väl accepterade tron ​​att den entropiska vinsten från hydrofob solvation kan stå för stabiliseringseffekten av hydrofoba substitutioner vid lägre temperaturer 15 . Medan uppskattningarna från hydratiseringen av aminosyrorna 34 är i allmänhet förenliga med våra resultat. Detta är det första experimentella beviset för de hydrofoba effekterna på proteinstabilitet, som erhålls genom direkt mätning vid temperaturer runt 100 ° C.

Ec 0VV_6 substituerad med sex laddade rester stabiliseras av både entalpiska och entropiska effekter runt 137 ° C

Under 100 ° C drivs jon-joninteraktionen (saltbrygga) helt av entropiska effekter på grund av frisläppandet av vatten som är starkt bundet till jonerna i laddade rester 35, 36, 37 . Proteinerna substituerade med enstaka laddade rester, Ec 0VV_H72K, Ec 0VV_S82K, Ec 0VV_Q87K och Ec 0VV_T88R, stabiliseras genom elektrostatiska interaktioner (kompletterande figur 3). ΔH-värdena för alla dessa proteiner minskade drastiskt relativt ΔH vid varje motsvarande temperatur på temperaturfunktionen för Ec 0VV_6 (fig. 3B). Eftersom förändringarna i H vid dessa mutationer är ogynnsamma för vikning, orsakades de observerade förbättringarna i stabilitet av entropiska effekter på grund av frisläppandet av vatten vid de laddade resterna som vi införde (elektrostatisk solvation). De termodynamiska analyserna bekräftade också tydligt stabilisering till följd av entropiska effekter (tabell 2). De andra enskilda mutanterna, Ec 0VV_A39D och Ec 0VV_S48 K, vars mutationsställen var belägna i det inre av molekylen (tabell 3), visade drastiskt minskade Td- och H- värden. Emellertid stabiliserades en dubbelmutant innehållande båda dessa enstaka mutanter, Ec 0VV_A39D / S48 K, i vilken Asp39 bildar en stark saltbrygga med Lys48, genom en ökning i ^ H i förhållande till de enskilda mutanterna (fig. 3B), förmodligen på grund av till Coulombs styrka till följd av saltbrobildning. Ett liknande resultat erhölls i den andra dubbla mutanten, Ec 0VV_T17 K / S48D (fig. 3B). Den dubbla mutanten Ec 0VV_Q87 K / T88R stabiliserades också genom en ökning i ^ H i förhållande till Ec 0VV_Q87 K och Ec 0VV_T88R. Eftersom denna dubbla mutant inte har ytterligare saltbryggor, kan två individuella termostabiliseringar fungera synergistiskt vid cirka 120 ° C för att främja desolvationen av de införda jonresterna, varigenom både den entalpiska förlusten och den entropiska förstärkningen som ömsesidigt tillskrivs elektrostatisk solvation. Dessutom kan ökningen av ^ H i denna dubbeljonmutant ha orsakats av en hydrofob interaktion på grund av alkylgrupperna i Lys87 och Arg88.

Full storlek bord

Ec 0VV_6, med sex ytterligare laddade rester, stabiliserades genom en ökning i ^ H- värdet relativt var och en av de sex ursprungliga jonmutanterna (fig. 3B). Ökningen i H kan indikera att hydrofoba effekter på grund av alkylgrupperna i Lys eller Arg och Coulombs kraft fortfarande fungerar effektivt vid dessa höga temperaturer. Enligt Coulombs lag är styrkan hos en elektrisk interaktion omvänt proportionell mot den dielektriska konstanten. Den dielektriska konstanten av vatten sjunker från 80 vid 0 ° C till 55 vid 100 ° C 38 . Vidare fann Elcock 39 att ökande temperatur sänker den elektrostatiska avlövningsstraffen som uppstod vid bildandet av en saltbro, vilket ledde till en ökning av saltbryggstabilisering från hans kontinuumsolvationsmodell 40 . Ökningen i ΔH för Ec 0VV_6 kan huvudsakligen bero på den höga grad av upplösning av jonresterna i detaturerat tillstånd vid cirka 137 ° C, utöver de andra effekterna som beskrivs ovan.

Temperaturberoendet för ΔH för Ec 0VV_6 har en korsning nära Td (113 ° C) av Ec 0VV, såsom visas i fig. 4, vilket antyder att bidraget av Δ H till stabiliteten för Ec 0VV_6 med ytterligare 6 laddade rester blir gynnsam i temperaturområdet över 113 ° C, jämfört med Ec 0VV. Fig. 4 visar dessutom att ökningen i G för Ec 0VV_6 till stor del beror på minskningen i S för Ec 0VV_6 jämfört med mallen Ec 0VV vid temperaturer under 113 ° C. Det vill säga, stabiliseringen på grund av joniska mutationer beror främst på både den entalpiska förstärkningen från jonjoninteraktioner i det nativa tillståndet och den entropiska förstärkningen från vattenfrisättningen av jonrester i denaturerad tillstånd vid temperaturer över 113 ° C.

En mutant, Ec 0VV_S110R, vars substitutionsposition är belägen i C-terminalen av a-helix och nästan begravd (tabell 3), stabiliserades genom en ökning i ^ H (fig. 3B). I detta fall, på grund av lokala överensstämmelser, kan minskningen av in H på grund av vattenutsläpp undertryckas av effekterna av andra stabiliserande faktorer.

Slutsats

Den rationella utformningen av hypertermostabila proteiner kan vara möjlig genom införandet av flera saltbroar vid höga temperaturer över 113 ° C som kan uppnås genom en föregående stabilisering genom hydrofoba substitutioner.

Matrials och metoder

Mutagenes, expression och rening av CutA1-mutanter från E. coli

Mutagenes, expression och rening av CutA1-mutanter från E. coli utfördes såsom beskrivits 30 med mindre modifieringar. De renade provernas homogenitet och identitet bedömdes med användning av SDS – PAGE. Proteinkoncentrationen uppskattades från absorbansen vid 280 nm, under antagandet av E 1 cm 1% = 14, 96, baserat på antalet aromatiska aminosyror 41 .

Differentialscanning calorimetry (DSC) experiment

För att mäta förändringarna i stabilitet på grund av mutationer utfördes DSC med en skanningshastighet på 60 ° C / h på en VP-kapillär DSC-plattform (Microcal, USA) för temperaturer upp till 130 ° C vid tryck under 60 psi, eller en Nano-DSC 6300Y mikrokalorimeter (TA Instruments, USA) för högre temperaturer upp till 160 ° C vid ett tryck av 88 psi. Proteinkoncentrationerna var omkring 0, 6 mg / ml i en 50 mM glycinbuffert vid pH 9, 0 innehållande 2 mM EDTA eller en 50 mM glycinbuffert vid pH 2, 0-3, 5. Alla prover dialyserades mot buffertarna över natten vid 4 ° C och filtrerades sedan genom ett membran med 0, 22 um porer. Denatureringstemperaturen ( Td ) är temperaturen vid vilken denatureringsentalpinens område (ΔH) är 0, 5. Td- och ΔH-värdena i denna studie representerar medelvärdena för minst sex experiment.

För att mäta värmekapaciteten för mutanta proteiner i deras ursprungliga tillstånd justerades proteinkoncentrationerna till cirka 2, 0 mg / ml i en 50 mM glycinbuffert vid pH 9, 0. Två olika skanningshastigheter, 60 och 200 ° C / h, användes. Varje experiment innefattade sex cykler med återuppvärmning till för-denatureringstemperaturerna: 95 ° C respektive 110 ° C för Ec 0VV respektive Ec 0VV_6. De partiella specifika volymerna för beräkning av värmekapacitet uppskattades från aminosyrasammansättningen för varje mutantprotein 42 .

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Matsuura, Y. et al. Termodynamik av proteindenaturering vid temperaturer över 100 ° C: CutA1-mutanta proteiner substituerade med hydrofoba och laddade rester. Sci. Rep. 5, 15545; doi: 10.1038 / srep15545 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.