Terapeutisk effekt av ett DNA-vaccin som är inriktat på endotel-tipcellantigen delta-liknande ligand 4 vid bröstkarcinom | onkogen

Terapeutisk effekt av ett DNA-vaccin som är inriktat på endotel-tipcellantigen delta-liknande ligand 4 vid bröstkarcinom | onkogen

Anonim

ämnen

  • Bröstcancer
  • DNA-vacciner
  • Tumörangiogenes

Abstrakt

Notch-ligand delta-liknande ligand 4 (DLL4) är en väsentlig komponent uttryckt av endotelcellsceller under angiogen sprouting. Vi har beskrivit en konceptuellt ny terapeutisk strategi för att rikta tumörangiogenes och endotelceller baserade på DNA-vaccination mot DLL4. Immunisering med DLL4- kodande plasmid-DNA genom in vivo elektroporering fördröjde allvarligt tillväxten av ortotopimplanterade mammary karcinom hos möss genom induktion av ett icke-produktivt angiogeniskt svar. Mekaniskt medförde vaccination ett toleransbrott mot självantigenet, DLL4, vilket framgår av produktionen av hämmande och i sig terapeutiska antikroppar mot musens DLL4. Det är viktigt att inga bevis för ett försenat sårläkningssvar eller för toxicitet förknippat med farmakologisk blockering av signalering av DLL4 noterades på möss immuniserade med DLL4- vaccinet. Vi har sålunda utvecklat en väl tolererad DNA-vaccinationsstrategi riktad mot endotelcellscellerna och antigenen DLL4 med bevisad terapeutisk effekt i musmodeller av bröstkarcinom; en sjukdom som har rapporterats dramatiskt inducera uttrycket av DLL4. Tänkbart skulle induktion av immunitet mot huvudförmedlare av patologisk angiogenes ge skydd mot återkommande malign sjukdom i adjuvansmiljön.

Introduktion

Det mest använda målet för att utveckla anti-angiogena terapeutiska värden i cancer är vaskulär endotelväxtfaktor (VEGF) på grund av dess väldokumenterade roll för att främja endotelcelltillväxt, migration och grodd (Pourgholami och Morris, 2008). Nyligen identifierades signalering med delta-liknande ligand 4 (DLL4) genom dess receptor Notch1 som en lika kritisk komponent för fysiologisk och patologisk neovaskularisering (Noguera-Troise et al., 2006; Ridgway et al., 2006; Hellstrom et al., 2007; Scehnet et al., 2007). DLL4 induceras specifikt av VEGF i spirande endotelceller, varvid det orkestrerar bildningen av korrekta angiogena groddar. Blockad av DLL4-funktion resulterar i hypersproutering på grund av förlusten av lateral hämning av endotypspetscell-fenotyp medierad genom Notch1. Som en följd är ett överdrivet, men icke-produktivt, angiogeniskt svar monterat, kännetecknat av dålig perfusion som resulterar i hypoxi. I experimentella tumörer verkar DLL4-signalering till Notch1 i endotelet för att förbättra vaskulär funktion (Li et al., 2007). Omvänt försvårar neutralisering av DLL4-aktivitet tumörtillväxt i prekliniska modeller, både som ett enda medel och i kombination med VEGF-hämning (Noguera-Troise et al., 2006; Ridgway et al., 2006). Lite är känt om lokaliseringen av DLL4 i mänskliga vävnader. Dock uttrycks DLL4 selektivt av endotelet av maligna vävnader, men inte de normala motsvarigheterna i bröst och kolon (Jubb et al., 2009, 2010).

Under de senaste åren har idén att utnyttja immunsystemet för att bekämpa cancer utvecklats i stor utsträckning. Terapeutisk cancervaccination har utförts med användning av en mängd olika vaccinalternativ från peptider eller rekombinanta proteiner som representerar tumörassocierade antigener till vacciner som består av autologa tumörceller (Pejawar-Gaddy och Finn, 2008). Hos människor har vaccinationsstudier som använder både rekombinant protein (Ullenhag et al., 2004) och genetiska virusvektorvacciner (Schlom et al., 2007) resulterat i förlängd patientöverlevnad. Genetisk vaccination, det vill säga överföring av ett genetiskt kodat antigen för upptag och translation i värdcellen, är en ny och lovande metod för immunisering mot både maligna och infektionssjukdomar (Liu et al., 2006). Förutom fördelar, såsom möjligheten för samtidig användning av flera antigener och lätthet att modifiera och producera, resulterar de inneboende egenskaperna hos den prokaryota DNA-ryggraden också i stimulering av det medfödda immunsystemet och ger därmed ytterligare adjuvansegenskaper under immuniseringen (Liu et al., 2006). Flera veterinär-DNA-vacciner har godkänts för rutinmässig användning, inklusive ett West Nile-virusvaccin för hästar (Davis et al., 2001) och ett vaccin för behandling av avancerat hundmelanom (Bergman et al., 2003). Dessa, tillsammans med en ny studie som visade att plasmid-DNA-vaccination hos människor resulterar i skydd mot influensutmaning (Jones et al., 2009), visar tydligt den terapeutiska potentialen för plasmid-DNA-vaccination.

I denna studie har vi beskrivit utvecklingen av en DNA-vaccinationsstrategi riktad mot tumörendotelcellscellerna genom immunisering med plasmid-DNA som kodar för DLL4 . Immunisering av möss genom elektroporering in vivo dämpad tumörtillväxt i två ortotopiska musmodeller av ERBB2-uttryckande mammarcancer. När vi sökte mekanismen för de observerade effekterna fann vi att vaccination mot DLL4 resulterade i en oproportionerlig och dåligt perfuserad vaskulär bädd på grund av induktion av ett kraftigt och hämmande humoralt svar mot självantigenet, DLL4. Det är viktigt att möss immuniserade med DLL4 cDNA inte uppvisade någon försening i sårläkning, vilket indikerar att fysiologisk angiogenes inte påverkades av vaccinationsstrategin. Således identifierar vår studie DNA-vaccination mot tumörangiogenes genom inriktning av DLL4 som ett lovande och väl tolererat tillvägagångssätt för vidareutveckling mot kliniska studier.

Resultat

Xenogen DNA-immunisering genom intradermal elektroporering inducerar ett humoralt immunsvar mot DLL4

För att generera DLL4- plasmidvaccinet klonade vi cDNA som kodar för humant DLL4 i pVAX1-expressionsvektorn ( DLL4- vaccin), som är specifikt utformad för utveckling av DNA-vacciner och godkänd för användning i människor. Expression av DLL4-protein bekräftades genom Western blot-analys av lysaterna från HeLa-celler transfekterade med DLL4- plasmiden (figur la). Därefter immuniserade vi möss med en av två olika protokoll (figur 1b). En kohort av möss immuniserades tre gånger med 4 veckors mellanrum genom att injicera 40 μg av DLL4- vaccin eller tom vektor intradermalt i flanken på två platser, följt av in vivo elektroporering vid varje injektionsställe (nedan kallat immuniseringsprotokoll 1). En andra kohort av möss fick två injektioner av 80 μg DLL4- vaccin genom intramuskulär injektion med 4 veckors mellanrum och en slutlig immunisering genom injektion av 40 μg DLL4- vaccin intradermalt på två platser, följt av in vivo elektroporering vid varje injektionsställe (nedan benämnt immuniseringsprotokoll 2). Inga öppna ogynnsamma effekter av immuniseringsprotokollet på mössens välbefinnande noterades. För att verifiera om immuniseringsstrategierna var framgångsrika analyserade vi sera från immuniserade möss för antikroppar mot humant DLL4 genom enzymbunden immunosorbentanalys. I motsats till sera från möss immuniserade med en tom vektor, innehöll sera från möss immuniserade med antingen protokoll 1 eller protokoll 2 antikroppar som känner igen den rekombinanta extracellulära domänen hos human DLL4 vid lätt detekterbara titrar (figur1c; data visas inte).

Immunisering med plasmidkodad DLL4 resulterar i ett immunologiskt svar i BALB / c-möss. ( a ) Uttryck av mänsklig DLL4 verifierades genom transient transfektion av HeLa-celler med en tom vektor eller vektorn som kodar för DLL4 (p DLL4 ) och analyserades med western blot. Rekombinant humant DLL4 användes som en positiv kontroll (rhDLL4). ( b ) BALB / c-kvinnliga möss immuniserades antingen intramuskulärt (IM) eller intradermalt (ID) enligt de avbildade protokollen. Alla intradermala injektioner gavs i kombination med elektroporering (EP). En vecka efter den slutliga immuniseringen utmanades djuren genom ortotopisk injektion av D2F2 / E2- eller TUBO-celler i bröstfettkudden. ( c ) För att undersöka om vaccinationen gav upphov till ett immunologiskt svar togs serum 10 dagar efter den slutliga immuniseringen (protokoll 1) och analyserades genom human DLL4-enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). Figuren visar en representativ analys för en av fyra analyserade möss.

Bild i full storlek

Vaccination mot endotelcellsantigen-antigen DLL4 är terapeutiskt effektiv vid bröstkarcinom

För att undersöka huruvida immunisering av möss med DLL4- plasmiden har terapeutiskt värde, använde vi ortotopiska modeller av ERBB2-uttryckande musköttkarcinom. D2F2 / E2-celler härleddes från en spontan mammärtumör i en BALB / c-mus och transfekterades med cDNA-kodande ERBB2 (Wei et al., 1999). Immunfargningsanalys visade att DLL4 uttrycktes starkt och specifikt i kärlen hos D2F2 / E2-tumörer (figur 2a). Möss immuniserade med tomt vektor- eller DLL4- vaccin utmanades ortotopiskt med tumörer 1 vecka efter den sista immuniseringen genom injektion av D2F2 / E2-celler i den fjärde inguinala fettkudden. Immunisering genom protokoll 1 resulterade i en signifikant fördröjning av tumörtillväxt jämfört med tillväxten av tumörer hos möss immuniserade med tom vektor (figur 2b; P <0, 01). Vid slutet av experimentet visade kontrollmöss presenterade med en genomsnittlig tumörvolym av 372 ± 141 mm 3, medan möss injicerade med DLL4- vaccinet uppvisade en genomsnittlig tumörvolym på 134 ± 84 mm 3 . På liknande sätt försenades tumörtillväxt hos möss immuniserade genom protokoll 2 signifikant, och i slutet av försöket var den genomsnittliga tumörvolymen 143 ± 112 mm 3 (figur 2b; P <0, 05). I en separat studie registrerades tumörtillväxt hos möss vaccinerade mot DLL4 under en längre tidsperiod efter eutanasi av de vektorimmuniserade mössen på grund av etiska överväganden. Tumörer i vaccinerade möss fortsatte att växa, om än i reducerad takt, och i slutet av studien var tillväxtförseningen jämfört med kontrollgruppen 11 dagar (figur 2c).

DNA-vaccination mot DLL4 resulterar i undertryckande av tumörtillväxt hos BALB / c-möss. ( a ) Expression av DLL4 i D2F2 / E2 tumörendotelceller bedömdes med immunofluorescerande färgning för endotelmarkörerna, CD31 (röd) och DLL4 (grön). Cellkärnor försämrades av DAPI (blå). Tillväxt av ortotopiskt implanterade D2F2 / E2 ( b och c ) eller TUBO ( d ) bröstkarcinom i BALB / c-möss efter immunisering med tom vektor eller med DLL4- plasmid-DNA enligt protokoll 1 (3 × ID + EP) eller protokoll 2 (2 × IM, 1 × ID + EP; n = 8 för alla grupper). Uppgifterna som visas i ( b och d ) är representativa för tre oberoende experiment. * P <0, 05, ** P <0, 01; Studentens t- test.

Bild i full storlek

Det är viktigt att nedsatt tumörtillväxt efter DNA-vaccination mot DLL4, med användning av endera protokollet, också observerades hos möss som injicerades ortotopiskt med den ERBB2-uttryckande mus-mammary carcinomcellinjen, TUBO (figur 2d; P <0, 05).

Sammantaget har vi visat den terapeutiska effekten av DNA-vaccination mot DLL4 i två olika musmodeller av ERBB2-uttryckande mammarcancer.

Immunisering med DLL4-vaccin främjar icke-produktiv angiogenes

Efter avslutande av de terapeutiska studierna skars tumörer ut, inspekterades för grova fenotypiska förändringar och bereddes för histologisk analys. Overtiska trombotiska händelser på tumörens yta detekterades för en majoritet av tumörer från möss immuniserade med DLL4- vaccin, medan ingen av de vektorimmuniserade mössen presenterade med tumörer som visade trombos (figur 3a). Därefter utförde vi immunförfärgning för endotelcellantigenet, CD31, för att undersöka tumörernas vaskularitet. I linje med de tidigare studierna med användning av DLL4-blockerande medel (Noguera-Troise et al., 2006; Ridgway et al., 2006), uppvisade D2F2 / E2-tumörer från möss immuniserade med DLL4 cDNA antingen genom protokoll 1 eller genom protokoll 2 60 respektive 75% högre vaskulär täthet jämfört med tumörer från möss immuniserade med tom vektor (figur 3b; data visas inte; P <0, 01). Liknande resultat erhölls i TUBO-tumörer (data visas inte). För att undersöka funktionen hos tumörvaskulaturen perfusionerade vi tumörbärande möss systemiskt med fluorescein-märkt tomatlektin. Den vaskulära bädden i tumörer från möss immuniserade med DLL4- vaccinet var i stort sett icke-funktionell, vilket framgår av en fraktion perfuserad kärlområde på 11 ± 1% (figur 3c). I motsats härtill uppvisade tumörer från möss immuniserade med en tom vektor en fraktion perfuserad vaskulär yta på 41 ± 13% (figur 3c; P <0, 01). Noterbart perfusionerades företrädesvis stora blodkärl i möss ympade med DLL4- vaccinet (figur 3c). Slutligen bedömde vi det apoptotiska indexet för D2F2 / E2-tumörer från vektor- eller DLL4- immuniserade möss genom immunfärgning för aktiverad caspase-3. Det var en signifikant 2, 2-faldig ökning i den apoptotiska hastigheten för tumörceller efter vaccination mot DLL4 (figur 3d; P <0, 05). Viktigare indikerade samfärgning med den vaskulära markören, CD31, att det inte fanns någon förändring i det apoptotiska indexet för endotelceller, vilket tyder på en funktionell försämring av endotelceller, snarare än immunmedierad eliminering av DLL4-uttryckande endotelceller som ett resultat av vaccinationen (data visas inte). Det fanns ingen skillnad i det proliferativa indexet mellan de två grupperna (data visas inte).

Inriktning av DLL4 genom vaccination resulterar i överdriven bildning av icke-funktionella blodkärl. ( a ) Visuell inspektion av skurna D2F2 / E2-tumörer avslöjade öppen trombos i tumörer från DLL4- vaccinerade möss. ( b ) Blodkärlens täthet av D2F2 / E2-tumörer visualiserade genom immunförening för endotelcellmarkören CD31 (röd; n = 5 för varje grupp). ( c ) Perfuserade blodkärl av D2F2 / E2-tumörer bestämda genom vaskulär perfusion med användning av fluoresceinmärkt tomatlektin (grön; n = 5 för varje grupp). Den totala ytan av den vaskulära bädden visualiserades genom immunfärgning för CD31 (röd; n = 5 för varje grupp). Fraktionens perfusionsområde uttrycktes som perfuserat område dividerat med total vaskulär area för varje fält. ( d ) Apoptotiskt index för D2F2 / E2-tumörceller bestämd genom immunfärgning för aktiverat kaspas-3 ( n = 5 för varje grupp). * P <0, 05, ** P <0, 01; Studentens t- test.

Bild i full storlek

Således bestämde vi att DNA-vaccination mot DLL4 leder till främjande av icke-produktiv angiogenes i tumörer, vilket ger upphov till en ökad apoptotisk hastighet av tumörceller.

Hämning av tumörtillväxt medieras av ett humoralt svar mot DLL4

För att belysa mekanismen varigenom immunisering med DLL4- plasmid-DNA framkallar en terapeutisk effekt utförde vi en serie studier som syftar till att undersöka den specifika rollen för en T-cell- och / eller ett B-cellmedierat immunsvar. Möss immuniserades med en tom vektor eller DLL4- vaccinet, varefter mjälten skars ut och en enkelcells splenocyt-suspension bereddes. Mus-DLL4-specifik T-cellaktivitet utvärderades med IFN-y ELISpot efter stimulering av splenocyterna med rekombinant extracellulär del av mus-DLL4 eller med en pool av mus-DLL4-härledda peptider som förutses binda med en hög affinitet till H2- Kd och H2-D d MHC-klass I-molekyler uttryckta av BALB / c-möss. I motsats till splenocyterna polyklonalt stimulerade med concanavalin A, som producerade höga nivåer av IFN-y, fanns det ingen märkbar induktion av IFN-y i splenocyter av de DLL4-härledda peptiderna, oavsett tidigare immunisering med DLL4- cDNA (figur 4a) . Splenocyter från möss som fick DLL4- vaccinet visade emellertid en högre basal nivå av IFN-y efter tumörutmaning, jämfört med möss vaccinerade med tom vektor (figur 4b; P <0, 001 för protokoll 1, P <0, 01 för protokoll 2). För att bedöma huruvida ett T-cellmedierat svar mot DLL4 var en del av effektormekanismen för den terapeutiska effekten, tappade vi CD4 + eller CD8 + T-celler före tumörutmaningen genom injektion av antikroppar för CD4 eller CD8 i immuniserade möss. Efter två injektioner av antikroppar uttömdes CD4 + och CD8 + T-celler med 99, 5 respektive 99, 6%, såsom bedömdes med flödescytometri (figur 4c). Speciellt, efter uttömning av T-celler, minskades inte den terapeutiska effekten av DLL4- vaccinet på tillväxten av ortotopiskt implanterade D2F2 / E2-mammary karcinom, vilket indikerar att T-celler inte har en primär del i de gynnsamma effekterna (figur 4d; P < 0, 01 för alla DLL4- immuniserade grupper kontra kontroll). Detta konstaterande överensstämde med bristen på ökad infiltration av immunceller i D2F2 / E2- eller TUBO-tumörer hos vaccinerade möss, som bedömdes genom immunförärgning för CD45 (data visas inte).

T-celler är inte förmedlare av effektorfunktionerna i DLL4-vaccinet. ( a ) DLL-specifika T-cellrespons från mus efter immunisering med protokoll 1 (3 × ID + EP) eller protokoll 2 (2 × IM, 1 × ID + EP) bedömdes med IFN-y ELISpot genom stimulering av splenocyter med mus-DLL4 peptider eller rekombinant mus extracellulär del av DLL4 ( n = 5 för varje grupp). Rekombinanta karcinoembryonala antigenproteiner och karcinoembryonala antigenpeptider användes som negativa kontroller. Den polyklonala stimulanten Concanavalin A (conA) användes som en positiv kontroll. Experimentet upprepades tre gånger. ( b ) Splenocytaktivitet hos möss efter immunisering genom protokoll 1 (3 × ID + EP) eller protokoll 2 (2 × IM, 1 × ID + EP) vid tidpunkten för uppoffring efter tumörutmaning bedömdes med IFN-y ELISpot utan antigen -specifik stimulering (vektor, n = 9; protokoll 1, n = 8; protokoll 2, n = 5). ( c ) Utarmning av CD4 + eller CD8 + celler initierades tre dagar före tumörutmaning genom injektion av anti-CD4 eller anti-CD8 antikroppar och verifierades genom flödescytometrisk analys av perifert blod 5 dagar efter injektion av antikroppar. Tumörtillväxtkurva från vektorimmuniserade möss duplicerades från figur 2c, som visar ett experiment som utförts samtidigt till T-cellutarmningsexperimentet. ( d ) Tillväxt av orthotopiskt implanterade D2F2 / E2-tumörer i kontrollmöss och i möss uttömda av CD4 + / CD8 + -celler efter vaccination med DLL4- plasmid-DNA ( n = 6 för alla grupper). ** P <0, 01, *** P <0, 001; Studentens t- test.

Bild i full storlek

Därefter analyserade vi serumet från möss immuniserade med en tom vektor eller DLL4- plasmiden för närvaro av antikroppar som var reaktiva mot musens DLL4 med användning av enzymbunden immunosorbentanalys. Serumet från kontrollimmuniserade möss innehöll inte immunoglobuliner mot DLL4 (figur 5a). I skarp kontrast uppvisade alla analyserade serum från möss som hade fått DLL4- vaccinet, antingen av protokollet, höga titrar av antikroppar som är specifika för DLL4-mus (figur 5a). Vi bedömde vidare potentialen hos antikropparna som finns i serumet från DLL4- immuniserade möss för att störa DLL4-signalering under utvecklingen av retinal angiogenes. Injektion av DLL4-immunserum i P3-valpar startade ett tjockare näthinnekapillärnätverk med ett ökat antal grenpunkter och spetsceller jämfört med vektorsimmunserum vid P5 (figur 5b), vilket tyder på närvaron av neutraliserande antikroppar mot musens DLL4. Slutligen, för att undersöka huruvida DLL4-immunserumet var naturligtvis terapeutiskt, behandlade vi naiva D2F2 / E2-tumörbärande möss. Påfallande är serumet från DLL4- immuniserade möss signifikant fördröjd tumörtillväxt jämfört med serumet från kontrollimmuniserade möss (figur 5c; P <0.01), vilket antyder att vaccinens terapeutiska effektivitet medieras genom ett humoralt svar mot musens DLL4.

Tumörtillväxtundertryckning i DLL4-vaccinerade möss förmedlas genom induktion av anti-DLL4-antikroppar. ( a ) Närvaron av anti-mus-DLL4-antikroppar i serumet från DLL4- immuniserade möss analyserades av ELISA. Figuren visar en representativ analys för en av fyra analyserade möss. ( b ) Isolering av B4-färgning av helmonterade P5-mushinnor från möss behandlade med immunserum från vektor- eller DLL4- immuniserade möss enligt protokoll 1 (3 × ID + EP; n = 4 för varje grupp). Pilspetsar indikerar endotelceller som är morfologiskt identifierade som spetsceller. ( c ) Tillväxt av ortotopiskt implanterade D2F2 / E2-tumörer i möss behandlade med serum från möss immuniserade med vektor ( n = 12) eller DLL4- plasmid-DNA ( n = 16) enligt protokoll 1 (3 × ID + EP). Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. ** P <0, 01; Studentens t- test.

Bild i full storlek

Sammanfattningsvis har vi utvecklat en immuniseringsstrategi som kan bryta toleransen mot den endoteliala cellcellantigenen, DLL4, och därmed resultera i induktion av DLL4-specifika hämmande antikroppar som innehåller terapeutisk aktivitet.

Vaccination mot DLL4 är inte förknippad med toxicitet eller försenad sårläkning

En ny studie av farmakologisk blockad av DLL4-signalering med antikroppar, fällor eller γ-sekretasinhibitorer rapporterade toxiciteter, inklusive levercellsatrofi, nekrotiska hjärtskador och godartade, subkutana sår neoplasmer, förknippade med långvarig användning (Yan et al., 2010) . För att undersöka om vaccination mot DLL4 ger upphov till liknande patologi utförde vi nekropsier på möss 5 månader efter deras första immunisering. Möss immuniserade med DLL4- vaccinet presenterat med lever som inte kan skiljas från vektorimmuniserade möss (figur 6a). Dessutom noterades inga nekrotiska områden i hjärtan på möss vaccinerade mot DLL4 (data visas inte). I våra studier som använde> 80 möss immuniserade med DLL4- vektorn observerades inga sårbildande subkutana lesioner. Det var anmärkningsvärt att ingen försening i pälsens återväxt på immuniseringsstället var synlig och punkteringssåren från elektroporationsproceduren läkades utan komplikationer.

Inga bevis för levertoxicitet eller försenad sårläkning efter immunisering med DLL4-vaccinet. ( a ) Hematoxylin- och eosinfärgning av vävnadssektioner i levern från möss som initierade immuniseringsproceduren med tom vektor eller DLL4- vaccinet 5 månader tidigare. ( b ) Läkningshastighet uttryckt som% stängning av sår tillförda möss immuniserade med tom vektor eller DLL4- vaccinet ( n = 8 möss per grupp, två sår per mus). * P <0, 05, upprepade mått ANOVA.

Bild i full storlek

En viktig faktor som ska beaktas för utvecklingen av vaccinbaserade tillvägagångssätt som riktar sig till den angiogena vaskulaturen är huruvida den hämmande effekten är begränsad till tumörangiogenes, eller sträcker sig också till fysiologisk kärlbildning. För att ta itu med denna fråga, dokumenterade vi läkningsprocessen av sticksår ​​i full tjocklek hos möss immuniserade med en tom vektor eller DLL4- vaccinet. Såsom visas i figur 6b, fortsatte sårläkning med en liknande hastighet oberoende av tidigare immunisering, med sår tillförda DLL4- immuniserade möss som nådde nästan fullständig tillslutning marginellt tidigare jämfört med vektorimmuniserade möss (figur 6b; P <0, 05).

Sammantaget var inga biverkningar som orsakats av blockering av fysiologisk DLL4-signalering i leverhomeostas eller sårläkning hos möss som utsattes för vår vaccinationsstrategi.

Diskussion

DLL4-signalering utgör ett spännande nytt mål för att begränsa funktionell tumörangiogenes, vilket framgår av nyligen genomförda studier (Noguera-Troise et al., 2006; Ridgway et al., 2006). Följaktligen resulterar hämning av DLL4-signalering genom användning av neutraliserande antikroppar, eller med ett lösligt DLL4-Fc-fusionsprotein, dramatiskt försämrad tumörtillväxt i xenograft-musmodeller. Fenotypiska analyser visar en till synes paradoxal ökning av vaskulariteten på grund av blockeringen i signalering genom DLL4-Notch1-vägen. DLL4-signalering via dess receptor, Notch1, uttryckt av den angränsande endotelcellen är nödvändig för bildandet av ett lämpligt antal endotelcellsceller i förhållande till endotelceller av stamceller (Hellstrom et al., 2007). Följaktligen leder till minskad Notch1-aktivering till överflödig bildning av endotelcellsceller, och som ett resultat, överdriven angiogen sprouting och en icke-funktionell kärl. Omvänt leder ektopisk aktivering av Notch1 med DLL4 till tumörtillväxtinhibering åtföljd av hypovaskularitet (Segarra et al., 2008). Våra analyser visade att den vaskulära fenotypen av tumörer odlade i möss ympade med DNA-vaccinet mot DLL4 liknade den hos tumörer från möss behandlade med DLL4-blockerande antikroppar, det vill säga ökad vaskulär täthet parallellt med reducerad vaskulär perfusion. I linje med den förbättrade, men icke-produktiva, angiogena spirningen i tumörer från immuniserade möss var perfusionen begränsad till de stora blodkärlen. Dessutom fann vi höga titrar av antikroppar mot DLL4 från mus i serumet efter immunisering med plasmid-DNA som kodar för humant DLL4 ; serum som visade sig reproducera känneteckenförändringar av hämning av DLL4-signalering under utvecklingsretinal angiogenes, och var hämmande för tumörtillväxt hos naiva möss. Det kraftfulla humorala svaret mot DLL4 från mus visar tydligt att den xenogena vaccinationsstrategin kunde bryta toleransen mot självantigenet, DLL4. Trots vår oförmåga att visa närvaron av DLL4-specifika T-celler i vaccinerade möss uppvisade splenocyter från immuniserade möss en högre basalproduktion av IFN-y; vars relevans förblir obestämd. Det är oklart vilken celltyp som är källan för IFN-y, men uttömning av CD4 + och CD8 + T-celler indikerade att dessa celltyper inte påverkar effektormekanismen för DLL4- vaccinet i de använda modellerna. Huruvida andra immunceller, såsom naturliga mördande celler, bidrar till IFN-y-produktionen och antitumoreffekterna återstår att undersöka.

Möjligheten att immunisera mot tumörangiogenes är spännande eftersom vaccination skulle möjliggöra en semi-profylaktisk behandlingsmetod, det vill säga förebyggande av återfall hos tumörfria patienter, snarare än att behandla redan befintliga tumörer. Långvarig och potent immunitet mot viktiga mediatorer av angiogenes, såsom DLL4, skulle tänkbart leda till induktion av ett vilande, icke-angiogeniskt tillstånd av spridda mikrometastaser, och därmed ett varaktigt skydd mot återkommande tillväxt utan behov av kronisk och kostsamma farmakologiska behandlingar med potentiella biverkningar. I själva verket visades möjligheten att generera ett långtidsminne mot tumörcellantigen efter postkirurgisk vaccination hos patienter med kolorektal cancer immuniserade med karcinoembryonantigenet, i vilket antikroppstiter 24 månader efter den sista vaccinationen korrelerade med längre överlevnad (Ullenhag et al., 2004). Vaccination med avsikt att förhindra tumörangiogenes har utförts genom att rikta in sig på olika endotelcellantigener, inklusive VEGFR2, angiomotin och trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor-p (Niethammer et al., 2002; Holmgren et al., 2006; Kaplan et al., 2006). I detta sammanhang representerar DLL4 ett särskilt attraktivt terapeutiskt mål med tanke på det senaste erkännandet av den vitala rollen för endotelcellsceller vid organisering av bildningen av den angiogena groden (Hellstrom et al., 2007; Suchting et al., 2007).

Induktionen av ett långtidsminnesvar mot angiogenes i allmänhet och DLL4 i synnerhet väcker viktiga säkerhetsproblem. Trots att tillgängliga data är begränsade visar studier av vaccination mot angiogenes hittills ingen eller endast mindre effekter på sårläkning eller embryonangiogenes (Niethammer et al., 2002; Plum et al., 2004). På liknande sätt hittade vi inte bevis för ett försenat sårläkningssvar efter vaccination mot DLL4, vilket stödde vidareutvecklingen av anti-angiogen vaccinationsterapier. Dock kan DLL4 ha andra roller för att bibehålla vävnadshomeostas. En ny studie visade uppkomsten av levertoxicitet, hjärtnekros och godartade vaskulära neoplasmer i huden efter långvarig farmakologisk blockad av DLL4 (Yan et al., 2010). Inga patologiska förändringar noterades hos möss som vaccinerats mot DLL4 under 5 månader, vilket indikerar att endogen induktion av antikroppar som är målriktade mot DLL4 ger upphov till en mer balanserad hämning, vilket erbjuder ett terapeutiskt fönster för selektiv behandling av malign tillväxt. Trots detta krävs mer noggranna analyser av organfunktion och kroniska effekter för att säkerställa procedurens säkerhet.

Lite är känt om uttrycket av DLL4 i humana tumörer. Njurcellcancer har dramatiskt uppreglerat DLL4 specifikt i kärlsystemet, vilket visas genom hybridisering in situ , och uttrycket är korrelerat med överflödet av VEGF (Patel et al., 2005). Uttrycket av endotel-DLL4 och VEGF-A är också korrelerade i koloncancer (Jubb et al., 2009). Våra studier indikerar att upprepad DNA-vaccination mot DLL4 har terapeutisk effekt i två olika ortotopiska musmodeller av ERBB2-uttryckande mammarcancer. Intressant nog konstateras att mänskliga bröstkarcinom konsekvent uppreglerar DLL4 med i genomsnitt 25 gånger jämfört med normal bröstvävnad (Ayyanan et al., 2006). Emellertid gjordes inga ansträngningar för att visa om uttrycket av DLL4 var begränsat till kärlsjukdom. I en separat rapport, där ett immunförhärdat tillvägagångssätt användes, befanns uttryck av DLL4 i endotelet vara en oberoende prognostisk faktor för ett ogynnsamt resultat i ett stort urval av bröstkarcinompatienter (Jubb et al., 2010). Ytterligare studier som undersöker korrelation mellan DLL4-uttrycksnivå eller -mönster till kliniska parametrar är således starkt motiverade.

Blockering av DLL4-signalering visades nyligen minska frekvensen av tumörinitierande celler i xenografts av koloncancer (Hoey et al., 2009), vilket indikerar att det kan finnas ytterligare fördelar med hämning av DLL4-signalering, utöver den öppna anti- angiogena effekter. Ändå är det troligt att den terapeutiska potentialen för en vaccinationsstrategi bäst skulle kunna realiseras i samband med kliniskt godkända regimer som riktar sig till andra celltyper inom tumören, såsom kemoterapeutiska läkemedel (till exempel taxaner), riktad terapi (till exempel trastuzumab) eller andra anti-angiogena behandlingar (till exempel bevacizumab). Vår utveckling av ett väl tolererat och effektivt vaccin mot patologisk angiogenes genom inriktning av DLL4 uttryckt med endotelcellsceller sätter steget för preklinisk optimering av den terapeutiska behandlingen som förberedelse för kliniska prövningar.

Material och metoder

Djurvård

Alla beskrivna djurstudier godkändes av den lokala kommittén för djurvård (Stockholm North, Sweden).

Plasmider och immuniseringar

Det cDNA som kodar för mänsklig DLL4 (Genecopoeia, Germantown, MD, USA) klonades in i pVAX1-vektorn (Invitrogen AB, Carlsbad, CA, USA) med användning av EcoR1 och SalI-restriktionsställen. DNA för immunisering producerades genom endotoxinfri beredning med användning av det endofria Giga-kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Kvinnliga BALB / c-möss, 6 till 8 veckor gamla, immuniserades tre gånger med de angivna intervallen (figur Ib), antingen genom intramuskulär injektion av 80 μg DNA i musculus tibialis eller genom intradermal injektion av 2 × 40 μg DNA omedelbart följt av elektroporering . Intradermal elektroporering (2 pulser, 1125 V / cm, 50 miks; +8 pulser, 275 V / cm, 10 ms) av injektionsställena utfördes med användning av Derma Vax elektroporationssystem (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD, USA).

Western blot

Expression av plasmidvaccinproteinprodukten verifierades genom transient transfektion av HeLa-celler med användning av Lipofectamine LTX (Invitrogen AB). Celler skördades efter 48 timmar och utsattes för Western blot med användning av en polyklonal kaninantikropp mot DLL4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Celllinjer och tumörutmaningsexperiment

BALB / c-bröstkarcinomcellinjerna, TUBO och D2F2 / E2, tillhandahölls vänligen av prof Guido Forni (University of Turin, Italy) respektive prof Wei-Zen Wei (Wayne State University, MI, USA). För tumörutmaningsexperiment fick mössen ortotiska injektioner av 1 × 10 6 TUBO- eller D2F2 / E2-celler i den fjärde inguinala bröstfettkudden.

Enzymbunden immunosorbentanalys

Plattor belades över natten vid 4 ° C med 2 pmol rekombinant humant DLL4 (Bioinvent International, Lund, Sverige) eller 1 pmol rekombinant mus-DLL4 (FoU-system) per brunn i 50 ul 0, 1 M natriumkarbonat, pH 9, 5. Sera utspäddes seriellt och inkuberades på plattorna under 1 timme vid rumstemperatur, och efter det att tvättarna var bundna antikroppar detekterades med användning av alkaliska fosfatas-konjugerade sekundära antikroppar (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

ELISpot

Kit för IFN-y ELISpot-analys för mus erhölls från Mabtech AB, Nacka, Sverige. I korthet renades splenocyter från immuniserade möss genom ficoll (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sverige), och 2 × 105 celler per brunn sattes till plattan. DLL4-specifik stimulering utfördes med mus-DLL4 9-mer-peptider härledda från den intracellulära delen av DLL4 eller den rekombinanta extracellulära delen av DLL4 (FoU-system) i en slutkoncentration av 5 ug / ml. Carcinoembryonic antigen BALB / c 9-mer peptid CEA 234 (Thermo Fisher Scientific, Ulm, Tyskland) eller rekombinant carcinoembryonic antigen (Protein Sciences, Meriden, CT, USA) användes som negativa kontroller. Den polyklonala stimulanten Concanavalin A användes som en positiv kontroll.

Immunfarvning och kvantifiering av vaskulär densitet och perfusion

Möss injicerades intravenöst med 50 ul fluorescein-märkt tomatlektin (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA), som fick cirkulera i 4 minuter innan mössen blev perfuserade hjärta med 10 ml iskall 0, 9% NaCl-lösning (fosfat) -buffrad), följt av 10 ml 4% paraformaldehyd. Tumörer skars ut och fryses i optimal skära-temperaturförening. Vävnadssektioner lufttorkades, fixerades i aceton och blockerades med användning av serumfritt proteinblock (DAKO, Glostrup, Danmark). Immunfarvning för CD31 utfördes med användning av MEC13.3-antikroppen (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), för DLL4 med användning av en polyklonal antikropp för kanin (FoU-system). Vaskulär täthet och perfusion kvantifierades som procentandelen av positivt färgningsarea, bestämt i 10 fält med hög effekt per mus för fem möss i varje grupp.

Mikroskopbildförvärv

Avbildning utfördes med användning av ett Nikon Eclipse E800-mikroskop utrustat med Nikon Plan Fluor-mål (× 10, NA 0, 30; × 20, NA 0, 50; × 40, NA 0, 75, Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna) vid rumstemperatur i luften med användning av Alexa 594 och Alexa 488-kopplade sekundära antikroppar. Bilder förvärvades med hjälp av en SPOT RTKE-kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heigths, MI, USA) med hjälp av SPOT-avancerad programvara.

T-cellutarmning

Utarmning av antingen CD4 + eller CD8 + T-celler från DLL4- vaccinerade möss initierades genom injektion av 200 μg av rått-anti-CD4 (GK1.5) eller rått-anti-CD8 (TIB-105) antikroppar (ATCC) 3 dagar före tumör utmaning. Rått IgG användes som en negativ kontroll (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA). Möss fick ytterligare intraperitoneala injektioner varje vecka under experimentets längd. T-cellutarmning verifierades genom flödescytometrisk analys efter färgning av de perifera blodcellerna för CD4 och CD8 (BD Biosciences).

Serumöverföring

Serum från djur immuniserade med tom vektor eller DLL4- vektorn uppsamlades vid avlivning, slogs samman och utspäddes 1: 3 med 0, 9% NaCl-lösning (fosfatbuffrad). Serumöverföring utfördes genom intraperitoneal injektion av 30 ul serum till P3 NMRI-valpar eller av 300 ul serum direkt efter tumörinokulering av naiva möss och två gånger i veckan under experimentets längd.

Analys av retinal angiogenes

Nätor avlägsnades från P5 NMRI-valpar och fullmonterades. Kärlen visualiserades genom färgning med biotinylerat isolektinB4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) följt av streptavidin-Alexa488 (Invitrogen).

Sårmodell och analys

Sårläkningsanalysen utfördes såsom beskrivits tidigare (Botusan et al., 2008) på möss immuniserade enligt protokoll 1. Kortfattat utfördes generell anestesi med 3% isofluran och hårets rygg rakades med en elektrisk klippare följt av en depilatorisk kräm. Huden sköljdes med alkohol och två sår i full tjocklek som sträckte sig genom pannicullus carnosus gjordes på dorsum på varje sida av mittlinjen med användning av en 6 mm biopsipunch. Efter kirurgiskt ingrepp höll djuren individuellt in. Under de första två dagarna fick djuren subkutan bupremorfin (0, 03 mg / kg) två gånger om dagen för att lindra eventuella besvär orsakade av proceduren. Varje behandling utvärderades i åtta djur per grupp. Digitala fotografier spelades in på operationdagen och varannan dag efter att de skadades. En cirkulär referens placerades bredvid för att möjliggöra korrigering av avståndet mellan kameran och djuren. Sårområdet beräknades i pixlar med användning av Image J 1, 32 (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, //rsb.info.nih.gov/ij/), korrigerat för området av referenscirkeln och uttryckt som procent av det ursprungliga området.

Statistisk analys

Statistiska analyser utfördes med användning av den icke-parade, två-svansade studentens t- test eller upprepade mätningar ANOVA (sårläkning) med a = 0, 05.