Systematisk proteininteraktomanalys av glykosaminoglykaner avslöjade ycbs som en ny bakteriell virulensfaktor | vetenskapliga rapporter

Systematisk proteininteraktomanalys av glykosaminoglykaner avslöjade ycbs som en ny bakteriell virulensfaktor | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Screening med hög kapacitet
  • proteomik

Abstrakt

Mikrobiella patogener har utvecklat flera strategier för att interagera med värdcellskomponenter, såsom glykosaminoglykaner (GAG). Vissa mikrobiella proteiner involverade i värd-GAG-bindning har beskrivits; emellertid har en systematisk studie på mikrobiell proteom – däggdjur GAG-interaktioner inte genomförts. Här använde vi Escherichia coli proteomchips för att undersöka fyra typiska däggdjurs-GAG, heparin, heparansulfat (HS), chondroitinsulfat B (CSB) och kondroitinsulfat C (CSC) och identifierade 185 heparin-, 62 HS-, 98 CSB - och 101 CSC-interagerande proteiner. Bioinformatiska analyser avslöjade de unika funktionerna av heparin- och HS-specifika interagerande proteiner i glycin-, serin- och treoninmetabolismen. Bland alla GAG-interagerande proteiner var tre yttre membranproteiner (MbhA, YcbS och YmgH). Invationsanalyser bekräftade att mutant E. coli som saknar ycbS inte kunde invadera epitelcellerna. Introduktion av plasmid som bär ycbS kompletterade de invaderande defekterna vid ycbS som saknar E. coli- mutant, vilket kan förbättras ytterligare genom överuttryck av ycbS . Förblockering av epitelceller med YcbS minskade andelen E. coli- invasioner. Dessutom observerade vi att hela komponenterna i ycb- operon var avgörande för invasionen. Förskjutningsanalysen avslöjade att YcbS binder till det lamininbindande stället för heparin och kan påverka värdens extracellulära matrisstruktur genom förskjutning av heparin från laminin.

Introduktion

Den extracellulära matrisen (ECM) är en huvudstruktur som innefattar molekyler som underlättar vidhäftning av celler, cell-till-cell-kommunikation och differentiering mellan olika djurceller 1 . ECM-komponenterna produceras intracellulärt av bosatta celler; när dessa molekyler har utsöndrats avsätter de sig och sammanställes därefter i den befintliga matrisen 2 . ECM består av ett laminerat nät av fibrösa proteiner och glykosaminoglykaner (GAG) 3, 4, 5, 6 . GAG är kolhydratpolymerer som innehåller variabelt sulfaterad disackaridupprepning av β4GlcUA – α4GlcNAc eller β4GlcUA – β3GalNAc. Upprepningarna av ß4GlcUA – α4GlcNAc bidrar till syntesen av heparin och heparansulfat (HS), medan β4GlcUA – β3GalNAc-upprepningarna bidrar till syntesen av kondroitinsulfat B (CSB) och kondroitinsulfat C (CSC) 7 . GAG-kedjor, inklusive HS, CSB och CSC, är vanligtvis fästa till kärnproteiner på ECM och bildar negativt laddade proteoglykaner. Däremot utsöndras heparin från degranulerade mastceller och existerar som en fri GAG-kedja, som interagerar med cellytan 8 . Dessa GAG uppvisar olika cellulära funktioner enligt deras sammansättning och polysackaridkedjestorlek 7, 9 .

Flera studier har rapporterat att GAG: er är involverade i cellstruktur, igenkänning, vidhäftning och signalering 4, 10, 11 . Dessutom interagerar GAG med mikrobiella proteiner, och dessa interaktioner är väsentliga för mikrobiell patogenicitet 6, 12 . Vissa patogener har utvecklats GAG-bindande proteiner (GBP) som känner igen värd GAG och använder fördelarna med dessa molekyler 13, 14 . Exempelvis underlättar sådan bindning bakteriell vidhäftning till värdcellytan och i vissa fall medierar till och med patogenspridning 14 . Bakteriella adhesiner är den vanligaste typen av bakteriella virulensfaktorer och underlättar vidhäftningen av bakterieceller till värdytan. Många limbiner av fimbrialtyp känner igen GAG och medierar därmed bindning till värden som ett kritiskt steg i patogenesen för de flesta infektioner 15 .

Vissa mikrobiella virulensfaktorer involverade i värd – GAG-bindning har beskrivits; emellertid har en systematisk studie på mikrobiell proteom och däggdjur GAG-interaktioner inte rapporterats. Protein-mikroarrayer har nyligen framkommit som ett användbart och kraftfullt verktyg för att genomföra studier med hög genomströmning av proteiner. Flera proteommikro-matriser har framställts, såsom jäst 16, Escherichia coli 17, Arabidopsis 18 och humana proteom-mikroarrayer 19, 20 . Dessa studier har nyligen tillämpats på olika forskningsområden, inklusive protein-protein, protein-lipid, protein-DNA, protein-peptid, protein-cell och protein-små molekylinteraktioner 21 . Här genomförde vi en proteombredd screening av GAG-interaktomen med hjälp av E. coli proteomchips innehållande ungefär 4300 icke-redundanta proteiner. Vi använde fyra typiska däggdjurs-GAG, nämligen heparin, HS, CSB och CSC, för att profilera interaktioner mellan dessa molekyler med E. coli- proteomet. Flera intracellulära och membranbundna GBP identifierades efter grundlig screening och bioinformatisk analys. Vi validerade tre GBP för yttre membran: MbhA, YcbS och YmgH. YcbS bekräftades som en huvudmolekyl för bakteriell infektion.

Resultat

Identifiering av den GAG-interagerande proteomen med användning av E. coli proteomchips

Vi utförde proteinomfattande screening av GAG-interaktomen med hjälp av E. coli proteomchips. De kombinerade systemmetoderna användes för att utvärdera nya GBP, och de viktigaste virulensfaktorerna bestämdes följaktligen. Som visas i kompletterande figur S1, uttryckte och renade vi ungefär 4300 E. coli- proteiner för att tillverka hela E. coli- proteomchipet. Dessa proteiner renades med användning av ett prototypreningsprotokoll med hög kapacitet och trycktes därefter på chips i duplikat 17 . Vi använde fyra typiska däggdjurs-GAG märkta med DyLight 650, heparin, HS, CSB och CSC för att profilera interaktioner mellan dessa molekyler med E. coli- proteomet. GBP identifierades med hjälp av en lokal avskärning av medelvärdet + 2 standardavvikelser (SD), vilket avser 2 SD: er högre än det regionala signalmedlet (proteinfläckarea, 9 × 9) för den specifika proteinfläcken. Bioinformatiska analyser, nämligen Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -vägskartläggning och motivsökningar, utfördes för att bestämma den biologiska relevansen av de identifierade GBP-värdena. De yttre membranen GBP identifierades därefter, och deras funktioner validerades med hjälp av E. coli invasionsanalyser som involverade knockout, komplementering, överuttryck och blockeringsstrategier. Interaktioner mellan GAG och GBP bekräftades vidare med användning av bindningsaffinitetsanalyser (Kd) och genom flödescytometri. Dessutom utvärderades handlingen av GBP-träffar på GAG: er med hjälp av förskjutningsanalyser.

I chipanalysen märkte vi kemiskt GAG med DyLight 650 N-hydroxysuccinimid (NHS) ester (fig. La), som reagerade med de primära eller sekundära aminerna för att generera stabila bindningar. De DyLight 650-märkta GAG: erna inkuberades individuellt med E. coli- proteomchipet. De representativa bindande proteinsignalerna visas i fig Ib. Vi använde ett avgränsningsvärde för medelvärde + 2 SD och identifierade 185, 62, 98 och 101 proteiner som GBP för heparin, HS, CSB och CSC, respektive (kompletterande data S1). Ingen bindningssignal identifierades från den negativa kontrollbilden (endast DyLight 650 utan GAG).

( a ) E. coli proteomchips testade med heparin, HS, CSB och CSC. GAG: erna märktes med DyLight 650 (GAGs-DyLight 650) och testades individuellt med användning av E. coli- proteomchips. Efter tvättning för att avlägsna överskott av obundet GAG, skannades flisen för att detektera bindningssignalerna. ( b ) För att bestämma reproducerbarheten för chipanalysen visas chipbilden av YcbS och heparin från triplikaxperiment. ( c ) De tre GAG-bindande proteinsignalerna MbhA, YcbS och YmgH anges med användning av en rektangel i undersökningsresultaten för heparin, HS, CSB och CSC.

Bild i full storlek

KEGG-bananalys av identifierade GBP

Vi använde KEGG för att avgränsa den biologiska relevansen av identifierade GBP. Bland alla GBP identifierades två anrikade funktioner (lipopolysackaridbiosyntes och ribosom). N-acetylglukosamin (GlcNAc) -upphärdande heparin och HS rapporterades reglera virulensegenskaper i mikrober 22 ; därför analyserade vi ytterligare KEGG-funktionen i heparin- och HS-specifika GBP, som binder till heparin eller HS men inte till CSB eller CSC. Totalt finns 105 heparin- och HS-specifika GBP. Resultaten avslöjade förbättrad lipopolysackaridbiosyntes i heparin- och HS-specifika GBP. Bland dessa GBP identifierade vi dessutom en unik anrikad funktion som styr glycin-, serin- och treoninmetabolism, vilket tyder på att många heparin- och HS-specifika GBP fungerar i bakteriell aminosyrametabolism. Aminosyrametabolism involverar syntes av virulensfaktorer i bakterier 23 ; därför har dessa fynd ytterligare klargjort de biologiska rollerna för heparin- och HS-specifika GBP för att reglera aminosyrametabolismen, och därigenom potentiellt reglera syntesen av bakteriell virulensfaktor.

Motivsökning av heparin- och HS-specifika GBP

Vi använde GLAM2 för att identifiera alla kända motiv som förekommer i en sekvens av heparin- och HS-specifika GBP. Specifikt identifierade vi en unik konsensussekvens, XPAX (0, 1) EA [SV] X (0, 1) EXQ [LV] X (0, 2) [AR] RLLR, för denna GBP-grupp (tilläggsfigur S2) . Dessutom matchade resterna 13–18 (X (0, 2) [AR] RLLR) av detta motiv fem av de sex tidigare rapporterade kända bindningsmotiven för heparin 24 . Detta motiv representerar troligen heparins bindningssäte.

Bioinformatiska analyser avslöjade att de membranbundna GBP möjligen gav den mest spännande observationen. På grund av den cellulära platsen för dessa molekyler har de yttre membranbundna GBP-värdena en högre sannolikhet för att upprätta direktkontakt med värdcellens GAG och kan således bidra till bakteriell bindning och invasion. Genontologi för den cellulära komponenten i GBP med användning av chipanalyser gav tre yttre membranproteiner: MbhA, YcbS och YmgH. MbhA binder till heparin, HS och CSB. YcbS och YmgH binder till heparin enbart (fig. 1c). Dessa tre GBP användes därefter i ytterligare analyser för att undersöka rollerna för dessa molekyler i värd-patogen-interaktioner.

YcbS är avgörande för E. coli- invasion i värdceller

Vi undersökte om bindningen av de identifierade yttre membranproteinerna är kritisk för invasionen av E. coli i värdceller. De tre yttre membranproteinerna sloges ner för att undersöka relevansen av dessa molekyler i bakterieinfektioner med användning av invasionsanalyser (kompletterande figur S3). Specifikt tillsattes bakterierna till den humana ileocekala epitelcellslinjen HCT-8 för invasion. De extracellulära icke-invaderande bakterier dödades efter inkubering av HCT-8-cellerna med gentamycin under 1 timme. De cytosolinträngande bakterierna frisattes därefter efter att ha stört HCT-8-cellerna med 0, 1% Triton X-100 och kvantifierats genom spridplattmetoden. En vildtypskontroll (WT) användes som en jämförelse för att beräkna procentandelen av bakterieinvasionen. Såsom visas i fig. 2a visade endast ycbS- spärrande E. coli- mutanter (∆ ycbS ) en signifikant minskning av bakterieinvasion jämfört med WT-kontrollen ( p <0, 05). Vi omvandlade därefter ycbS- plasmiden (pCA24N– ycbS ) till ∆ycbS . YcbS i ∆ ycbS inducerades att ge en WT-expressionsnivå med 0, 0025 mM IPTG. YcbS kan ytterligare induceras med högre koncentrationer av IPTG på ett dosberoende sätt. YcbS var icke-detekterbar i ∆ ycbS (fig. 2b). Invasionanalysen visade att jämfört med invasionsförmågan hos WT-kontrollen kompletterades den för ∆ycbS av plasmiderna som bär ycbS vid 0, 0025 mM IPTG-induktion (fig. 2c). YcbS- induktion vid högre koncentrationer av IPTG förbättrade dessutom bakteriella invasioner i ^ ycbS _ ycbS ( p <0, 05; fig. 2c). Detta resultat indikerar att YcbS direkt bidrog till förmågan hos E. coli att infektera värdceller.

( a ) Keio E. coli- mutanterna som saknade en enda GBP-gen utsattes för invasionsanalyser. Den ycbS- spärrande E. coli- mutanten (∆ ycbS ) visade signifikant lägre invasion än WT-kontrollen. ( b ) ycbS- mutanter (∆ ycbS ) transformerades med plasmiden pCA24N– ycbS för att bilda ∆ ycbS _ ycbS ; QPCR-analys visade att YcbS i ycbS kan induceras för att ge en WT-expressionsnivå med 0, 0025 mM IPTG och ytterligare överuttryck med IPTG på ett dosberoende sätt. PCA24N-plasmiden utan en geninföring användes som en negativ kontrollvektor i WT och A ycbS . ND representerar ett oidentifierbart värde. Asterisken representerar en statistiskt signifikant skillnad i ycbS- expression av E. coli i varje grupp ( p <0, 05). Data visas som medelvärdet av tre biologiska replikat. ( c ) Invationsanalysen avslöjade att uttryckta ycbS kompletterade de invaderande defekterna av ∆ ycbS när bakterierna behandlades med 0, 0025 mM IPTG. Ytterligare inducering av ycbS- plasmider med en ökande koncentration av IPTG-dosberoende ökade procenttalet av framgångsrika bakteriella invasioner av ∆ ycbS _ ycbS- stammen ( p <0, 05). Invaderade bakterier räknades och standardiserades som procenttal. Kontrollerna sattes till 100%. Stjärnorna representerar statistiskt signifikanta skillnader i invasionens effektivitet för E. coli i varje grupp ( p <0, 05). Uppgifterna visas som medelvärdet av fem biologiska replikat. ( d ) Bindningen av renad YcbS till HCT-8-cellytan reducerade gradvis E. coli- invasionen av värdcellerna utöver ökningen av YcbS (10, 50 och 100 nM), vilket visades med användning av blockeringsanalyser, jämfört med WT-kontrollen. De AroP-behandlade cellerna (negativ kontroll) visade inga blockerande effekter. Invaderade bakterier räknades och standardiserades som procenttal. Kontrollerna sattes till 100%. Stjärnorna representerar statistiskt signifikant skillnad i invasionens effektivitet hos E. coli jämfört med WT-kontrollen ( p <0, 05). Uppgifterna visas som medelvärdet av fem biologiska replikat.

Bild i full storlek

Därefter bestämde vi om det yttre membranproteinet YcbS blockerar E. coli- invasion i HCT-8-cellerna. Vi förinkuberade HCT-8-cellerna med olika koncentrationer (0, 50 och 100 nM) renad YcbS, följt av bedömning med användning av invasionsanalyser. AroP-proteinet användes som negativ kontroll eftersom det inte finns i vår GBP-lista. Resultaten avslöjade att blockering med YcbS gradvis minskade andelen av framgångsrik E. coli- invasion i värdcellerna jämfört med WT-kontrollcellerna ( p <0, 05; Fig. 2d). De negativa kontrollcellerna uppvisade inga blockerande effekter. Detta resultat bekräftar vidare att YcbS underlättar E. coli- invasion.

Ycb- operonet spelar en kritisk roll vid E. coli- invasion i värdceller

YcbS är en komponent i en förmodad chaperon-usher fimbrial operon i E. coli 26 . Därför undersökte vi huruvida de andra komponenterna i denna operon också bidrar till E. coli- värdcellinteraktioner. Vi utförde invasionsanalyser i olika E. coli- mutanter som saknade ycbQ , ycbR , ycbS , ycbT , ycbU , ycbV eller ycbF . För att säkerställa invasionsanalysresultatet uteslutande på grund av invasionsförmågan, inte tillväxtförmågan under analysperioden, undersöktes de ycb- försvagande E. coli- mutanterna för att säkerställa att de uppvisade ekvivalenta tillväxtkurvor med WT-kontrollen (kompletterande fig. S4 ). Våra resultat visade att alla mutanter, utom ycbF , hade en lägre invasionsförmåga än WT-kontrollen gjorde ( p <0, 05; fig. 3), vilket indikerar att ycb- operon spelar en viktig roll i bakterieinvasionen.

Sju ycb- försvagande E. coli- mutanter odlades med HCT-8-celler och utsattes för invasionsanalyser. Förutom ycbF uppvisade alla mutanta ycb- stammar en lägre invasionskapacitet än WT-kontrollen. Invaderade bakterier räknades och standardiserades som procenttal. Kontrollerna sattes till 100%. Stjärnorna representerar den statistiskt signifikanta skillnaden i invasionseffektiviteten hos E. coli- mutanta stammar jämfört med WT-kontrollen ( p <0, 05). Uppgifterna visas som medelvärdet av fem biologiska replikat.

Bild i full storlek

Bindande affinitet mellan YcbS och heparin

YcbS visade en stark bindningsaffinitet för heparin (fig. Ib); därför mätte vi ytterligare Kd för YcbS till heparin med användning av ytplasmonresonans (SPR). Renad YcbS immobiliserades först på SPR-sensorchipet. Olika koncentrationer av heparin (0, 8, 4, 20 och 100 mikrometer) användes därefter för att undersöka med YcbS-chipet. Resultatet avslöjade att YcbS var bundet till heparin med en Kd av 6, 9 μM (fig. 4a).

( a ) Heparins bindningsaffinitet till YcbS-proteinet bestämdes genom SPR-interaktionsanalys. Sensorgrammet avslöjade realtidsassociation och dissociation SPR-profiler motsvarande heparinkoncentrationer på det immobiliserade YcbS-chipet. Den beräknade Kd för YcbS – heparinbindning var 6, 9 μM. ( b ) Flödescytometri avslöjade att YcbS bunden till HCT-8-epitelceller visade signifikant högre DyLight 650-bindningssignaler än WT-kontrollen ( p <0, 05). Stapeldiagrammet representerar vikningsökningarna i signalökningarna i HCT-8-cellerna inkuberade med YcbS och DyLight 650-märkt anti-His-antikropp jämfört med de som inkuberades med DyLight 650-märkt anti-His-antikropp ensam. Uppgifterna visas som medelvärdet av tre biologiska replikat.

Bild i full storlek

Vi undersökte sedan om YcbS binder till de hepariniserade ytorna hos däggdjursceller genom flödescytometri. HCT-8-celler användes också som en värdcellmodell. En DyLight 650-märkt anti-Histidin (His) antikropp användes för att färga YcbS. Dessutom betraktades inkubation med anti-His-antikroppen ensam som den negativa kontrollen. DyLight 650-signaler på celler inkuberade med YcbS var signifikant högre ( p <0, 05; fig. 4b), vilket bekräftar att YcbS binder till HCT-8-celler.

YcbS förtränger heparin-lamininbindning

Lamininer binder till heparin i laminin globular (LG) domäner, som spelar en avgörande roll för att reglera ECM-aggregatet och stabilisera cellmembranstrukturen 27 . Dessutom är den heparinbindande domänen för LG-domäner ett bakteriemål. Störning med laminin-heparininteraktion genom heparinbindande patogener med hög affinitet kan destabilisera cellmembranstrukturen, vilket kan resultera i förlust av lämpliga signaler och en betydande störning av cellfunktionen 28, 29 . Nuvarande fynd avslöjade YcbS – heparin-interaktioner, som involverar bakteriella invasioner; därför antog vi att YcbS riktar sig mot heparin-laminin-interaktionen. För att testa denna hypotes utförde vi förskjutningsanalyser för att karakterisera YcbS-medierad heparin-laminin-bindning genom ett chip-analysmetod. Proteinchips innehållande tryckt laminin förinkuberades med DyLight 650-märkt heparin för genomförande av bindningsreaktionen. Efter flera tvättningar utfördes förskjutningsanalysen genom ytterligare inkubering av chips med olika koncentrationer av renad YcbS (fig. 5a). Resultaten avslöjade att YcbS dosberoende reducerar fluorescenssignalerna från DyLight 650-märkt heparin bundet till laminin (Fig. 5b, c). Bovint serumalbumin (BSA) användes som en negativ kontroll. Detta resultat indikerade att YcbS riktar sig mot heparin-laminin-interaktioner genom att förskjuta heparin från bindning till laminin. Detta indikerade att YcbS binder till det lamininbindande stället för heparin och potentiellt stör den värd-ECM-strukturen, vilket antyder att YcbS är avgörande för bakteriell invasion.

( a ) Ett schematiskt diagram över förskjutningsanalyser utförda efter testning av DyLight 650-märkt heparinförinkuberat lamininchips med användning av olika koncentrationer av YcbS för att mäta proteinets förmåga att förskjuta DyLight 650-märkt heparin från att binda till laminin. ( b ) Fluorescenssignalerna som detekterades från DyLight 650-märkt heparinbindning till laminindosberoende minskade med ökande koncentrationer av den undersökta YcbS. ( c ) Diagramdiagrammet rapporterar den genomsnittliga fluorescensintensiteten för DyLight 650-märkt heparinbindning till laminin i frånvaro (F0) och närvaro (F) av YcbS (n = 72). Fluorescensintensiteterna standardiserades som procenttal. Kontrollerna sattes till 100%. Stjärnorna representerar den statistiskt signifikanta skillnaden mellan fluorescensintensiteterna av DyLight 650-märkt heparinbindning till laminin i ökande koncentrationer av det undersökta YcbS jämfört med WT-kontrollen ( p <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

Vi genomförde en systematisk proteinomfattande screening av E. coli- proteininteraktomen hos fyra typiska däggdjurs-GAG. Hundratals proteiner identifierades som GBP. Vi använde genontologi för att visualisera anrikning av GBP i cellkomponent, biologisk process och molekylär funktion. Vi observerade att många termer relaterade till cytoplasma berikades i cellkomponenten (kompletterande fig. S5a). Analys i biologiska processer avslöjade vidare flera anrikningar beträffande ämnesomsättning (kompletterande fig. S5b). Detta resultat indikerade att de flesta GBP var lokaliserade intracellulärt och har funktioner som involverar bakteriell metabolism, vilket kan spegla interaktioner mellan GBP som bidrar till biosyntesen av bakteriekapseln eller andra bakteriella virulenta komponenter med en sammansättning som liknar den hos däggdjur GAG 30, 31 . Dessutom avslöjade den molekylära funktionen hos GBP nukleinsyrabindande proteiner som den mest dominerande proteinklassen (kompletterande fig. S5c). Detta resultat förväntades eftersom många nukleinsyrabindande proteiner tenderar att binda till negativt laddade molekyler, såsom DNA och RNA, och sulfaterade GAG 32 . Bland de fyra GAG: er, heparin bundet till mest identifierade GAG-träffar, vilket speglar att heparin är den mest negativt laddade biologiska molekylen som har identifierats 33, 34, 35 . Såsom tidigare beskrivits tillhandahåller heparin den perfekta ytan för vidhäftning av både grampositiva och -negativa bakterier genom bindning till positivt laddade proteiner på bakterieytan 36 .

I denna studie fokuserade vi på tre GBP för yttre membran för att undersöka konsekvenserna av dessa molekyler på E. coli vidhäftning till värdcellerna. Invasionanalyser avslöjade att YcbS inte bara binder till ytan hos däggdjursceller utan också spelar en avgörande roll i invasionen av värdceller. Vi observerade också att inte bara ycbS utan också nästan alla komponenter i ycb- operon ( ycbQ , ycbR , ycbS , ycbT , ycbU och ycbV ) är kritiska för bakterieinvasion.

ycb är ett kryptiskt operonsystem i E. coli K12, som producerar en extracellulär fimbrielliknande struktur som är avgörande för att bilda biofilmer 26 . Därför bidrar reglering av denna fimbrielliknande struktur av ycb- operonet troligen till bakteriell vidhäftning till värdcellytan. YcbQ, en annan komponent i ycb- operonet, binder också till laminin och spelar en viktig roll i bakteriell vidhäftning till värdcellerna 37 . Därför utvidgar resultaten som avslöjar YcbS – heparinbindning den nuvarande förståelsen av de funktionella rollerna hos ycb- operon vid infektion med E. coli . Dessutom är YcbQ och YcbS två yttre membrankomponenter i fimbrial struktur som produceras av ycb- operon 38, vilket antyder att dessa två proteiner fungerar som bakteriella vidhäftningar och upprättar en direkt interaktion med värdcellytan. Med tanke på skillnaden i bindningsförmågan hos YcbS och YcbQ för att vara värd för ECM-komponenter, bör dessa två proteiner fungera synergistiskt eller alternativt binda till olika värdcellytor. Förskjutningsanalysen avslöjade att YcbS förskjuter heparin från bindning till laminin, vilket indikerar att YcbS troligen bidrar till bakteriell infektion genom att störa heparin-lamininbindningen på värdcellulärytan. Noterbart är heparin-laminin-växelverkan en central aspekt av ECM-organisation från däggdjur, vilket bidrar till en serie interaktioner som resulterar i tätt vidhäftning, efterföljande internalisering och potentiella nedströms inflammatoriska svar som är karakteristiska för infektioner 39 . Därför kan YcbS och YcbQ agera samarbete för att underlätta bakterieinfektioner.

Förutom upptäckten av en ny roll som YcbS avslöjade vår chipanalys hundratals proteiner interagerade med GAG. Trots deras biologiska relevans på grund av GAG-bindning är den potentiella användningen av pund av avgörande betydelse för utvecklingen av sjukdomsterapi, inte bara inriktad på infektionsrelaterade sjukdomar utan också för cancerbehandling. Exempelvis skulle GBP vara användbara för att utveckla biologiskt aktiva GAG-bindande peptider och därmed demonstrera en alternativ läkemedelsbehandling mot cancer 40 .

Sammanfattningsvis är detta den första studien som systematiskt granskar fyra typiska däggdjurs-GAG: er med en lista över GBP som är potentiellt avgörande för både ytterligare molekylära studier och utvecklingen av nya terapeutiska behandlingar som riktar sig till interaktioner med cellulära GAG. Ytterligare analyser av de yttre membranproteinerna avslöjade en roll av ycb- operon vid E. coli- invasionen.

metoder

Bakteriestammar, cellodling och kemikalier

Enkel genutsläppsmutanter av E. coli K12 erhölls från Keio-insamlingen 41 ; dessa mutanter utformades för att skapa rader i ramar vid eliminering av motståndskassetten. Den öppna läsramen (ORF) -klonerna från E. coli K12 erhölls från det pCA24N-baserade överuttryck ASKA-biblioteket 42 . Varje klon kodar ett protein från en förutsagd ORF bunden till His under kontroll av en IPTG-inducerbar promotor. Kanamycin (50 ug / ml) användes för att odla Keio-knockout-mutanter. ASKA ORF-klonen bibehölls genom tillsats av kloramfenikol (30 ug / ml).

Den humana ileokekala epitelcellslinjen HCT-8 (American Type Culture Collection, CCL-244) bibehölls i ett komplett medium sammansatt av ett RPMI-1640-medium (Sigma – Aldrich) kompletterat med 1 mM natriumpyruvat (Sigma – Aldrich) och 10 % (v / v) värmeinaktiverat hästserum (Invitrogen) vid 37 ° C under 5% CO 2 och 95% fuktighet. Cellerna subkulturerades två gånger i veckan i förhållandet 1: 3 till 1: 8.

GAG: er (Sigma – Aldrich; intervall, 10–15 KDa) var heparin, HS, CSB och CSC, och dessa molekyler användes för proteommikroarray-screening.

Tillverkning av E. coli proteomchips

Vi konstruerade ett proteomchip innefattande cirka 4300 individuella renade E. coli- proteiner i full längd, såsom tidigare rapporterats 12 . E. coli- kloner innehållande vektorer som uttrycker 6 x His-märkta proteiner 42 ympades i 96-djupa brunnsplattor (Nunc). Expression inducerades därefter med användning av IPTG under 3, 5 timmar; klonerna pelleterades och lagrades vid -80 ° C över natten.

För proteinrening återsuspenderades de tinade cellpelletsna i en lysbuffert bestående av 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM imidazol, CelLyticB, 1 mg / ml lysozym, 50 enheter / ml benzonas, en proteinasinhibitorblandning, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid och Ni-NTA Superflow-hartser (Qiagen). Efter en 2, 5-timmars inkubation på en plattskakare vid 4 ° C överfördes blandningarna till 96-brunnars filterplattor (Nunc) och tvättades därefter med tvättbuffert I (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20% glycerol 20 mM imidazol och 0, 1% Tween 20, pH 8, 0) och tvättbuffert II (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 30% glycerol, 30 mM imidazol och 0, 1% Tween 20, pH 8, 0) och eluerades därefter med en elueringsbuffert (50 mM NaH2P04, 150 mM NaCl, 30% glycerol, 300 mM imidazol och 0, 1% Tween 20, pH 7, 5). De renade proteinerna trycktes i duplikat på Biao aldehydbelagda objektglas med användning av ChipWriter Pro (Bio-Rad) och lagrades vid -80 ° C tills vidare användning.

DyLight 650-märkning av GAG

GAG: erna var kemiskt märkta med DyLight 650 (Thermo Fisher Scientific). En blandning av 0, 5 mM av varje GAG ​​löstes i 50 mM boratbuffert och 10 mg / ml av en DyLight 650 NHS-ester (molförhållande, 1:20) inkuberades vid 4 ° C under 2 timmar. Reaktionsblandningen inkuberades därefter med ett 10-faldigt molärt överskott av Tris-HCl-buffert (pH 8, 5) för att släcka den oreagerade NHS-gruppen och lagrades vid -80 ° C tills vidare användning.

Testa E. coli- proteomchips med GAG

Varje E. coli- proteomchip blockerades med 1% BSA för att reducera icke-specifik bindning. Cirka 0, 5 mikrometer DyLight 650-märkt heparin, HS, CSB och CSC i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 0, 05% Tween 20 och 1% BSA testades individuellt med chipet vid rumstemperatur under 1 timme. Efter inkubation tvättades flisen i följd med TBS med 0, 05% Tween 20 och destillerades vatten under 5 minuter för att avlägsna överskott av obundna GAG. Spånen torkades genom centrifugering vid 201 x g och skannades därefter med användning av en LuxScan-10 K / A-matrisskanner (CapitalBio). Bindningssignalerna förvärvades och analyserades med GenePix Pro 6.0-programvara. Varje GAG-bindande experiment genomfördes i tre separata E. coli- proteomchips.

Bioinformatikanalys

GBP valdes på grundval av en lokal avgränsning, definierad som 2 SD: er över det regionala signalmedlet (proteinfläckarea, 9 × 9) för den specifika proteinfläcken. ProCAT 43 användes för signalnormalisering. Alla identifierade GBP var mappade i funktionella grupper med hjälp av KEGG-databasen 44, 45 . Konsensusmotivet sökte med GLAM2. De identifierade GBP-sekvenserna konverterades till FASTA-formatet och analyserades med GLAM2 för att kartlägga konsensusmotiv 46 . GLAM2-parametrarna ställdes in som standard, och de resulterande motiven sökte genom hela E. coli- proteomen med användning av GLAM2SCAN.

Kvantitativ realtid omvänd transkription PCR (QPCR)

Det totala cellulära RNA extraherades med användning av MagNA Pure Compact System (Roche). Mängden RNA bestämdes med användning av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific). RNA-prover transkriberades omvänt under 120 minuter vid 37 ° C med cDNA-omvänd transkriptionssats med hög kapacitet enligt tillverkarens instruktioner (Applied Biosystems). QPCR utfördes med användning av 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) och 200 nM fram- och bakre primers under följande betingelser: 10 minuter vid 95 ° C, 40 cykler på 15 s vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C De använda primersekvenserna är som följer: framåt 5'-GAACAGCACCGGGCTGAA-3 'och omvänd 5'-TAACGACGCCGCATCAAGT-3' för ycbS och framåt 5'-ATACCGCATAACGTCGCAAGA-3 'och omvänd 5'-GTGAGCCGTTAACCCCAC. Varje analys kördes i tre exemplar på ett Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems), och uttryckningsförändringar härleddes med användning av den jämförande CT-metoden. Dessutom användes 16S rRNA som referensgen för att normalisera specifikt genuttryck i varje prov.

Komplementering av ycbS i Keio E. coli- mutanter

Den ycbS- spärrande E. coli- mutanten erhölls från Keio-kollektionen 41 . För att komplettera Keio ycbS- mutanterna erhölls plasmiden pCA24N – ycbS som innehöll ycbS från ASKA-klonbiblioteket 42 och användes för att transformera ycbS- mutanten, såsom tidigare beskrivits 47 .

Kvantitativa cellinvasionsanalyser

För att bestämma bakterieinvasionen i epitelceller förinokulerades först bakteriekolonierna för spridplattan i 3 ml av ett färskt Luria – Bertani (LB) medium med skakning över natten vid 37 ° C och 30 × g. Cirka 1 ml av bakteriekulturerna inokulerades sedan i 20 ml av ett LB-medium och inkuberades med skakning vid 37 ° C och 30 x g tills de nådde den midlogaritmiska fasen (optisk densitet vid 600, 1, 0). För cellinvasionsanalyserna tillsattes 2 x 107 CFU / ml bakterieceller till sammanflytande HCT-8-celler (ungefär 2, 3 x 105 celler i en vävnadskulturplatta med 12 brunnar) i ett komplett medium sammansatt av en RPMI-1640 medium kompletterat med 1 mM natriumpyruvat och 10% värmeinaktiverat hästserum. Plattan inkuberades vid 37 ° C under 5% CO2 och 95% fuktighet under 3 timmar. De infekterade epitelcellerna inkuberades därefter med 100 μg / ml gentamycin i ett komplett medium efter fem tvättningar med ett RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich). Dessutom inkuberades cellerna under ytterligare 1 timme vid 37 ° C under 5% CO2 och 95% fuktighet för att döda de extracellulära bakterierna, såsom tidigare rapporterats 25 . Därefter tvättades HCT-8-cellerna fem gånger med ett RPMI-1640-medium och avbröts med 0, 1% Triton X-100, och de frisatta bakteriecellerna kvantifierades genom spridplattmetoden. Cellinvasionens effektivitet bestämdes som procentandelen av bakterieceller som utvunnits från de fem biologiska upprepade brunnarna jämfört med 100% effektivitet i cellerna infekterade med deras isogena föräldra-stam (WT-kontroll).

I experiment i vilka ycbS tillhandahölls med användning av pCA24N-plasmiden, förinokulerades först bakteriekolonierna för spridningsplattan i 3 ml av ett nytt LB-medium med skakning över natt vid 37 ° C och 30 x g. Cirka 1 ml av bakteriekulturerna överfördes därefter till 20 ml av ett nytt LB-medium och inkuberades med skakning vid 37 ° C och 30 x g tills de nådde en optisk densitet vid 600 av 0, 7. Därefter tillsattes olika koncentrationer av IPTG till bakteriekulturerna, inklusive WT-kontrollen, och kulturerna inkuberades vid 37 ° C och 30 x g under 3 timmar 48 för att säkerställa YcbS-uttryck från de ympade bakterierna under invasionstestet.

Blockering av analyser

Det renade YcbS (10, 50 och 100 nM) inkuberades med HCT-8-cellerna vid 37 ° C under 1 timme. Cellerna tvättades därefter två gånger med ett RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich) och utsattes för cellinvasionsanalyser, såsom beskrivs i föregående avsnitt.

Kd-bestämning med SPR

En anpassad SPR-biosensor 49 byggd enligt våglängdsfrågan med en femkanals Teflon-flödescell användes för att övervaka igenkänningsinteraktionen mellan heparin och YcbS. Den nakna guldytan på ett SPR-chip tvättades först noggrant med avjoniserat vatten och absolut etanol, torkades under argon och nedsänktes omedelbart i en blandning av 0, 5 mM 11-amino-1-undekantiolhydroklorid och 1, 5 mM 6-merkapto-1-hexanol i absolut etanol. Spånytan nedsänktes därefter i 12, 5% glutaraldehyd under 1 timme vid rumstemperatur. YcbS (1 mikrometer) immobiliserades dessutom kovalent på den aktiverade ytan över natten; sensorns chipyta rengjordes med rent vatten och torkades med kväve före användning. För att erhålla interaktionskinetiska mätningar stabiliserades SPR i TBS under 15 minuter. Den angivna koncentrationen av heparin injicerades under 15 minuter (flödeshastighet = 18, 2 mikroliter / min) och dissocierades därefter under 15 minuter. Affinitetsinteraktioner mellan immobiliserat YcbS och heparin i lösningen bestämdes, såsom tidigare rapporterats 50 .

Flödescytometri

Flödescytometri användes för att validera YcbS-bindning till HCT-8-cellerna. YcbS renades och verifierades genom natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). HCT-8-cellerna lossades med användning av 10 mM etylendiamintetraättiksyra – fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkuberades med 100 nM YcbS vid 4 ° C under 1 timme. Cellerna tvättades därefter två gånger med PBS innehållande 0, 1% BSA vid 157 x g under 5 minuter för att avlägsna obundna proteiner. Cellerna färgades ytterligare med DyLight 650-märkt anti-His-antikropp vid 4 ° C under 30 minuter för att fånga upp cell-YcbS-komplexet. Efter tvättning genom centrifugering vid 157 x g under 5 minuter uppsamlades 5000 celler från varje prov och analyserades med användning av Muse Cell Analyzer (Merck Millipore). De bearbetade uppgifterna förvärvades som skärmdumpar och textstorleken redigerades för tydlighet. Alla resultat jämfördes med obehandlade celler färgade med anti-His-antikropp i tre exemplar.

YcbS-inducerad förskjutning av heparin-laminin-bindning

För att utvärdera YcbS-förträngning i heparin-laminin-bindning trycktes proteinchips med 150 μg / ml laminin (EMD Millipore) och immobiliserades vid 4 ° C i 12 timmar. Spånen inkuberades därefter med 1, 34 um DyLight 650-märkt heparin under 1 timme vid rumstemperatur för att underlätta lamininbindning till DyLight 650-märkt heparin. Efter att ha tvättats med TBS innehållande 0, 05% Tween 20 inkuberades flisen vidare med tre koncentrationer (4, 20 och 100 nM) renat YcbS och sköljdes med destillerat vatten efter inkubering under 20 minuter. Den återstående DyLight 650-märkta heparinsignalen erhölls med användning av en LuxScan laserskanner (CapitalBio).

Statistiska analyser

Den kumulativa hypergeometriska fördelningen (eller Fisher exakt test, kallat det hypergeometriska testet) användes för att göra motivberikningen. Invasionanalysresultat presenterades som medelvärde ± standardfel; de experimentella och kontrollgrupperna jämfördes genom det två-tailed Student t-testet.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Hsiao, FS-H. et al . Systematisk proteininteraktomanalys av glykosaminoglykaner avslöjade YcbS som en ny bakteriell virulensfaktor. Sci. Rep. 6, 28425; doi: 10.1038 / srep28425 (2016).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande databas 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.