Systematisk utvärdering av sericinprotein som ersättning för fetalt bovint serum i cellkultur | vetenskapliga rapporter

Systematisk utvärdering av sericinprotein som ersättning för fetalt bovint serum i cellkultur | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Cell kultur
  • RNA-sekvensering

Abstrakt

Fetalt bovint serum (FBS) visar uppenbara brister i cellkultur, såsom låg sats-till-sats-konsistens, äventyrlig biologisk föroreningsrisk och höga kostnader, som starkt begränsar utvecklingen av cellkulturindustrin. Sericinprotein härrörande från silkesormkokonen har blivit allt populärare på grund av dess olika och fördelaktiga cellkulturegenskaper. Systematisk utvärdering av sericin som ersättning för FBS i cellodlingsmedium förblir emellertid begränsad. I denna studie genomförde vi cellulär morfologisk, fysiologisk och transkriptomisk utvärdering av tre allmänt använda däggdjursceller. Jämfört med celler odlade i kontrollen visade de som odlades i sericinsubstitutionsmedium liknande cellulär morfologi, likartad eller högre total överlevnad av cellulär, lägre populationsdubblingstid (PDT) och en högre procentuell S-fas med liknande G2 / G1-förhållande, vilket indikerar jämförbar eller bättre celltillväxt och spridning. På den transkriptomiska nivån berikades differentiellt uttryckta gener mellan celler i de två medierna huvudsakligen i funktion och biologiska processer relaterade till celltillväxt och proliferation, vilket återspeglade att gener aktiverades för att underlätta celltillväxt och proliferation. Resultaten från denna studie tyder på att celler som odlas i sericinsubstituerat medium fungerar lika bra som, eller till och med bättre, än de som odlas i FBS-innehållande medium.

Introduktion

Utvecklingen av biofarmaceutiska produkter har skapat en enastående ökning i efterfrågan på cellodlingsprodukter. Den globala cellkulturindustrin, som har en viktig position inom biologiska vetenskaper, är en viktig del av den biofarmaceutiska marknaden 1 och förväntas nå 18 630, 7 miljoner dollar år 2020, upp från 11 310, 9 miljoner dollar 2015 2 . Hittills har animaliskt ursprungsmaterial, såsom fetalt bovint serum (FBS), varit de främst använda ingredienserna i cellodlingsmedier. Även om FBS tillhandahåller vidhäftnings- och tillväxtfaktorer, såväl som de näringsmässiga och fysiokemiska föreningarna som krävs för cellunderhåll och tillväxt 3, 4, har det fortfarande många brister och nackdelar. För det första är strikt kvalitetskontroll svårt på grund av låg konsistens mellan parti och parti från nötkreaturfostret, vilket orsakar allvarliga problem inom vetenskaplig forskning och industrier baserade på cellkultur. För det andra involverar beredning av FBS komplicerade procedurer och kan lätt förorenas av mikrober såsom Mycoplasma. För det tredje finns etiska frågor i anskaffning av nötkreaturserum, vilket kräver många nötkreatur och ökar miljöföroreningar från gasutsläpp. I ökande utsträckning har man väckt oro för FBS-säkerhet och dess brister i cellkultur 5, 6, vilket belyser behovet av FBS-ersättare 7 . Trots att avsevärda ansträngningar har gjorts för att utveckla olika FBS-fria medier, är det fortfarande starkt önskat att utforska och utvärdera sådana media 8, 9 .

Sericin är en huvudkomponent i silkesormprotein, vilket hjälper till att omsluta fibroinfibern under kokongbildning genom att cementera det fibrösa kärnproteinet 10 . Traditionellt kasseras sericin under filaturproduktion i silkeindustrin, vilket bildar en betydande beståndsdel i avloppsvatten och resulterar i allvarlig miljöförorening 11 . Å andra sidan rapporteras sericin vara en mitogen faktor involverad i bättre utvecklingskompetens hos däggdjurszygoter 12, såväl som bättre cellproliferation 13, 14, 15 och vidhäftning 16, 17, och har använts i kulturen av Sf 9 insektsceller 18, humana hudfibroblastceller 19, mänskliga mårstromceller (hMSC), endotelceller, T-lymfocyter och hybridom 20, 21 . Hittills är emellertid en systematisk utvärdering av sericin som en komponent i serumfritt medium för odling av olika typer av celler begränsad 22, vilket kraftigt har hindrat den breda acceptansen och tillämpningen av FBS-fritt sericinmedium i cellodlingsindustrin.

I den här studien använde vi tre cellinjer, som representerar de vanligaste celltyperna i cellkultur, för att utvärdera sericins prestanda som FBS-mediumersättare. De tre typerna av celler var kinesiska hamsterovaryceller (CHO), som representerade fibroblastliknande celler; Afrikanska gröna apajnjur (MARC-145) celler, som representerade epitelceller; och HeLa-cellinjen, som representerade tumörceller. CHO-cellinjen är ett av de mest effektiva och framgångsrika expressionssystemen för exogena proteiner och den vanligaste däggdjursvärden för industriell produktion av rekombinant proteinterapi 23, 24, 25 . MARC-145-cellinjen är epitelliknande och en bra värd för reproduktion av porcint reproduktions- och respiratoriskt syndrom (PRRS) -virus på grund av dess mottaglighet 26, 27 . HeLa-cellinjen är en mycket viktig tumörmodell för cellbiologi, cancer, virusutbredning, biosyntes och antitumörmekanismforskning 28, 29, 30 .

Vi jämförde de morfologiska, fysiologiska och transkriptomiska egenskaperna mellan celler odlade i sericinsubstituerat medium och de som odlades i konventionellt FBS-innehållande medium, och fann att de förstnämnda utfördes lika bra eller till och med bättre än det senare i termer av alla cellulära funktioner som nämnts ovan och ger därmed en stark referens för att öka tillämpningen av FBS-fria medier i cellkulturindustrin.

Resultat

Cellulär morfologi och total överlevnad

Vi identifierade varje cell i varje bild i experimentet med hjälp av mjukbildsanalysprogramvara (CellProfiler). De tre typerna av celler växte lika bra i både sericinsubstituerade och kontrollmedier och visade också normal cellmorfologi (fig. 1). I detalj uppvisade CHO-celler som odlades i sericinsubstituerat medium en spridd, fibroblastliknande morfologi med omfattande cellcellskontakter, samma som för celler som odlats i det FBS-innehållande mediet (Fig. 1 A, B). MARC-145-cellerna var epitel-liknande och växte på samma sätt i båda medierna (Fig. 1C, D). Den typiska cellmorfologin för HeLa-cellerna (fig. 1E, F), specifikt en subkonfluent monolager av celler med en obefylld yta och cellgräns och kondenserat kärnkromatin, visades in vitro i båda media. Den oförändrade cellulära morfologin antyder att sericin väl stödde tillväxten av de tre typerna av celler. Vidare observerades inga signifikanta skillnader i cellmorfologi mellan celler odlade i antingen media baserat på cellstorlek, form och kontur (Kompletterande Fig. S1).

Ingen signifikant skillnad i cellmorfologi observerades i celler odlade i kontrollmediet och i det sericinsubstituerade mediet. ( A, B ) CHO-celler; ( C, D ) MARC-145-celler; ( E, F ) HeLa-celler. ( A, C, E ) kontrollmedium (10% FBS); ( B, D, F ) sericinsubstituerat medium (30 μg / ml sericinprotein). Skalstänger representerar 40 μm.

Bild i full storlek

Efter morfologisk observation undersöktes övergripande cellöverlevnad genom tiazolylblått tetrazoliumbromid (MTT) -analys. Baserat på olika koncentrationer av sericin befanns 30 μg / ml vara optimalt för alla tre cellinjer (fig. 2). Specifikt, med undantag för den låga sericindosen (15 μg / ml), uppvisade CHO-celler liknande total överlevnad i både sericinsubstituerade och kontrollmedier (fig. 2A). HeLa-cellerna visade signifikant högre total överlevnad i det sericinsubstituerade mediet (fig. 2C). Även om MARC-145-cellerna i 15 μg / ml, 60 μg / ml och 120 μg / ml sericinbehandlade medier visade lägre total överlevnad jämfört med de i kontrollen, visade celler fortfarande jämförbar överlevnad under 30 μg / ml sericinbehandling (Fig. 2B).

Cellöverlevnadskurvan med MTT-analys för tre cellinjer i dess respektive odlingsmedium vid olika tidpunkter. Den längsgående axeln Y visar MT: s OD-värde för MTT, vilket avser total överlevnad av celler. Data visas som medelvärde ± SD (n = 4). * P <0, 05 signifikant skillnad med avseende på kontrollmediumvärden; ** P <0, 01 signifikant skillnad med avseende på kontrollmediumvärden. A. CHO-celler; B. MARC-145-celler; C. HeLa-celler.

Bild i full storlek

Cellcykelfördelningar och cellreplikationsförmåga

För cellcykeldistributioner visade celler i sericinmediet en icke-signifikant ökning i procentandelen av S-fasen åtföljd av en proportionell minskning av G0 / G1 och G2 / M-faser jämfört med celler i kontrollmediet (fig. 3, kompletterande fig. S2). Dessa resultat indikerade att det fanns ett liknande (eller större) antal celler aktiva i DNA-syntes i sericinmediet än i kontrollmediet. Under tiden upptäckte vi inte någon märkbar förändring av toppvärdeförhållandet i G0 / G1- och G2 / M-fasceller mellan cellerna odlade i någon av medierna (fig. 4), vilket tyder på ingen skadlig snedvridning i cellulär genetisk programmering 31 .

Cellcykler av de tre cellinjerna aggregerades i S-fasen i det sericinsubstituerade mediet. Emellertid uppvisade celler i sericinmediet en icke-signifikant ökning i procentandelen av S-fasen åtföljd av en proportionell minskning av G0 / G1 och G2 / M-faser jämfört med celler i kontrollmediet Antalet celler i G0 / G1- S- eller G2 / M-fas ges som procentandelar av den totala cellpopulationen.

Bild i full storlek

Data visas som medelvärdena ± SD-värden för de tre cellinjerna (n = 4). Det fanns ingen signifikant skillnad i cellulärt DNA-innehåll. Kontroll: kontrollmedium (10% FBS); Sericin: sericinsubstituerat medium (FBS-fritt, 30 μg / ml sericinprotein).

Bild i full storlek

Cellulär replikativ kapacitet analyserades genom mätning av populationens fördubblingstid (PDT). PDT-värdena för alla tre celltyperna i det sericinsubstituerade mediet var signifikant lägre än de i kontrollmediet, vilket antyder att proliferationsgraden för celler var högre i det sericinsubstituerade mediet (Fig. 5). Ovanstående resultat indikerar att celler i serumfritt medium innehållande 30 μg / ml sericin uppvisade liknande eller bättre cellcykel- och cellreplikationsförmåga än vad som observerades i kontrollmediet.

Data visas som medelvärdena ± SD-värden för de tre cellinjerna (n = 4). Kontroll: kontrollmedium (10% FBS); Sericin: sericinsubstituerat medium (FBS-fritt, 30 μg / ml sericinprotein). Asterisker indikerar signifikant skillnad ( P <0, 05) med två-tailed parade Student t- test.

Bild i full storlek

Jämförelser av genuttrycksprofiler

För genuttrycksprofilanalyser genererade vi mer än 43 miljoner läsningar per prov. I detalj erhölls 49, 84 miljoner läsningar (6, 23 Gb, kontrollmedium) och 50, 37 miljoner läsningar (6, 30 Gb, sericinsubstituerat medium) för CHO-cellerna; 43, 34 miljoner läsningar (5, 4 Gb) och 44, 22 miljoner läsningar (5, 5 Gb) erhölls för MARC-145-cellerna; och 50, 32 miljoner läsningar (6, 29 Gb) och 65, 42 miljoner läsningar (8, 18 Gb) erhölls för HeLa-cellerna. Majoriteten (77, 8% och 81, 7% för CHO-celler; 75, 4% och 72, 6% för MARC-145-celler; 81, 4% och 78, 4% för HeLa-celler) kunde kartläggas unikt till respektive referensgenom. Dessutom fann vi totalt 145, 112 och 93 differentiellt uttryckta gener (DEG) mellan CHO, MACR-145 respektive HeLa-celler odlade under de två odlingsbetingelserna. Antalet DEG stod för 1, 01%, 0, 74% och 0, 77% av alla detekterade gener i motsvarande genom. Med tanke på att det finns mer än 20 000 gener i däggdjursgenom var antalet DEG som hittades i den aktuella studien relativt lågt, vilket antyder att substitution av FBS med sericin inte orsakade allvarliga förändringar i cellernas genuttrycksprofiler. Dessutom visade GO-anrikningsanalyser att DEG var överrepresenterade i molekylära funktioner såsom bindning av energisubstanser, enzymreglering och strukturella molekyler, såväl som biologiska processer såsom DNA-packning, cellaktivering, cellvidhäftning, cellproliferation, utvecklingsprocesser, biologisk reglering och metaboliska processer (Fig. 6). Specifikt var uppreglerade gener associerade med cellenergimetabolism och DNA-replikation, såsom cellulär respiration ( HMGCS1, TXNIP och ABCA13 ) och cellcykelprogression ( CKS1, RMRP, FN1 och MFSD8 ) (kompletterande tabell S1, S2 och S3), medan nedreglerade gener associerades med extracellulär matristransport, ribonukleoproteinkomplex och celltillväxtundertryckning såsom hämning av DNA-bindning ( ID1, ID2 och ID3 ), transkriptionell aktiveringsförmåga och fibrinolys (kompletterande tabell S1 och S2). Dessutom genererade vi ett Venn-diagram för att visualisera DEG-överlappningen för en trevägsjämförelse. Som visas i kompletterande figur S3 var andelen celllinjespecifika DEG 30, 3% i CHO-celler, 16, 1% i MARC-145-celler och 11% i HeLa-celler, vilket indikerar ganska stor överlappning. Den höga DEG-överlappningen antyder att RNA-seq-analysen var tillförlitlig och konsekvent. I överensstämmelse med observationerna från cellernas fenotypiska och metabola tillstånd aktiverades dessutom gener associerade med dessa funktioner och relaterade biologiska processer för att underlätta överlevnad och spridning av celler.

GO-anrikningsanalys av DEG för de tre celler som odlats i sericinsubstituerat och kontrollmedium. X-axel: funktionsobjekt. Y-axel (vänster): genprocent. Y-axel (höger): antal gener. ( A ) CHO-celler, med 19 250 gener som har GO-anteckningar, 145 ° visade signifikant anrikningsskillnad (P <0, 05, χ2 test); ( B ) MARC-145-celler, med 7.431 gener som har GO-kommentarer, 112 ° visade signifikant anrikningsskillnad ( P <0, 05, χ2- test); ( C ) Hela-celler, med 18 390 gener som har GO-anteckningar, visade 93 ° signifikant anrikningsskillnad ( P <0, 05, test2 test).

Bild i full storlek

Diskussion

Denna studie genomförde en systematisk bedömning av sericin som ett substitut för FBS i cellkultur genom att undersöka cellmorfologi, cellöverlevnad, cellcykel och proliferationskapacitet, samt transkriptomisk analys.

Morfologisk observation används vanligtvis i cellstatusbedömning och har använts för att utvärdera effekten av serumfria eller serumreducerade medier på cellkultur i flera studier 32, 33 . Dessa tidigare studier har emellertid begränsats till att undersöka cellöverlevnad. I det aktuella experimentet bedömdes effekten av sericinsubstituerat medium med avseende på cellmorfologisk jämförelse, cellcykel och PDT-bedömning. Våra resultat antyder att sericin kan ersätta FBS i cellkulturprocessen utan några signifikanta skillnader i cellmorfologi, i överensstämmelse med tidigare experiment relaterade till sericin och morfologi av odlade celler 34, 35 . Vidare, med avseende på cellcykel och PDT, befanns sericin främja celltillväxt och förkorta PDT, vilket har rapporterats tidigare i processen med fibroblastkultur 36 .

Tidigare applicering av serumfria medier har ofta använt dyra tillväxtrelaterade cytokiner, såsom fibroblasttillväxtfaktor, leukemihämmande faktor och transformerande tillväxtfaktor snarare än sericin 37, 38, 39, 40 . Takahashi et al . 41 försökte först sericin och fann att komplettering med SerD förbättrade den serumfria kulturen av insektsceller. Sedan dess har sericin använts som en beståndsdel i cellkulturen för att främja spridningen av celler i serumfria media 42, 43, 44 . Det har emellertid inte behandlats som ett helt substitut för FBS, och ingen omfattande utvärdering av dess effektivitet som ett serumfritt medium har genomförts. Till exempel, Miyamoto et al . 43 använde sericin tillsammans med dimetylsulfoxid som ett komplement till kultur och kryopreserverar mänskliga hepatocyter, vilket förbättrade cellbindningsförmågan och livskraften i serumersättningsmediet. Således är det svårt för dessa metoder att erhålla eller klargöra den exakta molekylära mekanismen för att främja celltillväxt.

Genom att optimera sericinkoncentrationen med hjälp av en serie gradienter, applicerade vi framgångsrikt sericin som ett komplett substitut för FBS. Våra preliminära resultat visade att sericin vid den optimala koncentrationen hade en bättre kapacitet att främja celltillväxt och reproduktion jämfört med den tillväxtfrämjande aktiviteten för olika sericinekstraktionsmetoder 36, faktortillsatsmetoder 44 och partiella sericinsubstitutionsmetoder 45, genom att mäta cell totalt överlevnad och PDT.

Vi mätte också cellulärt DNA-innehåll och analyserade cellcykeln, som inte har undersökts i tidigare forskning. Vi fann en icke-signifikant ökning i procenten av S-fascellerna åtföljt av en proportionell minskning av G0 / G1 och G2 / M-faspopulationer, särskilt i HeLa-cellerna. Detta visade en aggregering i S-faserna för de tre cellerna i det sericinsubstituerade mediet, vilket antydde en ökad proliferativ potential 46, 47 . Det är anmärkningsvärt att främjandet av cellcykeln inte orsakade skadlig snedvridning i cellulär genetisk programmering 48 . Med tanke på att avreglering av cellcykeln kommer att leda till onormal spridning av DNA-skadade celler och undvikande av apoptos 49, visade resultaten av den aktuella studien tydligt att sericinsubstituerat medium skulle kunna främja cellcykeln utan apoptos eller cellskada på det testade celler.

Ovanstående cellcykel- och cellreplicationsanalysresultat illustrerade att celldelningsprogrammen för de tre typerna av celler var starkt aktiverade i det sericinsubstituerade mediet jämfört med de i kontrollmediet, utan att orsaka ogynnsamma förändringar (apoptos eller skada) efter befordran av cellcykeln. I denna studie utvärderade vi för första gången cellstatusen i sericinsubstituerat medium på transkriptomnivå, vilket är ett lovande verktyg för att tillhandahålla molekylära ledtrådar för att främja celltillväxt och spridning. I överensstämmelse med observationerna från cellfenototypanalysen aktiverades gener associerade med tillväxtfunktioner och involverade i de relaterade biologiska processerna för att underlätta celltillväxt och spridning. De uppreglerade generna associerades med cellenergimetabolism och DNA-replikation, såsom cellulär andning. Betydelsen av DNA-packning och cellaktivering vid celldifferentiering är välkänt 50, 51, 52, och de gynnas av integration av cell-cell- och cell-matrixinteraktioner. På liknande sätt påverkar biologisk dynamik i cellvidhäftning naturen hos cell-cell- och cell-matrixinteraktioner som reglerar händelser såsom cellproliferation, differentiering och vävnadsbildning 53, 54 . Celladhesionsmolekyler är viktiga för gränssnittinteraktioner som stöder transduktion av signaler mellan celler och den extracellulära matrisen 55, 56 . De nedreglerade generna var huvudsakligen extracellulära matristransportörer och var involverade i celltillväxtundertryckningsprocesser, såsom hämning av DNA-bindning ( ID1, ID2 och ID3 ), transkriptionell aktiveringsförmåga och fibrinolys. Undertryckning av expressionen av ID1, ID2 och ID3 gener är känt för att frisätta hämningen av DNA-bindningsprocessen 57 . Sammantaget avslöjade GO-anrikning att DEG berikades i processerna för att främja celltillväxt och spridning, vilket ytterligare stödjer vår cellmorfologiska, cellcykel- och PDT-bedömning. Tio ° av MACR-145-cellerna valdes för validering genom kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR). Alla gener visade konsekventa trender mellan RNA-seq och qRT-PCR-studier (kompletterande fig. S4).

Vi genomförde en systematisk bedömning av sericin som ett substitut för FBS i cellkultur. Tillväxtstillståndet för celler var lika bra eller ännu bättre i det sericinsubstituerade mediet än det i det traditionella FBS-mediet. Våra fynd ger inte bara avgörande bevis för tillämpningen av sericin som en ersättning för FBS, utan kommer också att hjälpa till i framtida förståelse för hållbar utveckling inom både cellkultur och silkeindustri.

metoder

Celllinjer och kulturförhållanden

CHO-, MARC-145- och HeLa-cellerna odlades vid Kunming Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences. Genom preliminär testning bestämde vi de lämpliga ympningstätheterna för varje cellinje, som var 2, 5 x 105 för CHO-celler, 9, 6 × 105 för MARC-145-celler och 6, 7 × 105 för HeLa-celler per brunn i 6-brunnsodling plattor. De tre cellinjerna ympades sedan med lämpliga ympningsdensiteter för ytterligare odling. CHO-cellerna ympades i Dulbeccos modifierade Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin), 0, 3 mM L-prolin, 25 mM metioninsulfoximin, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES och 0, 25% pepton. De hölls i odlingsplattor med 6 brunnar vid 37 ° C, 70% relativ fuktighet och 5% CO2 / 95% luftatmosfär. För MARC-145- och HeLa-celler användes standardcellodlingstekniker, med celler odlade i DMEM innehållande 4, 5 g / 1 glukos, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 ug / ml streptomycin och inkuberades vid 37 ° C. C och 5% CO 2 /95% luftatmosfär. Efter de grundläggande cellkulturbetingelserna för de tre cellinjerna etablerade vi sericinsubstituerade respektive FBS-behandlingar. För sericinsubstituerad behandling tillsattes sericinprotein (Sigma, St. Louis, MO, USA) till det grundläggande cellodlingsmediet vid angivna koncentrationer (15 μg / ml, 30 μg / ml, 60 μg / ml eller 120 μg / ml). För kontrollen tillsattes FBS (Sigma, St. Louis, MO, USA) till det basiska cellodlingsmediet till en slutkoncentration av 10%. Alla cellkulturreagens köpdes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) om inget annat anges. Baserat på celltillväxt och total överlevnadsbedömning användes det sericinsubstituerade mediet vid den optimala sericinkoncentrationen för andra bedömningar. Celler vid den logaritmiska tillväxtfasen användes för utvärdering av cellmorfologi, total överlevnadshastighet, cellcykel och PDT. Dessutom genomfördes transkriptomiska analyser på de sericinsubstituerade och kontrollgrupperna för varje cellinje.

Bedömning av celltillväxt

För både de sericinsubstituerade och kontrollgrupperna bedömdes celltillväxt genom att undersöka cellöverlevnad och morfologi. Cellöverlevnad övergripande bedömdes med tiazolylblått tetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, USA), baserat på aktiviteten hos mitokondriella dehydrogenas-enzymer i celler 58 . Metaboliskt aktiva celler kan metabolisera MTT till olöslig formazan av dehydrogenaser, medan lösningens färg ändras från gulaktig till violettblå. Formazan är löslig i organiska lösningsmedel och kan uppskattas med spektrofotometri. Formazan kvantitet är proportionell mot antalet och totala överlevnaden av celler. Under samma cellantal och volym bestämdes cellöverlevnaden genom optisk densitet (OD) vid 570 nm, med bakgrundssubtraktion vid 650 nm, med användning av en mikroplattläsare (Infinite ® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Schweiz). Från dag 1 till dag 7 utsattes celler för MTT-analys dagligen med fyra tekniska upprepningar varje gång.

Cellbilder registrerades med ett Leica DMI4000B-mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) vid 80–90% cellöverströmning under cellodling. Cellidentifiering och cellbildsanalyser genomfördes med användning av open source CellProfiler-programvara 59 . Cellöversikt och storleksdata samlades in i den logaritmiska fasen.

Cellproliferationsbedömningar

Flödescytometrisk analys av cellcykeldistributionen

Som nämnts ovan användes medium substituerat med 30 ug / ml sericin, vilket var den optimala koncentrationen för alla tre cellinjerna, för bedömning av cellcykel och cellreplikationsförmåga. Cellcykeldistributionen undersöktes genom utvärdering av DNA-innehållet (fluorescensintensitet) i olika cellfaser. Cellulärt DNA-innehåll utvärderades med användning av propidiumjodid (PI) (Sigma, St. Louis, MO, USA) färgning av permeabiliserade celler med användning av flödescytometri (BD FACS Calibur, New Jersey, USA) enligt en modifierad metod 60 . Kortfattat skördades cellskiktet efter 80–90% cellkonfluss under cellodling i lösning innehållande 0, 25% (vikt / volym) trypsin och 0, 53 mM EDTA för att avlägsna alla spår av odlingsmediumkompositioner, tvättades sedan med iskallt fosfat- buffrad saltlösning (PBS), fixerad i 75% etanol och lagras vid -20 ° C över natt. Cellerna samlades sedan upp genom centrifugering (2500 rpm vid rumstemperatur under 3 minuter) och återsuspenderades i 20 mg / ml PI-lösning med 0, 5 U RNas A och 0, 02% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, USA), inkuberades sedan i mörkret vid 37 ° C under 30 minuter. Totalt 2 × 104 celler / prov analyserades med flödescytometri med användning av ett instrument utrustat med Cell Quest-mjukvara, med fyra tekniska upprepningar utförda varje gång. Procentsatserna av PI-färgade celler i G0 / G1, S och G2 / M-faser registrerades, och Gl- och G2-toppfluorescensintensiteter och G2 / G1-förhållandena utvärderades.

Utvärdering av befolkningsdubblingstid (PDT) på cellreplikativ kapacitet

Cellreplikationsförmåga utvärderades med PDT 61, som uppskattades med hjälp av en online-populationsfördubblingsberäkning 62 Denna analys utfördes varje dag, med fyra tekniska upprepningar som utfördes varje gång under den exponentiella fasen.

RNA-seq

RNA-seq-bibliotekskonstruktion och sekvensering

Celler som odlades i det sericinsubstituerade och kontrollmediet skördades på dag 7 (3-7 på varandra följande cellcykler) för RNA-sekv. Totalt RNA extraherades med användning av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Före omvänd transkription behandlades RNA med DNas I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) för att avlägsna kontaminerande genomiskt DNA. Både RNA-kvantitet och kvalitet bestämdes med användning av en Qubit 2.0-fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 63 . Integriteten hos RNA-proverna verifierades med användning av en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) och RIN-värden varierade mellan 8, 1 och 9, 6. Anrikningen av poly (A) + RNA utfördes med 5 ug totalt RNA med användning av magnetiska pärlor med Oligo (dT). Efter rening fragmenterades mRNA i små bitar. Den första cDNA-strängen syntetiserades med användning av slumpmässiga hexamerprimrar för omvänd transkription med klyvda RNA-fragment som tjänade som mallar. Det andra strängt cDNA syntetiserades med användning av RNas H och DNA-polymeras I, och sekvenseringsbiblioteken konstruerades enligt tillverkarens instruktioner. För varje cellinje (dvs CHO-, MARC-145- och HeLa-celler odlade i sericinsubstituerade respektive kontrollmedium) framställdes ett parvis-slutet sekvenseringsbibliotek med ungefär 300 bp insertstorlek med TruSeq RNA-Seq-satser ( Illumina Inc., San Diego, CA, USA) enligt tillverkarens rekommendationer. RNA-seq-biblioteket sekvenserades ytterligare med Illumina HiSeq 2000-plattformen (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). De sex uppsättningarna av rå Illumina-sekvenseringsavläsningar i fastq-format trimmades för läsningar av låg kvalitet, tvetydiga baser (N), sekvenseringsadaptrar, primrar och poly (A) / (T) svansar.

Bearbetning och analys av RNA-seq-data

De trimmade rena avläsningarna anpassades till det relaterade referensgenomet ( Chlorocebus sabaeus och Homo sapiens genomer och kommentarer laddades ner från Ensembl (//asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html) och den kinesiska hamsteren ( Cricetulus griseus ) äggstock (CHO) -cellinjegenom och kommentarer laddades ner från CHOgenome (CriGri_1.0, //chogenome.org/index.php)) med användning av TopHat2 64- programvara med standardinställningar. Beräkning av genuttrycksnivå och identifiering av differentiellt uttryckta gener (DEG) mellan de sericinsubstituerade och kontrollgrupperna genomfördes med Cufflinks 2.0.0 65 . Fragment per kilobas exon per miljon kartlagda fragment (FPKM) användes för att normalisera RNA-seq-fragmenträkningar och uppskatta den relativa mängden av varje gen. Cuffdiff-paketet i manschettknappar 2.0.0 65 användes för att utföra parvisa jämförelser av uttryck för varje gen mellan celler odlade under de två villkoren och för att rapportera DEG och transkript. DEG: erna bestämdes baserat på en P- värde <0, 05 och åtminstone en tvåfaldig förändring mellan de två FPKM: erna (högre i förhållande till låg). GO-anrikningsanalyser på DEG mellan de två grupperna utfördes av Web Gene Ontology Annotation Plotting (WEGO) 66 . Ett Venn-diagram konstruerades baserat på homologerna identifierade genom parvis ömsesidig BLAST-analys med e <10 −5 .

qRT-PCR validering av DEG

Vi utförde kvantitativ omvänd transkription-PCR (qRT-PCR) för 10 gener involverade i "hämning av DNA-bindning" ( ID1, ID2 ), "cellcykelprogression" ( FN1, MFSD4, MMP1 ) och "cellproliferation och migration" ( INHBA, LCN2, CBY1, CXCL12, SCNN1A ). P-aktingenen valdes som referensgenen 67 . Primers designades med Oligo-programvara (version 7.60). Tre biologiska replikat och tre experimentella duplikat utfördes.

Statistisk analys

För cellövergripande överlevnad, cellulärt DNA-innehåll, fluorescensintensitet och PDT-värden erhölls mätdata med fyra tekniska upprepningar varje gång. Data analyserades med två-tailed parade Student's t- test med en a-nivå av 0, 05.

ytterligare information

Anslutningskoder: RNA-seq-data deponeras till NCBI SRA (anslutningsnummer: SRX1722218, SRX1722219, SRX1722229, SRX1722231, SRX1722232 och SRX1722233).

Hur man citerar den här artikeln : Liu, L. et al . Systematisk utvärdering av sericinprotein som ersättning för fetalt bovint serum i cellkultur. Sci. Rep. 6, 31516; doi: 10.1038 / srep31516 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.