Synergistiskt förbättrad selektiv intracellulär upptag av anticancerläkemedelsbärare innefattande folsyra-konjugerade hydrogeler innehållande magnetit-nanopartiklar | vetenskapliga rapporter

Synergistiskt förbättrad selektiv intracellulär upptag av anticancerläkemedelsbärare innefattande folsyra-konjugerade hydrogeler innehållande magnetit-nanopartiklar | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • biopolymerer
  • Drogleverans

Abstrakt

Målstyrd läkemedelsleverans har länge varit omfattande undersökt sedan läkemedelsleverans och frisättning på den sjuka platsen med minimal dosering inser effektiv terapi utan negativa biverkningar. I detta arbete, för att uppnå förbättrad intracellulär upptag av läkemedelsbärare mot cancer, för effektiv kemoterapi, har vi utformat riktade multifunktionella anticancerläkemedelsbärarhydrogeller. Temperaturgivande poly ( N- isopropylacrylamid) (PNIPAm) hydrogelkärna innehållande superparamagnetiska magnetit-nanopartiklar (MNP) framställdes med användning av utfällningspolymerisation och polymeriserades ytterligare med amin-funktionaliserad sampolymerskal för att underlätta konjugeringen av målinriktad ligand. Därefter konjugerades folsyra, specifik målinriktad ligand för livmoderhalscancercellinje (HeLa) på hydrogelytan, vilket gav den ligandkonjugerade hybridhydrogeln. Vi avslöjade att förbättrad intracellulär upptag av HeLa-celler in vitro möjliggjordes av både magnetisk attraktion och receptormedierad endocytos, som bidrog av respektive MNP och folsyra. Vidare bekräftades platsspecifikt upptag av den utvecklade bäraren genom inkubering med flera andra cellinjer. Baserat på synergistiskt förbättrad intracellulärt upptag uppnåddes framgångsrikt effektiv cytotoxicitet och apoptotisk aktivitet av HeLa-celler inkuberade med anticancerläkemedelsladdade hybridhydrogeler. De utvecklade dubbelinriktade hybridhydrogenerna förväntas ge en plattform för nästa generations intelligenta läkemedelsleveranssystem.

Introduktion

Cancer är en av de ledande dödsorsakerna över hela världen trots de senaste framstegen inom cancerterapi. Även om många cancerformer kan behandlas effektivt genom enkel kirurgi i ett tidigt skede krävs ofta långvarig och intensiv kemoterapi eller strålbehandling för behandling av mer avancerade eller metastatiska cancerformer, vilket kan åtfölja olika biverkningar såsom läkemedelsresistens och toxicitet mot normala celler som omger tumörerna 1 . Olika läkemedelsbärare har utvecklats för att lösa dessa problem 2, 3, 4, men det finns fortfarande flera problem som begränsar kliniska tillämpningar, såsom cytotoxicitet för läkemedelsbärare, låg permeabilitet och reducerad förmåga att justera läkemedelsdoseringarna. Således krävs utveckling av ett mer effektivt system för minskad systemisk toxicitet och ökad effektivitet.

Hydrogener forskas intensivt inom biomedicinska fält som en viktig komponent för läkemedelsleverans 4 på grund av deras höga vatteninnehåll, biokompatibilitet och elastiska egenskaper. De kan tillhandahålla biokompatibla våtställningar för celler, vävnader och läkemedel, vilket liknar mycket naturliga miljöer. Speciellt är hydrogelpärlor fördelaktiga i läkemedelsleveransapplikationer på grund av det faktum att nästan vilket som helst material suspenderat i vatten kan laddas i hydrogelmatrisen och frisättningen lätt kan manipuleras genom valet av nätmaterial och tvärbindningsdensitet 5 . Vidare kan de genomgå volymfasövergången som svar på yttre stimuli såsom temperatur, pH, lösningsmedelspolaritet och ljus, vilket möjliggör frisläppande av de laddade materialen på begäran. Exempelvis är tvärbunden poly ( N- isopropylacrylamid) (PNIPAm) en väldokumenterad temperatursvarig hydrogel som visar reversibel lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) fasövergång runt temperaturen i människokroppen 6 . Läkemedel i lösning kan laddas i svullet tillstånd vid lägre temperatur och frisättning kan uppnås vid kroppstemperatur när vätskeinnehållet pressas ut genom LCST-beteende.

Förutom den externa stimuli-utlösta läkemedelsfrisättningen är en målinriktad leverans också mycket önskvärd för de intelligenta läkemedelsbärarna, eftersom koncentrationen av medicinen endast kan ökas i nödvändiga delar av kroppen 7 . Smart leverans vid rätt punkt med minimal dosering tillåter effektiv läkemedelsbehandling utan negativa biverkningar. Även om läkemedelsbärare kan ackumuleras på tumörstället genom förbättrad permeabilitet och retention (EPR) -effekt av läckande neoplastisk vaskulatur runt tumörvävnaden 8, är avancerad aktiv målinriktningsteknik mycket önskvärd för effektiv leverans.

För att uppnå den aktiva inriktningen på hydrogelbäraren har mycket forskningsinsatser, såsom konjugering av målinriktade ligander eller införlivande av magnetiska nanopartiklar (MNP). Konjugering av specifik affinitetsligand inklusive antikropp 9, peptid 10, aptamer 11, glykosaminoglykan 12 och vitamin 13 tillhandahåller selektiv leverans av läkemedel till målceller via receptormedierad endocytos. Hydrogener innehållande MNP kan användas i den magnetstyrda läkemedelsleveransen 14 . Användning av magnetfält för att öka ackumulering av magnetisk nanopartikel på målstället har realiserats både in vitro 15 och in vivo 16 . Men detta tillvägagångssätt enbart säkerställer inte den specifika interaktionen mellan läkemedelsbärare med målceller. Därför skulle dual-targeting-system som kan uppnås genom att kombinera ligandkonjugering och magnetstyrning synergistiskt öka den terapeutiska effektiviteten hos hydrogelfordon.

I denna studie, för att göra de dubbelt riktade stimuli-responsiva läkemedelsbärarna, strävade vi efter att bereda ligandkonjugerade hydrogeler innehållande MNP för leverans av läkemedel mot cancer. Först framställdes MNP-inkorporerad PNIPAm-baserad kärna genom utfällningspolymerisation, därefter modifierades dess yta ytterligare med en aminfunktionell grupp genom efterföljande polymerisation av NIPAm och allylamin (AA). För det andra konjugerades folsyra (FA) på ytan av hydrogel via EDC / NHS-koppling, vilket gav den dubbelinriktade stimuli-responsiva läkemedelsbäraren hydrogel. Fysikokemiska egenskaper hos de genererade hydrogelerna kännetecknades av dynamisk ljusspridning (DLS), avsökande elektronmikroskopi (SEM), transmissionselektronmikroskopi (TEM) och UV / Vis-spektroskopi. För att studera potentialen för styrd och långvarig frisättning studerades magnetrespons och läkemedelsfrisättningsprofil. Påverkan av den målriktade ligandkonjugeringen och närvaron av magnet på det intracellulära upptaget och distributionen observerades med användning av konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) med flera cellinjer. Slutligen mättes effektiviteten för läkemedelsladdad MHG-FA mot cancer, med användning av MTT-analys och apoptotisk aktivitetsanalys.

Resultat och diskussion

Hydrogel design och syntes

Figur 1 visar det syntetiska schemat för framställning av dubbelt riktade stimuli-responsiva läkemedelsbärare. MHG sammansatt av hydrogelkärnan innehållande MNP och amin-funktionaliserat skal framställdes genom utfällningspolymerisationsmetod. I korthet framställdes p (NIPAm-co-VP) hydrogelkärna innehållande MNP: er först, följt av p (NIPAm-co-AA) skalbildning. Det avsvunna tillståndet av kärnpartikeln vid 70 ° C minimerade penetrationen av skalblandningar under skalbildningen, vilket möjliggjorde att fria amindelar exponerades på ytan. Riktande ligand FA konjugerades till den fria aminen på skalytan via EDC / NHS-kemi. Slutligen laddades anticancerläkemedlet DOX vid 4 ° C.

Hydrogelkärna innehållande MNP och amin-funktionaliserat skal framställdes genom utfällningspolymerisation. Riktande ligand, folsyra (FA), konjugerades via EDC / NHS-kemi. Anticancerläkemedel, DOX, laddades vid 4 ° C.

Bild i full storlek

Utfällningspolymerisation som används i detta arbete ger flera fördelar att (1) relativt enhetliga hydrogeler kan erhållas utan användning av något ytaktivt medel eller stabilisator; (2) hydrogelstorleken kan regleras från flera tiotals nanometer till flera mikrometer genom att justera koncentrationen av monomeren eller omrörningshastigheten; och (3) hydrogelkompositionen kan enkelt manipuleras genom enkel tillsats under polymerisationen. Dessa funktioner möjliggör enkel och enkel komponentvariation av kärnan (NIPAm, VP och bisAA) och skalet (NIPAm, AA och bisAA). PNIPAm är en välkänd temperaturkänslig polymer som uppvisar reversibel volymförändring nära LCST på 32 ° C 6 . För att applicera läkemedelsbärarna in vivo föredras LCST över kroppstemperaturen. Således utformades hydrogeln för att inducera skarp volymfasövergång något över kroppstemperaturen genom sampolymerisation av VP med NIPAm. I vår tidigare studie avslöjade vi att införlivandet av hydrofila VP-enheter i PNIPAm-kedjan ledde till ökningen av LCST 17 . För skalbildningen tillsattes AA som aminkälla för konjugering av FA genom amidkoppling och bisAA användes som tvärbindningsmedel.

Aktiv dubbelinriktning uppnås av MNP i kärnan och FA konjugerad på hydrogelytan. Såsom illustreras i fig. 2 kan superparamagnetisk MNP lockas till en yttre magnet och därför kan förbättrad ackumulering på målstället uppnås. EPR-effekt av den läckande vaskulaturen på tumörstället är en väl dokumenterad effekt 8 . Detta i kombination med starkt lokalt magnetfält kan leda hydrogelinnehållande MNP för att öka ansamlingen i målvävnaden (företrädesvis tumörställe). Idén att använda magnetiska mikro- och nanopartiklar för in vitro biomedicinska tillämpningar som cellsortering och immunanalys har länge använts 18, 19, 20 . Nyligen har Wang et al . visade förbättrad cellupptag av järnoxid-polypyrrol-PEG-nanopartiklar in vitro driven av närvaron av magnet för anticancerläkemedelsleverans 15 . Dessutom kan MNP ytterligare tillhandahålla möjlighet som T2-kontrastmedel vid magnetisk resonansavbildning 21 . Eftersom MNP kan generera värme under ljusbestrålning, kan de också användas vid hypertermibehandling av tumörer eller utlösa den ljusinducerade volymfasövergången hos de temperatursvariga hydrogelerna 22 .

Hydrogeler i cirkulation ackumuleras i målvävnaden genom kombinationen av EPR-effekten av den läckande kärlkransen och det starka lokala magnetfältet som appliceras av den yttre magneten. Därefter medieras upptag av FA-konjugerade hydrogeler i celler av folatreceptorn via receptormedierad endocytos. Bild med tillstånd av Ara Jo.

Bild i full storlek

FA valdes som målinriktande ligand eftersom det är en av de bäst karakteriserade liganderna som ska utnyttjas för att rikta cancerceller 23 . Upptag av FA-konjugerade partiklar i celler medieras av folatreceptorn via receptormedierad endocytos (Fig. 2). Eftersom FA-konjugering uppnås genom EDC / NHS-reaktion genom amidbindningsbildningen mellan aminogruppen av hydrogel och karboxylgruppen i FA, kan FA lätt ersättas med andra målinriktade ligander. Förbättrad ansamling på tumörstället i kombination med målinriktad ligand kan synergistiskt öka upptaget av hydrogeln av cancerceller och därför kan ökad terapeutisk effekt uppnås.

Karakterisering

Storleken och ytladdningen för kärnan, kärn-skal-hydrogel (MHG) och folsyra-konjugerad kärn-skal-hydrogel (MHG-FA) bestämdes av DLS. Som sammanfattat i tabell 1 ökade hydrodynamiska storlekar från 160, 2 till 191, 2 och 219, 5 medan PDI förblev relativt lågt (0, 111, 0, 177 respektive 0, 125). Dessa resultat innebär att storleken på hydrogeln ökar med bildandet av skalet och konjugering av bulkinriktande ligand.

Full storlek bord

Provens morfologi observerades av SEM (fig. 3a) och TEM (fig. 3b). Hydrogeler var relativt likformiga och sfäriska i form med en diameter som var mindre än 200 nm. Mindre partikelstorlek som observerats i torkade prover av SEM och TEM än hydratiserade hydrogeler i DLS-mätning är ett välkänt fenomen 24, 25 . Såsom visas i fig. 3b avslöjar TEM-bilden närvaron av MNP som svarta prickar huvudsakligen i kärnan hos MHG: er, vilket indikerar att polymerisation vid det vågna tillståndet av kärnan vid 70 ° C både minimerade interpenetrationen av skalkomponenter i kärnan och förhindrade MNP från att dyka ut under syntesen. För att bekräfta om magnetstyrd inriktning kan uppnås exponerades MHG: er upphängda i destillerat vatten för en magnet. Såsom visas i fig. 3c uppnåddes tydlig separering på mindre än 10 minuter vilket indikerar stark attraktion till ett lokalt magnetfält.

Morfologier av hydrogeler observerade av ( a ) SEM och ( b ) TEM. ( c ) Foton av hydrogellösningar i frånvaro (vänster) och närvaro av en magnet (höger). ( c ) UV-vis absorbansspektra för FA (blå linje), MHG (svart linje) och MHG-FA (röd linje). ( e ) Temperaturberoende storleksändring av PNIPAm-hydrogeler sampolymeriserade utan (svart linje) och med VP (röd linje). ( f ) DOX-frisättning från hydrogeler över tiden vid 37 ° C.

Bild i full storlek

Zeta-potentialvärdena för kärnan, MHG och MHG-FA var −9 mV, +10, 2 mV respektive −20, 6 mV (tabell 1). Denna indirekt bekräftade skalbildning som positiv ytladdning indikerade närvaron av amingrupp på skalytan och FA-konjugering då skift tillbaka till negativ ytladdning indikerade närvaron av fri karboxylgrupp kvar i FA. Figur 3d visar UV / Vis-spektra för den fria FA, MHG och MHG-FA. Medan MHG (svart linje) inte visade någon absorptionstopp, visade FA (blå linje) stark absorption vid ~ 260 nm på grund av π-π * övergångar. MHG-FA (röd linje) visade absorptionstopp vid ~ 280 nm, vilket bekräftade att konjugeringen av FA på MHG. Den lilla förskjutningen från ~ 260 nm till ~ 280 nm kan tillskrivas från bildningen av amidbindning mellan karboxylgruppen av FA och aminogruppen av hydrogel.

DOX, ett läkemedel mot cancer mot cancer som används i denna studie, är ett antineoplastiskt medel som vanligtvis används för att behandla tumörer 26 . Läkemedelsbelastning utfördes vid 4 ° C där PNIPAm hydrogel är helt svullnad och sålunda fler läkemedel kan införlivas i det expanderade nätverket. Belastningseffektiviteten uppmätt med vikten var 27, 5, 31, 1 och 34, 1%, något ökande med högre DOX-koncentration (0, 26 mg, 0, 52 mg respektive 1, 3 mg i 3 ml PBS). Inkorporering av 12, 5 mol% VP ökade LCST från ~ 32 ° C till ~ 37 ° C (fig. 3e). Den hydrofila funktionella gruppen av VP främjar hydratiseringen av polymerskelettet, fördröjer polymeraggregering och leder därmed en uppåt LCST-förskjutning. Såsom antagits påverkade detta starkt läkemedelsfrisättningsprofilen. 12, 5 mol% av VP-inkorporering uppnådde fördröjd DOX-frisättning under ~ 100 timmar (fig. 3f) medan PNIPAm ensam frigav DOX på drygt 6 timmar (figur SI i kompletterande information). Frisättning av anticancerläkemedel på några timmar är ett stort problem vid läkemedelsleverans eftersom det ökar risken för biverkning 27 kraftigt.

Dubbelinriktad cellupptag och distribution

Intracellulärt upptag och distribution av hydrogeler observerades med CLSM. Tre olika cellinjer testades inklusive folatreceptor (FR) -positiv HeLa och FR-negativ MDA- och Nuff-celler 28, 29 . För att testa den magnetledda upptagningen av MHG: er placerades W_magnet-gruppkulturplattor på magneten och inkuberades med hydrogelerna under 24 timmar. MHG visas som gröna prickar från sampolymeriserat fluorescein-o-metakrylat (FMA), en grön fluorescerande monomer. Nucleus färgades blått med Hoechst 33342 och plasmamembran färgades orange för att bättre skilja de endocytoserade hydrogelerna från de utanför det cellulära membranet. Z-stack-bilder togs också för att bekräfta att hydrogeler var inne i cellen som inte fästes på cellytan (figurerna S2 och S3).

FA-konjugering påverkade upptagningen av HeLa-celler starkt (fig. 4a). Betydligt fler MHG-FA: er (gröna prickar i bilden till vänster uppe i fig. 4a) hittades jämnt fördelade över cytoplasman än MHG: er (gröna prickar i bilderna till vänster från ovan i fig. 4a). Fluorescenskvantifiering med hjälp av avbildningsmjukvara (Image J) bekräftade också signifikant mer upptag (nästan 5 gånger) av MHG-FA än MHG med HeLa-cellinjer (fig. 4b). FA-konjugering sänkte emellertid upptaget i andra två testade cellinjer (MDA i fig. 4a och b och Nuff i figur S4). Negativ ytladdning av MHG-FA (~ −20 mV) sänkte förmodligen den elektrostatiska växelverkan mellan hydrogeler med negativt laddat cellulärt membran än positivt laddad MHG (~ + 10 mV).

( a ) Intracellulär lokalisering av hydrogeler i HeLa- och MDA-MB-231-celler registrerade med CLSM. Celler inkuberades med 100 μg / ml MHG-FA (W_FA) eller MHG (W / O_FA) utan magnet (W / O_magnet, bilder till vänster) eller med magnet (W_magnet, bilder till höger). MHG visas som gröna prickar från sampolymeriserad FMA, en grön fluorescerande monomer. Kärnor märktes blå med Hoechst 33342 och cellplasmamembran färgades orange. ( b ) Kvantitativt cellulärt upptag av hydrogeler med HeLa och MDA-MB-231-celler räknade med användning av Image J. Felstänger representerar standardavvikelse för tre representativa celler.

Bild i full storlek

Samodling på magnetfält påverkade också upptaget av hydrogeler. Betydligt mer hydrogeler hittades i HeLa-celler som odlades på magnet (högra högerbilder i fig. 4a) än icke-magnetiska HeLa-celler (övre vänstra bilder i fig. 4a). Kvantifiering bekräftade 3-faldigt upptag av magnetstyrd upptag av HeLa-celler (längst till vänster svarta och grå staplar i fig. 4b). Liknande trender observerades också i andra testade cellinjer. Nästan tvåfaldigt mer upptag av hydrogeler resulterade i magnetkulturerade celler (fig. 4a, b och figur S4). Celler som samodlas på magnet har större chans att interagera med hydrogeler eftersom MHG: er sedimenteras snabbt på grund av starkt lokalt magnetfält och därmed högre upptag.

Kombination av FA-konjugering och magnetkultur resulterade i signifikant högre upptag av HeLa-celler (vänster andra bilder från övre och högra höger bilder i Fig. 4a) vilket var ~ 15-faldigt (Fig. 4b) jämfört med W / O_FA och W / O_magnet-grupp. Denna synergistiska förbättring observerades inte i andra testade cellinjer på grund av frånvaro av FR. Folinsyra valdes som målsökande ligand i denna studie eftersom den är en av de mest populära målmolekylerna i leverans av cancerläkemedel som krävs för snabb celltillväxt i många cancerceller 23 . Dessutom kan vår mångsidiga hydrogel-framställningsmetod rymma konjugering av andra målsökande molekyler såsom Arg-Gly-Asp (RGD) -peptid eller antikroppar när så önskas 30 . Vidare är sekundärinriktning som uppnås med magnetfält enkel och lätt att använda för subkutana tumörmodeller in vivo .

DOX-triggad cytotoxicitet och apoptos

DOX är ett allmänt använt kemoterapeutiskt medel känt för att inducera apoptos genom mitotisk katastrof 26 . DOX-laddade MHG-FA inkuberades med HeLa-celler i olika koncentrationer (12, 5, 25, 50 och 100 μg / ml) tillsammans med kontrollgrupper (fri DOX vid 100 μg / ml och två DOX-fria hydrogeler, MHG och MHG-FA vid 100 μg / ml). HeLa-celler inkuberades med varje grupp under begränsad tid (30 min) och tvättades i stor utsträckning med PBS för att minimera effekten av nyligen endocytoserade hydrogeler. Efter mediautbyte inkuberades cellerna ytterligare i upp till 24, 48 och 96 timmar (fig. 5a – c, respektive) och MTT-cytotoxicitetsanalys utfördes för att kvantifiera livskraftiga celler. Oavsett inkubationstid visade ingen-DOX-hydrogeler (MHG och MHG-FA) liten eller ingen cytotoxicitet (fig. 5). Detta visar att vårt system är en säker leveransmetod. Magnetit, PNIPAm och FA är alla FDA-godkända och relativt säkra material och deras kombination resulterade också i ett säkert läkemedelsleveransfordon 31, 32, 33 . FA-konjugering ökade något cellens livskraft än MHG antagligen på grund av minskad zeta-potential för MHG-FA genom EDC / NHS-koppling av primära aminer med FA (tabell 1).

Celler behandlades under 30 minuter utan (W / O_magnet, svarta staplar) eller med magnet (W_magnet, grå staplar) och inkuberades ytterligare i upp till ( a ) 24 timmar, ( b ) 48 timmar och ( c ) 96 timmar. Den relativa cellviabiliteten beräknades genom jämförelse med absorbans av obehandlade celler.

Bild i full storlek

Gratis DOX-kontroller visade omedelbar cytotoxicitet uppvisande över 90% celldöd så tidigt som 24 timmar (Fig. 5a längst till vänster). DOX-laddad MHG-FA (höger 4 grupper i fig. 5a – c), å andra sidan, uppvisade inkubationstid- och dosberoende cytotoxicitet. Såsom antagits, visade DOX-laddad MHG-FA retention i cytotoxisk aktivitet på grund av långvarig frisättning av DOX. Att öka LCST från ~ 32 ° C till ~ 37 ° C genom VP-sampolymerisation, uppnådde en långvarig DOX-frisättning under ~ 100 timmar (fig. 3f) vilket resulterade i långsammare cytotoxisk profil in vitro . Detta kan vara mycket fördelaktigt särskilt in vivo genom att undvika för tidig DOX-frisättning under cirkulationen och oönskade biverkningar. Det är anmärkningsvärt att vid 96 timmar visade 100 μg / ml DOX-belastad MHG-FA samodlad på magnet betydande cytotoxicitet nästan jämförbar med den för fri DOX-kontroll. Magnetrespons blev uppenbar efter 48 timmars inkubation. Samodlade odlade celler (grå staplar i fig. 5) visade signifikant högre cytotoxicitet än celler med ingen magnet (svarta staplar i fig. 5) medan fria DOX-kontroller visade inget svar på magnetexistensen som förväntat.

Annexin V och dödcellanalys utfördes på MHG-FA och DOX-laddade MHG-FA-behandlade celler efter 48 timmars inkubation (fig 6a). Resultaten från tre oberoende studier var i genomsnitt och visades som ett diagram i fig. 6b. MHG-FA-inkuberade celler förblev friska i enlighet med MTT-analysresultaten. DOX-laddad MHG-FA visade signifikant ökning av apoptotiska celler. En försumbar mängd nekrotiska celler bekräftar att celler går genom DOX-triggade apoptotiska stadier. Effekten av magnet närvaro påverkade HeLa-celler starkt och visade över 90% av cellerna i apoptos i sen fas.

Cellerna behandlades med 100 ug / ml MHG-FA eller DOX-belastad MHG-FA under 30 minuter och inkuberades ytterligare under 48 timmar. Apoptos analyserades genom Annexin V / 7-AAD dubbelfärgning och flödescytometri. ( a ) Representativa resultat från tre oberoende experiment. Den nedre högra kvadranten representerar tidiga apoptotiska celler färgade huvudsakligen av Annexin V och den övre högra kvadranten står för sena apoptotiska celler färgade av både Annexin V och 7-AAD. ( b ) Procentandelen av både apoptotiska (sent och tidigt) och nekrotiska celler inducerade av MHG-FA och DOX-laddad MHG FA.

Bild i full storlek

Slutsats

Sammanfattningsvis framställdes magnetit / hydrogel-kärn-skal-hydrogeler (MHG) innehållande magnetiska nanopartiklar i kärnan och PNIPAm-baserat hydrogel-skal, konjugerat med folsyra, som ett mångsidigt verktyg för läkemedelsleveransvehikel med två mål. Hydrogener kännetecknades av DLS, SEM, TEM och UV / Vis. Magnetrespons och läkemedelsfrisläppsprofil studerades också. Påverkan av den målsökande ligandkonjugationen och närvaron av magnet på det intracellulära upptaget och distributionen observerades med användning av CLSM med flera cellinjer. Slutligen mättes effektiviteten hos DOX-laddade MHG-FA med användning av MTT-analys och apoptotisk aktivitetsanalys. I överensstämmelse med författarnas hypotesen förstärktes dubbelinriktning genom FA-konjugering och magnetstyrd inkubation synergistiskt intracellulärt upptag av MHG-FA och därmed ökad DOX-triggad apoptos.

metoder

material

N- isopropylacrylamid (NIPAm) köptes från TCI (Nihonbashi-honcho, Chuo-ku, Tokyo, Japan). Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) erhölls från Bio Basic Inc. (Markham, Ontario, Kanada). Natriumhydroxid (NaOH) och saltsyra (HCl) köptes från JUNSEI (Nihonbashi-honcho, Chuo-ku, Tokyo, Japan). Fetalt bovint serum (FBS), penicillin / streptomycin, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) och Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) köptes från Hyclone (Logan, UT, USA). Alla andra kemikalier inklusive fluorescein- o- metakrylat (FMA), allylamin (AA) och doxorubicinhydroklorid (DOX) erhölls från Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) och användes såsom erhållits utan ytterligare rening.

HeLa (mänsklig livmoderhalscancer), Nuff (nyfött humant förhudsfibroblast) och MDA-MB-231 (mänskligt bröstadenokarcinom) -celler köptes från American Type Culture Collection (ATCC) och odlades som rekommenderat. HeLa- och Nuff-celler odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin (100 U / ml) vid 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO2. MDA-MB-231 celler odlades i RPMI kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin (100 U / ml) vid 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO2.

Framställning av FA-konjugerade magnetit-hydrogeler (MHG-FA)

Partikelkärna innehållande MNP framställdes genom utfällningspolymerisationsmetod under kväveatmosfär. NIPAm (131, 7 mg, 1, 16 mM), vinyl-2-pyrrolidinon (VP) (18, 5 mg, 0, 17 mM), N , N ' -metylenbisakrylamid (BisAA) (6 mg, 0, 039 mM), FMA (10, 0 mg, 0, 025 mM) och MNP (0, 027 mg, 32 ul) löstes i 20 ml destillerat vatten. MNP framställdes med samutfällningsmetoden såsom beskrivits i vår tidigare studie 34 . Den avgasade lösningen omrördes vid 250 varv / minut och upphettades till 70 ° C i ett oljebad, och sedan tillsattes kaliumpersulfat (KPS) (4, 8 mg, 0, 017 mM) för att initiera den fria radikalpolymerisationen. Reaktionen fortsatte under 3 timmar under en kväveatmosfär. Därefter dialyserades kärnpartiklarna (MWCO 15 000) mot vatten under 4 dagar.

Kärnpartiklar skalades ytterligare genom fri radikalpolymerisation. En 10 ml destillerat vatten innehållande 36 mg kärnpartiklar, NIPAm (0, 75 g, 0, 663 mM), AA (6, 8 mikroliter, 0, 141 mM) och BisAA (3 mg, 0, 019 mM) avgasades under 20 minuter för att avlägsna syre, och sedan KPS (4, 8 mg, 0, 017 mM) tillsattes. Reaktionen fortsatte under 6 timmar vid 70 ° C följt av dialys (MWCO 15 000) mot vatten i 4 dagar. Resulterande kärn-skal-hydrogeler betecknades som magnetit-hydrogeler (MHG).

För att konjugera FA på MHG: erna N- hydroxysuccinimid (NHS) (1, 9 mg, 0, 034 mM), 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) (1, 3 mg, 0, 016 mM) och FA (1, 3 mg, 0, 006) mM) löstes först i 2 ml dimetylsulfoxid (DMSO). 17 mg MHG dispergerades i 20 ml PBS-lösning, därefter justerades pH till 4, 5 ~ 4, 7 med 1, 0 M HCl. Den aktiverade FA-lösningen sattes till MHG-lösningen och omrördes vid rumstemperatur i mörkret under 16 timmar. PH justerades till 9, 0 med 1, 0 M NaOH för att avbryta reaktionen och dialyserades (MWCO 15 000) mot PBS (pH 7, 4) under 3 dagar och destillerat vatten under 3 dagar. Resulterande MHG-FA lyofiliserades för kvantifiering och lagring. Alla partiklar skyddades från ljus för att bevara fluorescensen av FMA för efterföljande CLSM-experiment.

Karakterisering av MHG-Fas

Storleken och ytladdningen mättes med DLS (Zetasizer Nano S90, Malvern Instruments, UK) och zeta-potentialanalys (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments), respektive. Morfologin för det lyofiliserade provet observerades av SEM (JSM-6700F, JEOL, Japan) och TEM (JEM-2010, JEOL, Japan). UV / Vis-spektra av prover suspenderade i 1 ml destillerat vatten registrerades med användning av en UV-synlig spektrofotometer (V550, JASCO Inc., Easton, MD, USA).

Läkemedelsbelastning och släpp

MHG-FA (3, 6 mg) och DOX (0, 26, 0, 52 och 1, 3 mg) suspenderades i 3 ml PBS (pH 7, 4) och omrördes under 72 timmar på skakaren vid 4 ° C i mörker. DOX-laddade hydrogeler överfördes till ett dialysrör (MWCO 15 000) och dialyserades sedan mot PBS vid 37 ° C under 24 timmar. DOX-belastade MHG-FA separerades från media innehållande obelastat läkemedel och vägdes efter frystorkning. Den totala mängden av den laddade DOX erhölls genom att mäta absorbansen vid 490 nm med användning av en UV-VIS-spektrofotometer. Därefter bestämdes koncentrationen av DOX med en förutbestämd kalibreringskurva. Belastningseffektiviteten av 27, 5, 31, 1 och 34, 1% beräknades genom att dividera den totala mängden av den belastade DOX med vikten av MHG-FA. Läkemedelsfrisättning utfördes genom dialys vid 37 ° C i PBS (pH 7, 4). Mängden frisatt DOX från MHG-FA övervakades genom att mäta absorbansen av diffus DOX i PBS vid 490 nm.

Intracellulär distribution och upptag

Intracellulärt upptag och distribution av vätgas undersöktes av CLSM (LSM-700, Carl Zeiss, Tyskland). I korthet ympades HeLa-, Nuff- och MDA-MB-231-celler i en 12-brunnars odlingsplatta (5 x 104 * / brunn) innehållande 0, 1% gelatinbelagda 12-mm glasskydd 24 timmar före ympningen. Därefter inkuberades celler med MHG och MHG-FA (vid 100 | ig / ml) med / utan närvaro av magnet under 24 timmar vid 37 ° C. Celler tvättades sedan med PBS, cellmembranen färgades med Cell Mask TM Orange Plasma Membrane Marker (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner, fixerade med 4% paraformaldehyd (Wako, Osaka, Japan) och kärnorna färgades med Hoechst 33342 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) under 1 timme enligt tillverkarens protokoll och tvättades igen med PBS. Cellerna skannades i tre dimensioner som en z-stapel med tvådimensionella bilder och en bild som skärs horisontellt genom ungefär mitten av cellhöjden valdes för att skilja intracellulär fluorescens från dem på cellytan. Varje utsläppsljus skannades separat för individuella excitationer av färgämnen för att eliminera fluorescens tvärtal. Antal gröna pixlar räknades med hjälp av Image J-programvaran för att kvantifiera relativa upptag av hydrogeler.

DOX-responsiv cellviabilitet och apoptosanalys

Cytotoxicitet av MHG, MHG-FA och DOX-belastad MHG-FA bestämdes genom MTT-analys. HeLa-celler pläterades i plattor med 96 brunnar med en densitet av 2 x 104 celler / brunn 24 timmar före behandlingen. Efter cellfästning ersattes media med komplementmedier innehållande olika hydrogeler vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator. Efter 24 timmar, 48 timmar och 96 timmar ersatte 10 ul MTT-lösning (lager framställd vid 5 mg MTT i 5 ml medium) mediet och cellerna inkuberades ytterligare i 2 timmar vid 37 ° C. Formazan-fällningen löstes i DMSO, och absorbansen vid 550 nm mättes med användning av en mikroplåtläsare (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH, Cary, NC, USA). Den relativa cellviabiliteten (%) beräknades som (OD för behandlade celler / OD för icke-behandlade celler) × 100. Apoptotisk aktivitet av celler mättes med användning av MUSE TM Annexin V och Dead Cell-kit (Millipore, Billerica, MA, USA), enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat, efter inkubation med DOX-laddade hydrogeler under 24, 48, 72 och 96 timmar, samlades cellpellets från varje grupp genom centrifugering (1 200 rpm, 3 min) och resuspenderades i komplett medium. Och Muse Annexin V och Dead Cell Dye-analysreagens reagens tillsattes (100 ul till varje rör). Efter inkubering i 20 minuter vid rumstemperatur i mörkret analyserades cellerna med användning av en Muse Cell Analyzer (Merck Millipore).

Statistik

Data från upprepade experiment visas som medelvärde ± standardfel för medelvärdet.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Kim, H. et al . Synergistiskt förbättrad selektiv intracellulär upptag av anticancerläkemedelsbärare innefattande folsyra-konjugerade hydrogeler innehållande magnetitnanopartiklar Sci. Rep 7, 41090; doi: 10.1038 / srep41090 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.