Struktur av ljungan-virus ger insikt i genomemballage av detta picornavirus | naturkommunikation

Struktur av ljungan-virus ger insikt i genomemballage av detta picornavirus | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Biofysik
  • Viral genetik
  • Virusstrukturer

Abstrakt

Picornavirus ansvarar för en rad mänskliga och djursjukdomar, men hur deras RNA-genom förpackas förblir dåligt förstått. En särskilt dåligt studerad grupp inom denna familj är de som saknar det inre skiktproteinet VP4. Här rapporterar vi atomstrukturen för ett sådant virus, Ljungan-virus, typmedlem av släktet Parechovirus B, som har kopplats till diabetes och myokardit hos människor. Den 3, 78-Å-upplösning kryo-elektronmikroskopiska strukturen visar anmärkningsvärda funktioner, inklusive en utökad VP1 C-terminus, som bildar ett stort utsprång på virusets yttre yta, och ett grundmotiv vid N-terminalen i VP3, bindande till vilket beställer cirka 12 % av det virala genomet. Denna uppenbarligen laddningsdrivna RNA-infästning antyder att denna gren av picornavirus använder en annan mekanism för genomkapsling, kanske utforskad tidigt i utvecklingen av picornavirus.

Introduktion

Inkapsling av det virala genomet som leder till sammansättning av infektiösa avkommande virioner är ett viktigt steg i virusets livscykel. De mest använda strategierna för förpackning av virala genomer innefattar antingen att fylla en förformad procapsid med avkommande genom eller kärnbildning av kapsidsammansättning kring virala nukleinsyror 1, 2 . Vi har en övertygande bild av hur vissa bakteriofager paketerar det virala genomet till en förmonterad procapsid med förpackning av motorproteiner 3, och hur växtvirus styr RNA-förpackningar genom protein-protein eller protein – RNA-interaktioner 4 dock är picornavirus-enheten mycket mindre tydlig. Picornavirus, små (300 Å i diameter) enkelsträngade, positiva känslor, RNA-virus, med ett genom mellan 7, 1 och 9, 7 kb, är ansvariga för en mängd olika mänskliga och djursjukdomar och inkluderar poliovirus (PV), humant rinovirus, enterovirus A71, hepatit A-virus (HAV) och mul- och klövsjukevirus 5 . Den selektiva inkapslingen av det virala genomet och inte cellulära RNA kräver specifikt igenkännande av förpackningssignaler - sekvenser eller strukturer som är unika för viral nukleinsyra. Många försök att identifiera en RNA-inkapslingssignal i enterovirusgenom har misslyckats med 6, även om en nyligen genomförd studie rapporterade att PV ( Enterovirus- släkt) inkapsling underlättas av interaktioner mellan kapsidproteiner och RNA-replikationskomplexet 7 och Aichi-virus ( Kobuvirus- släktet) rapporterades att innehålla en 5′-terminal RNA-stamslinga som är kritisk för viral RNA-kapsling 8 . Ingen av dessa studier har emellertid tillhandahållit strukturella bevis för att förklara inkapsling.

Ljungan-virus (LV), ett picornavirus som ursprungligen isolerats från voles, har föreslagits som ett zoonotiskt virus, potentiellt förknippat med typ 1-diabetes mellitus, myokardit och Guillain – Barré-syndrom hos människor 9 . För närvarande har fyra LV-genotyper karaktäriserats (LV-1 till LV-4), två isolerade i Sverige och ytterligare två i USA 10 . LV tillhör Parechovirus- släktet och är nära besläktat med humana parechovirus (HPeV) (∼ 48% aminosyraidentitet mellan VP0-proteinerna) 11, 12 . Parechovirus uppvisar flera distinkta särdrag, inklusive bristen på den slutliga, antagna RNA-katalyserade, mognadsklyvningen av kapselproteinprekursorn VP0 till VP2 och VP4 (ref 12, 13, 14, 15), förekomsten av en ∼ 20-amino- syraförlängning anrikad med basrester till N-terminalen av VP3 (ref. 15) och distinkta 2A-proteiner med okänd funktion 16 . Avsaknaden av VP4 i dessa virus, som är inblandad i att bilda membranporer som är avgörande för viral obeläggning 17, antyder att parechovirus kan täcka sig via en annan mekanism. Jämfört med HPeV förkortas N-terminalen i LV VP0 ytterligare med cirka 30 rester och innehåller inte myristyleringssignalen GXXX (S / T) som är typisk för majoriteten av picornavirus 18 . En ytterligare viktig skillnad mellan HPeV och LV finns vid C-terminalen för VP1 - LV har inte arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) -motivet som är viktigt för cellytan interaktion med integrinreceptorer i de flesta HPeVs 19, 20, utan istället innehåller en unik 42-aminosyraförlängning. Hittills har inga receptorer identifierats för LV.

För många picornavirus produceras två dominerande typer av virala partiklar under en naturlig infektion, moget virus (innehållande förpackat RNA) och tomma procapsider (utan RNA), som kan separeras med kontinuerlig sackarosdensitetsgradient ultracentrifugering 21 . Sådana naturliga tomma partiklar har emellertid inte observerats för varken LV eller HPeV 22 . Skälen för frånvaron av tomma partiklar är oklara, men kan återspegla en distinkt monteringsmekanism. Det kan tänkas att det grundläggande N-terminala A / LRM (arginin / lysinrikt motiv) för VP3 kan vara involverat i RNA-proteininteraktioner och detta, tillsammans med det faktum att viralt RNA inte klyver VP0 i VP2 och VP4, kan återspeglar en förändrad mekanism för genominkapsling för parekovirus. Samlade LV-partiklar är robusta, så att även värmebehandling, som tenderar att producera modifierade enteroviruspartiklar 23, inte ger upptäckbar förändring i LV-partiklar 22 . Vidare rapporteras att LV-partiklar är resistenta mot surt pH, tvättmedel och oxiderande miljöer med fullständig inaktivering av råa extrakt som kräver uppvärmning till 90 ° C (ref. 24).

Även om en 8.5-Å kryo-elektronmikroskopistruktur (cryo-EM) av HPeV-1 har rapporterats 15, finns det ingen högupplöst strukturinformation för parechovirus. Här rapporterar vi bestämningen av en atommodell av LV från en 3, 78-Å-upplösning kryo-EM-analys. Strukturella jämförelser placerar viruset nära HAV inom den evolutionära hierarkin av picornavirus, medan väsentliga skillnader på både de inre och yttre kapsidytorna, inklusive visualisering av 12% av RNA-genomet som bildar icosahedrally ordnade interaktioner med kapsiden, antyder användning av en laddningsdriven mekanism för genominkapsling.

Resultat

Karakterisering och strukturbestämning

En infektiös komplementär DNA (cDNA) -klon konstruerades tidigare från den cytolytiskt replikerande cellkulturanpassade LV-varianten 87-012G 25 . Virus genererat från denna cDNA-klon gav en klar cytopatisk effekt (CPE) 3 dagar efter infektion. LV odlades i GMK-celler och renades genom centrifugering, linjär och diskontinuerlig sackarosgradient ultracentrifugering och ultrafiltrering (se metoder). Till skillnad från andra picornavirus, till exempel enterovirus A71, CVA16 och HAV, observerades endast ett band efter rate-zonal centrifugering och kännetecknades av SDS – polyakrylamidgelelektrofores (kompletterande figur 1a, b). PaSTRy-analysen 26, X 260 / X 280 absorbansförhållandena (1, 64) och transmissionselektronmikroskopi med negativ fläck (kompletterande figur 1c) indikerade att detta band innefattade mogna virioner, innehållande RNA.

Cryo-EM-mikrografer av renade LV-virioner registrerades med användning av ett FEI Polara-elektronmikroskop utrustat med en Gatan K2-toppdetektor (se Metoder). Totalt 5 558 virioner valdes från cryo-EM-bilderna och utsattes för tvådimensionell (2D) inriktning och tredimensionell (3D) rekonstruktion med enkelpartikeltekniker (fig. 1) med användning av EMAN2 och Relion 27, 28 . Bildbearbetning och 3D-rekonstruktion antog verkligen oberoende förbättringar 29 och upplösningen bedömdes med hjälp av den "guld" standard Fourier shell correlation (FSC) = 0, 143 kriterium 30, 31 . Den slutliga upplösningen var 3, 78 Å (tabell 1; kompletterande fig. 2). Polypeptid-huvudkedjan och sidokedjorna var väl upplösta för det mesta av kapsiden (fig. 2), vilket möjliggjorde en atommodell för majoriteten av de tre kapsidproteinerna manuellt inbyggd. Modellen förfinades 32 med användning av standard röntgenkristallografisk mätvärden, inklusive R- faktor, korrelation i verklig rymd och Ramachandran-tomter, för att validera den förfinade strukturen (tabell 2).

Image

( a ) Cryo-EM-bild av LV. ( b ) 3D-rekonstruktion av LV-partikeln sett ner i den trefaldiga axeln. Ytan färgas av radie från blå till grön till röd från den lägsta till den högsta radien. Icosahedralen femfaldiga, trefaldiga och tvåfaldiga axlar är märkta som 5, 3 respektive 2. ( c ) En tunn skiva av den centrala delen av LV-partikeln sett ner i den trefaldiga axeln. ( d ) Den centrala delen av LV-rekonstruktionen gjord på högre konturnivå (4σ över medelvärdet), sett längs en femfaldig symmetriaxel och djupkö för att avslöja de fem högdensitetsutskjutningarna inuti kapsiden under varje topp.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Image

( a ) Från ett avsnitt av VP1. ( b ) Från ett avsnitt av VP0.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Ovanliga ytfunktioner

LV-kapsidproteinerna är mestadels välordnade, bortsett från resterna 1–30 av VP1, 1–36 av VP0 och 1-3 av VP3. Det finns mycket markerade (∼ 20 Å höga) utskjutande förskjutningar cirka 45 Å från icosahedralen femfaldiga axlar, men annars är den yttre ytan i stort sett lik den för andra picornavirus; eftersom den är relativt slät är den mest lik HAV 21, även om den är mindre vinklad (fig. 3a, b). Det finns inga spår av enterovirus-canyonen, ofta platsen för receptorbindning 33, eftersom förkortade VP1- och VP0-slingor avlägsnar norra och södra väggar i kanjonen, på ett mycket liknande sätt som HAV. De tvärgående centrala sektionerna av LV-täthetskartan (fig. 1c, d) betonar de inre skillnaderna, vilket avslöjar genomiskt RNA involverat i synliga kontakter med proteinskalet vid de femfaldiga axlarna.

Image

( a - c ) Jämförelse av kapsider från LV ( b ) med HAV ( a ) och TrV ( c ). Kapsiderna är färgade med radie från blått till rött enligt den visade skalfältet. ( d ) Banddiagram över LV-protomeren. VP1, VP0 och VP3 visas i respektive blått, grönt och rött; VP1 C-terminal 55-resterna som bildar ytutsprånget runt den femfaldiga axeln visas med en elektronuppsättningskarta med lägre upplösning. ( e - g ) Banddiagram som visar LV-kapsidproteinerna VP1 ( e ), VP0 ( f ) och VP3 ( g ) med de individuella strängarna och terminalerna märkta, jämfört med de för HAV (grå), N- och C-terminalerna LV-proteinerna är märkta i respektive blått och rött.

Bild i full storlek

Stabilitet hos LV

LV-kapsider från råa extrakt har rapporterats kunna motstå hög temperatur och lågt pH (bibehålla infektivitet över 70 ° C och vid pH ned till cirka 4), vilket skulle göra dem lika robusta med HAV-kapsider 21 . Våra resultat (kompletterande figur 3) visar emellertid att genomiskt RNA exponeras vid en signifikant lägre temperatur (∼ 60 ° C) med liten variation i stabilitet med pH, varvid ∼ 10 ° C är lägre än kapsiddissociationstemperaturen för HAV. I själva verket är detta i stort sett i linje med tidigare experiment med renad LV 24, vilket antyder att en exogen faktor kan stabilisera partiklarna i infekterade celler. I enterovirus inträffar kapsidproteinsmältning i två distinkta steg som indikerar en tvåstegsövergång i proteinkonformation, medan LV endast genomgår den konformationella övergången med högre temperatur, i överensstämmelse med observationen att alternativa partiklar av parekovirus inte kan produceras genom värmebehandling 22 . Dessa resultat, tillsammans med bristen på VP4, indikerar att LV troligen inte täcker över en ny mekanism, som skiljer sig från de som används av de flesta andra picornavirus 21 . I linje med detta föreslog övervakning av LV-replikering genom immunfluorescensfärgning direkt cell-till-cell-överföring 25, vilket också föreslogs för HAV 21 .

Organisationen av VP1-3 liknar den som observerades i HAV

Kapsidproteinerna (VP0, VP1 och VP3) antar den förväntade åttsträngade anti-parallella p-cylinderkonfigurationen och är arrangerade med pseudo T = 3-symmetri (där T är trianguleringsnumret), så att VP1 omger de femfaldiga axlarna och VP0 och VP3 växlar om de två- och trefaldiga axlarna. Strukturbaserad sekvensinriktning tillåter oss att göra en robust sekvensinriktning som avslöjar begränsad likhet (∼ 25% identitet) med andra picornavirus (kompletterande figur 4). Sammantaget har HAV den mest kända strukturen som LV och vikten av de tre proteinerna i de två virusen jämförs i fig. 3d – g. Kanske korrelerat med frånvaron av en kanjon, har LV inte en kontinuerlig hydrofob ficka i VP1 (kompletterande figur 5a), såsom den som ses i enterovirus 34 där utvisning av en lipidfickfaktor är en förutsättning för att täcka 35 . LV VP1 liknar närmast den hos HAV, som likaledes inte har en fickfaktor (root-medelkvadratavvikelse för 83% av Ca är 2, 0 Å); liknande egenskaper mellan de två virusen i VP1 är: en förlängd ßH-sträng och alternativ konformation av GH-slingan som blockerar ingången till fickan, medan βC-, βE-, FF- och HH-strängarna förskjuts så att den inte längre kan rymma en lipidisk fickfaktor . Det finns ändå skillnader i konformationen av CD-, EF- och GH-slingorna mellan LV- och HAV VP1-strukturerna (fig. 3e). LV GH-slingan är tre rester kortare (en av de kortaste i valfri picornavirus) och CD- och EF-slingorna är nio respektive sju rester kortare. Den största skillnaden mellan LV och HAV VP1 inträffar emellertid vid C-terminalen på grund av to 50-restförlängningen i LV (kompletterande figur 4 och nästa avsnitt). LV VP0 liknar starkt HAV VP2 (rotmedelskvadratavvikelse för 206 Ca (95%) är 1, 6 Å). Sekvensinriktning indikerar en kort motsvarighet (∼ 27 rester) av HAV VP4 i LV VP0 (kompletterande figur 4), även om det inte rapporteras någon klyvning av VP0 till VP2 och VP4 i släktet Parechovirus 14 . Både HAV VP4 och LV VP0 N-terminalen (resterna 1–36) är störda. N-terminalen för HPeV VP0 förlängs med cirka 30 rester jämfört med LV. LV använder VP2 N-terminal domänbyte över icosahedrons tvåfaldiga axel, först observerad i ett picornavirus för HAV 21 (och sett i insekt picorna-liknande virus 36 ), möjligen förmedlar extra stabilitet vid detta gränssnitt (fig. 3d, f). Detta arrangemang är förmodligen vanligt för alla medlemmar i släktet. Dessutom visar interaktionsregionen (VP2 aA-spiral) intill icosahedrons tvåfaldiga axlar, som skiljer sig under de initiala stadierna för enterovirusbeläggning 35, 37, tät packning i LV (3, 7 Å-separering), som sågs i HAV 21, möjligen ytterligare bidrar till stabiliteten hos LV-partiklarna. Den totala vikten av VP3 liknar andra picornavirus; emellertid har LV och parechovirus en N-terminal förlängning, som är ansvarig för att interagera med RNA (se nedan). LV VP3 har en puffstruktur som förbinder αA-spiralen och ßB-strängen, som är frånvarande i HAV, men den senare har en ytterligare puffstruktur mellan ßC-strängen och αB-spiralen i VP3 (kompletterande figur 4). Det finns också skillnader mellan de två virusen i konformationen av VP3 GH-slingan (fig. 3). Vi kan förvänta oss stark likhet mellan strukturen för LV och HPeV: er; emellertid, antikroppar alstrade mot VPO- och VP1-kapsidproteinerna från LV, medan de erkänner LV-virionen, känner inte igen HPeV-1 genom immunofluorescens hos infekterade celler 38 .

Ytprojektioner omger de femfaldiga axlarna

Den yttre ytan av LV-kapsiden har ovanliga utsprång som omger de femfaldiga axlarna, som sträcker sig radien för LV-partikeln till ∼ 170 Å (Fig. 3b). Även om dessa är dåligt ordnade och bäst ses i rekonstruktioner med lägre upplösning, är det otvetydigt att de bildas från C-terminalen i VP1. Störningen utesluter spårning av proteinskelettet för denna domän (resterna 242–297) men den förutsagda proteinsekundära strukturen skulle föreslå tre helices. Ett sådant utsprång bildat från en C-terminal förlängning är unik i picornavirus; emellertid finns det i Seneca dalvirus en liknande storlek och placerad projicering bildad av slingor av VP1 och VP2, och i det insekt picorna-liknande viruset Triatomavirus (TrV 39 ) finns sådana utsprången bildade från insättningar i öglorna och p- ark med VP1 och VP3, även om de är förskjutna med ∼ 13 Å (Fig. 3). De 55 aminosyrorna som bidrar till denna struktur har en hög andel laddade rester (13 negativt och 8 positivt laddade rester). Vissa andra picornavirus, till exempel CV-A9 och HPeV-1, har ett arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) -motiv vid C-terminalen av VP1 som är involverad i integrinigenkänning; emellertid är detta motiv inte närvarande i LV VP1-förlängningen, som verkar inte innehålla några distinkta sekvensmotiv (kompletterande figur 4), även om det delar 40% identitet med det universella stressproteinet från Streptomyces auratus . Cellkulturanpassat virus som kan replikeras mer effektivt har visat sig ha tre mutationer i denna region: Y289H i VP1 och A162T och S172G i VP0 (ref. 40) (Kompletterande figur 5b). VP0-mutationerna är belägna i vardera änden av EF-slingan och även om de inte är exponerade på ytan kan de mycket väl förändra ytkonformationen, särskilt eftersom A162T är nära en disulfidbindning mellan Cys 191 (GH-slinga) och Cys 124 (CD-slinga) från VP1. Y289H är beläget i VPl-C-terminalförlängningen (kompletterande fig. 5b), ostörd densitet för vilken är belägen över korsningen mellan de tre kapsidproteinerna i en biologisk protomer (fig. 3d) och ligger därför intill VP0 EF-slingan. LV kodar för två 2A-proteiner, 2A1 och 2A2. Det 20-restlånga aftovirusliknande 2A1-proteinet har ett DvExNPGP-motiv som föreslås för att mediera klyvning av LV-polyproteinet in vitro och kan utgöra karboxiterminalen för det strukturella proteinet VP1 (ref. 13). Det är ännu inte beslutat om detta utgör en del av den extra tätheten vi ser i det femfaldiga utsprånget. I HAV-protein är emellertid VPX (VP1 + 2A) närvarande under partikelmontering och 2A-proteinet tros ha en roll i att styra sammansättningen innan det klyvs av. Det är möjligt att 2A1 i LV också har en roll i partikelmontering och kan likaledes klyvas vid partikelmognad.

Den N-terminala regionen av VP3 binder en RNA-stamslinga

Den utvidgade N-terminalregionen av VP3 definierades tydligt i densitetskartan och modellerades med utgångspunkt från rest 4 och framåt (fig. 4b). Sekvensen är markant basisk, påminner om de RNA-bindande domänerna för T = 3 växtvirus 41 (kompletterande figur 4). Genom att fortsätta från rest 64 till rest 4 lämnar polypeptiden VP3 åttsträngad antiparallell ß-cylinder och passerar längs en femfaldig axel för att införa i en symmetri-relaterad VP3 på den inre ytan av proteinskalet (Fig. 4 ). Det finns fem framträdande, 5-nm långa spiralområden med densitet som sträcker sig radiellt från varje femfaldig axel vid kapsidens inre yta (fig. 4). Det finns en betydande mängd densitet utöver den som motsvarar resterna av VP3 N-terminalförlängningen, som vi identifierar som RNA delvis baserat på formen på elektrondensiteten (fig. 4a; kompletterande fig. 6). Vi noterar att en funktion på en liknande plats också observerades i humant parechovirus, även om vid lägre upplösning, så att det inte var möjligt att identifiera arten av protein-RNA-interaktion 15 . Elektrostatiska interaktioner dominerar kontakten mellan VP3 N-terminalen och RNA-stamslingan (Fig. 4c). Den N-terminala polypeptiden (resterna 1–64) innefattar 13 basiska bostäder, varav de flesta är grupperade inom de första 20 resterna. Totalt 65 basrester från huvudsakligen de N-terminala segmenten av VP3-underenheterna runt de femfaldiga axlarna, men även inkluderande ett område av VP1, producerar en positivt laddad miljö som delvis motverkar den rikliga negativa laddningen av RNA-fosfatgrupperna. Rester inkluderande Arg 6, Lys 7, Lys 9, Lys 12, Lys 14, Arg 49, Arg 62, Lys 64 av VP3 och Arg 225 från VP1 är engagerade i interaktioner med det beställda RNA (fig. 4b); av dessa konserveras de flesta av VP3-resterna över släktet, medan rest 225 av VP1 konserveras strikt.

Image

( a ) Elektrondensitet för N-terminalen hos VP3 och det ordnade RNA runt den femfaldiga axeln. ( b ) Strukturen för VP3 N-terminaler runt den femfaldiga axeln (enskilda kopior kännetecknas av blå, gröna, röda, orange och gråa band, från rest 4 märkt N till rest 64 märkt C) och deras närhet till RNA (magenta) ). ( c ) Inre elektrostatisk yta hos LV-pentamer som visar övervägande av positiv laddning som interagerar med ryggraden i det genomiska RNA (magentapinnar). ( d ) Tecknad diagram som representerar LV genomiskt RNA som en sfär med ordnade fragment som bildar pentameriska utsprång (magenta); pentamererna i kapsidprotein associerar med genomet RNA genom elektrostatisk interaktion.

Bild i full storlek

Vår tolkning av RNA-tätheten placerar 15 baser av RNA i nära samband med N-terminalen av VP3, även om upplösningen är otillräcklig för att identifiera dem individuellt. Styrken hos den icosahedrally medelvärdena tätheten innebär att RNA är väsentligen fullständigt upptagen (Fig. 4a; Kompletterande Fig. 6). Genom hela kapsiden innefattar det beställda RNA cirka 900 baser, 12% av det virala genomet. Vi noterar att Seal et al . 42 observerade att HPeV-1 innehåller en stor (40%) fraktion av hårnål-RNA jämfört med PV-RNA och att modellering av den genomiska 5'-änden visade unik sekundär strukturvikning av denna region 25 ; Vi föreslår att denna strukturella begränsning är ett vanligt inslag i parechovirus.

Evolution och implikationer för montering

Sammantaget är strukturen hos LV mest lik den för HAV (fig. 5). Vidare har LV ett antal strukturella funktioner som också observerats i insektsvirus, inklusive VP2 N-terminal domänbyte (Fig. 5a), närvaron av en grundläggande VP3 N-terminal 'arm' 43 och observation av välordnat genom RNA med många protein / RNA-interaktioner 44 . I själva verket antyder både struktur och sekvensbaserad fylogeni att LV är det närmaste picornavirus till de insekta picorna-liknande virusen (Fig. 5b, c).

Image

( a ) Superposition av LV VP0 med VP2 av poliovirus, FMDV, HAV och CrPV. N-terminalen för LV VP0 viker på samma sätt som hos HAV och CrPV men på olika sätt till andra picornavirus. Stjärnan markerar EF-slingan som utgör en del av kanjonens södra vägg i poliovirus. ( b ) Struktur och ( c ) sekvensbaserade fylogenetiska träd av representativa picornavirus respektive cripavirus: CVB3, coxsackievirus B3; PV1, poliovirus typ 1; HRV14, humant rinovirus 14; BEV1, bovint enterovirus typ 1; EV71, EV-A71; TMEV, Theilers-virus; MEV, Mengo-virus; SVV, Seneca dalvirus; FMDV, mul- och klövsjukevirus; ERAV, häst-rinit A-virus; HAV, hepatit A-virus; AiV, Aichi-virus 59 ; TrV, triatomvirus; CrPV, cricket paralysis virus.

Bild i full storlek

Diskussion

En av de viktigaste särdragen hos LV är den långa förlängningen vid C-terminalen på VP1. Andra picornavirus som CV-A9 och den nära besläktade HPeV har också VP1 C-terminalförlängningar, även om de är kortare, och dessa fungerar i celltillbehör 15 . Detta är den mest troliga rollen för denna förlängning, vilket antagligen ger viruset utrymme att fästa vid en annan receptor, även om en roll i partikelmontering också är möjlig som i HAV 21 . I linje med detta, mutationer som ökar replikationseffektivitetskartan till den här regionen eller den angränsande VP0 EF-slingan. Ökad replikationseffektivitet var också associerad med induktion av ett apoptotiskt svar i GMK-celler, vilket indikeras genom detektering av aktiverat kaspas-3 och DNA-fragmentering 40 . Det kan tänkas att denna förlängning med en rik samling basiska rester också kan ha en alternativ funktion för att reglera värdgenuttryck.

Observationen av 15 baser av relativt välordnat RNA associerat med N-terminalen av VP3 nära de femfaldiga axlarna är också betydande när det gäller familjen Picornaviridae . Välordnat genom-RNA har hittills endast observerats i parechovirus 15 . För andra släkter i familjen har endast enstaka isolerade baser observerats. Detta antyder att medlemmar av Parechovirus-släktet kan använda en mekanism för passiv genominkapsling varigenom VP3 fungerar som en RNA-kapareon, organiserar genomet i en kondenserad struktur som är kompatibel med den icosahedriska symmetri av partikeln genom många till stor del elektrostatiska interaktioner med korta RNA-segment med förformade stam-loop-strukturer. En sådan mekanism skulle skilja sig väsentligt från modellen för enterovirusförpackning, som involverar interaktion mellan kapselproteiner och icke-strukturella proteiner i RNA-replikationskomplexet, såsom beskrivits för PV 7, men är inte inkonsekvent med observationen av RNA-sekundära strukturer beskrivna som förpackningssignaler i Aichi-virus 8 (släktet Kobuvirus , se fig. 5c) och icosahedral RNA-växtvirus, satellit-tobaksnekrosvirus 4 . Detta kan också vara relevant för den rapporterade bristen på VP0-klyvning i parechovirus, eftersom denna mognadsklyvning tros hända autokatalytiskt i närvaro av RNA, och kan vara ett slutligt kvalitetssäkringssteg som krävs, till exempel av släkter såsom enterovirus. Betydande delar av ordnat RNA har rapporterats i insekts-, växt-, andra djurvirus och bakteriofager 45, 46, 47, 48, och basiska regioner, ofta belägna vid N- eller C-terminalen hos skiktproteinerna, finns i flera familjer av icosahedral-virus där de tros vara involverade i RNA-protein-interaktioner som är ansvariga för att inkapsla virusgenomet 1 . I likhet med vissa insektsvirus bär LV ett sådant grundläggande A / LRM-motiv vid VP3 N-terminalen, som ses att binda viralt RNA. Denna bindning verkar inte vara direkt sekvensberoende, men styrs av elektrostatiska effekter i samband med lokal RNA-struktur. En roll för de mycket grundläggande 20 N-terminala resterna av LV VP3, i samband med RNA, i att styra sammansättningen och dimensioneringen av den pseudo T = 3-partikel 49, skulle vara förenlig med bristen på observation av tomma parechoviruspartiklar i det virala livscykel. I frånvaro av RNA kan laddningen på de enskilda protomererna vara avvisande och kanske blockera montering av pentamer 4 . För nodavirus 47, 50 har det visats att val av icke-viralt RNA för förpackning resulterar i bildning av mer dynamiska partiklar. Det kan vara så att nyligen utvecklade picornavirus använder mer specifika inkapslingssignaler i RNA 51 snarare än en elektrostatisk effekt. Andra bevis som presenteras här, såsom VP2-domänbyte och frånvaro av en VP1-ficka, tyder faktiskt på att LV, liknande HAV, behåller ett antal strukturella och funktionella egenskaper som är karakteristiska för primordiala picornavirus, som kan ha haft sitt ursprung i insektsvirus. Att förstå de fysiska egenskaperna hos LV och dess montering bör hjälpa till att utforma metoder för att förhindra och lindra infektionen och spridningen av detta virus.

metoder

Infektiöst cDNA in vitro transkription och transfektion

En infektiös cDNA-klon, pLV87-012G, innehållande den fullständiga genomsekvensen av LV-1 87-012G, lineariserades med användning av NotI-stället kodat nedströms om poly-A-svansen och transkriberades in vitro med användning av ett MEGAscript T7-transkriptionssats (Ambion). RNA transfekterades in i subkonfluenta Vero-celler med användning av Escort IV-reagens (Sigma). CPE var initialt svag och ökad CPE observerades under fem passager, varefter celllysat användes för att infektera GMK-celler.

Virusproduktion och rening

LV odlades i 28 x 175 cm 2 kolvar av GMK-celler infekterade vid en infektionsmultiplikation av 2. Cellerna odlades i DMEM (Sigma) kompletterat med 1% fetalt bovint serum (Gibco) tills 90% av cellerna uppvisade en CPE . Både celler och virusinnehållande supernatant uppsamlades, frystes och tinades tre gånger och centrifugerades sedan för att avlägsna cellskräp. Supernatanterna centrifugerades under 3 timmar vid 95 000 g och virala pellets återsuspenderades i PBS-buffert + 0, 01% Triton X-100, laddades sedan på 15-45% (vikt / volym) sackarosdensitetsgradienter och centrifugerades vid 222 000 g max under 1, 5 timmar i en SW41-rotor vid 4 ° C. Ytterligare detaljer har beskrivits tidigare 12 .

Negativfärgad elektronmikroskopi

Alikvoter av renade prover späddes till 0, 2 mg ml-1 och avsattes på glödutmatade, Formvar / kolbelagda koppargaller (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, USA). Efter 30 s inkubering blottades överskottsprovet bort och rutorna tvättades två gånger med avjoniserat vatten. Prover färgades med 1% (vikt / volym) uranylacetat under 45 s och överskott av färgning avlägsnades genom blotting. Raster undersöktes på ett Tecnai T12 (FEI, Hillsboro, OR) transmissionselektronmikroskop som arbetade vid 80 kV. Bilder skaffades på en 4 × 4-k-FEI Eagle-kamera med hög känslighet med en nominell förstoring på 67 000.

Cryo-EM och datainsamling

En 3-ul alikvot av renade LV-virioner (∼ 1 mg ml −1 ) applicerades på ett färskt glödutsläppt 400-mesh håligt kolbelagt kopparraster (C-platt, CF-2 / 1-2C; Protochips Inc. ) och blottades under 3 s, i 70% relativ fuktighet för djupfrysning (Vitrobot; FEI) i flytande etan. Cryo-EM-data samlades in med användning av ett FEI Tecnai G2 Polara-mikroskop (FEI) som drivs vid 300 kV, utrustat med ett energifilter (GIF Quantum; Gatan, Pleasanton, CA) som arbetade i nollförlustläge (20 eV energiväljar spaltbredd) och en direkt elektrondetektor (K2-toppmötet; Gatan). Mikrografer samlades med ett defokus mellan 1, 5 och 3 mikrometer som filmer (25 bilder, vardera 0, 2 s) i en enda elektron-räknarläge med användning av SerialEM 52 vid en kalibrerad förstoring av 37, 027, vilket resulterade i en pixelstorlek av 1, 35 Å.

Bildbehandling och 3D-rekonstruktion

Mikrograferna korrigerades för strålinducerad drift genom att anpassa och medelvärdet av de enskilda ramarna för varje film med användning av MOTIONCORR 53, 54 . Partiklar valdes automatiskt med ETHAN 54 och screenades sedan manuellt med boxerprogrammet i EMAN 55 . Parametrar för kontrastöverföringsfunktion (CTF) för driftkorrigerade mikrografier uppskattades med ett GPU-accelererat program Gctf (Kai Zhang, Gctf: realtids CTF-bestämning och korrigering, 2015, //www.biorxiv.org/content/early/2015/07 / 12 / 022.376). Mikrografer som visade tecken på astigmatism eller signifikant drift kasserades och användes inte för vidare analys. Totalt 5 558 partiklar från 288 mikrografer utsattes för 2D-inriktning och 3D-rekonstruktion med användning av Relion 1.3 (ref. 28) genom att följa rekommenderade guldstandardförädlingsprocedurer 28 och tillämpa icosahedelsymmetri. Två initiala modeller för LV genererades, en skapades av EMAN2 (ref. 27); en annan genererades genom att filtrera den rekonstruerade HAV-strukturen till 30 Å; de oberoende initiala modellerna konvergerade alla till samma resultat. Flera cykler av 2D-klassificering och 3D-förfining användes för att ytterligare välja partiklarna för slutlig förfining. The final resolution was evaluated using the 'gold' standard Fourier shell correction (threshold=0.143 criterion) 30, 31 of the two truly independent reconstructions (Supplementary Fig. 2). The data set and refinement statistics are summarized in Table 1.

Model building and refinement

The atomic models of LV VP0, VP1 and VP3 were built de novo into density with the structures of HAV capsid proteins as a guide, using COOT 56 . REFMAC 57 was used to calculate the difference map that highlighted the areas where the model was incorrect. Models were further improved by iterative positional and B-factor refinement in real space using Phenix 32 and rebuilding in COOT 56 . Only coordinates were refined, the maps were kept constant. Each round of model optimization was guided by cross-correlation between the map and the model. Refinement statistics are given in Table 2 as evaluated by Molprobity 58 functions integrated in Phenix.

Thermal stability assay

PaSTRy 26 experiments were performed with an MX3005p RT–PCR instrument (Agilent) using both SYTO9 and SYPRO-Red (Invitrogen) dyes to detect the presence of RNA and the exposed hydrophobic regions of proteins, respectively. Fifty-microlitre reactions were set up in a thin-walled PCR plate (Agilent), containing 1 μg of the LV virus, 5 mM SYTO9 and 3 × SYPRO-Red in PBS (pH 7.4), and the temperature ramped from 25 to 99 °C. Fluorescence was recorded in triplicate at 1-°C intervals.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-6 and Supplementary References

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.