Strukturen hos en lipidbunden utvidgad synaptotagmin indikerar en roll i lipidöverföring | natur

Strukturen hos en lipidbunden utvidgad synaptotagmin indikerar en roll i lipidöverföring | natur

Anonim

ämnen

  • Membranhandel

Den här artikeln har uppdaterats

Abstrakt

Växande bevis tyder på att nära inställningar mellan endoplasmatisk retikulum (ER) och andra membran, inklusive anställningar med plasmamembranet (PM), förmedlar utbyte av lipider mellan dessa tvåskikt. Mekanismerna för sådan utbyte, som möjliggör lipidöverföring oberoende av vesikulär transport, förblir dåligt förstås. Närvaron av en synaptotagminliknande mitokondriell-lipidbindande protein (SMP) -domän, en föreslagen lipidbindande modul, i flera proteiner lokaliserade på membrankontaktställen har väckt möjligheten att sådana domäner kan impliceras i lipidtransport 1, 2 . SMP-innehållande proteiner inkluderar komponenter i ERMES-komplexet, en ER-mitokondriell bindemedel 3 och de utökade synaptotagminerna (kända som tricalbins i jäst), som är ER-PM-tetrar 4, 5, 6 . Här presenterar vi med 2, 44 Å-upplösning kristallstrukturen för ett fragment av human utökad synaptotagmin 2 (E-SYT2), inklusive en SMP-domän och två angränsande C2-domäner. SMP-domänen har en p-tunnstruktur som proteinmoduler i den tubulära-lipidbindande (TULIP) superfamiljen. Den dimeriseras för att bilda en ungefär 90 Å-lång cylinder som korsas av en kanal som är fodrad helt med hydrofoba rester, med de två C2A – C2B-fragmenten som bildar välvda strukturer som är flexibla kopplade till SMP-domänen. Det är viktigt att strukturanalys kompletterad med masspektrometri avslöjade närvaron av glycerofosfolipider i E-SYT2 SMP-kanalen, vilket indikerar en direkt roll för E-SYTs i lipidtransport. Dessa fynd ger starka bevis för en roll av SMP-domäninnehållande proteiner i kontrollen av lipidöverföring vid membrankontaktställen och har breda konsekvenser utanför området för ER-till-PM-anställningar.

Huvudsaklig

ER-PM-kontaktplatser, som finns i alla eukaryoter, tros ha flera funktioner 7, 8, 9, inklusive en evolutionärt bevarad roll i regleringen av lipidsammansättning och metabolism vid PM 8, 9, 10, 11 . E-SYT: er är ER-bosatta proteiner som fungerar som tetrar som länkar ER- och PM-membranen i nära placering 4, 5, 6 . Det finns tre E-SYT: er (E-SYT1, 2 och 3) i däggdjursceller, som homo- eller heterodimeriserar 6 . Varje E-SYT har ett aminoterminal ER-membranankare, följt av en kort länkregion, en SMP-domän och tre eller flera C2-domäner 6 (Fig. La). ER-membranankar- och C2-domänerna krävs för bindning, medan SMP-domänens roll har varit oklar 6 . Bioinformatikanalyser som tyder på att SMP-domäner tillhör TULIP-superfamiljen var därför spännande eftersom flera TULIP-proteiner är kända för att binda lipider och delta i lipidöverföring 1, 2 .

a, E-SYT2 domänarkitektur. Domängränser anges som restnummer. b, Vänster, monomerer i E-SYT2 dimer är gröna eller blå. C2A – C2B-bågar (se även fig. 3) kontaktar SMP-fatet som i kristallen. Till höger är E-SYT2 färgad från blå (N-terminalen) till röd (C-terminalen), och C2A – C2B-bågarna dras bort från SMP-dimern. Sömmen längs SMP-dimerens sida är delvis synlig. Tvättmedel och lipidmolekyler är rosa. c, Ytrepresentation av SMP-dimer. Hydrofoba rester (blå) leder kanalen. Lipidfettsyragrupper representerar utrymme. d, banddiagram för BPI (Protein Data Bank (PDB) anslutning 1BP1), E-SYT2 och CTEP (PDB accession 2OBD). Strukturella element i BPI eller CTEP som inte finns i E-SYT2 är cyan.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

För att få insikt om E-SYT-funktion bestämde vi kristallstrukturen för ett fragment av human E-SYT2 (rester 163–634) innefattande SMP-, C2A- och C2B-domänerna (utökad datatabell 1). Den karboxiterminala delen av E-SYT2, som består av en utsträckt linkerregion följt av en tredje C2-domän (C2C) som interagerar med fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PI (4, 5) P2) vid PM 6, var inte i konstruktionen.

Detta E-SYT2-fragment dimeriseras både i lösning, som bedöms med hjälp av kromatografi för storlek-uteslutning, och i kristallen. Varje SMP-domän är en p-fat (fig. Ib), innefattande ett starkt tvinnat P-ark och två a-helices, H1 och H3. En tredje spiral, H2, täcker delvis ena änden av trumman. Den andra änden av trumman associerar med motsvarande ände av den andra SMP-domänen för att bilda en 90 Å-lång cylinder. Resterna vid gränssnittet mellan de två SMP-domänerna är bland de mest konserverade (utvidgade data fig. 1), i överensstämmelse med dimerns fysiologiska relevans, och de medierar förmodligen homo- och heterodimerisering av E-SYTs 6 . En ungefär 10-Å-diameter kanal som är fodrad exklusivt med hydrofoba rester löper genom cylindern (Fig. 1c). Den ansluts med lösningsmedel i båda ändarna och via en smal söm längs cylinderns längd.

Det finns ingen signifikant likhet mellan de primära sekvenserna för E-SYT2 SMP-domänen och proteiner med känd fold. Icke desto mindre, som förutses av bioinformatikstudier 1, 2, etablerar vår struktur fast SMP-domänen som medlem i TULIP-superfamiljen. I tidigare karaktäriserade TULIP-proteiner, såsom bakteriedödande / permeabilitetsökande protein (BPI) och kolesterylesteröverföringsprotein (CETP) (fig. 1d), bildar SMP-liknande moduler också rörformiga strukturer med en långsträckt hydrofob kanal 12, 13 . BPI och CETP dimeriseras emellertid inte, eftersom varje monomer innefattar två SMP-liknande domäner snarare än en, med de två modulerna anordnade i tandem och anslutna med ett ß-ark som inte finns i E-SYT.

Inom SMP-kanalen visar kartorna med elektrondensitet tydliga tätheter för två lipidliknande molekyler per E-SYT2-monomer (fig. 2a, b). En densitet överensstämmer med en diacylglycerollipid, medan den andra påminner om Triton X-100, ett tvättmedel som används vid proteingrening. Triton X-100 modellerades till denna densitet med dess 4- (1, 1, 3, 3 tetrametylbutyl) -fenylgrupp begravd i den hydrofoba kanalen och dess hydrofila polyetylenkedja sträckte sig genom sömmen in i lösningsmedlet (fig. 2). En icke-denaturerande masspektrometri (MS) -analys 14 av rekombinant E-SYT2 renad i frånvaro av Triton X-100 visar att ligandbundna proteiner är närvarande och att två lipidmolekyler kan binda per monomer (utvidgad data fig. 2), så troligen binder en andra lipidmolekyl i stället för tvättmedlet i fysiologiskt sammanhang. Denaturering av negativ-joniserande MS-och MS / MS-analys med hög upplösning identifierade vidare ligander av den rekombinanta E-SYT2 som två huvudkomponenter i bakteriemembranet, fosfatidylglycerol och fosfatidyletanolamin (PE) (utvidgad data fig. 3 och utvidgad datatabell 2).

a, 2Fo - Fc elektrondensitet (1, 0 σ ) i vilken Triton X-100-detergenten och fosfoglycerollipiden modellerades; modeller efter förfining överlagras. Lipidhuvudgrupper modellerades inte. b, Final 2 F o - Fc elektrondensitet för lipidliknande molekyler. Proteinatomer inom 8 Å från lipid indikeras. c, Positivt läge, icke-denaturerande elektrosprayjonisering (ESI) masspektrum av E-SYT2 uttryckt i däggdjursceller. Under nativa förhållanden (20 mM ammoniumacetat, pH 6, 9) är en konformation av apo E-SYT2 centrerad kring laddningstillståndet +16 det vanligaste monomera tillståndet (indikerat som P); molekylvikt = 57, 032, 4 ± 1, 6 Da. De mest representerade arterna under nativa förhållanden är dimerer som innehåller minst fyra lipidmolekyler (P2 L4) med ett laddningstillstånd centrerat kring +24. m / z , massa till laddningsförhållande. d, En E-SYT2-konstruktion som inkluderar SMP-domänen binder fluorescerande NBD – PE, medan C2A – C2B-bågen inte ensam gör det. Proteiner inkuberades med fluorescerande lipid, analyserades sedan med nativt PAGE, vilket undersöktes med avseende på fluorescens (överst) och färgades av Coomassie (botten). Bandet med det SMP-innehållande proteinet samvandrar med fluorescerande PE. e, E-SYT2 förbelastad med NBD – PE, sedan ytterligare renad, inkuberades med fosfatidylkolin (PC), sfingomyelin (SM), ceramid (CER) eller kolesterol (CH). Prover visualiserades på nativa geler genom fluorescens och Coomassie-färgning. Fluorescenssignal normaliserades till mängden protein i varje spår, vilket bedömdes med Coomassie-färgning. Experimentet genomfördes fem gånger; felfält representerar standardavvikelse. PC, men inte någon av sterolerna, förskjuter NBD – PE. (Se även utvidgad data, fig. 7.)

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Elektrondensitetskartorna visar att lipidfettsyragrupperna ligger i den hydrofoba kanalen, medan den polära huvudgruppen sticker ut genom sömmen och lösas. Det finns ingen täthet för huvudgruppen, vilket innebär att den inte har omfattande kontakter med E-SYT2 och är störd. Detta antyder att SMP-domänen kan binda en mängd olika glycerofosfolipider. BPI och CETP binder olika lipider på liknande sätt med hydrofoba delar begravda i den hydrofoba kanalen och de hydrofila grupperna utsatta för lösningsmedel längs sömmen 12, 13 .

För att identifiera lipider bundna till E-SYT2 i däggdjursceller uttrycktes ett 3 × flaggmärkt E-SYT2-fragment innefattande SMP- och C2A – C2B-domänerna i Expi293-celler och renades genom anti-Flag immunutfällning. Denaturering av MS av denna konstruktion och kvantitativ lipidomisk analys avslöjade närvaron av glycerofosfolipiderna fosfatidylkolin (PC; 67%), PE (21%), fosfatidylinositol (7%) och fosfatidylserin (3%) (Utvidgade data, fig. 4, 5 och utvidgade data Tabell 3). Dessa relativa mängder av de viktigaste fosfolipiderna reflekterar grovt deras relativa mängd i djurcellmembran 15, vilket antyder en brist på specificitet med avseende på speciella glycerofosfolipidligander. Vi letade efter men upptäckte inte andra lipidarter som lysofosfatidylkolin, sfingosin eller sfingosin-1-fosfat, sfingomyelin, några fosfoinositider eller märkbara mängder ceramid. Inte heller detekterades kolesterolestrar, som är bundna av CETP 13, eller kolesterol.

Vid analys med icke-denaturerande MS konstaterades att E-SYT2 förekom både som monomer och dimer (fig. 2c). Laddningstillståndets fördelning centrerad kring +16 representerar monomerer huvudsakligen i apo-formen, motsvarande en molekylvikt av 57 030 dalton (Da) efter dekonvolution (utvidgad data fig 6a). Endast en låg procentandel av monomererna (∼ 10%) var bundna till en eller två lipidmolekyler, med massor motsvarande de huvudsakliga lipidarter som tidigare identifierats. Det mesta av proteinet var dimera med en laddningstillståndsfördelning centrerad kring +24. Efter dekonvolution av detta spektrum (utvidgade data fig 6b, c och 7) är molekylvikten för dimern er 117 500 Da, vilket antyder närvaron av minst fyra bundna lipidmolekyler (förutsatt en medelmassa på 750–800 Da per lipid) . Nästan inga dimerer detekterades i apo-formen. Dessa fynd indikerar att dimerisering krävs för stabil bindning av lipiderna.

Bindning till glycerofosfolipider demonstrerades också in vitro genom att testa förmågan hos renade lipider att förskjuta förbelastade fluorescerande 7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl-1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (NBD – PE) från E-SYT2 (Fig. 2d, e). Inkubation av förbelastad E-SYT2 med PC-förskjuten NBD – PE, vilket avslöjades genom förlust av fluorescens i bandet motsvarande E-SYT2 i nativ polyakrylamidgelelektrofores (SIDA; Fig. 2e). I kontrast till MS-resultaten förträngde kolesterol, sfingomyelin och ceramid emellertid inte PE, vilket tyder på att de inte är bundna av E-SYT2, även när de är rikligt närvarande. Den större styvheten hos dessa lipider jämfört med glycerofosfolipider kan förhindra deras inträde i E-SYT2-lipidbindningsstället.

C2A och C2B veckas båda in i typ II C2-domäner och är styvt länkade till en båge som sträcker sig ∼ 70 Å tvärs över (Fig. 3 visar bästa bild av bågen), som nyligen beskrivits 16 . I kristallstrukturen kommer båda C2A – C2B-modulerna i E-SYT2-dimeren i kontakt med samma SMP-domän, med olika C2A – C2B-rester som interagerar med olika korrigeringar på SMP (fig. 1a, till vänster). Återstoder vid gränssnitten bevaras inte (Utvidgad data fig. 1), vilket antyder att C2 – SMP-interaktioner är kristallkontakter och att C2A – C2B inte interagerar med SMP-dimer i lösning (fig. 1b, till höger). Snarare interagerar E-SYT2 C2A – C2B-fragmentet med lipid-tvåskikt på ett Ca 2 + -beroende sätt 17 . Följaktligen identifierades kalciumkoordinerande rester i slingor i slutet av bågsstrukturen i C2A 16 .

a, Schematisk för en cell med en ER-PM-kontaktplats. b, 'Tunnelmodell' för E-SYT2, där E-SYT2 överbryggar ER och PM för att överföra lipider mellan dem. E-SYT2 SMP-dimer är ∼ 90 Å lång, så ER och PM kan inte vara längre från varandra om E-SYT2 fungerar som en tunnel. E-SYT2 är förankrat till ER via dess N-terminalregion och till PM via C2C-domänen (PDB-anslutning 2DMG). C2A – C2B interagerar med membran via slingor i änden av bågen och kan interagera med ER, PM eller antingen, beroende på mellanmembranavståndet. Modellen ska skalas. c, "Shuttle-modell" av E-SYT2 som kopplar samman ER och PM och dras i skala. Längden på ostrukturerade länkarregioner anges i rester. Vid större ER – PM-avstånd, som visas här, kan C2A – C2B (C2AB) inte nå PM. SMP-dimeren kan transportera lipider mellan ER och PM, eventuellt tillsammans med partnerproteiner (märkta med ett frågetecken).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Avståndet mellan ER- och PM-membranen på kontaktplatserna beräknas till 100–300 Å (ref 8, 18, 19). E-SYT2 sträcker sig över detta utrymme med ett N-terminal membranankare infogat i ER och dess C2C-domän som är bunden till PM via en interaktion med PI (4, 5) P2, som berikas där 6 (Fig. 3). Även om C2C, när den uttrycks ensam, rekryteras till PM 6, 17, observerade vi och andra 17 inte någon förening av C2A – C2B med en viss organell i levande celler. Med tanke på de geometriska begränsningarna som införts av domändimensioner och länkarlängder är en interaktion mellan C2A – C2B och den cytosoliska ytan på ER plausibel och överensstämmer med dess tidigare observerade sura fosfolipidoberoende membraninteraktioner 17 . En interaktion mellan C2A – C2B och PM vid mycket smala ER – PM-kontakter (mindre än ∼ 100 Å), där den kan nå PM, är dock trolig.

Strukturen för E-SYT2 SMP-domänen och identifiering av lipider i dess hydrofoba kanal etablerar slutligen denna domän som en lipidbindande modul. Den strukturella likheten mellan E-SYT2 och proteiner i TULIP-superfamiljen, varav flera fungerar i lipidöverföring extra-cytosoliskt 2, 12, 13, antyder vidare en roll i lipidtransport. Dessutom indikerar närvaron av denna modul i proteiner som lokaliseras för kontakter mellan ER och andra membran 4, 5, 6, 20 starkt en roll i överföringen av lipider från deras syntesplats i ER till dessa membran, såsom PM för E-SYT2. Som svar på hur en sådan överföring kan ske kan SMP-dimerer i princip bilda en bro mellan anslutna membran längs vilka lipider överförs ("tunnelmodell"; fig. 3), med deras hydrofoba delar som glider längs den hydrofoba kanalen och deras hydrofila huvud grupperar lösningsmedel exponerat vid sömmen. CETP föreslogs att fungera på exakt detta sätt för att kanalisera kolesterolestrar mellan lipoproteinpartiklar 21 . Eftersom den bara är 90 Å lång kan E-SYT2 SMP-dimer vara för kort för att spänna mellan membranutrymmet. En annan möjlighet, trolig för ER – PM-avstånd under Å 200 Å, är att SMP-dimern skifter mellan membran, extraherar lipid från en och levererar den till den andra ('skyttelmodell'; fig. 3). I en tredje, inte ömsesidigt exklusiv modell, fungerar E-SYT2 i samverkan med andra lipidöverföringsproteiner för att åstadkomma transport. Denna modell är tilltalande eftersom den inte kräver företrädesvis E-SYT för att binda specifika lipider, som istället skulle kunna väljas av partnerproteinerna. Fosfatidylinositolöverföringsproteiner (PITP) och proteiner i OSH-familjen är intressanta kandidater eftersom de kan interagera med specifika lipider 22, 23 och tros fungera i lipidöverföring på kontaktplatser 8, 9 .

Identifieringen av E-SYT: er som lipidöverföringsproteiner representerar ett viktigt steg framåt för att dissekera biologin på ER-PM-kontaktplatser. Ändå är vårt arbete också mer allmänt tillämpligt på andra kontaktplatser, till exempel ER-mitokondriella kontakter, där ERMES-kopplingsanläggningen förutsägs innehålla tre SMP-moduler 1, 2 . Vi misstänker att dessa hetero-dimeriseras på ett head-to-head-sätt, som observerats i E-SYT2 SMP-homodimer, för att bilda en eller flera lipidbärarmoduler med hydrofoba lipidbindande kanaler.

Metoder Sammanfattning

Infödda eller selenometioninsubstituerad rekombinant human E-SYT2 (resterna 163–634) överuttrycktes och renades från Escherichia coli . Proteinet kristalliserades med hänga-drop-metoden, ekvilibrerande mot moderlut som innefattade 100 mM malonsyra, imidazol och borsyra (MIB) buffert vid pH 4, 3-4, 6 och 12, 5-14% PEG 1500, och dessutom 0, 1 M NaI för selenometionin -substituerat protein. Vi använde den anomala dispersionsmetoden med flera våglängder med de selenometioninsubstituerade kristallerna för fasning (utvidgad datatabell 1). Strukturen förfinades mot data från nativa kristaller (utvidgad datatabell 1). Strukturbestämning, MS-analys och lipidbindande analyser in vitro beskrivs mer detaljerat i metoder.

Online-metoder

Kloning, proteinuttryck och rening

Human E-SYT2 (rester 163–634) klonades in i en modifierad pCDF-vektor, som kodar för en N-terminal glutathion S -transferas (GST) -tagg och ett precisionsproteas-klyvningsställe. Plasmiden transformerades till Escherichia coli BL21 (DE3) -celler. Celler odlades till en OD 600 nm 0, 7, skiftades sedan till 20 ° C, och proteinuttryck inducerades genom tillsats av 1 mM isopropyl-P-d-tiogalaktosid (IPTG). Celler skördades 20 timmar efter induktion. Selenometioninsubstituerad E-SYT2 producerades på samma sätt som beskrivits tidigare 24 . Celler uppsamlades genom centrifugering, resuspenderades i lysbuffert (20 mM Tris pH 8, 0, 500 mM NaCl, 5 mM ditiotreitol (DTT), 10 mM EDTA) kompletterat med proteasinhibitorer (komplett EDTA-fri; Roche) och lyserades med användning av en cellstörare (Avestin). E-SYT2 isolerades med glutathionsepharosharts, tvättades en gång med lysbuffert kompletterat med 1% Triton X-100 och två gånger i lysbuffert, utom utan EDTA. GST-taggen klyvdes med användning av Precision-proteas och det hexahistidin-märkta proteaset avlägsnades genom att leda proteinlösningen över Ni-NTA-harts. Proteinet renades ytterligare genom gelfiltrering (Superdex 200; GE Healthcare), eluerades i buffert innehållande 20 mM Tris (pH 8, 0), 300 mM NaCl och 5 mM DTT och koncentrerades till cirka 8 mg ml-1.

För rening från däggdjursceller klonades human E-SYT2 (rester 163-634) till pCDNA 3.1 med en N-terminal 3 × Flagg-tagg. Expi293-celler transfekterades i 3 dagar före skörd. Celler lyserades i buffert (20 mM Tris pH 8, 0, 250 mM NaCl, 10 mM EDTA) kompletterat med proteashämmare (komplett EDTA-fri; Roche) med frys-tö-metoden med användning av flytande kväve fem gånger. Proteiner renades med anti-Flag M2-harts (Sigma) och eluerades i buffert (20 mM Tris pH 8, 0, 250 mM NaCl) innehållande 100 | ig ml-1 3 × Flaggpeptid. Ytterligare rening var genom storlek-uteslutningskromatografi, såsom beskrivits tidigare.

Kristallisation, datainsamling och strukturbestämning

Kristaller av nativt protein odlades vid rumstemperatur med häng-droppmetoden. Lika volymer proteinlösning och moderlut (1, 3 | il) blandades och suspenderades över moderluten (100 mM malonsyra, imidazol och borsyra (MIB) buffert (Qiagen) vid pH 4, 3, 12, 5% PEG 1500). Kristallerna tillhör rymdgruppen P2 1 2 1 2 1, med a = 74, 3, b = 88, 4, c = 167, 2 Å. Selenometioninsubstituerade kristaller odlades under liknande betingelser förutom att moderluten dessutom innehöll natriumjodid (100 mM MIB (Qiagen) vid pH 4, 6, 14% PEG 1500, 0, 1 M NaI). Kristaller överfördes till moderlut, kompletterat med 16% etylenglykol, monterad på slingan och snabbfryst i flytande kväve. För de selen-substituerade kristallerna uppsamlades data vid två våglängder valda för att maximera selen- och jod-anomala signaler. All data samlades in i NE-CAT-streck 24-ID-C vid Advanced Photon Source och behandlades med XDS 25 . Faser beräknades i Phenix 26 med den anomala dispersionsmetoden med flera våglängder med användning av data från de selen-substituerade kristallerna, och kartongerna för elektrondensitet förbättrades ytterligare genom lösningsmedelsutplattning och icke-kristallografisk tvåfaldig medelvärde. Vi använde COOT 27 för modellbyggnad. När modellen byggdes framåt kombinerade vi iterativt faser beräknade från delmodeller med experimentfaser för att förbättra kartorna i fortfarande obebyggda regioner. Modellen förfinades till 2, 44 Å mot data från nativa kristaller med användning av Phenix 26 . De inledande förfiningsrundorna genomfördes med användning av minst kvadrater, verkligt utrymme, individuella B-faktor och torsionsvinkelglödgningsalternativ och alternerades med manuell ombyggnad i COOT 27 . Detergent- och lipidmolekyler såväl som vatten modellerades i de sista förfiningsstegen, för vilka vi använde minst kvadrater, individuella B-faktor- och TLS-förfining. Siffrorna framställdes med användning av PyMol-programvara 28 . Modellen har god Ramachandran-geometri (96%, 4% och 0, 1% av resterna finns i tillåtna respektive generöst tillåtna regioner).

MS-analyser

Renade proteinprover avsaltades med en Vivaspin 10.000 MWCO-anordning (GE Healthcare) för att byta ut den initiala bufferten med 20 mM ammoniumacetat, pH 6, 8, och för att eliminera eventuellt förorenande små molekyler. Provet infunderades sedan direkt vid ett flöde av 1 mikroliter -1 och en koncentration av 0, 4 mg ml-1 i en fyrdubbla tid för flygning (QTOF) 6550 Agilent masspektrometer utrustad med ett Agilent 1200-serie-system. Icke-denaturerande analyser utfördes i positivt jonläge med nanoelektrospraysspänning inställd på 1 400 V (Vcap), temperatur 280 ° C, torkningsgasflöde 11 1 min −1 och fragmentor 175 V. Proverna injicerades i 20 mM ammoniumacetat, pH 6.8, och spektra erhållna med en skanningshastighet på 1 spektra s-1. Data samlades in över ett massintervall på 1 000–10 000 m / z och avkoncentrerades med hjälp av Bioconfirm-programvaran (Agilent) och den maximala Entropy-dekonvolution-algoritmen. Denaturering av MS, för att identifiera möjliga ligander och för att bekräfta den teoretiska massan av apo E-SYT2, utfördes i positivt och negativt jon-läge med användning av förhållanden som kunde bryta protein-ligand-komplexet (sura lösningar med hög ånga innehållande 5% ättiksyra i 20 mM ammoniumacetat). Samma sura betingelser användes också för att dissociera nativa dimerer och för att bekräfta att deras närvaro inte var en instrumental artefakt. Data erhölls mellan 100 och 1 000 m / z (både positivt och negativt läge) för att identifiera liganderna och mellan 1 000 och 10 000 m / z (positivt läge) för att övervaka proteinkonformationella tillstånd. Den strukturella identiteten för ligander bekräftades genom kollisionsinducerad dissociation (CID) i positivt och negativt jon-läge efter val av prekursorjoner i MS / MS-läge och fragmentering med ett kollisionsenergivärde av 25 eV.

För att förbättra lipididentifieringen uppsamlades ett lipidekstrakt som erhölls genom sonikering (10 min) av proteinet (4 ug) i 100 ul metanol (eller kloroform / metanol för extraktion av neutrala lipider) efter centrifugering av provet och proteinutfällning. Provet återsuspenderades sedan i lösningsmedel B (se senare) och analyserades genom vätskekromatografi (LC) -MS / MS med samma masspektrometer utrustad med ett ChipLC-system och ett HILIC-chip (Amide 80, Agilent) för den kromatografiska separationen av isolerade lipider. Agilent 1200-serien HPLC använde en kapillärpump för provinjektion på anrikningskolonnen och en Nano-pump för separering. Lösningsmedel som används för HILIC HPLC: 50% acetonitril i vatten innehållande 25 mM ammoniumformiat pH 4, 6 justerat med myrsyra (lösningsmedel A), 95% acetonitril innehållande 25 mM ammoniumformiat pH 4, 6 justerat med myrsyra (lösningsmedel B). Använd LC-gradient: 100% B från 0 till 1, 5 min, 100% till 85% B från 1, 5 till 3 min, 85 till 80% B från 3 till 11, 5 min, 100% B från 11, 5 till 13, 5 min, 100% B från 13, 6 till 19 min. Agilent 6550 QTOF-masspektrometer användes i positivt jon-läge och negativ-jon-läge; elektrosprayspänning sattes till 1 580 V (Vcap), temperatur 185 ° C, torkgas 14 l min −1, fragmentorspänning 175 V. Instrumentet kördes i auto MS / MS-läge med en MS-anskaffningshastighet av 2 spektra s −1 och MS / MS-anskaffningsgraden på 4 spektra-1.

Kvantifiering av lipidart som frisattes från E-SYT2 uttryckt i däggdjursceller utfördes med LC-MS / MS (MRM-läge) efter att ha spickat lipidstandarder i provet före extraktionen och med användning av en 6460 QQQ (Agilent) masspektrometer, utrustad med en 1290-seriens kromatografiska system. Lipidstandarder: 1, 2-dimyristoyl- sn- glycero-3-fosfokolin (DMPC), 1, 2-dimyristoyl- sn- glycero-3-fosfoetanolamin (DMPE), 1, 2-dimyristoyl- sn- glycero-3-fosfo - l-serin (DMPS), 1, 2-dimyristoyl- sn- glycero-3-fosfo- (1-rac-glycerol) (DMPG), 1, 2-dihexadekanoyl- sn- glycero-3-fosfat (DPPA) 1, heptadekanoyl-2-hydroxisn-glycero-3-fosfat (LPA), N- heptadekanoyl-d -erytrosfingosin (Cer) köptes från Avanti polära lipider, dioktanoylfosfatidylinositol (PI) köptes från Echelon Biosciences. De experimentella förhållandena och övergångarna som övervakades för att kvantifiera lipidarterna rapporteras tillsammans i kompletterande metoder.

In vitro- lipidbindningsanalys, lipidbelastning

Gelfiltrerad SMP – C2A – C2B (19 ul vid ∼ 2 mg ml −1 ) eller C2A – C2B (vid ∼ 3 mg ml −1 ) i 20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl och 5 mM DTT blandades med 1 µl NBD – PE 16: 0 vid 1 mg ml −1 i metanol. Lipidkontrollen var 19 pl av ovanstående buffert med 1 pl NBD – PE 16: 0. De inkuberades på is under 1 timme och visualiserades på en DTT-uppnående nativ PAGE-gel. Fluorescens visualiserades med användning av Imagequant LAS4000 och protein via Coomassie-färgning. Endast den SMP-innehållande konstruktionen binder NBD – PE.

Lipid-tävlingsanalys

NBD – PE-förbelastat protein erhölls genom att inkubera GST – SMP – C2A – C2B med NBD – PE såsom beskrivits tidigare. För att separera E-SYT2 från överskott av PE, återfanns GST – SMP – C2A – C2B till glutationharts, tvättades och klyvdes med användning av Precision-proteas.

Lipider torkades under kväve och återsuspenderades vid 6, 4 mM i metanol. Ceramid upphettades till 42 ° C för att lösa upp lipiden. Lipid (1 | il) sattes till SMP – C2A – C2B förbelastad med NBD – PE (19 pl vid 1 mg ml-1). Prover inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur och visualiserades sedan på nativa geler såsom beskrivits tidigare. Gelbilder kvantifierades med användning av imageJ 29 . Fluorescerande signal normaliserades till mängden protein i varje spår, vilket bedömdes med Coomassie-färgning.

Förändra historien

anslutningar

Primära anslutningar

Proteindatabank

  • 1BP1)
  • 1BP1) 3D-vy
  • 2DMG)
  • 2DMG) 3d-vy
  • 4P42
  • 4P42 3d-vy

Insättningar av data

Koordinater och strukturfaktorer har deponerats i Protein Data Bank under anslutningsnummer 4P42.

Utökad data

Utökade datasiffror

  1. 1.

    E-SYT2 strukturanalys.

  2. 2.

    Bindning av fosfolipider med E-SYT2 uttryckt i bakterier.

  3. 3.

    MS / MS-fragmenteringsspektra i negativt läge av två representativa rikliga glycerofosfolipider frisatta från bakteriellt uttryckt E-SYT2 under denaturerande MS-betingelser.

  4. 4.

    Negativt MS-spektra av glycerofosfolipider frisatta från E-SYT2, uttryckt i däggdjursceller, under denaturering av MS-tillstånd.

  5. 5.

    Positivt och negativt läge MS / MS-fragmenteringsspektra av representativa rikliga glycerofosfolipider frisatta från E-SYT2 uttryckt i däggdjursceller under denaturering av MS-tillstånd.

  6. 6.

    Deconvoluted spektra av E-SYT2.

  7. 7.

    Lipid-tävlingsanalys.

Utökade datatabeller

  1. 1.

    Statistik för insamling och förfining

  2. 2.

    Fosfolipider närvarande som ligander i E-SYT2 renade från E. coli och observerades efter denaturering av MS i negativ-joniseringsläge

  3. 3.

    Ett riktat kvantitativt lipidomiskt tillvägagångssätt baserat på LC-MS / MS användes för att kvantifiera de olika lipidarter som frisätts av E-SYT2 efter extraktion av organiskt lösningsmedel

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.