Strukturell och biokemisk karakterisering av krlb-regionen i insulinreceptorsubstrat-2 | naturstruktur och molekylärbiologi

Strukturell och biokemisk karakterisering av krlb-regionen i insulinreceptorsubstrat-2 | naturstruktur och molekylärbiologi

Anonim

Abstrakt

Insulinreceptorsubstrat 1 och 2 (IRS1 och -2) är avgörande adapterproteiner för att förmedla de metaboliska och mitogena effekterna av insulin och insulinliknande tillväxtfaktor 1. Dessa proteiner består av en pleckstrin-homologidomän, en fosfotyrosinbindande domän och en C- terminal region som innehåller många platser för tyrosin, serin och treoninfosforylering. Tidigare jäst-tvåhybridstudier identifierade en region som är unik för IRS2, benämnd kinas regulatorisk loop-bindningsregion (KRLB), som interagerar med tyrosinkinasdomänen i insulinreceptorn. Här presenterar vi kristallstrukturen för insulinreceptorkinas i komplex med en 15-restpeptid från KRLB-regionen. I strukturen är detta segment av IRS2 bundet i det kinasaktiva stället med Tyr628 positionerat för fosforylering. Även om Tyr628 fosforylerades av insulinreceptorn var dess katalytiska omsättning dålig, vilket resulterade i kinasinhibering. Våra studier indikerar att KRLB-regionen fungerar för att begränsa tyrosinfosforylering av IRS2.

Huvudsaklig

Hormoninsulinet aktiverar intracellulära signalvägar som reglerar celltillväxt och metabolism. De pleiotropiska effekterna av insulin förmedlas av dess cellyteceptor, ett a2 β2-receptortyrosinkinas. Efter insulinbindning och autofosforylering av receptor (aktivering) rekryteras flera proteiner till de två cytoplasmatiska (kinasinnehållande) domänerna i receptorn för nedströms signalutbredning. Bland dessa är IRS-proteinerna, en familj med fyra till sex adapterproteiner som har en N-terminal pleckstrin-homologi (PH) -domän och en fosfotyrosinbindande (PTB) domän, följt av en sträcka av mer än 900 rester innehållande flera tyrosinställen, serin och treoninfosforylering 1 .

Gen-deletionsstudier på möss visar att Irs1 och Irs2 är väsentliga för normal organismutveckling och glukoshomeostas 1 . Även om IRS1 och IRS2 har många vanliga särdrag på proteinnivå och överlappande vävnadsuttrycksmönster, är fenotyperna för Irs1 och Irs2 knockout-möss distinkta. Irs1 - / - möss är 40% mindre än vilda kullkamrater av vildtyp och uppvisar insulinresistens i perifera vävnader 2, 3 . Irs2 - / - möss är bara något mindre (10%) än vildtypsmöss men är insulinresistenta och utvecklar typ II-diabetes som en följd av förlust av beta-cellfunktion i bukspottkörteln 4 .

Många av tyrosinfosforyleringsställena i den C-terminala regionen av IRS1 och IRS2 ligger i ett YΦXM-motiv (där Φ betecknar en hydrofob rest (ofta metionin) och X betecknar vilken rest som helst), som, när fosforylerad av insulinreceptorn eller insulin- som tillväxtfaktor 1 (IGF1) -receptor, fungerar som ett rekryteringsställe för Src-homologin 2 (SH2) -domänerna för fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) 5 . Aktivering av PI3K genom ingrepp av tyrosinfosforylerad IRS1 eller IRS2 krävs för glukosupptag i insulinresponsiva celler 6 . Andra tyrosinfosforyleringsställen i IRS1 och IRS2 rekryterar adapterproteinet GRB2 och proteintyrosinfosfatas SHP2 (ref. 1). Förutom tyrosin-fosforyleringsställen, innehåller IRS1 och IRS2 många platser med serin- och treoninfosforylering som i allmänhet negativt reglerar tyrosinfosforylering, antingen under normal negativ feedback eller i patologisk insulinresistens 7 .

Tandem PH-PTB-domänerna i den N-terminala regionen av dessa adapterproteiner fungerar för att rekrytera IRS1 och IRS2 till insulinreceptorn för fosforylering. PTB-domänen binder till fosforylerad Tyr972 (pTyr972) och angränsande rester (NPXY-motiv) i juxtamembranområdet i insulinreceptorn 8, 9 . PH-domänen är också viktig för rekrytering av IRS1 och IRS2 till receptorn 10, 11, även om huruvida detta sker via fosfoinositidbindning inte har fastställts ordentligt. Tidigare jäst-tvåhybrid (Y2H) -studier gav bevis för en andra (utöver PTB-domänen) insulinreceptorinteragerande region i IRS2, som kallades kinas regulatorisk loopbindning (KRLB) -region 12, 13 eller receptorbindningsdomän 2 (RBD2) 14 . Denna region av IRS2 interagerar med tyrosinkinasdomänen i insulinreceptorn (IRK), och interaktionen är beroende av fosforylering av kinasaktiveringsslingan 12, 14 . KRLB-regionen definierades grovt från Y2H-studierna för att inkludera rester 591–733 (ref. 12, 14), startande ungefär 300 rester C-terminal till PTB-domänen (fig. 1) och innehåller tre tyrosinrester i ett YΦXM-motiv. Vidare har denna region en hög andel glycin-, serin- och prolinrester, och förutsägelser av sekundärstruktur indikerar att det är ostrukturerat. Även om motsvarande region i IRS1 innehåller betydande sekvenslikheter, inklusive de tre YΦXM-platserna, interagerar den inte stabilt med IRK 13, 14 . Mutagenesstudier i KRLB-regionen identifierade två icke-YΦXM tyrosinrester, Tyr624 och Tyr628 (musnummerering), som är avgörande för bindning till IRK 13 .

Domänorganisation och placering av tyrosin-fosforyleringsplatser dras till linjär skala (musnummer, 1 321 rester). Tyrosin-fosforyleringsställen som är rekryteringsplatser för PI3K (YΦXM-motiv) är märkta med *, GRB2-stället (Y911) är märkt med † och de två SHP2-platserna (Y1242 och Y1303) är märkta med §. KRLB-regionen som bestämdes genom Y2H-studier (resterna 591–733) visas med streckade linjer, och 15-restregionen som kokristalliserades med IRK visas i den grå rutan, med sekvensen utvidgad nedan och Tyr628 understruket. Motsvarande 15-restsekvens i IRS1 (mus) visas också.

Bild i full storlek

I den aktuella studien karaktäriserade vi det exakta sättet att binda mellan KRLB-regionen i IRS2 och IRK genom samkristallisation av IRK (människa) med en 15-rest KRLB-peptid (mus) som omfattar Tyr624 och Tyr628. Biokemiska experiment in vitro och i celler demonstrerade att KRLB-regionen fungerar som ett negativt reglerande element för att kontrollera omfattningen av tyrosinfosforylering på IRS2. Detta reglerande element är troligtvis en nyckelfunktion som skiljer IRS2-funktionen från den för IRS1.

Resultat

Kristallstruktur av KRLB Y628 bunden till IRK

Vi kokristalliserade en 15-restpeptid som representerar IRS2-rester 620–634 (AYNPYPEDY 628 GDIEIG), som kommer att kallas KRLB Y628, med IRK fosforylerad på aktiveringsslingan (pTyr1158, pTyr1162 och pTyr1163). De monokliniska kristallerna innehöll ett KRLB Y628 –IRK-komplex i den asymmetriska enheten. Vi bestämde kristallstrukturen (raffinerad med 1, 65-Å-upplösning) genom molekylersättning, och användande som sökmodell en kristallstruktur av fosforylerad IRK i komplex med ett YΦXM-peptidsubstrat (IRS1 Tyr727) och AMP-PNP 15 .

I kristallstrukturen i komplexet är denna region av IRS2 bunden över kinasdomänens främre yta med Tyr628 placerad i det aktiva stället (fig. 2a). En superposition av denna struktur med Tyr727 – IRK-strukturen visade att C-terminal till underlaget tyrosin, KRLB Y628 och Tyr727-peptiden binder på liknande sätt (Fig. 2b). Emellertid gör N-terminal till substrat-tyrosin, KRLB Y628 mycket mer interaktioner med kinasdomänen (fig. 2b, c). Fjorton rester av KRLB Y628 beställs i strukturen, medan endast sex rester av Tyr727-peptiden beställs (jämförbar upplösning: 1, 65 Å (KRLB Y628 ) mot 1, 9 Å (Tyr727)). Den totala nedgrävda ytytan för KRLB Y628 –IRK-komplexet är 2 112 Å 2, mot 1 033 Å 2 för Tyr727 – IRK-komplexet och 1 256 Å 2 för IGF1-receptorkinas (IGF1RK) -komplexet med ett YΦXM-peptid (IRS1 Tyr896) 16 . I det sista komplexet beställs ytterligare två C-terminala rester av peptiden.

( a ) IRK visas som en molekylär yta, med N-loben färgad mörkgrå och C-loben färgad ljusgrå. Aktiveringsslingan (resterna 1150–1171) är grön färgad och den katalytiska slingan (resterna 1130–1137) färgas orange. IRS2 KRLB Y628 visas i stickrepresentation. Den sista 2 F o - Fc elektrondensiteten (1, 65-Å upplösning, 1σ kontur) visas i blått nät. Peptidens N och C-terminaler är märkta. ( b ) Jämförelse av IRK-bindningssätt för KRLB Y628 och IRS1 Tyr727 (YΦXM-motiv). Överlagrade (C-lob-rester 1080–1283) på KRLB Y628 –IRK-strukturen är Tyr727-peptidsubstratet (rosa) och AMP-PNP (ANP) från den ternära IRK-strukturen (PDB-kod 1IR3) 15 . Svavelatomer är gröna och fosforatomer är svarta. IRK-molekylytan är halvtransparent. ( c ) Jämförelse av KRLB Y628- bindning och konformation av den oposforylerade IRK-aktiveringsslingan. Överlagrad (katalytisk slingrester 1130–1137) på KRLB Y628 –IRK-strukturen är den fosforylerade aktiveringsslingan (mörkgrön) från strukturen för autoinhiberad IRK (PDB-kod 1IRK) 17 . Välj vätebindningsinteraktioner mellan KRLB Y628 och IRK-rester visas som streckade linjer. ( d ) Jämförelse av KRLB Y628, KRLB Y628 + ATP och KRLB pY628 bundna till IRK. IRK-molekylytan (halvtransparent) är från KRLB Y628 –IRK-strukturen. KRLB Y628 från strukturen med ATP är färgad cyan och KRLB pY628 är färgad ros. Bilder framställdes med PyMOL (//pymol.org).

Bild i full storlek

Tyr628 (P-rest) i KRLB Y628 –IRK-strukturen skapar vätebindningar med IRK-katalytiska rester Asp1132 och Arg1136, men förskjuts 1, 5 Å (Ca-läge) relativt Tyr727 av YΦXM-peptiden (fig. 2b, c). Denna förskjutning möjliggörs steriskt av glycin (Gly629) vid P + 1-läget i peptiden, en atypisk P + 1-rest för ett insulinreceptorsubstrat. Den grenade sidokedjan i Ile631 (P + 3) kompenserar för bristen på en hydrofob sidokedja i P + 1-läget genom att ströva P + 1 och P + 3-bindningsfickorna i kinasets peptidbindande spår (fig. 2b) ). Som är fallet för YΦXM-peptidbindning, görs ryggradsvätebindningar (fem) mellan peptidrester C-terminal till Tyr628 och IRK-aktiveringsslingan.

En superposition av KRLB Y628 –IRK-strukturen med strukturen av oposforylerad, autoinhiberad IRK 17 avslöjade en markant likhet mellan sättet för bindning av KRLB Y628 till IRK och stabilisering av IRK-aktiveringsslingan i dess inaktiva tillstånd (fig. 2c). Tyr624 (P – 4-rest), Asp627 (P – 1) och Tyr628 (P) av KRLB Y628 efterliknar interaktioner med kinasdomänen Tyr1158, Asp1161 respektive Tyr1162 i den oposforylerade aktiveringsslingan. På den aktiva platsen kan Tyr628 (KRLB Y628 ) och Tyr1162 (aktiveringsslinga) överlagras, det vill säga att det inte finns någon förskjutning. Uppenbarligen är förskjutningen av Tyr628 relativt Tyr727 av YΦXM-peptiden, underlättad av Gly629 (P + 1), nödvändig för rester N-terminal till Tyr628 (nämligen Tyr624 och Asp627) för att göra sina respektive interaktioner med kinasdomänen. De observerade interaktionerna mellan Tyr624 och Tyr628 med IRK förklarar de tidigare mutagenesresultaten för dessa två tyrosiner 13 .

Sidokedjan av Tyr621 (P – 7) är belägen i ATP-bindningsfickan där adeninbasen skulle binda, vätebunden (som adenin) till ryggbenkvävet från Met1079 i länken mellan N-loben och C-loben (Fig 2c, d). Denna observation höjer möjligheten att Tyr621 kan tävla med ATP för bindning till kinaset. För att delvis ta itu med detta drog vi magnesium-ATP i kristaller av KRLB Y628 –IRK och bestämde strukturen för det ternära komplexet med en upplösning på 2, 1 Å. I denna struktur med ATP närvarande förflyttas Tyr621 faktiskt från ATP-bindningsfickan och är nu ostört tillsammans med de intilliggande resterna (Ala620 och Asn622; Fig. 2d). ATP är bundet i klyftan mellan de två kinasloberna, med en enda Mg2 + -jon som koordineras av a- och P-fosfatgrupperna i ATP, liksom med kinasrester Asp1150 (aktiveringsslinga) och Asn1137 (katalytisk slinga).

Bindning av KRLB-regionen till IRK och IGF1RK

På basis av kristallstrukturen bidrar många rester nära Tyr628 i KRLB-regionen till interaktionen med IRK. För att undersöka deras respektive bidrag introducerade vi punktmutationer i KRLB-regionen i full längd (resterna 591–733), enligt definitionen av Y2H-studierna 12, 14, och mätte förmågan hos KRLB-mutanterna att binda till IRK genom in vitro- drag -ned experiment. En väsentlig förlust av IRK-bindning inträffade med mutation till alanin (eller fenylalanin) av många KRLB-rester: Tyr621 (P – 7), Tyr624 (P – 4), Asp627 (P – 1), Tyr628 (P), Gly629 (P + 1), Ile631 (P + 3) och Ile633 (P + 5) (fig. 3). Neddragningsresultatet för G629A bekräftade att 1, 5-Å-förskjutningen av Tyr628 relativt Tyr727 för YΦXM-peptiden (fig. 2b), som Gly629 ger, är en avgörande egenskap i KRLB-bindningsläget. Förlust av IRK-bindning för Y621A stöder hypotesen att detta tyrosin kan påverka fosforyleringskinetiken för Tyr628 genom att tävla med ATP för bindning till kinasdomänen (Fig. 2d).

( a ) Hans-taggade KRLB-protein, vildtypsprotein (WT) eller olika mutanter, inklusive en deletionsmutant (rester 602–637), användes i neddragningsförsök med fosforylerad IRK. Neddragningarna (ovan) upplöstes med SDS-PAGE och immunblotting genomfördes med en antifosfotyrosinantikropp (PY99). IRK- och KRLB-proteinnivåer demonstrerades med PY99-immunoblott (mitten) respektive Coomassie Blue-färgning (botten). ( b ) Hans-märkta KRLB-protein, vildtypsprotein eller Y628F-mutant (KRLB (YF)) användes för att dra ner fosforylerad IRK eller fosforylerad IGF1RK. Neddragningarna upplöstes med SDS-PAGE och immunblotting genomfördes med PY99 (ovan). Mellanflotten visar nivåer av fosforylerad IRK och IGF1RK i proverna. KRLB-proteinnivåer visas i bottengeln färgad med Coomassie Blue.

Bild i full storlek

Vi testade också en avkortad version av KRLB-regionen, resterna 602–637, i ett neddragningsförsök tillsammans med KRLB-regionen i full längd. Denna kortare form saknar de tre YΦXM-fosforyleringsställena, men inkluderar de 15 rester som observerats i kokristallstrukturen. Det neddragbara experimentet visade att den korta formen av KRLB-regionen binds ungefär lika bra till IRK som den längre formen (fig. 3a), vilket indikerar att omfattningen av det IRK-interagerande området troligen är begränsat till resterna i närheten av Tyr628, sett i kristallstrukturen.

Sekvensidentiteten mellan IRK och IGF1RK är 82%. Vi undersökte därför KRLB-regionens förmåga att interagera med IGF1RK. Det anmärkningsvärda resultatet var att KRLB-regionen binds väsentligt bättre till IRK än till IGF1RK (fig. 3b), trots att alla IRK-rester som interagerar direkt med KRLB-peptiden bevaras i IGF1RK.

Vi använde isotermisk titreringskalorimetri för att mäta bindningsaffiniteten hos KRLB-peptiden för fosforylerad IRK och bestämde en dissociationskonstant ( Kd ) på 1, 3 μM (kompletterande fig 1 online), vilket är betydligt lägre (högre affinitet) än Kd bestämd genom viskometrisk analys för ett YΦXM-peptidsubstrat (IRS1 Tyr939): 0, 2 mM ( Km = 0, 05 mM) 18 . Som en annan jämförelse av KRLB-bindningsstyrkan var den uppmätta Kd för bindning av IRS1 PTB-domänen till en fosforylerad peptid som representerar insulinreceptorjuxtamembranregionen (pTyr972) 87 μM 19 (vilket är relativt högt för en PTB-domän – fosfopeptidinteraktion) .

Fosforylering av KRLB-regionen av IRK

Tidigare biokemiska studier på en 11-rest KRLB-peptid (rester 623–633) innehållande Tyr624 och Tyr628 antydde att denna peptid inte var ett substrat för insulinreceptorn 13 . Mot bakgrund av KRLB Y628 –IRK-kristallstrukturen, i vilken Tyr628 är bunden i den aktiva platsen, återbesökte vi detta problem genom att genomföra en in vitro- kinasreaktion med glutation S-transferas-märkt IRK (GST-IRK) som enzymet och KRLB-regionen (rester 591–733) som underlag. MALDI-Q-TOF och LC-ESI-MS / MS Q-TOF användes för att kartlägga platserna för tyrosinfosforylering. Uppgifterna (inte visade) avslöjade att Tyr628 verkligen fosforylerades, liksom YΦXM-platserna Tyr594, Tyr649 och Tyr671. Det fanns inga bevis för fosforylering av Tyr621 eller Tyr624.

Ovanstående in vitro- fosforyleringsexperiment genomfördes vid en hög ATP-koncentration (5 mM), medan i den tidigare studien 13 fosforylerades inte 11-restpeptiden vid 30 um ATP. Vi mätte Km (ATP) för IRK-fosforylering av Tyr628 i 15-resters KRLB-peptid (KRLB Y628 ) med användning av MALDI-TOF (kompletterande figur 2 online) och bestämde en Km (ATP) av 1, 7 mM, vilket är väsentligen högre än 40 μM K m (ATP) för ett typiskt YΦXM-ställe 18 . Med samma MS-metod mätte vi en Km (ATP) på 80 μM för IRS1 Tyr983 (YΦXM) (data visas inte).

För att bestämma om Tyr621 bidrar till den höga Km (ATP), såsom föreslagits av kristallstrukturen (fig. 2d), jämförde vi IRK-fosforylering av en KRLB Y621A-mutant med den av vildtypen vid olika ATP-koncentrationer. Fosforylering av vildtyp KRLB-regionen platå vid en ATP-koncentration av ∼ 1, 6 mM, i överensstämmelse med vår kvantitativa bestämning av Km (ATP) för KRLB-peptiden med 15 rester, medan fosforylering av Y621A-mutantplatån nära 0, 4 mM ATP ( Fig. 4). Således beror den höga Km (ATP) för Tyr628-fosforylering, åtminstone delvis, av Tyr621.

Vildtyp KRLB-protein eller en Y621A-mutant fosforylerades av IRK vid den angivna ATP-koncentrationen. Reaktionskomponenterna upplöstes med SDS-PAGE och immunblotting genomfördes med användning av antifosfotyrosinantikroppen PY99. IRK-nivåer visas i de två mellersta anti-pTyr-blotten, och KRLB-proteinnivåerna visas nedan i de två Coomassie Blue-färgade gelerna. Testning av en Y628F-mutant under dessa analysbetingelser indikerar att endast Tyr628 (inte någon av de tre närvarande YΦXM-ställena) är avsevärt fosforylerad för vildtypsprotein och Y621A (data visas inte).

Bild i full storlek

Hämning av fosforylering av IRK-substrat med KRLB Y628

Vi försökte initialt att mäta de kinetiska värdena vid stabilitet i 15-resters KRLB-peptid med hjälp av en kontinuerlig spektrofotometrisk analys, i vilken fosforyleringshastigheten härleds från hastigheten för ADP-produktion 20 . Tillsats av ett typiskt YΦXM-peptidsubstrat till IRK i närvaro av magnesium-ATP ökar hastigheten för ADP-produktion (som en följd av substratfosforylering) över en bashastighet för IRK ATPas-aktivitet (Fig. 5, reaktioner 3 och 4 mot reaktion 2 ). När vi använde KRLB Y628 som ett substrat (vid 2 mM ATP), blev vi förvånade över att observera att hastigheten för ADP-produktion minskade väsentligt, långt under basal ATPas-hastighet (fig. 5, reaktion 5 och 6 kontra reaktion 2). Detta antydde att peptiden var bindande till IRK och antingen inte fosforylerades - det vill säga fungerar som en pseudosubstrathämmare - eller att den fosforylerades men med låg omsättning (med undertryckande av basal ATPas-hastighet i båda fallen). MALDI-TOF utförd på postreaktionsprovet visade att KRLB-peptiden fosforylerades på Tyr628, i överensstämmelse med den senare förklaringen.

( a ) Effekt av peptider KRLB Y628 (Y628) och KRLB pY628 (pY628) på IRK-fosforylering av IRS1 Tyr983 (Y983) med användning av den kontinuerliga spektrofotometriska analysen. Den negativa lutningen för den linjära delen av kurvan (passningsintervall 20–120 s) är proportionell mot hastigheten för ADP-generering, med bidrag från IRK-substratfosforylering och IRK ATPas-aktivitet (reaktion 2, ingen peptid). För tydlighetens skull visas rådata för en representativ delmängd av reaktionerna, vilka alla anges i b . ( b ) Relativa hastigheter för ADP-produktion erhållna från data i a plottas, normaliseras till basal IRK ATPas-hastighet (reaktion 2). Reaktion 1 innehåller 2 mM ATP och 20 mM MgCl2, men inget IRK- eller peptidsubstrat (visas inte i a ). Reaktion 2 inkluderar dessutom 200 nM fosforylerad IRK. Reaktionerna 3–10 inkluderar dessutom de angivna koncentrationerna av peptid. Felfält representerar sd för de reaktioner som utförs i tre exemplar. Histogramstängerna är skuggade enligt reaktionsinnehållet: till exempel ljusgrå, IRK + Y983 (100 μM eller 200 μM); svart, IRK + Y983 (100 μM) + pY628 (50 μM, 100 μM eller 200 μM).

Bild i full storlek

Eftersom KRLB-peptiden binder med relativt hög affinitet (jämfört med en YΦXM-peptid) och som ett underlag vändes dåligt testade vi förmågan hos KRLB Y628 och den Tyr628-fosforylerade formen av peptiden (KRLB pY628 ) att hämma IRK fosforylering av substrat. Tillsats av KRLB Y628 till en reaktion innehållande IRK och en IRS1 Tyr983-peptid (YΦXM) sänkte hastigheten för ADP-produktion på ett dosberoende sätt (Fig. 5b, reaktioner 7–9 mot reaktion 3), vilket visar att KRLB-peptiden kan hämma fosforylering av en YΦXM-peptid. Den fosforylerade KRLB-peptiden hämmade också IRS1 Tyr983-fosforylering (fig. 5b, reaktioner 10–12 kontra reaktion 3), men mindre effektivt, som man kunde förvänta sig (produktens affinitet är mindre än reaktantens). Med användning av en annan analys inhiberade KRLB Y628 aktiveringsslingfosforylering av en kinasdöd IRK av GST-IRK, ​​liksom KRLB pY628, medan IRS1 Tyr983-peptiden inte hade någon hämmande effekt (tilläggsfigur 3 online). När tyrosinkinasdomänen från Src ersatte IRK, verkade KRLB-peptiden som ett normalt tyrosinsubstrat (det vill säga, hastigheten för ADP-produktion ökade; data visas inte), vilket visar att KRLB-substratets långsamma omsättning är specifik för IRK .

Eftersom den fosforylerade KRLB-peptiden var kapabel att hämma substratfosforylering, samkristalliserade vi KRLB pY628 med IRK och erhöll en struktur av komplexet med 1, 95-Å-upplösning. KRLB pY628 binder till IRK på ett sätt som liknar KRLB Y628 (fig. 2d), inklusive positioneringen av Tyr621 i ATP-bindande klyftan. PTyr628-fosfatgruppen ligger inom vätebindningsavståndet från Asp1132 och Asn1137 i den katalytiska slingan. Det faktum att KRLB pY628 skulle kunna samkristalliseras med IRK är ytterligare indikation på att affiniteten hos den fosforylerade peptiden för IRK är märkbar; tidigare försök att samkristallisera en fosforylerad YatedXM-peptid med IRK hade visat sig misslyckade.

In-cellfosforylering av IRS2 av insulinreceptorn

För att förstå den funktionella rollen för KRLB-regionen för IRS2-signalering transfekterade vi IRS2 i full längd, antingen vildtypen eller en KRLB (dubbel) mutant, Y624F-Y628F, till äggstocksceller från kinesiska hamnar som är stabilt transfekterade med insulinreceptorn (CHO- IR). De transfekterade cellerna stimulerades med olika doser insulin, och fosforyleringsnivån för IRS2 övervakades genom immunblotting av anti-IRS2-immunutfällningar. Förlust av KRLB-bindning till insulinreceptorn (via mutation av Tyr624 och Tyr628) ökade avsevärt insulinstimulerad tyrosinfosforylering av IRS2 (Fig. 6a).

( a ) Lysater från insulinstimulerade (eller ostimulerade) CHO-IR-celler transfekterade med vildtyp IRS2 (WT) eller den dubbla mutanten Y624F, Y628F immunutfälldes med en anti-IRS2-antikropp, och immunfällningen upplöstes med SDS-PAGE . Immunoblotting genomfördes med användning av en antifosfotyrosinantikropp (4G10; anti-pTyr, ovan) eller en anti-IRS2-antikropp (nedan) för att visa ungefär lika stora nivåer av IRS2 i immunutfällningarna. ( b ) Lysater från insulinstimulerade (eller ostimulerade) CHO-IR-celler transfekterade med antingen vildtyp IRS2 eller Y628F immunfällades med en anti-IRS2-antikropp, och immunfällningen upplöstes med SDS-PAGE. Immunoblotting genomfördes med användning av fosfospecifika antikroppar mot pTyr612 från human IRS1 (pTyr649 från mus IRS2; PI3K-ställe), till pTyr896 av human IRS1 (pTyr911 från mus IRS2; GRB2-ställe) eller en anti-IRS2-antikropp för att visa ungefär lika stora nivåer av IRS2 i immunutfällningarna. ( c ) Lysat av insulinstimulerade (eller ostimulerade) CHO-IR-celler transfekterade med antingen vildtyp IRS2 eller KRLB-mutanter Y628F eller Y621A immunutfälldes med en anti-IRS2-antikropp, och immunutfällningen upplöstes med SDS-PAGE. Immunoblotting genomfördes med användning av en anti-fosfotyrosin-antikropp (PY99) eller en anti-IRS2-antikropp för att uppvisa ungefär lika stora nivåer av IRS2 i immunutfällningarna. De tre första banorna i anti-IRS2-blot (nedan) är identiska med dem i anti-IRS2-blot i b, eftersom proverna härleds från samma experiment. De ostimulerade fosforyleringsnivåerna för Y628F och Y621A skiljer sig inte märkbart från nivån för vildtyp IRS (data visas inte).

Bild i full storlek

Även om den totala tyrosin-fosforyleringsnivån för vildtyp IRS2 är lägre än den för KRLB-mutanten, är det tänkbart att genom transfosforylering av det andra kinasdomänet i receptordimern kan speciella tyrosinställen i IRS2 fosforyleras till en större utsträckning som en följd av KRLB-bindning i det kinasaktiva stället. För att få en uppfattning om huruvida sådan underlättelse kan uppstå, använde vi två IRS1 fosphotyrosinspecifika antikroppar som korsreagerar med motsvarande platser i IRS2. En av antikropparna känner igen ett PI3K-bindningsställe i IRS1 (pTyr612) och IRS2 (pY649; 21 rester C-terminal till Tyr628), och den andra känner igen ett GRB2-bindningsställe i IRS1 (pTyr896) och IRS2 (pY911; 283 rester C- terminal till Tyr628). En tredje fosfotyrosinspecifik antikropp, till ett SHP2-bindningsställe i IRS1 (pTyr1179), testades också, men det visade sig inte korsreagera med IRS2 (pTyr1242) (data visas inte). De insulinstimulerade fosforyleringsnivåerna för både pTyr649 och pTyr911 var lägre i vildtyp IRS2 än i KRLB-enstaka mutanten Y628F (Fig. 6b).

För att bestämma om Tyr621 har en roll i att modulera IRS2-fosforylering i celler som det gör in vitro , genom att ställa in en hög Km (ATP) på 1, 7 mM för Tyr628-fosforylering (fig. 4) jämförde vi insulinstimulerad fosforylering av IRS2 Y621A med den av den vilda typen och Y628F. Mutation av Tyr621 ledde till en ökning av IRS2-fosforylering till en nivå liknande den för Y628F (fig. 6c). Dessa data antyder att på cellulära ATP-nivåer är konkurrens av Tyr621 med ATP för bindning till IRK (fig. 2b) viktig för att undertrycka IRS2-fosforylering av KRLB-regionen.

Diskussion

Mekanism och specificitet för KRLB-bindning till IRK

Kristallstrukturen i KRLB-rester 620–634 i komplex med fosforylerad (aktiverad) IRK avslöjade att denna region av IRS2 binder i det aktiva stället för kinasdomänen med Tyr628 redo för fosforylering (fig. 2a). Vid bindning till IRK imiterar Tyr628-regionen bindning av ett YΦXM-peptidsubstrat C-terminal till Tyr628 (fig. 2b) och den icke-fosforylerade IRK-aktiveringsslingan N-terminal till Tyr628 (fig. 2c). Den sista observationen förklarar varför KRLB-bindning är beroende av tidigare autofosforylering av aktiveringsslingan och den åtföljande strukturella omorganiseringen 15 . Noterbart leder en naturligt förekommande mutation i aktiveringsslingan för insulinreceptorn (R1152Q), identifierad i flera patienter med typ II-diabetes, till icke-insulinberoende bindning av KRLB-regionen till mutantreceptorn 21 . Denna arginin är inte välordnad i strukturen för icke-fosforylerad IRK 17, men vi antar att R1152Q-mutationen delvis destabiliserar den autoinhiberade konformationen av aktiveringsslingan, vilket underlättar bindning av KRLB-regionen i det kinasaktiva stället.

Även om tidigare Y2H-studier 12, 14 grovt hade definierat omfattningen av KRLB-regionen som rester 591–733, indikerar våra kristallografiska och in vitro -neddragningsstudier (fig. 2 och 3) att denna andra insulinreceptorinteragerande region i IRS2 är begränsad till cirka 15 rester som omfattar Tyr628 (rester 620–634). I detta område (fig. 1) saknar IRS1 inte bara ekvivalenten Tyr628 (Gly582) utan också ekvivalenterna Asp627 (P – 1), Gly629 (P + 1) och Ile633 (P + 5), som alla är viktigt för bindning med hög affinitet till IRK (fig. 3a). Detta förklarar varför att helt enkelt ersätta Gly582 med tyrosin i IRS1 inte var tillräckligt för att generera KRLB-funktionalitet i IRS1 (ref. 13). En databasmönstarsökning indikerade att IRS2 sannolikt är det enda proteinet med en KRLB-liknande sekvens för bindning till insulinreceptorn. Huruvida det finns sekvenser med liknande funktionalitet för andra proteintyrosinkinaser är svårt att förutsäga på grund av den begränsade strukturella informationen om peptidsubstrat-kinasinteraktioner, särskilt för rester N-terminal till substrat-tyrosin.

Trots den höga sekvensbevaringen (82% identitet) i kinasdomänerna i insulin- och IGF1-receptorerna visade KRLB-regionen en stark bindningspreferens för IRK (fig. 3b), vilket är förenligt med tidigare observationer 22 . De molekylära determinanterna som ligger till grund för denna diskriminering är inte tydliga, eftersom IRK-resterna som är involverade i bindning av KRLB-peptiden bevaras i IGF1RK. Tänkbart skulle denna differentiella bindning kunna härledas från två aminosyraskillnader i kinas 16- gångjärnsregion, eftersom KRLB-peptidens N-ände i kristallstrukturen är proximal till gångjärnsregionen. Alternativt kan det vara subtila skillnader i konformationen av det aktiva tillståndet i de två kinaserna (till exempel peptidbindande spår) som står för skillnaden i affinitet.

KRLB-regionens funktionella roll i IRS2

IRS1 och IRS2 har tandem PH-PTB-domäner i sina N-terminala regioner som fungerar för att rekrytera dessa proteiner till de aktiverade insulin- och IGF-receptorerna för effektiv fosforylering av flera tyrosinrester i den omfattande C-terminala regionen 1 . Efter upptäckten av en andra insulinreceptorinteragerande region (KRLB) i IRS2 (ref. 12, 14) var det rimligt att anta att detta område skulle fungera för att förbättra receptorkopplingen och, eventuellt, fosforylering av IRS2 jämfört med IRS1, vilket saknar detta bindande modalitet.

Bindningen av KRLB-återstoden Tyr628 i det IRK aktiva stället var oväntat, eftersom detta tyrosin inte var känt eller förutspådde att vara ett insulinreceptor-fosforyleringsställe. Således involverar denna andra kopplingsmekanism för IRS2 det kinasaktiva stället snarare än ett distalt ställe, som vanligtvis används för substratrekrytering till ett receptortyrosinkinas (till exempel PTB-domänbindning till juxtamembranområdet). De ursprungliga Y2H-studierna 12, 13, 14 gav bevis för att interaktionen mellan KRLB-sekvensen med 15 rester och IRK inte är en typisk substrat-kinasinteraktion. Vanliga tyrosinsubstrat i insulinreceptorn (YΦXM) och andra tyrosinkinaser interagerar kortvarigt på det aktiva stället - de fosforyleras och frisätts - och regioner som innehåller sådana platser poängterar inte positivt i ett Y2H-experiment (till exempel motsvarande region av IRS1 (ref. 13, 23)). Våra biokemiska experiment in vitro visade att Km (ATP) för Tyr628-fosforylering är väsentligt högre än för ett YΦXM-substrat (∼ 1, 7 mM kontra ∼ 40 μM; kompletterande figur 2), att Tyr628-regionen binder med relativt hög affinitet till IRK ( Kd = 1, 3 um; kompletterande fig. 1) och att den fosforylerade peptiden bibehåller märkbar bindningsaffinitet (fig. 5b och kompletterande fig. 3). Dessa egenskaper leder till dålig substratomsättning, vilket förmodligen förklarar det positiva Y2H-resultatet för KRLB-regionen.

Vilka är de funktionella konsekvenserna av KRLB-bindning på det aktiva stället för insulinreceptorn? Våra data i CHO-IR-celler indikerar att KRLB-regionen verkar för att undertrycka IRS2-tyrosinfosforylering. När Tyr624 och Tyr628 muterades till fenylalanin minskade bindningen till det kinasaktiva stället markant (fig. 3a), men tyrosin-fosforyleringsnivån för IRS2 ökade ändå avsevärt (fig. 6a). Mekanismen genom vilken KRLB-regionen hämmar IRS2-tyrosinfosforylering av insulinreceptorn innefattar uppenbarligen ockupation och blockering av det kinasaktiva stället, både före och efter fosforylering. Observera att det finns cirka 330 rester (förutses vara ostrukturerade) i IRS2 mellan C-terminaländen på PTB-domänen och Tyr628. Denna bindning tycks vara av tillräcklig längd för att låta PTB-domänen och KRLB-regionen binda till insulinreceptorn antingen i cis , till samma cytoplasmatiska domän eller i trans , engagera båda cytoplasmatiska domäner. Eftersom det KRLB-medierade undertrycket av IRS2-fosforylering var större än tvåfaldigt (fig. 6a), kan dockning av Tyr628 på det aktiva stället för en kinasdomän begränsa förmågan hos andra tyrosiner i IRS2 att nå det aktiva stället för det andra kinaset. domän (även om det finns många mellanliggande rester mellan Tyr628 och de mer C-terminala fosforyleringsställena). KRLB-regionen kan också hämma fosforylering av andra insulinreceptorsubstrat, såsom adapterproteinet APS, som tänkbart kan rekryteras till receptorn samtidigt med IRS2; APS binder till den fosforylerade aktiveringsslingan snarare än till juxtamembranområdet 24 .

När KRLB-regionen överuttrycktes i en skelettmuskelcellslinje, som stabilt uttryckte insulinreceptorn, minskade rekryteringen av endogen IRS2 till insulinreceptorn, liksom IRS2-tyrosinfosforylering 25 . Den överuttryckta KRLB-regionen tävlar mot endogen IRS2 för bindning till insulinreceptorn. Noterbart ökade rekryteringen av endogen IRS1 till insulinreceptorn i de KRLB-överuttryckande cellerna 25 . Detta beror uppenbarligen på minskad konkurrens från PTB-domänen för endogen IRS2 för bindning till juxtamembranstället i receptorn. Det faktum att IRS1-fosforylering också ökades indikerar att förbättrad rekrytering av IRS1 till receptorn uppväger KRLB-medierad hämning av kinasdomänen.

En proteomikstudie utförd i 3T3-L1 adipocyter visade att Tyr628 av IRS2 (endogent) genomgår en 6, 4-faldig ökning av fosforyleringsnivån efter 5 minuters insulinstimulering 26 . Sex andra IRS2-tyrosinfosforyleringsställen detekterades i denna studie, med insulinstimulerade fosforyleringsnivåer som ökade från 1, 2 till 4, 9 gånger. Som jämförelse visade de fyra tyrosin-fosforyleringsställena som detekterades i IRS1 högre insulinstimulerade ökningar, från 5, 6 till 29 gånger. Även om dessa data inte är omfattande - information för många platser i IRS1 och IRS2 saknas - är de ändå överensstämma med hypotesen att KRLB-regionen agerar för att undertrycka tyrosinfosforylering av IRS2.

En möjlig fysiologisk roll för KRLB-medierad undertryckning av IRS2-tyrosinfosforylering av insulinreceptorn kan vara att etablera en differentiell signaltröskel för IRS2. Det finns nio YΦXM-platser i IRS2 till vilka PI3K potentiellt kan rekryteras, men det finns bara en GRB2-plats (på samma sätt för IRS1) (Fig. 1). Det är troligt att den reducerade nivån av tyrosinfosforylering i IRS2 fortfarande kan vara tillräcklig för aktivering av PI3K för metabolisk signalering men otillräcklig för aktivering av Ras (genom GRB2) för mitogen signalering. Denna mekanism skulle göra det möjligt för IRS2 att selektivt koppla ihop metaboliska signalvägar vid insulinstimulering, men ändå aktivera mitogena signalvägar vid IGF1-stimulering. IRS1 skulle kunna kopplas till både metaboliska och mitogena vägar nedströms om insulin och IGF1. Knockoutstudierna av Irs1 (tillväxt och metabola fenotyper) och Irs2 (metaboliska och IGF1-medierade beta-celltillväxtfenotyper) överensstämmer generellt med detta scenario 2, 3 . Slutligen kan den millimolära nivån Km (ATP) för Tyr628-fosforylering och den stramare bindningen av Tyr628 kontra pTyr628 i det kinasaktiva stället tänkas tjäna som en regleringsmekanism, varvid graden av insulinstimulerad tyrosinfosforylering av IRS2 är beroende av cellulär ATP-nivåer. Ytterligare studier av Irs1- och Irs2- knockout- och knock-in-möss och cellinjer härledda därav kommer att vara nödvändiga för att definitivt fastställa den fysiologiska rollen för IRS2 KRLB-regionen.

metoder

Proteinuttryck och rening.

Human IRK (rester 978–1283) uttrycktes i baculovirusinfekterade Sf9-insektsceller, renades och autofosforylerades in vitro såsom beskrivits tidigare 15 . En GST-märkt (N-terminal) version av IRK genererades genom subkloning av rester 956–1283 av den humana insulinreceptorn i baculovirusöverföringsvektorn pAcG2T (BD Biosciences). Fusionsproteinet uttrycktes i baculovirus-infekterade Sf9-celler och renades med användning av en GSTrap-kolonn (GE Healthcare) och en Superdex-75 (GE Healthcare) storleksuteslutningskolonn.

En 6 × His-taggad (C-terminal) och GST-märkt (N-terminal) KRLB-konstruktion genererades genom subkloning av cDNA-kodande mus IRS2-rester 591–733 i vektorn pET41 (Novagen). En kortare konstruktion som kodar rester 602–637 genererades också. Site-riktad mutagenes utfördes med hjälp av QuikChange-systemet (Stratagene). Alla konstruktioner transformerades till E. coli- stam Rosetta (DE3) (Novagen). Bakterier odlades i LB kompletterat med 50 mg l-1 kanamycin och 35 mg l-1 kloramfenikol vid 37 ° C till en OD600 av 0, 7. Expression inducerades med 1 mM IPTG vid 30 ° C under 5 timmar. Se kompletterande metoder online för rening.

Kristallisering.

KRLB Y628 (AYNPYPEDYGDIEIG) och KRLB pY628 (AYNPYPEDpYGDIEIG) syntetiserades (GeneMed-syntes) och solubiliserades i 200 mM Tris-HCl (pH 7, 5). Tris-fosforylerad IRK (pTyr1158 / 1162/1163) och KRLB Y628 eller KRLB pY628 blandades i ett molförhållande 1: 3. Kristaller av KRLB Y628 –IRK och KRLB pY628 –IRK erhölls vid 4 ° C genom ångdiffusion i hängande droppar innehållande 1 mikrol proteinlösning (7 mg ml −1 IRK, 1 mg ml −1 KRLB Y628 eller KRLB pY628, i 20 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 180 mM NaCl och 1 mM DTT) och 1 ul reservoarbuffert (28% (vikt / volym) PEG 8000 och 0, 1 M HEPES (pH 7, 5)). Mikrososning användes för att förbättra kristallkvaliteten. Kristaller av KRLB Y628 –IRK – ATP erhölls genom blötläggning av KRLB Y628 –IRK-kristaller över natten i ett kryosolvent (28% (vikt / volym) PEG 8000, 0, 1 M HEPES (pH 7, 5) och 20% (vikt / volym) etylenglykol) innehållande 10 mM ATP och 20 mM MgCl2. Kristaller av KRLB Y628 –IRK eller KRLB pY628 –IRK överfördes till samma kryosolvent kort och snabbfrysta i flytande kväve. Kristallerna för de tre komplexen tillhör alla monoklinisk rymdgrupp P2i med ett komplex per asymmetrisk enhet och ett 53% lösningsmedelinnehåll. Statistik för insamling och förädling sammanfattas i tabell 1. Se kompletterande metoder online för datainsamling, strukturbestämning och modellbyggnad.

Full storlek bord

In-vitro neddragningsförsök.

150 μg renat vildtyp eller mutant KRLB-protein (resterna 591–733, His-märkt) blandades med 15 μg tris-fosforylerat IRK eller tris-fosforylerat IGF1RK i 300 μl bindningsbuffert (150 mM NaCl och 50 mM Tris- HCl (pH 7, 5)). 20 ul togs från varje neddragbar blandning för SDS-PAGE för att visa ungefär lika stora mängder IRK eller IGF1RK, och immunblotting genomfördes med anti-fosfotyrosinantikropp PY99 (Santa Cruz). 100 ul av en His-Select-pärlslam (Sigma-Aldrich) ekvilibrerades med bindningsbufferten och neddragningsblandningarna inkuberades med pärlorna under 1 timme vid 4 ° C. Pärlorna laddades sedan i en spinnfilterkolonn (Pierce), snurrades i en mikrocentrifug vid 100 g under 1 min för att avlägsna eventuellt obundet protein och tvättades tre gånger med bindningsbuffert plus 20 mM imidazol i spinnfilterkolonnen. Tvättbufferten avlägsnades genom snurrning vid 100 g . Bundna proteiner eluerades med elueringsbuffert (150 mM NaCl, 500 mM imidazol och 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5)), kokades med Laemmli provbuffert och upplöstes med SDS-PAGE (14%). Geler färgades antingen med Coomassie Brilliant Blue för att övervaka mängden KRLB-protein, eller överfördes till ett nitrocellulosamembran (Millipore) för immunblotting med PY99 för att detektera mängden IRK eller IGF1RK i neddragningen.

In vitro- fosforylering av KRLB-regionen.

GST-taggen av vildtyp eller Y621A KRLB (resterna 591–733) avlägsnades med tobaksettsvirus (TEV) -proteas. 1 um renad KRLB eller Y621A inkuberades med 30 nM tris-fosforylerad IRK i reaktionsbufferten (50 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 100 mM NaCl och 50 μM Na3 VO4) innehållande olika koncentrationer av ATP vid 25 ° C under 2 min. Reaktionerna stoppades genom tillsats av Laemmli-provbuffert och kokning. Proven separerades med SDS-PAGE (14%) och överfördes till ett nitrocellulosamembran. Fosforyleringsnivåerna för KRLB och Y621 detekterades genom immunblotting med anti-fosfotyrosinantikropp PY99.

In vitro- hämning av IRK-fosforylering.

Kontinuerliga spektrofotometriska analyser utfördes såsom tidigare beskrivits 27 med användning av en SpectraMax 190-mikroplattläsare (Molecular Devices). Tillsammans med kopplingsreagensen innehöll reaktionerna 200 nM tris-fosforylerad IRK, 100 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 2 mM ATP, 20 mM MgCl2 och olika koncentrationer av IRS1 Tyr983 peptid (KKSRGDYMTMQIG), KRLB Y628 och KRLB pY628 . Priserna för ATP-förbrukning beräknades mellan 20 s och 120 s.

Celltransfektion, immunutfällning och immunblotting.

Mus Irs2 cDNA klonades in i pcDNA3-vektorn. Punktmutationer i Irs2 genererades med användning av QuikChange II XL (Stratagene) och bekräftades genom DNA-sekvensering. CHO-IR-celler odlades i a-MEM innehållande 10% FBS plus gentamicin. Cellerna ympades i 10 cm vävnadsodlingsskålar och transfekterades vid 60% sammanflytning. 60 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) och 24 μg Irs2- DNA eller tom vektor användes för transfektion vid 37 ° C under 6 timmar. Efter 24 timmar svaltades cellerna i 3 timmar i Ham's F-12-medium (Invitrogen). Cellerna stimulerades med insulin i önskad dos under 10 minuter. Varje skål tvättades två gånger med iskall PBS.

Celler lyserades genom tillsats av 1 ml iskall lysbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 8, 0), 135 mM NaCl, 1% (vikt / volym) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM natriumpyrofosfat, 1 mM Na 3 VO4, 10 mM NaF och proteashämmare cocktail (Roche)) och inkuberar på is under 30 minuter. Celllysat klargjordes genom centrifugering. För IRS2-immunutfällning inkuberades de klarade lysaten över natten med anti-IRS2-antikropp (M-19, Santa Cruz) vid 4 ° C. Protein G-agaros (Roche) användes för att fälla ut antikroppen och bundna proteiner genom inkubering under 2 timmar vid 4 ° C. Protein G-agaros tvättades omfattande med lysbuffert och solubiliserades i SDS-PAGE-provbuffert. De bundna proteinerna eller celllysaten upplöstes med SDS-PAGE (8, 8%) geler, överfördes till nitrocellulosamembran och detekterades genom immunblotting med anti-IRS2 antikropp, anti-fosfotyrosin antikropp (PY99), anti-IRS1, 2 pTyr612 (Santa Cruz ), anti-IRS1 pTyr896 (Millipore) och anti-IRS1 pTyr1179 (Santa Cruz). För de dosberoende insulinstimuleringsexperimenten (fig. 6a) användes FuGENE 6-transfektionsreagens (Roche) för transfektion, och IRS2-immunutfällning genomfördes genom inkubation över natten med anti-IRS2-antikropp följt av 1 timmars inkubation med protein G –Sepharose (Amersham) och tvätt tre gånger med lysbuffert.

Anslutningskoder.

Atomkoordinater och strukturfaktorer har deponerats i Protein Data Bank med anslutningskoder enligt följande: KRLB Y628 –IRK, 3BU3; KRLB Y628 –IRK + ATP, 3BU5; KRLB pY628 –IRK, 3BU6.

Obs: Tilläggsinformation finns på webbplatsen Nature Structural & Molecular Biology .

anslutningar

Primära anslutningar

Proteindatabank

  • 3BU3
  • 3BU3 3d-vy
  • 3BU5
  • 3BU5 3d-vy
  • 3BU6
  • 3BU6 3d-vy

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande text och figurer

    Kompletterande figur 1–3 och kompletterande metoder