Strukturell grund för potent zika – dengue-virusantikropp korsneutralisation | natur

Strukturell grund för potent zika – dengue-virusantikropp korsneutralisation | natur

Anonim

ämnen

  • Proteinvacciner
  • Röntgenkristallografi
  • Ett Erratum till denna artikel publicerades den 14 september 2016

Abstrakt

Zika-virus är medlem av Flavivirus-släktet som inte hade förknippats med allvarlig sjukdom hos människor förrän de senaste utbrotten, då det var kopplat till mikrocefali hos nyfödda i Brasilien och till Guillain-Barré-syndrom hos vuxna i Franska Polynesien. Zika-virus är relaterat till dengue-virus, och här rapporterar vi att en undergrupp av antikroppar riktade mot en konformationell epitop som isoleras från patienter med dengue-virus också neutraliserar Zika-virus. Kristallstrukturen hos två av dessa antikroppar i komplex med höljesproteinet från Zika-virus avslöjar detaljerna i en konserverad epitop, som också är platsen för interaktion mellan kuvertproteindimeren med prekursormembran (prM) -proteinet under virusmognad. Jämförelse av immunkomplexen av Zika- och dengue-virusviruset ger en ledning för en rationell, epitopfokuserad design av ett universellt vaccin som kan framkalla potenta korsneutraliserande antikroppar för att skydda samtidigt mot både Zika- och dengue-virusinfektioner.

Huvudsaklig

Zika-virus (ZIKV) är ett arthropodburen höljesvirus som tillhör Flavivirus-släktet i familjen Flaviviridae , som också inkluderar den mänskliga patogena gula febern, dengue, West Nile och fästburen encefalitvirus 1 . Flavivira har två strukturella glykoproteiner, prM och E (för prekursormembran respektive höljesproteiner), som bildar en heterodimer i endoplasmatisk retikulum (ER) i den infekterade cellen och driver spirandet av pigga omogna virioner i ER-lumen. Dessa partiklar passerar genom den cellulära utsöndringsvägen, under vilken den trans- Golgi-bosatta proteas furin klyver prM. Denna behandling krävs för infektivitet och resulterar i förlust av ett stort fragment av prM och omorganisation av E på virionsytan. De mogna partiklarna har en jämn aspekt, med 90 E dimerer organiserade med icosahedralsymmetri i ett "fiskbensmönster" 2, 3 .

Tredimensionella kryo-elektronmikroskopistrukturer (cryo-EM) -strukturer hos de mogna ZIKV-partiklarna har nyligen rapporterats vara nära atomupplösning (3, 8 Å) 4, 5, vilket visar att viruset väsentligen har samma organisation som de andra flavivirusen med känd struktur, såsom dengue-virus (DENV) 3 och West Nile-virus 6, 7 . E-proteinet är ungefär 500 aminosyror långt, med de 400 N-terminala resterna som bildar ektodomänen väsentligen vikta som p-ark med tre domäner, benämnda I, II och III, i linje med rad I med centrum. Den bevarade fusionsslingan är vid den distala änden av stången i domän II, begravd vid E dimer-gränssnittet. Vid C-terminalen följs E ectodomain av "stam", med två α-helices som ligger platt på det virala membranet (stamhelixerna), som länkar till två C-terminala transmembrana a-helices. Det viktigaste kännetecknande för ZIKV-virionen är en insättning i en glykosylerad slinga av E ('150' -slingan), som sticker ut från den mogna virionsytan 4, 5 .

Flavivira har grupperats i serokomplex baserat på korsneutraliseringsstudier med polyklonalt immunsera 8 . E-proteinet är huvudmålet för neutraliserande antikroppar och är också den virala fusogenen; klyvning av prM tillåter E att svara på det endosomala pH-värdet genom att genomgå en storskalig konformationell förändring som katalyserar membranfusion och frigör det virala genomet i cyotosolen. Förlust av prekursorfragmentet av prM låter E-proteinet sväva från dess täta packning vid virionens yta, och utsätter transienter på annat sätt begravda ytor. En yta som exponeras av denna "andning" är fusionsslingepitopen (FLE), som är ett dominerande korsreaktivt antigenställe 9 . Även om antikroppar mot denna plats kan skydda genom komplementmedierade mekanismer, såsom visas i en musmodell för West Nile-virus 10, är de dåligt neutraliserande och leder till antikroppsberoende förbättring 11, 12, 13, 14, 15, och därmed förvärrar Flavivirus-patogenesen och komplicerar utvecklingen av säkra och effektiva vacciner.

Vi rapporterade nyligen den funktionella och strukturella karakteriseringen av en panel av antikroppar isolerade från patienter med denguesjukdom 13, 16 . De flesta av dessa antikroppar är inriktade på FLE, men andra riktar sig mot ett kvartärt ställe som är lättillgängligt vid den exponerade ytan av E-proteinet på virionen, vid gränssnittet mellan de två E-subenheterna i dimeren. Dessa i stort sett neutraliserande antikroppar (bnAbs), benämnda EDE för E-dimerepitop, neutraliserar kraftigt alla fyra DENV-serotyper. Deras bindningsställe bevaras över serotyper eftersom det också är interaktionsstället för prM med E-dimerer under transport av omogna viruspartiklar genom Golgi-apparaten i cellen. Det fanns två undergrupper av EDE-antikroppar, kännetecknade av ett differentiellt krav för glykosylering på 150-slingan för bindning. EDE1 bnAbs binder bättre i frånvaro av glykan, medan EDE2 bnAbs binder bättre när glykanen är närvarande.

I denna studie visar vi att EDE-bnAbs neutraliserar ZIKV lika kraftfullt som de neutraliserar DENV. Vi finner också att FLE-antikropparna, som neutraliserar DENV, även om de inte är lika kraftfulla som EDE-bnAbs, inte neutraliserar ZIKV vid koncentrationer upp till 1 μM trots en hög affinitet för det rekombinanta ZIKV E-proteinet. Vi beskriver vidare kristallstrukturerna för ZIKV E-proteindimeren enbart och i komplex med EDE1 C8 och EDE2 A11 och identifierar deras bindande determinanter.

En ZIKV – DENV superserogrupp

Filogenetiska analyser av de huvudsakliga humana patogena flavivirusen med användning av aminosyrasekvenserna av det virala RNA-polymeraset NS5 indikerar en gruppering av ZIKV med gruppen av myggburna encefalitiska virus. Klyngen är olika när aminosyrasekvenserna för E-proteinet beaktas, varvid ZIKV förgrenas med DENV-gruppen (fig. La). Om sekvensklusteringen sträcker sig till den antigena ytan av E, bör antikroppar som korsreagerar med flera DENV-serotyper också binda ZIKV E. För att testa denna hypotes, använde vi biolagers interferometri för att studera bindningsegenskaperna hos en dåligt neutraliserande, korsreaktiv FLE antikroppar och de potentiellt neutraliserande EDE-antikropparna för rekombinant, löslig ZIKV E-ektodomain (ZIKV sE) producerad i insektceller (se Metoder). FLE-antikroppen (P6B10) band nästan 10 gånger tätare än EDE1 C8-värden (uppenbar dissociationskonstant (Kd) -värden på 1, 5 nM mot 9 nM) och nästan 1 000 gånger tätare än EDE2 A11 (fig. 1b och utökad data) Fig. La). I överensstämmelse med deras affiniteter kunde vi isolera ett komplex av ZIKV sE med en C8 Fab genom storleks-uteslutningskromatografi, men inte med en A11 Fab (Utvidgad data Fig. 1b).

Image

a, fylogenetiska träd av de viktigaste humana patogena flavivirusen baserade på aminosyrasekvenserna för E-proteinet (till vänster) och av polymeras NS5-proteinet (höger). Leddjurvektorerna är differentierade av bakgrundsfärgen. JEV, japanskt encefalitvirus; MVEV, Murray Valley-encefalitvirus; POWV, Powassan-virus; SLEV, Saint Louis encefalitvirus; TBEV, fästingburet encefalitvirus; YFV, gulfebervirus; WNV, West Nile-virus. b, ZIKV sE-reaktivitet med humana rekombinanta antikroppar i full längd FLE P6B10, EDE1 C8 och EDE2 A11. Vänster bindande egenskaper övervakades med biolagerinterferometri (BLI) på Octet-Red (ForteBio). De normaliserade svarsvärdena uttryckta som en fraktion av beläggningsställets placering planeras mot koncentrationer av ZIKV sE-dimer visad i logaritmisk skala. Linjer betecknar globala kurvanpassningar som används för K d- utvärdering (se Utökad data Fig. 1a för linjärt koncentrationsområde som visar koncentrationsberoende mättnadsanpassningar). Normaliserade svarvärden härleddes från enskilda sensorgram som visade bindningsegenskaperna för EDE1 C8 mätt vid olika ZIKV-sE-koncentrationer.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Neutraliseringsanalyser i afrikanska celler med grön apajnjur (Vero) med användning av dessa och andra medlemmar av de tre antikroppsuppsättningarna, visade att EDE1-antikropparna starkt neutraliserar ZIKV, medan EDE2-antikropparna var minst en loggordning mindre potent. Trots sin starka affinitet neutraliserade P6B10 inte ZIKV i det använda koncentrationsintervallet och heller inte någon av de två andra FLE-antikropparna som testades (fig. 2). EDE1-bnAbs neutraliserade bäst ZIKV-afrikansk stam HD78788, med en halv-maximal inhiberande koncentration (IC50) på cirka 0, 1 nM. Denna stam har under åren varit cellkulturanpassad och passerad hos ammande hjärnmöss och saknar E-glykosylering. IC 50 mot PF13-stammen, isolerad i Franska Polynesien 2013 och i vilken E-proteinet är glykosylerat i position 154, låg i det nanomolära intervallet och kan jämföras med eller lägre än det mot de fyra DENV-serotyperna (tabell 1). EDE2-bnAbs visade ingen skillnad i neutralisering av de två stammarna, vilket antydde att närvaron av N154-glykan i ZIKV E-proteinet inte förstärkte interaktionen.

Image

Resultaten representerar medelvärdet ± sem av fyra oberoende experiment utförda i triplikat för PF13 och i duplikat för HD78788-stammar. De två ZIKV-stammarna är i ljusa färger, blå respektive röd. Neutraliseringsdata för de fyra DENV-serotyperna (streckade linjer i bleka färger) togs från ref. 13, och ges här för jämförelse. Motsvarande IC50-värden tillhandahålls i tabell 1. Observera att den använda DENV-4-stammen var ett naturligt isolat som saknade N153-glykosyleringsstället (N - ).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Full storlek bord

ZIKV – EDE bnAbs immunkomplex

Vi kristalliserade oliganderad ZIKV sE och komplex av ZIKV sE med EDE1 C8 och EDE2 A11 med en-kedjig Fv (scFv) respektive Fab-fragment (Utvidgad datatabell 1). I strukturen för oliganderad ZIKV sE beställs 150-slingan, till skillnad från den odlykosylerade 150-slingan i den nyligen bestämda strukturen av proteinet producerat i bakterier och återvecklas in vitro 17 . I motsats till vårt insektscellutsöndrade protein, som är en dimer (utvidgad data fig. Ib), rapporterades det återveckade proteinet att vara monomer i lösning, vilket tyder på att glykan kan hjälpa till att strukturera slingan och främja sE-dimerisering.

Antikropparna känner igen en kvartär epitop i ZIKV sE dimer på samma sätt som de känner igen DENV serotyp 2 (DENV-2) sE dimer som beskrivits tidigare 16 . Aminosyraresterna som deltar i kontakterna, för både ZIKV- och DENV-2-strukturerna, visas i utvidgade data Fig. 2. Som förväntat är mönstret mycket lika, med de få skillnaderna som markeras i röda ramar i Utvidgad data Fig. 2b. Båda epitoperna i sE-dimeren upptas i fallet med komplexet med C8 (fig. 3a), medan endast en är upptagen i fallet med A11 (fig. 4a). Inspektion av kristallmiljön visade att en andra Fab inte kunde dockas vid denna position utan att kollidera med angränsande komplex i kristallen. Denna observation indikerar att kristalltillväxt vald för inkorporering av sE-dimerer med en enda Fab-bunden, vilket underlättas av den låga affiniteten hos A11.

Image

a, helhetsvy av komplexet, med sE-delen färgad av domäner (I, II och III i röd, gul respektive blå); antikropparna i grått och mörkgrönt för ljusa respektive tunga kedjor. CDR: er är färgade (H1, ljusblå; H2, sand; H3, rosa; L1, ljusgrå; L2, magenta; L3, orange). Insatsen visar en jämförelse med motsvarande DENV-2-komplex. För tydlighetens skull överlagrades den variabla regionen för C8 Fab-fragmentet i DENV-2 sE – C8-komplexet på C8 scFv i komplex med ZIKV sE för att rita Fab-axlarna och visa dockningsvinklarna bättre. b, Zooma av ZIKV sE – C8-interaktionen för att visa igenkänningen av b- strängen. Vätebindningar visas som prickade linjer och immobiliserade vattenmolekyler som röda sfärer. c, Samma region på DENV-2 sE – C8 Fab-komplexet. Observera att N67-glykanen på DENV också interagerar med antikroppen. d, Fotavtrycket för EDE1 C8 visas på ZIKV sE-dimer som visas i ytrepresentation (ser utanför virionen) färgad enligt bevarande av ytutsatta aminosyror. Atomer från huvudkedjan och konserverade sidokedjor är orange, mycket likadana sidokedjor är gula och alla de andra är vita. e, f, Fotavtryck av EDE1 C8 på en ytrepresentation av ZIKV sE ( e ) och DENV-2 sE ( f ) visade i lila. FL, fusionsslinga. De två protomererna av sE i dimer är i ljus och mörkgrå. Relevanta antigena SE-regioner är märkta. Notera att den mer begränsade interagerande ytan i ZIKV sE-dimer än i DENV-2, till exempel är N67-glykan frånvarande i ZIKV sE.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Image

Färgkodning är som i fig. 3. a, Helhetsvy av komplexet, med endast en Fab bunden per sE-dimer, på grund av kristallpackning. Den streckade ellipsen representerar positionen för den saknade A11 Fab. Insatsen jämför bindningsvinkeln till sE-dimer i ZIKV och i DENV-2. b, c, Interaktioner vid b- strängen i ZIKV (vänster) och i DENV-2 (höger). Notera b- strängens olika vinkel med avseende på antikroppen (antikroppen är i exakt samma orientering i båda panelerna). d, e, Zooma på glykan på 150-slingan för ZIKV sE ( d ) och för DENV-2 sE ( e ), med sockerrester som beskrivs i tangenten. CDR H3-spiralen är för långt för att göra interaktioner med glykan, som är fallet i DENV-2-strukturen (se Utvidgade data Fig. 2b och 5b).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

BnAbs dockar på ZIKV sE i olika vinklar än de gör på DENV-2 sE (se insatser i fig 3a och 4a). I fallet med C8-komplexet beror skillnaden i dockning främst från en förändrad krökning av sE-dimeren. Vi noterar att konformationen av ZIKV sE i komplex med antikropparna är mycket lik den som den antar på viruspartikeln, med ungefär 1, 5 Å rotmedelmåttkvadiavvikelse (rmsd) för 790 Ca-atomer (se utökad datatabell 2). Den obundna ZIKV sE-kristalliserade här visar en mer avlägsen konformation (2, 5 Å rmsd vid jämförelse med både virion ZIKV E och någon av sE-antikroppskomplexen), vilket antyder att antikropparna stabiliserar en konformation nära den på den virala partikeln. Däremot ger samma jämförelser som gjorts för DENV-2 sE, ensamma eller i komplex med bnAbs, rmsd-värden på 5–7 Å med avseende på E-konformationen på DENV-virionen observerad av cryo-EM 3 . Som jämförelse resulterar superposition av ektodomainen av virion E från ZIKV 5 och DENV-2 (ref. 3) i ett liknande 1, 5 Å rmsd-värde, vilket indikerar att de presenteras ungefär på samma sätt, men att DENV sE är mer deformerbar i lösning. Denna formbarhet kan återspegla den konformationella andning som rapporterats för DENV E 18 . Istället förblir ZIKV sE i en liknande konformation i frånvaro av interaktioner med de underliggande stam-a-helikterna och med M-proteinet (den membranförankrade rest av prM efter furin-klyvning) på virionen, i linje med den högre stabiliteten hos ZIKV-partiklarna som nyligen beskrivits 4 .

EDE1 C8-komplex

Den totala begravda ytan på EDE1 C8 i komplexet med ZIKV sE är cirka 900 Å 2, jämfört med cirka 1 300 Å 2 i DENV-2 sE-komplexet (Utvidgad datatabell 3). Figur 3d visar bevarandet av epitopen, och Fig. 3e och f jämför C8-fotavtrycket på ZIKV och DENV-2 sE. Den DENV-specifika glykanen i position N67, som är ordnad i DENV-2 sE-strukturen (fig. 3c), står för cirka två tredjedelar av den totala skillnaden i fotavtrycksområdet. N67-glykanen interagerar med ramområdet 2 för den tunga kedjan (FRH2), och dess frånvaro i ZIKV sE visar att dessa kontakter inte är nödvändiga för bindning. Nyckelklusteret av interaktioner som upprätthålls är centrerat på p-sträng b i domän II, med sidokedjor från komplementaritetsbestämande regioner (CDR: er) H2, H3 och L3 som känner igen alla tillgängliga vätebindningsdonatorer (huvudkedjekarbonyler) och acceptorer ( huvudkedjekarbonyler) av bdc- p- arkkanten (fig. 3b, c). Dessutom är fusionsslingans huvudkedja (som innehåller flera glycinrester) och disulfidbindningen mellan Cys74 och Cys105 inramade av aromatiska sidokedjor av CDR: erna L1 och L3 (se även utvidgad datafigur 3). Återstoder från dessa två CDR: er känner också igen strikt konserverade sidokedjor i fusionsslingan (Arg99) eller närliggande rester (Gln77).

Över dimer-gränssnittet, och som i komplexet med DENV-2, är 150-slingan delvis störd, utan någon detekterbar densitet för N154-glykan (fig. 3a och utvidgad data fig. 3d). Som visas i utvidgad data, fig. 3, är de interagerande resterna över dimer-gränssnittet olika, vilket återspeglar den mer begränsade sekvensbevaringen i dessa regioner av E-proteinet: i DENV-2 sE-komplexet är dessa kontakter med rester från p-strängar A och B i domän III, men i ZIKV involverar de huvudsakligen Lys373 från p-sträng E som interagerar med CDR: er L1 och L2, via ett nätverk av direkta eller vattenmedierade vätebindningar (Utvidgad data Fig. 3b, c). På liknande sätt bidrar flera laddade rester i domän I och från den närliggande kl- slingan för domän II över gränssnittet, till bindningen och interagerar med den tunga kedjan CDR: er H2 och H3 (Utvidgad datafigur 3e, f). Alla polära interaktioner mellan C8 och ZIKV sE är listade i utvidgade datatabeller 4 och 5, och den elektrostatiska ytan på epitopen visas i utvidgad data, fig. 4, vänster panel. Sammanfattningsvis identifierar dessa observationer det bevarade klustret av kontakter med b- strängen och fusionsslingan i domän II som de viktigaste bindande determinanterna för C8, med ytterligare kontakter från hela dimer-gränssnittet - eller från N67-glykanen i DENV - ytterligare stabiliserande men inte bestämmer interaktionen.

EDE2 A11-komplex

Utökad data Fig. 4 jämför fotavtrycket för C8 och A11 på ZIKV sE, tillsammans med den yttre elektrostatiska potentialen för komplexen, som visar en stark grundlapp på sE i C8-komplexet på grund av störningen i 150-slingan. Såsom visas i utvidgade data, fig. 5, skulle C8 kollidera med glykan om slingan förblev på plats, vilket var fallet i komplexet med DENV-2 sE 16 . I A11-komplexet förblir 150-slingan i samma konformation som i cryo-EM-strukturerna i virionen (utvidgad data fig. 5a) och i röntgenstrukturen för glykosylerad oliganderad sE som rapporterats här. I DENV-2 sE – A11-komplexet känns igen glykan av en a-spiral i den långa CDR H3-slingan (fig. 4e). Skillnaden i längd i 150-slingan för E i ZIKV jämfört med DENV förskjuter glykans position med cirka 6–7 Å, så att den inte kan göra samma interaktioner med CDR H3 α-helix (Fig. 4d, e och Utvidgad data Fig. 5b). Som en konsekvens dockar A11-antikroppen i en annan vinkel på ZIKV sE än den gör på DENV-2 sE, till och med står för skillnaden i sE-dimerkurvatur (fig. 4a, inlägg). Kontakterna längs b- strängen bevaras (fig. 4b, c). Jämfört med C8, känns igen b- strängen endast längs hälften av dess längd (rester 71 och 73), medan C8 känner igen den hela tiden, från rest 68 (eller från 67 i DENV).

Diskussion

Våra resultat identifierar de strukturella detaljerna i en kvartär epitop som ger en tidigare okänd koppling av potent korsneutralisering mellan Zika- och dengue-virus, och identifierar därmed ett antigen Flavivirus-kluster utöver de traditionella serokomplexen. Detta förhållande definierar en superserogrupp på grundval av stark korsneutralisering genom en konserverad epitop som inte hade erkänts med användning av polyklonal sera 8 . Detta fynd introducerar således möjligheten att utveckla ett universellt vaccin som skyddar mot alla virus från denna grupp.

Vaccindesign mot dengue-virus har hindrats av heterogeniteten hos DENV-partiklar och behovet av att använda flervärda formler för att immunisera mot alla fyra serotyper 19, 20 . Ett särdrag hos DENV är att det genomgår ofullständig furinmognadspjälkning av prM i många celltyper, vilket ger upphov till heterogena mosaikpartiklar med en omogen likartad spikig lapp på ena sidan och en jämn mogen-liknande region på motsatt sida 21 . Dessa partiklar är smittsamma eftersom de kan smälta samman med cellmembranet genom den mjuka, mogna sidan. Eftersom FLE exponeras i omogna regioner 22, är det mesta av antikroppssvaret hos DENV-infekterade patienter riktat mot det 23 . Dessa korsreaktiva antikroppar täcker partiklarna på den omogna sidan 22 men neutraliserar endast svagt, eftersom de kan binda den mogna sidan endast när E-proteinet "andas" 24, 25, 26 . En nyligen publicerad struktur av monomer ZIKV sE i komplex med en FLE-specifik monoklonal musantikropp med låg neutraliserande aktivitet visar verkligen att dess bindningsställe skulle vara tilltäppt i det dimera E-proteinet på mogna infektiösa virioner 17 . Observationen att P6B10 och andra FLE-antikroppar fortfarande neutraliserar DENV 13 antyder att E i de mogna lapparna på DENV spenderar mer tid i konformationer som exponerar FLE än E i de korrigeringarna på ZIKV. Denna slutsats överensstämmer med den högre termiska stabiliteten hos ZIKV rapporterade nyligen 4 .

Våra resultat antyder att epitopen riktad av EDE1 bnAbs är bättre lämpad för att utveckla ett epitopfokuserat vaccin mot virus i ZIKV / DENV superserogruppen än FLE, som inducerar dåligt neutraliserande och starkt infektionsförstärkande antikroppar 12, 13, 14 . EDE1 är också bättre lämpad än den relaterade EDE2-epitopen: även om EDE1-bnAbs kräver en E-dimer för att binda, är de faktiska bindningsdeterminanterna centrerade på b- strängen och på de mycket bevarade, E-dimer-exponerade elementen i fusionsslingan, vilket framgår av jämförelsen mellan deras bindning till DENV-2 och ZIKV sE. Det faktum att EDE2 bnAbs förlitar sig starkt på sina kontaktpunkter på den intilliggande underenheten - på den variabla 150-slingan där glykosylering inte alltid finns - är en nackdel, vilket visas av deras dåliga affinitet (Fig. 1) och deras starka induktion av antikropp -beroende förbättring 12 .

Inriktning på b- strängen och de E-dimer-exponerade elementen i fusionsslingan verkar som ett kraftfullt alternativ till multi-immunogen-metoderna mot DENV-klustret som har haft begränsad framgång i kliniska prövningar 27 . Eftersom E-proteinpolypeptidkedjan varken visar insättningar eller borttagningar i regionen av b- strängen för något medicinskt relevant Flavivirus uppvisar denna region en låg risk att inducera flyktmutationer, troligtvis eftersom det också är det interagerande stället med prM under virusmognad. Slutligen, i en mer omedelbar tillämpning, antyder vår studie också att EDE1-antikropparna, kanske bär "LALA" -mutationen 28 om effektorfunktioner ska undvikas, kan vara användbara för immunprofylax för gravida kvinnor som riskerar att få ZIKV-infektion.

metoder

Inga statistiska metoder användes för att förutbestämma provstorlek. Experimenten randomiserades inte, och utredarna var inte blinda för tilldelning under experiment och utvärdering av resultatet.

Rekombinant produktion av ZIKV sE-protein

Rekombinant Zika-virus sE-protein (stam H / PF / 2013, GenBank-anslutningsnummer KJ776791) producerades med en tandem-strep-tagg i Drosophila Expression System (Invitrogen) såsom beskrivits tidigare 29, 30 . Ett kemiskt syntetiserat DNA-fragment (GeneArt) innehållande Zika sE-sekvensen (aminosyror 1-408) klonades in i expressionsvektorn pT389 (ref. 31) som kodar exportsignalsekvensen BIP, ett enterokinas-klyvningsställe och strep-taggen. Drosophila Schneider 2 (S2) -celler transfekterades stabilt med användning av blasticidin för selektion. Proteinuttryck inducerades genom tillsats av CuSO4 och supernatanter uppsamlades 7-10 dagar efter induktion. Antigener renades via affinitetskromatografi med Streptactin-kolumner (IBA) enligt tillverkarens instruktioner. I ett slutligt reningsgelfiltreringssteg användes en Superdex-ökning av 200 10/300 GL-kolonn ekvilibrerad i 50 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl.

Produktion av antigenbindande (Fab) och scFv-fragment från bnAbs

BnAb-fragmenten klonades i plasmider för expression som Fab 32 och scFv 33 i Drosophila S2-celler. Konstruktionerna innehåller en tandem-strep-etikett smält vid C-terminalen (endast i den tunga kedjan i fallet med Fab) för affinitetsrening. Reningsprotokollet inkluderade en Streptactin-affinitetskolonn följt av gelfiltrering såsom beskrivits ovan.

Uttryck av humana monoklonala anti-DENV E-antikroppar

Fullständiga IgG-antikroppar producerades i 293T-celler (en gåva från C. Lee), som var fria från mycoplasma-kontaminering testad med Lookout Mycoplasma PCR-detekteringssats (Sigma MP0035). Dessa celler samtransfekterades med plasmider innehållande tunga och lätta kedjor av immunglobulin Gl såsom beskrivits tidigare 13 .

Immunkomplexbildning och isolering

Det renade ZIKV sE-proteinet blandades med Fab A11 eller scFv C8 (i ungefär tvåfaldigt molärt överskott) i standardbuffert (500 mM NaCl, Tris 50 mM, pH 8, 0). Volymen bringades till 0, 5 ml genom centrifugering i en Vivaspin 10 kDa avskärning; efter en 30-minuters inkubering vid 4 ° C separerades komplexet från överskott av Fab eller scFv genom storleks-uteslutningskromatografi för ZIKV sE och scFv C8. För ZIKV sE och Fab A11 kunde ingen uppenbar komplexbildning ses i storleks-uteslutningskromatografi; därför användes en lösning innehållande sE i en koncentration av 1, 5 mg ml-1 och Fab A11 i en koncentration av 3 mg ml-1 (motsvarande ett molförhållande ~ 1: 2-antigen: antikropp) direkt för kristallisation. I alla fall byttes bufferten till 150 mM NaCl, 15 mM Tris, pH 8, för kristallisationsförsök. Proteinkoncentrationerna som användes för kristallisation, bestämda genom att mäta absorbansen vid 280 nm och använda en extinktionskoefficient uppskattad från aminosyrasekvenserna, listas i tabellen 1 för utökad data.

Analyser av bioferies interferometri i realtid

Interaktioner mellan renat ZIKVE-protein med IgG FLE P6B10, IgG EDE1 C8, IgG EDE2 A11 och kontroll IgG 28C (ett antiinfluensavirus) övervakades i realtid med användning av en bio-skiktinterferometri Octet-Red384-anordning (Pall ForteBio ). Anti-humant IgG Fc-fångstbiosensorer (Pall ForteBio) laddades under 10 minuter med 1 000 varv per minut skakningshastighet med användning av antikroppar vid 5 ug ml-1 i analysbuffert (PBS plus 0, 2 mg ml-1 BSA och mellan 0, 01%). Obundet antikroppar tvättades bort i 1 min i analysbuffert. IgG-laddade sensorer inkuberades sedan under 15 minuter vid 1 200 rpm i frånvaro och närvaro av tvåfaldigt seriellt utspädd ZIKV sE-proteinkoncentration i analysbuffert. Molkoncentrationer beräknades för sE-proteinet i en dimer form. För antikropparna FLE P6B10, EDE1 C8 och EDE2 A11 användes följande ZIKV-sE-koncentration: 0, 78–50 nM, 3, 125–200 nM och 50–3 200 nM, respektive. Referensbindande experiment genomfördes parallellt på sensorer belastade med kontroll IgG 28C. Dissociation av de bildade komplexen övervakades sedan under 10 minuter genom att doppa sensorerna i enbart analysbuffert. Driftstemperaturen hölls vid 25 ° C. Data i realtid analyserades med Scrubber 2.0 (Biologic Software) och Biaevaluation 4.1 (GE Healthcare). Specifika signaler erhölls genom dubbelreferenser, det vill säga subtrahera icke-specifika signaler uppmätta på icke-specifika IgG-belastade sensorer och buffertsignaler på specifika IgG-belastade sensorer. Associerings- och dissocieringsprofiler, såväl som signaler med steady-state kontra koncentrationskurvor, anpassades med antagande av en 1: 1-bindande modell.

Bestämningar av kristallisation och röntgenstruktur

Kristallisations- och kryokylningssituationerna för diffraktion av datainsamling listas i utökad datatabell 1. Kristallisationsförsök utfördes i sittdroppar om 400 nl. Droppar bildades genom att blanda lika stora volymer av protein- och reservoarlösningen i Greiner-plattor med 96 brunnar, med användning av en myggrobot och övervakades av en Rock-Imager. Kristaller optimerades med hjälp av en robotiserad Matrix Maker- och mygguppsättning på 400 nl sittande eller hängande droppar, eller manuellt i 24-brunnars plattor med användning av 2-3 μl hängande droppar.

På grund av den starka anisotropin av kristallerna (se resultat för anisotropi i utökad datatabell 1) testades ett viktigt antal kristaller vid flera strållinjer vid olika synkrotroner (SOLEIL, St Aubin, Frankrike; ESRF, Grenoble, Frankrike; SLS, Villigen, Schweiz). Kristallerna med de mindre anisotropa diffraktionsdata användes för att bestämma strukturerna. Datauppsättningarna indexerades, integrerades, skalades och slogs samman med XDS 34 och AIMLESS 35 . En preliminär modell av ZIKV sE-protein byggdes från DENV-2 sE (4UTA) -strukturen med hjälp av strukturshomologimodelleringsservern SWISS-MODEL 36 . Strukturerna för komplexen bestämdes sedan genom molekylersättning med PHASER 37 med användning av sökmodellerna listade i utökad datatabell 1. AIMLESS och PHASER-program användes i CCP4-sviten 38 .

DEBYE- och STARANISO-programmen som utvecklats av Global Phasing Ltd applicerades på de data som skalades med AIMLESS utan att använda en upplösningsgräns med STARANISO-servern (//staraniso.globalphasing.org/). Dessa program utför en anisotropisk avskärning av sammanslagna intensitetsdata på grundval av en analys av lokal I / σ ( I ), beräknar Bayesiska uppskattningar av strukturamplituder med hänsyn till deras anisotropa nedfall och tillämpar en anisotropisk korrigering på data. Dessa korrigerade anisotropa amplituder användes sedan för ytterligare förfining av strukturerna med BUSTER / TNT 39 . Observera att tabellen 1 för utökad data visar förfiningstatistiken mot de fullständiga uppsättningarna reflektioner som är avkortade vid bästa högupplösta längs h- , k- eller l- axeln.

Modellerna korrigerades sedan alternativt manuellt och slutfördes med hjälp av COOT 40 och förfinades med användning av BUSTER / TNT mot amplituderna korrigerade för anisotropi. Förfiningar begränsades med användning av icke-kristallografisk symmetri. De förfinade strukturerna har följande slutliga R- arbete / R- fria (i%) värden: ZIKV sE – EDE1 C8 scFv (19.5 / 22.1), ZIKV sE – EDE2 A11 Fab (22.3 / 23.7) och oliganderad ZIKV sE (20.8 / 23.6) (se utökad datatabell 1).

Analys av atommodeller och illustrationer

Varje komplex analyserades med CCP4-programserien och de polära kontakterna beräknades med PISA-webbplatsen 41 . För de intermolekylära interaktioner som visas i utvidgade data, fig. 2 och 3 och utvidgade datatabeller 4 och 5, var de maximala avstängningsavstånden som användes 4 Å respektive 4, 75 Å för polära respektive van der Waals-kontakter. Flera sekvensinställningar beräknades med användning av Clustal W och Clustal X version 2 (ref. 42) på EBI-servern 43 . Siffrorna som illustrerar strukturmodellerna framställdes med användning av ESPript 44 och PyMOL Molecular Graphics System, version 1.5.0.4 (Schrödinger) (//pymol.sourceforge.net).

Filogena träd

The maximum likelihood phylogenetic trees were inferred using 12 representative amino acid sequences of Flavivirus envelope protein E or RNA polymerase NS5 proteins, using the LG model available in PhyML 45 and a combination of SPR+NNI branch-swapping. Bootstrap values were calculated from 100 bootstrap replicates. The trees were visualized using Figtree (//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). The accession codes of sequences used in the tree: Zika virus (ZIKV, KJ776791, strain H-PF-2013_French_Polynesia); dengue virus serotype 1 (DENV-1, NC_001477); dengue virus serotype 2 (DENV-2, NC_001474); dengue virus serotype 3 (DENV-3, NC_001475); dengue virus serotype 4 (DENV-4, NC_002640); Saint Louis encephalitis virus (SLEV, NC_007580); Japanese encephalitis virus (JEV, NC_001437; Murray Valley encephalitis virus (MVEV, NC_000943); West Nile virus (WNV, NC_001563); yellow fever virus (YFV, NC_002031); tick-borne encephalitis virus (TBEV, NC_001672); and Powassan virus (POWV, NC_003687).

Viral stocks

The African strain Zika HD78788 was obtained from the Institut Pasteur collection and the Asian strain Zika PF13, isolated from a patient during ZIKV outbreak in French Polynesia in 2013, was obtained through the DENFREE (FP7/2007-2013) consortium. Viral stocks were prepared from supernatant of infected C6/36 cells (ATCC CRL-1660) clarified by centrifugation at 3, 000 g at 4 °C and titrated on Vero cells (ATCC CRL-1586) by a focus-forming assay. Stocks were kept at −80 °C until use. All cell lines were free from mycoplasma contamination.

Neutralization assays

Virus neutralization by the tested human antibodies was evaluated using a focus reduction neutralization test (FRNT). About 100 focus-forming units from virus stocks were incubated with a serial dilution of antibody for 1 h at 37 °C. The mixture was then added to Vero cells and foci were left to develop in presence of 1.5% methylcellulose for 2 days. Foci were then stained after fixation with 4% formaldehyde using anti-E 4G2 antibody (ATCC HB-112) and anti-mouse horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody (ThermoFisher 31430). The foci were visualized by diaminobenzidine (DAB) (Sigma D5905) staining and plates were counted using the ImmunoSpot S6 Analyser (Cellular Technology Limited, CTL). Neutralization curves and 50% FRNT values were calculated by nonlinear regression analysis using Prism 6, GraphPad software.

anslutningar

Primära anslutningar

Proteindatabank

  • 5LBS
  • 5LBS 3d view
  • 5LBV
  • 5LBV 3d view
  • 5LCV
  • 5LCV 3d view

Hänvisade anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • KJ776791

Insättningar av data

Atomic coordinates and structure factors amplitudes have been deposited in the Protein Data Bank (PDB) under accession numbers 5LBS (for complex ZIKV sE–EDE1 C8 scFv), 5LCV (for complex ZIKV sE–EDE2) and 5LBV (for A11 Fab and unliganded ZIKV sE).

Utökad data

Utökade datasiffror

  1. 1.

    Antibody binding to recombinant ZIKV protein.

  2. 2.

    Residues involved in bnAb–antigen interactions.

  3. 3.

    Details of EDE1 C8 bnAb contact across the dimer interface.

  4. 4.

    Surface electrostatic potential on an open-book representation of the immunocomplexes.

  5. 5.

    Details of the A11 interaction with the glycan on the 150 loop.

Utökade datatabeller

  1. 1.

    Crystallization conditions, data collection and refinement statistics

  2. 2.

    The rmsd values between sE dimers in the various structures of ZIKV and DENV-2

  3. 3.

    Buried surface areas and surface complementarity in the ZIKV sE dimer–EDE complexes and in DENV-2 sE dimer–EDE complexes

  4. 4.

    Polar and salt-bridge interactions for ZIKV sE–EDE2 A11 Fab, DENV-2 sE–EDE2 A11 Fab, ZIKV sE–EDE1 C8 scFv and DENV-2 sE–EDE1 C8 Fab

  5. 5.

    Polar and salt-bridge interactions for ZIKV sE–EDE2 A11 Fab, DENV-2 sE–EDE2 A11 Fab, ZIKV sE–EDE1 C8 scFv and DENV-2 sE–EDE1 C8 Fab

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.