Rumslig kartläggning av den biologiska effektiviteten hos skannade partikelstrålar: mot biologiskt optimerad partikelterapi | vetenskapliga rapporter

Rumslig kartläggning av den biologiska effektiviteten hos skannade partikelstrålar: mot biologiskt optimerad partikelterapi | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biologiska tekniker
  • strålbehandling

Abstrakt

De fysikaliska egenskaperna hos partiklar som används vid strålterapi, såsom protoner, har väl karakteriserats, och deras dosfördelning är överlägsen fotonbaserade behandlingar. Protonterapi kan dock också ha inneboende biologiska fördelar som inte har utnyttjats. Till skillnad från fotonstrålar varierar linjär energiöverföring (LET) och därmed biologisk effektivitet hos partikelstrålar längs strålbanan. Selektiv placering av områden med hög effektivitet kan förbättra tumörcellsdöd och samtidigt skona normala vävnader. Tidigare metoder för att kartlägga rumsliga variationer i biologisk effektivitet är emellertid tidskrävande och ger ofta inkonsekventa resultat med stora osäkerheter. Därför är de data som behövs för att noggrant modellera relativ biologisk effektivitet för att vägleda nya behandlingsplaneringsmetoder begränsade. Vi använde Monte Carlo-modellering och automatiserade klonogena överlevnadsanalyser med hög innehåll för att kartlägga den biologiska effektiviteten hos skannade protonstrålar med hög noggrannhet och genomströmning samtidigt som biologiska osäkerheter minimerades. Vi fann att förhållandet mellan celldöd, dos och LET är komplexa och icke-unika. Uppmätta biologiska effekter var väsentligt större än i de flesta tidigare rapporter, och icke-linjärt överlevande fraktionsrespons observerades även för de högsta LET-värdena. Förlängning av detta tillvägagångssätt kan generera data som behövs för att optimera protonterapiplaner med variabel RBE.

Introduktion

Intresset för partikelterapi, särskilt protonterapi, har ökat. Antalet behandlingscentra i USA väntas bara fördubblas under de kommande 5–10 åren. Även om de initiala kliniska resultaten är lovande är den snabba expansionen av partikelterapi kontroversiell med tanke på dess höga kostnad och behovet av slumpmässiga studier för att utvärdera de kliniska fördelarna med protonterapi jämfört med standardfoton (röntgen) -baserade behandlingar 1, 2, 3 .

För närvarande drivs det breda intresset för protonterapi av de fysikaliska egenskaperna hos partikelterapi, vilket möjliggör större skonning av normala vävnader från överskott av strålning. De relevanta fysiska egenskaperna härrör från det faktum att protoner och andra laddade partiklar kontinuerligt tappar energi när de går igenom vävnad, med energiförlusten ökar när partiklarna går långsamt. Detta fenomen resulterar i en dosavsättningsprofil i vilken doserna är låga vid ingången till vävnad, högre nära slutet av intervallet och faller till nästan noll plötsligt därefter. Den högsta punkten i dosavsättningskurvan kallas Bragg-toppen. I princip erbjuder dessa fysikaliska dosavsättningsegenskaper för partikelterapi en betydande potential att förbättra det terapeutiska förhållandet jämfört med konventionella strålterapimoder.

Även om de fysiska egenskaperna hos partiklar som protoner är väl förståda, återstår mycket att lära sig om deras unika biologiska effekter. En stor mängd forskning har visat att partiklar i allmänhet har högre relativ biologisk effektivitet (RBE) än fotoner (som per definition har en RBE på 1 när de produceras av Cobalt-60) mot slutet av deras intervall. Denna ökade RBE indikerar att partiklar är mer biologiskt effektiva för att inducera celldöd än fotoner, vilket understryker deras potential för behandling av strålningsresistenta tumörer 4, 5 . Tyngre partiklar, såsom koljoner, har en betydligt högre RBE än fotoner, med typiska värden som sträcker sig mellan 2 och 4 beroende på platsen längs strålbanan 6, 7 . Protoner, som är relativt ljusa partiklar, har en RBE närmare fotonen. I den nuvarande kliniska praxis för protonterapi antas RBE att ha ett generiskt, rumsligt invariant, konstant värde av 1, 1 8 .

Detta antagande har berättigats baserat på många in vitro- och in vivo- experiment som genomfördes under relativt begränsade förhållanden med användning av äldre leveransmetoder (t.ex. höga doser per fraktion, passiv spridning) 8 . Även om många, befintliga experimentella data tenderar att vara inkonsekventa och involvera stora osäkerheter, är en faktor som ofta används för att motivera den fortsatta användningen av medelvärde RBE-värde på 1, 1 9 . Även med höga osäkerheter och inkonsekvenser har många experiment visat att RBE för protonstrålar kan variera avsevärt längs strålbanan och som en funktion av dos, men dessa potentiella variationer i RBE redovisas inte i kliniska behandlingsplaneringssystem 10, 11, 12 . Således kommer begreppet generiskt RBE-värde för protonterapi alltmer att granskas. En djupare förståelse för de unika biologiska effekterna av protoner, i kombination med framstegen inom planering av leveranstekniker, skulle kunna utvidga det terapeutiska indexet för protonterapi avsevärt.

När leveranssättet fortskrider uppstår möjligheten att utnyttja RBE-variationen för både protoner och andra joner. Historiskt sett levererades de flesta kliniska partikelbehandlingar med passiv spridningsteknik, där en tunn stråle sprids i sidled och moduleras i längdriktning för att producera en volym av enhetlig dos, innefattande superposition av flera Bragg-toppar i det som kallas den utspridda Bragg-toppen (SOBP 11) Denna volym formas genom att introducera material i strålen för att anpassa den till målets tredimensionella form. I denna leveransmetod bidrar Bragg-kurvorna med högsta intensitet till största delen av dosen till bildandet av de distala kanterna hos strålarna, som vanligtvis ligger inom normala vävnader utöver måltumörvolymen.

Nyare tekniker använder magnetiskt skannade tunna, orörda strålar ("strålar") av partiklar med sekvenser av energier för att producera dosfördelningsmönster för att planera och leverera den mest avancerade formen av partikelterapi, intensitetsmodulerad partikelterapi (IMPT). IMPT involverar sofistikerade optimeringstekniker för att justera intensiteter och energier av oroliga orörda strålar för att balansera behovet av att leverera maximala doser till tumörmål samtidigt som man maximalt sparar närliggande normala vävnader.

IMPT har potential att utnyttja den högre RBE av protoner eller andra partiklar runt Bragg-toppen genom att företrädesvis placera de mest biologiskt effektiva delarna av strålen inuti målvolymen och borta från normala strukturer. Detta i motsats till nuvarande leveransmetoder, i vilka behandlingen optimeras enbart för att skapa en enhetlig dos i målvolymen utan hänsyn till den varierande biologiska effektiviteten hos partiklarna i strålen. Denna förmånliga placeringsmetod kunde avsevärt öka skillnaden mellan doser till mål kontra normala vävnader. Emellertid kräver införlivandet av variabel RBE i IMPT-optimering att exakta modeller utvecklas för att beräkna RBE som en funktion av dos per fraktion, linjär energiöverföring (LET) och vävnadstyp, vilket i sin tur skulle kräva stora mängder exakt data om RBE . Tyvärr är data för att utveckla dessa modeller begränsade och har varit svåra att få fram på grund av många komplicerade faktorer som tillräcklig tillgång till stråltid, icke-standardiserade bestrålningar, variationer i experimentella tekniker och rapportering samt den stora mängden rapporterade biologiska svar 9, 13

I en nyligen omfattande översyn analyserade Paganetti systematiskt hundratals publicerade klonogena datapunkter för att bestämma en relevant proton RBE 9 . Den översynen uppgav att även om användningen av en RBE på 1, 1 är acceptabel för stora kliniska SOBP: er, stöder litteraturen ökade RBE-värden på 1, 15 i centrum, 1, 35 vid den distala kanten och 1, 7 vid distalt falloff för en SOBP. Lika lika viktigt belyser översynen den stora spridningen av befintlig klonogen data och föreslår ett behov av experimentell protokollstandardisering utöver mer fullständig rapportering av passningsparametrar och fel. Även om tydligare datarapportering är relativt enkel, kommer det ideala experimentella protokollet att krävas optimering på grund av mängden komplicerade faktorer i en klonogen analys bara som kan bidra till den observerade dataspridningen.

I denna rapport beskriver vi vår kombinerade användning av grundläggande partikelfysik och minimering av biologisk osäkerhet för att utforma ett system med hög kapacitet för att förbättra noggrannheten för de förvärvade biologiska data som en funktion av dos och LET. Vi rapporterar preliminära resultat genererade med aktivt skannade monoenergiska protonstrålar som en demonstration av potentialen för en sådan metod. Vi räknar med att denna metod kommer att fortsätta att utvecklas för att tillgodose flera experimentella behov, inte bara för protonbiologi utan också för liknande experiment med andra jonarter.

Resultat

Monte Carlo-baserad design av en anpassad enhet för att kartlägga biologiska effekter exakt och effektivt

De rumsliga energispektra, och därmed LET-spektra, för en terapeutisk protonstråle beror på flera faktorer inklusive infallande energi, SOBP-bredd och mätningsposition i SOBP såväl som den maskinspecifika hårdvara som används för spridning och områdemodulering. Vi jämförde de beräknade energispektra mellan passivt spridda och skannade strålar på tre matchade platser längs strålbanorna och fann väsentliga skillnader mellan de två leveransmetoderna (Fig. 1a – c). De breda energispektra för passivt spridda strålar, särskilt de långa lågenergisvansarna, kan ge betydande osäkerhet i förhållandet mellan biologisk effekt och LET.

(a) Djupdosprofiler för en 79, 7-MeV skannad protonstråle jämfört med en matchad passivt spridd stråle av samma intervall med en 3 cm utspridd Bragg-topp (SOBP) i vatten. (b) Energispektra för protoner vid tre punkter A, B, C i den spridda strålen markerad i panel (a). (c) Motsvarande energispektra för den monoenergiska 79, 7-MeV skannade strålen. (d) Schematiskt diagram över bestrålningsanordningens (jig) -koncept som illustrerar strategin för kolumn-för-kolumn samtidigt bestrålning av biologiska prover i 96-brunnsplattan med protoner vid olika punkter på den orörda Bragg-kurvan. Grå staplar indikerar Lucite; rött, kulturmedium. Den stegade konstruktionen är utformad för att matcha kolumnerna på en 96-brunnars platta och tjänar till att variera position längs Bragg-kurvan, även om endast 9 kolumner visas på bilden och stegdimensionerna inte ska skalas. (e) Dos- och LET-fördelningar i cellskikten, placerade ovanpå jiggen, beräknades med Monte Carlo-simuleringar. De visade relativa dosresultaten normaliserades till ingångsdosen i kolumn 1 i plattan med 96 brunnar. Den LET som visas är dosgenomsnittet LET. De associerade felen för både dos och LET erhölls från en känslighetsanalys av osäkerheter i experimentell installation. Tjockleken på de 12 stegen i jiggen valdes enligt variationerna i dos och LET längs Bragg-kurvan. Kolonn 9 var i linje med Bragg-toppen genom att införa tre filmer med tjocklek 268 um vardera. En exponerad och bearbetad platta med 96 brunnar visas längst ned på panelen för att illustrera dos-LET-effekten av celldöd. (f) Jiggen som är direkt monterad på skanningsbalkens skåp. 96-brunnsplattorna sätts in i en exakt fräst spår i jigghållaren utformad för att minimera positionsfel. Protoner inträffar underifrån.

Bild i full storlek

För att minimera bredden i energin och LET-spektra och för att underlätta korrelationer av biologisk effekt med LET och dos, utvecklade vi ett system med monoenergiska skannade protonstrålar. Eftersom LET ökar som en funktion av djupet längs Bragg-kurvan, först långsamt och sedan snabbt, använde vi Monte Carlo (MC) -simuleringar för att designa en apparat (jig) för att dämpa protonenergi på ett stegvis sätt från händelsenergi till slutet av intervallet (schematiskt illustrerat i fig. ld). Vi valde plattor med 96 brunnar för att möjliggöra samtidig bestrålning av biologiska prover till flera dos-LET-kombinationer och automatiserad plattbehandling. Bestrålningsjiggen designades genom att gruppera de 96 brunnarna i 12 kolumner med 8 brunnar vardera, så att var och en av kolumnerna samtidigt utsätts för en annan kombination av dos och LET, vilket möjliggör förvärv av 12 gånger datamängden från en enda exponering. Alla brunnar i en kolonn är avsedda att erhålla samma dos-LET-kombination (fig. 1e). Den resulterande designen kan betraktas som en växel med flera steg och består av 12 steg. Stegens tjocklek varierar från 0 till ett maximivärde som producerar protoner med ökande LET; de tjockaste stegen bestrålar cellerna med delen av Bragg-kurvan från strax före till strax utanför Bragg-toppen. Jiggen var specialtillverkad från Lucite och fästs direkt in i trosan i skannbalkskåpet. Den biologiska provplattan placeras ovanpå jiggen med strålen riktad uppåt (fig. 1f). Tjockleken på materialet som placerats i protonstrålbanan varierar initialt i stora steg och sedan i allt finare steg när protonområdet slutar närmar sig och vid punkter bortom. Denna metod togs för att öka upplösningen i regioner med hög dos och LET-gradienter. MC-beräkningar indikerade att jiggen inte märkbart förändrade profilerna för energispektra (Kompletterande Fig. 1).

Validering av rumslig noggrannhet och bestrålning av prover

För att verifiera precisionen för jiguppsättningen och strålningstillförsel i förhållande till Bragg-kurvan genererades ett skanningsmönster bestående av 441 fläckar av en 79, 7-MeV protonstråle för att bilda ett 20 × 20 cm 2 fält. Fältet befanns vara enhetligt över ett område av 12 x 13 cm 2, tillräckligt stort för att täcka det biologiska provområdet på 10, 8 × 7, 2 cm2 (fig. 2a & b). De respektive kolumndoserna till ett simulerat cellskikt befanns också ligga inom den statistiska osäkerheten för MC-simuleringarna (± <1%). För att bestämma platsen för Bragg-toppen exponerade vi en bunt med tolv EBT3-filmer (vardera 268 um tjocka) placerade ovanpå en tom 96-brunnars platta insatt i jiggen (fig. 2c). Optisk densitometri-analys avslöjade att platsen för Bragg-toppläget förändrades från film till film beroende på den totala mellanliggande tjockleken. För att tillåta tre mätpunkter i högdoseringsgradientområdet utanför Bragg-toppen, försökte vi att placera toppen i cellskiktet i kolumn 9. Vi fann att toppen var belägen vid kolumn 9 för den fjärde filmen, vilket indikerade att insättning av tre filmer under provplattan skulle ge den önskade växlingen (Fig. 2d). Därefter placerades tre EBT3-filmer under provplattan i alla MC-simuleringar och bestrålningar för klonogena analyser. I närvaro av jiggen varierade dosen över tallrikens kolumner från ingången till toppen med en faktor 5, 5. Två efterföljande valideringstester utfördes med två månaders mellanrum med användning av en kalibrerad klinisk plan-parallell joniseringskammare och jiguppsättningen. Jonkammaren infördes i en Lucite-hållare och bestrålades ovanpå den exakta jig-uppsättningen som skulle användas för framtida bestrålning av biologiskt prov. Den MC-förutsagda dosen och jonkammarmätningen visade sig skilja sig med 0, 35%, vilket ligger inom den förväntade inställningsusäkerheten från vår känslighetsanalys (kompletterande figur 2; kompletterande tabell 2). Denna inställning användes sedan för att bestråla plattor med 96 brunnar med biologiska prover till ett antal ingångsdoser, varigenom en uppsättning prov exponerades för en matris av dos-LET-kombinationer (fig. 1e).

(a) Doseringsprofil längs den centrala längdaxeln i isocenterplanet, resulterande från ett 20 × 20 cm 2 enhetligt avsökningsmönster med 3, 5 cm i full bredd vid halvmaksimala (FWHM) fläckar med avstånd från 1 cm från varandra, mätt med en 1.020 kammare MatriXX-system (IBA I'mRT MatriXX, Schwarzenbruck, Tyskland). Fältbredden mellan dosnivåerna 98% och 100% är 12 cm. (b) Doseringsprofil längs den centrala sidoaxeln i isocenterplanet. Fältbredden mellan dosnivåerna 98% och 100% är 13 cm och ligger längs kolonnens brunnar; likformigheten över 7, 2 cm-omfattningen av de 8 brunnarna i varje kolumn är 99% –100%. (c) Schematisk över den experimentella inställningen för verifiering av intervall. En bunt med 12 EBT3-filmer (vardera 268 um tjock) placerades direkt ovanpå en tom 96-brunnars platta och exponerades. (d) Optiska densitometri-mätningar av enskilda filmer gjorda genom mitten av brunnraderna indikerade att Bragg-toppen var vid brunnskolumn 9 för denna film, den fjärde i bunten. Förutom att verifiera noggrannheten för penetrering av protoner tillät detta experiment oss att bestämma antalet filmer som behövs för att placera en av kolumnerna (nummer 9) vid Bragg-toppen och ha tre mätpunkter i det höga lutnings distala fall-off .

Bild i full storlek

Kartlägga variationer i biologisk effekt med automatiserade analyser med högt innehåll

För att fastställa genomförbarheten av vår strategi och relatera våra resultat till de från historiska studier, använde vi dosmedelvärde LET-beroende cancercellinje klonogen överlevnad som den primära slutpunkten för våra initiala experiment. Vi anpassade screeningtekniker med högt innehåll för högre kapacitet och använde specifika tekniker för att öka noggrannheten för de data som genererats 14 . Vi jämförde först systemet med högt innehåll genom att jämföra klonogena analysresultat erhållna från både det höga innehållet och den traditionella metoden för manuellt att räkna kolonier i 6-brunnars plattor av odlade H460 icke-småcelliga lungcancerceller (fig. 3a & b) . H460-cellinjen valdes för sin exceptionella klonogenicitet och dess fördubblingstid, vilket vi visade sig vara 19 timmar (i överensstämmelse med publicerade värden) 15, 16 . Logfas-H460-celler pläterades in i antingen 96-brunnars plattor (0, 33 cm 2 tillväxtarea per brunn) eller 6-brunnars plattor (9, 5 cm2 tillväxtarea per brunn) från samma stamlösning med en såddäthet av 100 celler per brunn för plattorna med 96 brunnar och ett koncentrationsintervall för plattorna med 6 brunnar. Cellerna fick fästa och normalisera i 8-10 timmar innan de bestrålades. Strålning levererades med en 137 Cs bestrålare. Tre olika passager av cellinjen användes för att beräkna den genomsnittliga överlevande fraktionen (SF) med en enda platta med 96 brunnar vid varje dosnivå för metoden med hög innehåll, eller med 6 replikat för varje dos per experiment för den traditionella metoden. Efter bestrålning fick cellerna växa tills tillräcklig kolonibildning observerades under kontrollförhållandena (5 dagar för systemet med högt innehåll och 10-12 dagar för den traditionella metoden) och fixades och färgades sedan. Poängsättning, antingen genom manuell räkning för den traditionella metoden eller med en IN Cell Analyzer 6000 för systemet med högt innehåll (fig. 3b), visade god korrelation mellan tekniker, med en icke-statistiskt signifikant skillnad mellan kurvorna ( P = 0, 315, extra summa av kvadrater F- test; Fig. 3c).

(a) Som ett riktmärke för vårt system med 96 brunnar jämförde vi kulturer i det formatet, bearbetades och räknades med IN Cell Analyzer 6000, med de i 6-brunnars plattor, räknade manuellt. Karakteristiska bilder av varje platttyp visas. (b) Representativa bilder på en enda brunn som visar bildhantering med högt innehåll. (c) Cellöverlevnadskurvor för individuella plattor med celler odlade i 6-brunnars eller 96-brunnarsystem, exponerade för 137 Cs gammastrålning och värderades genom manuell eller automatiserad bearbetning. Det visade sig att kurvor inte var statistiskt olika mellan teknikerna ( P = 0, 315, extra summa av kvadrat F- test). Felstänger representerar standardfel för medelvärdet (sem). (d) Klonogen överlevnad planerad som en funktion av dos och LET för protonbestrålningsexperiment med H460-celler. Felstaplar för dos beräknades genom känslighetsanalys och SF med sem (e) klonogen överlevnad som en funktion av dos och LET för protonexperiment utförda med H1437-celler. P <0, 0001 för jämförelser av 0, 9 keV / um till ≥10, 8 keV / um, extra summan av kvadrat F- test.

Bild i full storlek

Vi behandlade nästa plattor för exponering för protoner med jiggen. Exponentiellt växande H460-celler togs bort, räknades automatiskt, utspäddes och pläterades i plattor med 96 brunnar. Plattor ympades med 100 celler per brunn från samma stamlösning med användning av en automatiserad tallrik. Efter antingen foton ( 137 Cs) eller protonbestrålning odlades plattorna tills kolonibildningen, vid vilken tidpunkt de färgades och bereddes för avläsning och efterföljande överlevnadsanalys. Resultaten av vårt högt innehåll proton experiment visade att bestrålning med ökande LET resulterade i en markant minskning av cellöverlevnad (Fig. 3d). Denna trend var antingen dold eller inte närvarande vid de lägre LET-värdena i platåområdet för Bragg-kurvan, men den var särskilt uttalad för LET-värden vid och bortom Bragg-toppen (fig. 3d). Datainpassning fann att SF i en dos av 2 Gy (SF2) för H460-cellerna var 0, 40 för den lägsta testade LET (0, 9 keV / um) och 0, 29 för protoner med en LET av 10, 8 keV / um vid Bragg-toppen. Utöver Bragg-toppen, i hög-LET-områden, hittade vi fortfarande lägre SF2-värden på 0, 10 för 15, 2 keV / um, 0, 021 för 17, 7 keV / um och 0, 0037 för 19, 0 keV / um.

Dessa initiala resultat med H460-cellinjen fick oss att ytterligare utvärdera vår metod. För att få högre dosdata använde vi den p53-mutanta NSCLC-linjen, H1437, som är resistent mot apoptos 17 . Ett efterföljande experiment med H1437-celler bekräftade trenden med H460-cellerna (fig. 3e). Beräknade SF2 var mellan 0, 70 och 0, 79 för de låga LET-testade (0, 9 till 5, 1 keV / um), 0, 63 för 10, 8 keV / um, 0, 47 för 15, 2 keV / um, 0, 29 för 17, 7 keV / um och 0, 16 för 19, 0 keV / um med användning av data passar till H1437-datasättet. Tabell 1 innehåller detaljerad information om a- och p-passningsparametrarna och de registrerade RBE-värdena vid 10% SF mot 137 Cs för de klonogena överlevnadsdiagrammen. Plottning av RBE mot LET för de två cellinjerna avslöjade ett olinjärt svar över det testade intervallet där RBE skalades på ett bifasiskt sätt (fig. 4a).

Full storlek bord

(a) RBE vs LET vid 10% SF. En olinjär trend mellan biologisk effekt och LET observerades för båda cellinjerna. RBE-fel beräknades genom att sprida standardfelet för a- och p-passningarna från fig. 3 (kompletterande tabell 1). (b) H460-celler pläterades i glasbotten med 96-brunnarsplattor, bestrålades och behandlades 2 timmar senare för yH2AX-foci-färgning. Representativa bilder visas. Jämförelse av brunnar exponerade för LET och doser på 4, 6 keV / μm, 2, 9 Gy och 17, 3 keV / μm, 1, 7 Gy, den genomsnittliga kärnkraftsfokusen per Gy ökades signifikant i de höga LET-proverna ( P <0, 0001, Mann-Whitney oparad t- test ). Felfält representerar konfidensnivån på 95%.

Bild i full storlek

För att visa användbarheten för det utvecklade systemet för användning med andra analyser än klonogen överlevnad jämförde vi nästa DNA-dubbelsträngsbrottinduktion (mätt som bildning av yH2AX-foci) mellan låg- och hög-LET-regioner i H460-cellerna. Som förutsagt var fler foci närvarande i två LET-regioner 2 timmar efter bestrålning (fig. 4b). Det totala dosmedelvärdena för yH2AX-foci per kärna visade sig vara signifikant lägre vid 3, 57 ± 0, 25 för 4, 6 keV / um protoner mot ett genomsnitt på 7, 02 ± 0, 44 foci per kärna vid 17, 3 keV / um ( P <0, 0001, Mann-Whitney oparat t- test).

Diskussion

Vi fann att en integrerad fysik- och biologi-strategi, i kombination med tekniker med hög genomströmning, kan användas för att systematiskt kartlägga biologiska svar på aktivt skannade protonstrålar som en funktion av dos och LET. När vi utvecklade den här metoden försökte vi minska osäkerhetskällorna samtidigt som vi ökar dataproduktionen.

Klonogena analyser har använts för att bedöma cellulär reproduktiv integritet efter en förolämpning i mer än 50 år 18, 19 . Utvecklingen av den exakta metoden och förståelsen av analysen har gett en rik mängd relevant litteratur att använda. För vart och ett av våra experiment bestämdes odlade cellkoncentrationer med hjälp av en automatiserad cellräknare, och alla plattor ympades med en konstant densitet från en enda stamlösning inom 10–15 minuter av varandra med användning av en automatiserad tallrik. Användning av en enda såddlösning var avsedd att reducera potentiella fel i cellräkning på kolonibildning. Även vid den ideala teoretiska gränsen för cellräkningsnoggrannhet är det tillhörande räkningsfelet för en standardcelllösning ungefär 15% –30% 20, 21 . Enbart detta faktum bidrar med inneboende brus till klonogen data och introducerar sammansatt osäkerhet när antalet celler per dos räknas separat.

Alla cellinjer har inneboende biologiska känsligheter för odlingsförhållanden som kan eller inte kan påverka resultatet av ett klonogent experiment. Vi försökte ta bort eller minimera eventuella förvirrande faktorer från vår kolonialys som följer. Användning av en enda såddlösning per experiment kräver en enda multiplikationskorrigering, i tillämpliga fall 22 . Plätering av celler före bestrålning och tillåtelse för dem att återfästa och återhämta sig från de spänningar som induceras genom plätering höll vårt fokus på effekten av strålning på klonogeniciteten hos exponentiellt växande celler 23, 24 . Såddceller efter bestrålning lägger till faktorer som bidrar till den biologiska slutpunkten, vilket resulterar i ökad osäkerhet. Omedelbar plätering efter bestrålning innefattar särskilt effekterna av cellavskiljning under sådd medan cellerna fortfarande reparerar strålningsinducerad skada 25 . Förutom förankringsberoende signalering och morfologiska förändringar genomgår vidhäftande celler under frigöring, enzymatiska frigöringslösningar, såsom trypsin, klyver membranbundna vidhäftningsmolekyler som fungerar som huvudsignaler i cellspänningssvar, inklusive apoptos 26, 27, 28, 29 . Cellavskiljning efter bestrålning kan ytterligare förväxla bestämning av RBE eftersom fotoner och joner har olika effekter på cellvidhäftning och rörlighet 30, 31, 32 . Som sådan inbegriper omedelbar plåtrutläsningar efter bestrålning kopplingen av strålningsbehandlingen med cellulär återfästning, utom i pläteringseffektivitetskontrollen som används för att bestämma övergripande SF-nivåer. En annan komplicerande faktor för plätering efter bestrålning är det möjliga bidraget av potentiellt dödlig skadareparation till cellöverlevnad beroende på de experimentella förhållandena och tidslinjen 19, 33, 34, 35 . För detta arbete använde vi det minsta antalet räknesteg för en klonogen analys, försökte minimera relativa fel genom att säkerställa utbytbarheten mellan plattformar mellan experiment och avlägsnade komplicerade biologiska processer från avläsningen av kolonibildningen.

Vår metod med hög kapacitet som presenteras här är inte utan sina brister. Den ursprungliga jigkonstruktionen var avsedd att jämnt prova Bragg-kurvan. På grund av den gradvisa ökningen av LET längs ingångsplatån, följt av den snabba ökningen proximal till och precis utanför Bragg-toppen, resulterade den nuvarande jigkonstruktionen i översampling av låga LET-punkter (<5 keV / um) och undersampling av LET i intervallet 5–10 keV / um. Idealt skulle designen av jiggen kunna optimeras för enhetlig LET-sampling. Den ökade genomströmningen som uppnås genom att använda 96-brunnsformatet kostar att begränsa det maximala antalet celler som kan ympas utan väsentlig koloniöverlappning i hög-SF-plattor till cirka 200 14 . Såddensitetsbegränsningen begränsar intervallet av mätbara SF: er, vilket gör uppnåeliga doser cellberoende. Den infrastruktur som krävs för metoden med hög genomströmning är också större än för standardmetoden och kanske inte är allmänt tillgänglig. Påverkan av åskådareffekten på den klonogena analysen är oklar, så vi kan inte kommentera några förväntade skillnadseffekter mellan standard och metod med hög genomströmning 36 .

Även om inga studier har rapporterats som visar en metod för att kartlägga den biologiska effekten av protoner med denna typ av genomströmning, har andra grupper gjort liknande rigorösa undersökningar med traditionella klonogena analyser för att kartlägga kombinerade LET-doseffekter 11, 12, 13, 37 . Som tidigare nämnts är direkta jämförelser mellan studier svåra på grund av skillnader mellan experiment; allmänna observationer kan emellertid göras. Även om nyligen genomförda studier har visat att RBE och LET skalar linjärt, tyder våra resultat på att sambandet mellan LET och biologisk effekt kanske inte är så enkelt 9, 12, 13 . I båda testade cellinjerna ökade RBE snabbt med LET för värden vid och bortom Bragg-toppen (> 10 keV / um), men denna trend minskades för LET: er uppmätt från ingången till den proximala delen av Bragg-toppen (<10 keV / pm). Alla SF-data passar från vårt arbete till den linjär-kvadratiska modellen producerade kurvor med betydande 'sub-letal' (β) komponenter, vilket resulterar i icke-linjära dosresponser även vid de högsta LET: erna (tabell 1). Ubiquitösa kvadratiska komponenter är ovanliga, eftersom ett etablerat kännetecken för SF efter hög LET-bestrålning inkluderar a-dominerade överlevnadskurvor 6, 9, 12, 37, 38 . Denna observation resulterar i ett olinjärt svar mellan RBE och LET (fig. 4a). En möjlig förklaring är att i många tidigare undersökningar bestäms LET-värden som används för att kvantifiera förhållandet mellan RBE och LET genom medelvärde över det breda spektrumet för en passivt spridd stråle snarare än det smala LET-spektrumet för en skannad stråle. Eftersom olika energi- och LET-spektra sammanfaller kan ge samma medelvärde men ändå resultera i väsentligt olika biologiska effekter, kan den dosvärderade LET som används för att uppskatta RBE inte korrelera bra med uppmätta biologiska resultat 39 . Denna medelvärde kan dämpa LET-effekten av celldöd, speciellt i slutet av intervallet för laddade partiklar, där LET har en bred spridning. Till exempel visade MC-simulering i den 12: e kolumnen på plattan i den presenterade installationen ett proton-LET-intervall på 3 till 80 keV / um, vilket resulterade i ett dosvärderat LET-värde på cirka 19 keV / um. Smala LET-spektra bör bidra till att ytterligare belysa förhållandet mellan RBE och LET.

De uppmätta RBE: erna i det distala falloff-området av strålen är avsevärt högre än de som normalt rapporteras i litteraturen såväl som det kliniskt använda värdet 1, 1; sådana värden är emellertid inte okända eller de högsta rapporterade 8, 9, 40 . Våra resultat innebär att utvärderingen av biologisk effekt måste säkerställa en omfattande karaktärisering och antyder att ytterligare studier med metoder med hög precision krävs för att utveckla exakta modeller av biologisk effekt.

Även om tillämpning av resultaten av in vitro- analyser på in vivo- modeller har sina egna komplikationer, är klonogen överlevnad den överlägset mest använda och välkorrelerade cancercellanalysen för tumörkontrollsannolikhet, med väsentliga bevis som visar att förhållandet mellan de två metoderna 9, 41, 42, 43, 44 . Den faktiska översättningen av det presenterade arbetet mot preklinisk utvärdering av en biologiskt viktad behandling in vivo kräver betydande arbete även i den enklaste murina cancermodellen på grund av känslighet för inställningsosäkerheter och anatomins lilla skala. Samtidigt finns ett mycket större kunskapsgap i bedömningen av in vivo normal vävnadsstrålningstoxicitet, där cellulär klonogenicitet är en av många faktorer som påverkar organsvaret och funktionen 45, 46, 47 . För fullständig biologisk optimering måste normala vävnadstoleranser och svar också förstås och kvantifieras i lämpligt biologiskt sammanhang för effektiv modellering.

Medan klonogen överlevnad var den primära slutpunkten i den aktuella studien, kan detta system lätt modifieras för att införliva mer avancerade biologiska metoder och modeller. I synnerhet har 3D-vävnadsodling ett stort löfte om att producera inställningar som bättre rekapitulerar en in vivo normal- eller tumörmiljö med motsvarande vävnadsimitation 48, 49, 50, 51 . Vår metod kan också fungera som en plattform för att undersöka andra mått på biologiskt svar som en funktion av LET, inklusive DNA-skadesvar, cellsignalering eller epigenetiska förändringar. Dessutom kommer anpassningen av andra biologiska modeller, underlättad genom metoden med högt innehåll, att möjliggöra funktionella analyser av överlevande celler, vilket kan vara användbart för att undersöka strålningsinducerade negativa effekter på normala vävnader.

Kliniska undersökningar i Europa och Asien har väckt intresse för användningen av tyngre joner för cancerterapi, med motiveringen att den högre RBE för tunga partiklar kan vara särskilt värdefull för att övervinna resistensen hos sådana tumörer mot fotonbestrålning 5, 52 . De fysiska egenskaperna hos protoner har generellt drivit den globala expansionen av protonterapicentrum, men de inneboende biologiska skillnaderna mellan foton- och protonstrålar har inte aktiverats hittills. LET-värdena för de skannade protonstrålarna i den aktuella studien är måttliga jämfört med de för tyngre joner. Intresset för koljonterapi har ökat eftersom koljoner har högre LET och högre biologisk effektivitet, vilket kan vara användbart för strålningsresistenta tumörer. Emellertid kan de biologiska osäkerheterna förknippade med tunga partiklar vara ännu större än hos protoner. Både de fysiska och biologiska egenskaperna hos protoner och koljoner kanske dessutom inte gör dem till de bästa partiklarna för klinisk användning. Snarare kan mellanpartiklar ha den största potentialen. Att utöka de tekniker som utvecklats här för användning med andra jonkällor (helium, kol, syre) skulle möjliggöra konstruktion av en datamatris som beskriver sambandet mellan dos, LET och biologisk effekt. I samband med datormodellering av fysikaliska egenskaper kan sådana data möjliggöra förutsägelser av den biologiska effekten av andra partiklar, vilket i sin tur kan göra det möjligt att identifiera de mest gynnsamma partiklarna innan den kostsamma konstruktionen av en terapianläggning.

Slutsats

För närvarande, i protonbehandlingsplanering, redovisas inte formell biologisk effektivitet; endast fysiska egenskaper beaktas. Nyare leveransteknologier, såsom punktscanning, tillåter leverans av individuellt heterogena behandlingsfält genom att använda tekniker som IMPT. I princip kan optimering av IMPT innefatta variabel biologisk effektivitet för att producera dosfördelningar i vilka protoner med hög biologisk effektivitet företrädesvis avsätter dos i tumören och de som passerar genom normala vävnader företrädesvis har låg biologisk effektivitet. De väsentliga osäkerheter som är förknippade med befintliga RBE-data kan emellertid utesluta utvecklingen av exakta biologiska modeller för användning i sådana applikationer. Genom att införliva data genererade med system som beskrivs här kan utveckling av mer exakta modeller och optimering av IMPT baserat på RBE vara genomförbart. I teorin kan detta öka den terapeutiska potentialen hos partikelterapi för många typer av cancer.

metoder

Designa en bestrålningsanordning med Monte Carlo-simulering

Vi använde ett kalibrerat och experimentellt validerat MC-system baserat på Geant4 verktygssats för att designa experimentenheten 53, 54 . Tre versioner av Geant4 (9.5.p02, 10.0 och 10.1), med den förpackade FTFP_BERT (version 1.3 och 2.0) fysiklistan, testades och inga skillnader hittades för terapeutiska protonsimuleringar. Egenskaperna hos protonstrålar som kommer in i munstycket (t.ex. energi, vinkel och rumslig spridning) var finjusterade så att den beräknade djupdosen och stråleprofilerna matchade motsvarande uppmätta data 55 . Tjockleken för varje steg i bestrålningsjiggen (fig. 1f) valdes från en 79, 7-MeV punktscanningstrålens djupdos och djup-LET-fördelningskurvor i en Lucite-fantom. Anordningen tillverkades med en fräsmaskin med hög noggrannhet (± 3 um). Den ursprungliga mallen var ett kuboidblock (21 × 19 × 11 cm 3 ) Lucite.

Monte Carlo dos- och LET-beräkningar i biologiska prover

Ett 5 pm cellskikt i varje brunn i plattan med 96 brunnar ansågs vara målet för dos- och LET-beräkningar. Biologisk effekt antas ofta vara en funktion av dosgenomsnittet LET (LET d ), vilket också var fallet i denna rapport. Antalet primära källprotoner sattes till 1, 1x10 9 för att säkerställa att den statistiska osäkerheten i den beräknade dosen och LET-värdena i brunnarna var ± <1%. LET beräknades steg-för-steg i partikelspårningsprocessen. Energiavsättningen e över varje protonsteg l inom cellskiktet fick poäng. På grund av den stokastiska naturen av energideponering genom joniserande strålningar behandlades / / l som en slumpmässig variabel form av LET. Sannolikfördelningen för ε / l bedömdes under simuleringen för att utvärdera den statistiska osäkerheten i LET-beräkningen. Vid beräkning av LET d behandlades e som dosviktningsfaktorn för varje e / l protoner för varje cellskikt. En dynamisk MC-teknik användes för att simulera magnetisk styrning av protonstrålen 56 . Alla MC-simuleringar genomfördes på vårt institutionella högpresterande datorkluster och Lonestar-klustret vid Texas Advanced Computational Center.

Jämförelse av energispektra för att matcha spridda och skannade protonstrålar

För att illustrera vikten av att använda skanningsstrålen i kontrast till den tidigare praxisen med att använda passivt spridda balkar, valde vi en passivt spridd stråle på 120 MeV, som breddades i sidled med spridare för att bilda ett 18 × 18 cm 2 fält och moduleras i längdriktningen med ett områdesmoduleringshjul för att bilda en SOBP 3 cm bred. Slutligen leddes strålen genom områdeskiftaren för att uppnå ett intervall lika med det för den 79, 7-MeV punktscannande strålen som vi använde för biologiexperimenten. Tre punkter i djup på 2, 15 cm, 4, 0 cm och 4, 75 cm (positionerna A, B och C i fig. 1a – c och kompletterande fig. 1) längs strålbanan valdes för att beräkna och jämföra protonens kinetiska energispektra.

Hitachi protonterapisystem

Protonbestrålning gjordes med synkrotronens och strålningssystemet för Hitachi ProBeat (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan) vid Proton Therapy Center i Houston 57 . Detta leveranssystem kan tillhandahålla 94 diskreta energier som sträcker sig från 72, 5 MeV till 221, 8 MeV 55, 58 . Den använder en steg-och-skjuts-skanningsteknik där strålen stoppar vid en specificerad punkt och levererar det angivna antalet monitorenheter och sedan går till nästa position.

Stråleegenskaper och skanningsmönster

Den ovannämnda monoenergetiska avsökningsstrålen med 79, 7 MeV (område 4, 8 cm i vatten och 4, 1 cm i Lucite), med en plats med storleken 3, 3 cm i full bredd-vid-halv-max i luft vid isocenter, användes för protonbestrålning 55 . Ett 20 × 20 cm 2 område skannades enhetligt. Den hade en 12 × 13 cm 2 enhetlig högdosregion för att säkerställa att brunnarna i plattperiferin var tillräckligt långt från penumbra för att påverkas av det laterala fallet vid fältets kanter (fig. 2a & b). Avståndet mellan fläckarna sattes till 1 cm i isocenterplanet. Spotintensiteten kan ställas in på mellan 0, 005 och 0, 04 monitorenheter; Vi valde det maximala värdet för denna studie.

Vi använde rotationsgränsen med strålefall på botten av plattan underifrån för att minimera osäkerheter som beror på variation i tjockleken på vätskeskiktet ovanför cellerna, installationen och spridningen från brunnsväggarna. Olika händelsedosnivåer uppnåddes med användning av flera ommålningar av målplattorna med skanningsmönstren. Händelsedosen per ommålning bestäms genom en kalibreringsprocess som beskrivs nedan. De relativa dosnivåerna per kolonn i plattan med 96 brunnar bibehölls alltid (fig. 1e) för att vara desamma för alla bestrålningsexperiment.

Systemkalibrering och verifiering

Vi kalibrerade systemet med hjälp av en kalibrerad plan-parallell jonkammare bestrålad under referensförhållanden som uteslutte jiggen. Dosen vid det kalibrerade kammarläget under identiska förhållanden beräknades också med MC-simuleringar. Doserna beräknade i brunnar med MC-simuleringar normaliserades till dosen vid referenspunkten. Kalibreringsfaktorn bestämd på detta sätt ledde till leverans av 2, 6 cGy ± 0, 1% per målning (krävande 17, 64 monitorenheter) till cellskiktet i kolumn 1 i närvaro av jiggen. Varje gång innan en uppsättning cellbestrålningsexperiment gjordes, gjordes kvalitetssäkring för att säkerställa att de specificerade dosnivåerna skulle levereras.

Positionering av de experimentella enheterna

Den geometriska inställningen för anordningarna och proverna var identisk för alla experiment. Jiggen, med de tre filmerna ovanpå, sätts in i en hållare, som placeras i den sista nedströms snuten. Snutenänden inställdes på samma värde, 9, 1 ± 0, 1 cm, för varje bestrålning, så att toppen av jiggen, där de biologiska proverna sitter, placerades vid isocenterplanet (verifierat med laserkorsmarkörer från två ortogonala riktningar) .

Känslighetsanalys av osäkerheter i experimentell installation

Lucite-jiggen, tre EBT3-filmer och borrplattbotten utgör de energidämpande komponenterna för protoner före cellskiktet. Följaktligen beror den MC-beräknade noggrannheten för den levererade dosen och LET-värdena på tjockleken, kemisk sammansättning och densitet för dessa material, särskilt för brunnar som ligger nära slutet av strålens område.

Speciellt, med tanke på den geometri vi använder och enhetligheten i bestrålningsfältet, är noggrannheten hos den dos som levereras till proverna okänslig för små förändringar i position i längdriktningen eller i sidled relativt balken. Det är nästan helt och hållet en funktion av precision av tjocklekarna på jiggstegen, brunnplattan, filmerna och noggrannheten i kunskapens materialtätheter och kompositioner. Eftersom vi använde samma jigg och filmer för alla experiment, bidrar de inte till slumpmässiga osäkerheter, men de kan bidra till systematiska osäkerheter. Eftersom jiggen var tillverkad med en hög noggrann fräsmaskin och den leverantörscitaterade osäkerheten i filmtjocklek är mycket liten (kompletterande tabell 2), uppskattades den totala systematiska osäkerheten i dosen vara försumbar. Emellertid verifierades spridningsegenskaperna för jiggen genom att mäta dosen och området för den överförda strålen med filmer och jonkammare och jämföra resultaten med MC-simuleringar.

Eftersom stora antal plattor användes, kunde tillverkningsvariabilitet i tjockleken på brunnsbotten och dess sammansättning bidra med icke-försumbar osäkerhet till dosen i det distala fall-området med hög gradient. Kammer- och MC-simuleringarna bidrog vardera mindre än ± 1% till osäkerheten.

Parametrar som användes för att uppskatta osäkerheter anges i tilläggstabell 2. Den nominella densiteten för jigmaterialet och 96- brunnars plattmaterial sattes till 1, 19 och 1, 09 g / cm3 59, 60 . De uppskattade osäkerheterna, dominerade av den slumpmässiga komponenten, anges i tilläggstabell 3. De högsta osäkerheterna motsvarar högdosgradienten vid den distala kanten.

Den MC-beräknade dosen och LET med användning av det nominella värdet behandlades som medelvärdena (Fig. 1e). Den genomsnittliga avvikelsen från det nominella med nedre och övre inställningsintervall behandlades som osäkerheten i det nominella värdet för att ge osäkerheten i dos- och LET-värden (felstänger i fig. 1e, kompletterande tabell 3). Effekten av osäkerheter på protonernas energispektra i tre av kolumnerna på plattan med 96 brunnar visas i tilläggsfiguren 2.

Biologiskt provberedning, bestrålning och bearbetning

H460 och H1437 NSCLC-celler odlades i RPMI 1640-medium med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin-L-glutamin vid 37 ° C och 5% CO2. Celler räknades med hjälp av en automatiserad cellräknare och ympades i koncentrationer som sträckte sig från 100-2000 celler per brunn för standard 6-brunns klonogen analys och med 100 celler per brunn när 96-brunnsformat användes. Reproducerbarhet av plätering säkerställdes med användning av en BioTek MultiFlo FX Microplate Dispenser för automatiserad och snabb cellplätering. Celler fick fästa och stabilisera i kultur i 8–10 timmar före bestrålning. Plattor fördes in i behandlingsrummet en i taget för bestrålning och återvände omedelbart till kultur efter exponering. Kontrollplattorna hanterades identiskt med behandlingsplattorna men bestrålades inte. Två plattor per dosnivå bestrålades, vilket resulterade i 16 replikat per LET-doskombination. Efter att kolonier bildats (vid 5 dagar för H460-cellerna och 7 dagar för H1437-celler) fixerades cellerna och färgades med 0, 5% kristallviolett i metanol. High-content automated laser confocal analysis with an IN Cell Analyzer 6000 was used to identify viable colonies containing ≥50 cells. Briefly, using a 4 × objective, four overlapping fields per well were obtained and the GE Developer v1.9 software used to create a composite. Colonies and cells were identified with masks generated from object filters. Cells were linked to colonies, and only colonies containing 50 or more cells were scored. The excitation wavelength was 640 nm (red) and the emission wavelength was 706 nm (Cy5). The 4 × lens has a 0.20 numerical aperture. The IN Cell uses a 5.5-Mp sCMOS camera (2560 × 2160 pixels) with a 6.5-µm pixel size. We defined the limit of detection for a clonogenic screen assay as 1 colony per well or an SF of 1/(cells plated*plating efficiency). Dose levels where the aggregate SF was lower than the limit were omitted from analysis. SFs were analyzed by normalizing the number of counted colonies at a given dose by the plating efficiency and by fitting the obtained data to a linear-quadratic model using weighted non-linear regression.

Dose-LET-dependent γH2AX foci formation after proton irradiation was examined by plating cells into a glass-bottom microplate, irradiating them using the high-throughput system, and returning to culture. Two hours after irradiation, cells were fixed with 4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline (PBS). The fixative was removed and cells were washed in PBS 3 times before permeabilization with 0.5% Triton X-100/PBS. Permeabilized cells were then blocked with a 5% goat serum/0.3% Triton X-100/PBS solution. For primary labeling, the cells were incubated with a murine γH2AX antibody (1:1000, clone JBW301, EMD Millipore) in 1% bovine serum albumin (BSA)/0.1% Triton X-100/PBS. Cells were then washed 3 times with 0.1% Triton X-100/PBS and incubated with AlexaFluor 488-labeled goat anti-mouse antibody in 1% BSA/0.1% Triton X-100/PBS (1:1000, Life Technologies). The cells were washed again with 0.1% Triton X-100/PBS before mounting medium was added with the fluorescent dye 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Plates were imaged on an Olympus IX81 microscope using a 40x water immersion objective. The average number of γH2AX foci per nucleus was determined by using CellProfiler (Broad Institute) to identify DAPI-labeled nuclei as image masks and quantify the number of associated γH2AX foci. Images having the same average and median number of foci per nucleus matching the respective condition's overall pooled value were selected as the representative images.

Statistical analyses

Statistical analyses were done using GraphPad Prism 6.0. SF data are shown on a semilog scale as mean ± standard error of the mean. Data were fit using a weighted (1/Y)-nonlinear regression to the linear-quadratic model. The extra sum-of-squares F test was used to compare clonogenic survival curves as a function of LET. The γH2AX foci data are shown as mean ±95% confidence interval. The average numbers of γH2AX foci for each condition were tested for statistical significance by the Mann-Whitney unpaired t test. RBE standard deviations were calculated by propagating the standard error of the α and β fits.

ytterligare information

How to cite this article : Guan, F. et al .Spatial mapping of the biologic effectiveness of scanned particle beams: towards biologically optimized particle therapy. Sci. Rep. 5, 9850; doi: 10.1038/srep09850 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.