Sojabönor reducerar kraftigt plasmakoncentrationerna av valproinsyra: en interaktionsstudie mellan livsmedel och läkemedel | vetenskapliga rapporter

Sojabönor reducerar kraftigt plasmakoncentrationerna av valproinsyra: en interaktionsstudie mellan livsmedel och läkemedel | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Klinisk farmakologi
  • Läkemedelssäkerhet

Abstrakt

Syftet med denna studie var att undersöka effekterna av soja på farmakokinetiken och farmakodynamiken hos valproinsyra (VPA). I en preklinisk studie förbehandlades råttor med två olika mängder sojaxtrakt under fem dagar (150 mg / kg och 500 mg / kg), vilket resulterade i minskningar med 57% respektive 65% i Cmax för VPA. AUC för VPA minskade till 83% och 70% i sojabasbehandlingsgrupperna. Intressant nog var utsöndringsgraden för VPA-glukuronid (VPAG) högre i de sojmatade grupperna. Nivåer av UDP-glukuronosyltransferas (UGT) UGT1A3, UGT1A6, UGT2B7 och UGT2B15 förhöjdes i den sojabehandlade gruppen och GABA-koncentrationerna förhöjdes i hjärnan efter VPA-administration. Detta var emellertid mindre uttalat i förbehandlat grupp av sojaxtrakt än för den obehandlade gruppen. Detta är den första studien som rapporterar effekterna av sojabönbehandling på farmakokinetiken och farmakodynamiken hos VPA i gnagare.

Introduktion

Valproic acid (2-propylvaleric acid) (VPA) är ett antiepileptiskt läkemedel som förbättrar överföring av aminobutyrinsyra 1 i centrala nervsystemet. Valproinsyra används också som en alternativ monoterapi mot litium för behandling av akut mani, cyklotymi, blandad mani 2 och anticancer medel 3 . VPA är tätt bundet till proteiner som ett resultat av låg clearance 4, och VPA-metabolism sker via tre vägar: glukuronidering, ß-oxidation eller cytokrom P450-medierad oxidation, vars senare har ett mindre bidrag till ämnesomsättningen 5 . Valproatglukuronid är den viktigaste urinmetaboliten av valproinsyra och metaboliseras av UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2B7 och UGT2B15 6, 7, 8, 9 .

Den globala konsumtionen av sojabönapreparat (sojabönor, sojabönapasta, sojasås) har ökat stadigt under det senaste decenniet. Sojaisoflavoner kan förhindra hjärt-kärlsjukdom 10 och postmenopausal osteoporos, samt öka benmineraltätheten i ryggraden för att förbättra benstyrkan 11 . Sojaisoflavoner skyddar mot leverskada genom att minska lipidperoxidation i en modell av icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) inducerad av en metioninkolin-brist (MCD) diet 12 . Sojamat kan också bidra till endometrial hälsa 13, 14 och skydda mot prostatacancer, bröst och tjocktarmscancer 15, 16 . Hela sojamat innehåller ett antal bioaktiva isoflavonkomponenter, främst bestående av genistein och daidzein. Sojaisoflavoner har också visat sig minska effekten av tamoxifen 17 . Genistein är känt för att hämma CYP-isozymer CYP1A- och CYP2E-beroende substratmetabolism in vitro 18 . Vidare ökar soja fas II-metabolism för att främja snabbare avgiftning och clearance av potentiellt cancerframkallande mellanprodukter. Sojaprodukter kan också störa levotyroxinersättning 19, warfarin 20 och tamoxifen 21 . Med tanke på dessa interaktioner bör läkemedel med smala terapeutiska marginaler såsom valproinsyra noga övervägas med avseende på soja.

Metabolism och eliminering av valproinsyra påverkas av glukuronidering, främst av uridin 5′-difosfat-glukuronosyltransferaser. På liknande sätt har olika studier visat att sojabönor inducerar UGT-enzymer, viktiga komponenter i glukuronideringen 22, 23 . Därför undersökte vi effekterna av sojabönor på farmakokinetiken och farmakodynamiken av VPA hos råttor i denna studie.

Resultat

Koncentration av VPA i plasma

För att identifiera möjliga interaktioner mellan soja och VPA, utförde vi en analys av plasmakoncentrationer av VPA med användning av råttor förbehandlade med olika mängder sojaxtrakt (150 mg / kg och 500 mg / kg). Förbehandling med soja resulterade i markant lägre plasma-VPA-koncentrationer jämfört med vatten ensam (figur 1). Specifikt minskade VPA C maxvärden till 57% för 150 mg soja och 65% för 500 mg sojabehandlingar. VPA t max och MRT var inte olika mellan behandlingarna. På liknande sätt minskade AUC till 83% respektive 69% för 150 mg / kg respektive 500 mg / kg sojabehandlingar. Clearance ökade med 5% till 34% och distributionsvolymen ökade 70% i sojabehandlingsgrupperna. Det fanns en signifikant skillnad i Cmax, t 1/2, AUC, clearance och fördelningsvolym mellan sojabehandlingen och kontrollgrupperna (tabell I).

Fem dagar efter det att råttor administrerades oralt extrakt av soja vid 150 och 500 mg / kg, 50 mg / kg, VPA injicerades IV och blod isolerades vid de angivna tidpunkterna. Genomsnittliga VPA-koncentrationstidsprofiler efter injektion med en enda iv 50 mg / kg endast med VPA, VPA + Soja 150 mg och VPA + Soy 500 mg (felfält visar SE, n = 9). VPA (

), VPA + soja 150 mg / kg (

), VPA + soja 500 mg / kg (

).

Bild i full storlek

Full storlek bord

Urin VPAG och VPA utsöndring

VPA metaboliseras till en glukuronid för enkel borttagning genom urinen 24 . Därför mätte vi mängderna av VPA och VPAG som utsöndras i urin. Data om utsöndring av VPAG i urin efter administrering av VPA med och utan soja presenteras i tabell II. VPAG-koncentrationen var 1, 67 gånger och 1, 44 gånger högre i 500 mg / kg respektive 150 mg / kg sojagrupper. Figur 2A visar att koncentrationen av VPA i urin minskade mer signifikant i de sojabönbehandlade grupperna jämfört med gruppen behandlad med VPA enbart. Konsekvent var nivån av VPAG som utsöndras genom urin högre i de grupper som sambehandlades med soja (figur 2B), vilket antyder att soja bidrar till den mycket effektiva utsöndringen av VPA genom att förbättra glukuronideringen av VPA.

Full storlek bord

Fem dagar efter att råttor administrerades oralt extrakt av soja vid 150 och 500 mg / kg, 50 mg / kg, VPA injicerades IV och urin isolerades vid de angivna tidpunkterna. Genomsnittlig urin VPA (A) och VPAG (B) koncentrationstidsprofiler efter injektion med en enda iv 50 mg / kg endast med VPA, VPA + soja 150 mg / kg och VPA + soja 500 mg / kg (felstänger visar SE, n = 9. VPA (

), VPA + soja 150 mg / kg (

), VPA + soja 500 mg / kg (

).

Bild i full storlek

UGT-mRNA-enzyminduktion

Sojabehandling rapporterades tidigare att inducera UGT-enzymuttryck i levern 22, 23 . För att förstå mekanismen för VPA och sojainteraktion analyserades UGT-enzymgenuttryck. Förbehandling med soja resulterade i signifikant högre UGT1A3, UGT1A6, UGT2B7 och UGT2B15 nivåer i levervävnaden jämfört med obehandlade råttor. När det gäller UGT2B15 ökades mRNA till 150–200% i sojabönbehandlingsgruppen jämfört med kontrollen (figur 3A). En femfaldig ökning observerades för UGT2B7 när förbehandlad med 500 mg soja jämfört med kontrollgruppen (figur 3B). Intressant nog observerades en tre- till fyrfaldig mRNA-ökning för de sojabasbehandlade grupperna för UGT1A3 (figur 3), medan en tvåfaldig ökning observerades för UGT1A6 (figur 3D). Uppgifterna visade också att en högre dos soja (500 mg / kg) inducerade UGT mer signifikant än den relativt lägre dosen soja (150 mg / kg), som korrelerade med den farmakokinetiska profilen för VPA (figur 1).

Fem dagar efter att råttor administrerades oralt extrakt av soja vid 150 och 500 mg / kg, 50 mg / kg, injicerades VPA iv. UGT2B15 (A), UGT2B7 (B), UGT1A3 (C) och UGT1A6 mRNA (D) analyserades genom realtids PCR-analys.

Bild i full storlek

UGT-enzymaktivitet

Enzymatiska aktiviteter bestämdes med användning av selektiva substrat, CDCA, 4-MUB, AZT och BPA för UGT1A3 25, UGT1A6 26, 27, UGT2B7 28 och UGT2B15 29 . Såsom visas i figur 4 konstaterades den hepatiska mikrosomala enzymatiska aktiviteten hos fyra UGT: er öka i fallet med sojabehandlad grupp jämfört med endast VPA. UGT-glukuronideringsaktivitet konstaterades 2, 0 (CDCA-glukuronid), 2, 5 (4-MUB glukuronid), 1, 8 (AZT-glukuronid) och 1, 6 (BPA-glukuronid) ökning i soja 500 mg förbehandlad grupp jämfört med endast VPA. Resultaten av enzymaktivitetsanalys var i allmänhet överensstämmande med mRNA-bestämningarna (figur 3).

(A) CDCA-24 glukuronid (UGT1A3), (B) 4-MUB glukuronid (UGT1A6), (C) AZT glukuronid (UGT2B7) och (D) BPA glukuronid (UGT2B15) i levermikrosomer från soja förbehandlade och obehandlade råttor. VPA iv injicerades fem dagar efter oral administrering av sojaxtrakt (150 och 500 mg / kg).

Bild i full storlek

VPA- och GABA-koncentrationer i hjärnan

Eftersom GABA är en neurotransmitter som förklarar de farmakologiska effekterna av VPA 30, mättes GABA i denna studie. GABA-koncentrationerna i hjärnan ökades inom 5 minuter efter VPA-injektion och förblev signifikant förhöjda i 12 timmar därefter (figur 5A). I den sojabehandlade gruppen hämmades koncentrationerna av GABA i hjärnan signifikant under hela studietiden; plasmanivåerna av GABA var emellertid inte olika mellan behandlings- och kontrollgrupperna (kompletterande figur 1). För att förstå de ökade koncentrationerna av GABA i hjärnan, mätte vi koncentrationer av VPA. Koncentrationerna av VPA i hjärnan minskade snabbt, medan de hos råttor förbehandlade med soja minskade mer signifikant jämfört med gruppen som fick en enda behandling av VPA (figur 5B). Även om VPA fortfarande var mätbart i plasma 24 timmar efter 50 mg / kg-dosen, föll nivåerna i hjärnan under detektionsgränsen vid den tiden. Dessutom kunde VPAG-metaboliter inte detekteras i hjärnan (data visas inte).

Fem dagar efter att råttor administrerades oralt extrakt av soja vid 150 och 500 mg / kg, 50 mg / kg, VPA injicerades IV och hjärnor isolerades vid de angivna tidpunkterna.

Bild i full storlek

Diskussion

När patienter föreskrivs ett läkemedel med en smal terapeutisk marginal eller lider av ett specifikt patologiskt tillstånd, såsom leverfunktion, kan livsmedelsinteraktioner vara en viktig fråga för patientens hälsa. Enzyminhibering eller -induktion är viktigt för läkemedel som kräver terapeutisk läkemedelsövervakning (TDM), och allvarligheten i livsmedelsläkemedelsinteraktioner beror på det terapeutiska indexet för varje läkemedel. Läkemedelsmetaboliserande enzymer omvandlar lipofila läkemedel till mer hydrofila föreningar för att underlätta eliminering. Våra resultat visar att sojabönbehandling under fem dagar signifikant förändrade plasmafarmakokinetiken för VPA och dess metabolit VPAG. Det har rapporterats att VPA metaboliseras i stor utsträckning av UGT-enzymer, och vi föreslår att den minskade plasmaexponeringen och den ökade Cmax för VPA orsakades av induktion av UGT-metabolism i levern. Vidare indikerar våra nuvarande observationer att koncentrationen av VPAG- och GABA-urin i urin var väsentligt olika mellan kontrollgrupperna och sojabehandlade grupperna. Eliminationen t 1/2 av VPA ökades signifikant i den sojabönbehandlade gruppen. Tillsammans antyder dessa resultat att det finns en interaktion mellan livsmedel och läkemedel för soja och VPA.

Denna studie ger den första direkta in vivo- bevisen på att sojabönor minskar serumkoncentrationen av VPA genom interaktioner. I denna studie liknade de farmakokinetiska profilerna för VPA med en enda behandling liksom resultaten från Yoshioka et al. 31, som visade att soja har en signifikant effekt på Cmax för VPA men inte på t maxvärde (figur 1). Analys av urin utsöndrad 0–24 timmar efter VPA-konsumtion gav en mycket tydligare bild av effekten av soja (figur 2A). Soja hade en markant effekt på utsöndring och därmed absorption av VPA, eftersom det fanns en parallell minskning av koncentrationen av VPA-koncentration i plasma. VPA utsöndras i stor utsträckning som glukuronidkonjugat, vilket svarar för 30-70% av den administrerade dosen 6 . Dessutom visade sig urinutskillnadskoncentrationen i VPAG i vår studie vara högre i sojabehandlingsgruppen (figur 2B). Specifikt var VPAG-bildningen i urin 1, 44–1.68 veck större i sojabehandlingsgrupperna jämfört med den obehandlade gruppen, vilket antyder att glukuronideringsvägen är involverad i mekanismen för interaktion mellan VPA och soja.

UGT: er, den primära enzymfamiljen som var ansvarig för glukuronidering, aktiverades starkt i de soberförbehandlade grupperna. VPA metaboliseras i stor utsträckning i levern, vilket främst sker genom glukuronidering med troliga bidrag av UGT1A6, UGT1A9 och UGT2B7. VPA metaboliseras också av en mindre CYP-beroende oxidationsväg, som inkluderar flera enzymer såsom CYP2A6, CYP2C9 och CYP2C19 32, vilket antyder att VPA i hög grad metaboliseras genom leverenzymvägar. Hitomi Mori visade att aktivering av UGT med antibiotika karbapenem resulterar i minskade VPA-plasmakoncentrationer 24 . Nyligen rapporterades att serumnivån av VPA också sänks genom kombinerad behandling med karbapenem, panipenem och meropenem 33, 34 . Samtidig administrering med orala preventivmedel minskar koncentrationen av VPA, eventuellt till följd av UGT-induktion med etinylöstradiol. Som beskrivits ovan tros induktionen av UGT i allmänhet vara ansvarig för mekanismen för interaktioner med VPA. Vi har visat att UGT-mRNA såväl som aktivitet, som huvudsakligen är ansvarig för metabolismen av VPA, signifikant inducerades av sojabönbehandling under fem dagar (figur 3 och 4). På liknande sätt inducerades UGT hos råttor som matades soja under en och två veckor 35 . Det finns flera andra rapporter som har visat att sojamat ökar UGT-aktiviteten 36, 37, 38 . De viktigaste sojabönspecifika flavonoiderna genistein, daidzein och glycitein svarar för upp till 50%, 40% och 10% av det totala överflödet av sojabönisoflavoner, respektive 39 . Sojaisoflavoner och flavonoider ökar leverens UGT-aktivitet hos gnagare 35, 37 . På liknande sätt har genistein rapporterats inducera UGT-aktivitet 40, 41 . Även om vi inte testade effekterna av varje komponent av sojabönor på UGT verkar isoflavonkomponenterna bidra till läkemedels- och livsmedelsinteraktioner genom induktion av UGT-enzymerna.

I den aktuella studien användes GABA som en farmakodynamisk markör för koncentrationen av VPA. Vi fann att GABA-koncentrationen i hjärnan efter VPA-behandling var lägre i sojabönbehandlingsgruppen jämfört med kontrollgruppen (figur 5A). Även om koncentrationen av VPA minskade kraftigt inom en timme (figur 5B), ökades koncentrationen av GABA kraftigt under hela perioden upp till 12 timmar. Samtidig behandling av soja hämmade kraftigt koncentrationerna av både GABA och VPA i hjärnan. Emellertid observerades ingen signifikant skillnad i serum-GABA-koncentrationer med eller utan soja (kompletterande figur 1). På liknande sätt befanns VPA öka GABA-nivåerna i hela hjärnan och flera hjärnregioner i gnagare 42, 43, 44 . I likhet med den kinetiska profilen för GABA-koncentrationer som observerats i vår studie, visade man sig att GABA-koncentrationer tidigare ökade inom 5 minuter efter VPA-injektion och att förbli signifikant förhöjda i minst 8 timmar därefter 45 . Således indikerar resultaten från den aktuella studien att soja påverkar koncentrationen av VPA, vilket resulterar i en farmakodynamisk effekt på GABA-koncentrationen i hjärnan.

Sammanfattningsvis ger resultaten från denna studie de första bevisen för skillnader i farmakokinetiska och farmakodynamiska effekter efter förbehandling med soja. Vi identifierade sojaxtrakt som en inducerare av lever UGT hos råttor. Tillsammans tyder våra data på att förbehandling med soja inducerar induktion av UGT, vilket resulterar i förändringar i de farmakokinetiska och farmakodynamiska profilerna av VPA. Intagandet av VPA med sojaxtrakt förknippades också med en minskning av biotillgängligheten i VPA, och denna farmakokinetiska interaktion kan leda till en kliniskt signifikant minskning av GABA-koncentrationen. Denna studie föreslår en ny mekanism för att redogöra för soja-inducerade livsmedels-läkemedelsinteraktioner. Ytterligare klinisk studie är motiverad att undersöka de detaljerade konsekvenserna av dessa fynd.

metoder

material

Acetonitril och myrsyra köptes från Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA). Natriumvalproat (VPA, 300 mg / 3 ml ampuller) tillhandahölls av Chonbuk National Hospital. Valproinsyra-B-D-glukuronid (VPAG) köptes från Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Chenodeoxykolsyra 24-acyl-P-D-glukuronid, 3'-Azido-3'-deoxytymidin-P-D-glukuronid och bisofenol En P-D-glukuronid köptes från Toronto forskningskemikalie (Ontario, Kanada). Nonansyra, gamma-aminobutyric acid, ammonium formiat, Uridine 5'-difosfoglucuronic acid trisodium salt (UDPGA), MgCl2, Saccharic acid 1, 4 lactone, chenodeoxycholic acid (CDCA), Azidothymidine (AZT), Bisophenol A (BPA), 4 -metylumbelliferon (4-MUB) och 4-metylumbelliferyl-p-D-glukuronidhydrat köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA). Vatten renades med användning av ett Milli-Q-system från Millipore (Bedford, MA, USA).

Beredning av sojaxtrakt

Sojabönor köptes från en lokal Jeonju-marknad (Sydkorea). Först maldes och pulvriserades bönorna, och det resulterande sojabönapulvret avfettades med petroleumeter och sonikerades två gånger med 1800 ml 95% etanol under 3 timmar vid 50 ° C. Filtraten koncentrerades med användning av en vakuumindunstare vid 50 ° C och pulveriserades genom frystorkning.

Djurbehandling

Sprague-Dawley-hanråttor i åldern 6–8 veckor köptes från Samatako (Deajeon, Sydkorea). Råttorna synkroniserades med en ljus / mörk cykel för att justera dygnsrytmer. Råttor fastades över natten innan experimentet inleddes och tilläts fri tillgång till kranvatten. Råttorna delades upp i tre grupper: råttor i grupp I matades 500 mg / kg sojaxtrakt två gånger dagligen med sondage under fem dagar, råttor i grupp II utfodrades 100 mg / kg sojaxtrakt två gånger dagligen med sondage under fem dagar, och råttor i grupp III matades kontrollen med en lika stor volym vatten under fem dagar. Efter den senaste sojaxtraktbehandlingen avlägsnades tillgången till dieten och endast vatten tillhandahölls. På sjätte dagen injicerades råttor med 50 mg / kg VPA genom femoralvenen.

Djurvård

Alla djurförfaranden utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur godkända av Chonbuk National University Committee of Ethics of Animal Experimentation.

Provtagning av blod och urin

Blodprover uppsamlades vid följande tidpunkter: 0, 0, 083, 0, 25, 0, 5, 0, 75, 1, 2, 4, 8, 12 och 24 timmar efter dosering. Plasmaproverna separerades genom centrifugering vid 2000 x g under 10 minuter, och plasma överfördes till eppendorf-rör och lagrades vid -80 ° C tills de analyserades. Urinprover samlades också varannan timme under 24 timmar.

Kvantifiering av VPA och VPAG i plasma och urin

Kvantifiering av VPA och VPAG i serum och urin bestämdes med HPLC kopplad med masspektrometri. Till ett 100 pl plasma / urinprov tillsattes 100 ul IS och 800 ul acetonitril. Den resulterande lösningen virvlades i 30 sekunder och centrifugerades vid 13 000 x g under 20 minuter. Därefter överfördes supernatanten till ett HPLC-injektionsflaska för injektion. HPLC-separering utfördes på ett Agilent 1100-system (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Kromatografiseparation utfördes med användning av en Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 2, 1 mm inre diameter, 3, 5 um partikelstorlek). Den mobila fasen bestod av lösningsmedel A, 10 mM ammoniumformiat och lösningsmedel B, acetonitril. VPA-, VPAG- och IS-kvantifieringar uppnåddes med användning av negativ jonläge elektrosprayjonisering med multipel reaktionsövervakning (MRM). MRM-övergångarna av m / z 319 till 174, 8 för VPAG, m / z 143 till 143 och m / z 157 till 157 användes för analys.

Kvantifiering av GABA

Hjärnor avlägsnades, vägdes, dissekerades och homogeniserades i triklorättiksyra. Acetaminophen användes som en intern standard. Zorbax-kolumner användes för kvantifiering av GABA. Den mobila fasen A bestod av 0, 1% myrsyra i vatten och den mobila fasen B bestod av 0, 1% myrsyra i acetonitril. De specifika jonerna (m / z) som övervakades var GABA (m / z 104 till 87) och acetaminofen (m / z 151, 7 till 109, 7).

Total RNA-isolering och PCR i realtid

Sex timmar efter IV-injektionen av VPA, skrapades råttor och leverprover extraherades. Cirka 100 mg frusen levervävnad pulveriserades i flytande kväve, och totalt RNA extraherades med användning av Trizol-reagens enligt tillverkarens instruktioner. RNA kvantifierades och renheten övervakades genom spektrometri (Eppendorf Bio Photometer). Uttrycksnivåerna av UGT1A6, UGT1A3, UGT2B7 och UGT2B15 i råttlevervävnader mättes med kvantitativ realtids PCR på en ABI PRISM (Applied Biosystems, NJ, USA). PCR-amplifiering utfördes såsom beskrivits tidigare. Primersparets sekvenser visas i kompletterande tabell I.

Mikrosomberedning

Hepatiska mikrosomer framställdes såsom beskrivits tidigare av Lee et al 46 . Leverprover återsuspenderades i buffert A (250 mM sackaros, 20 mM HEPES, pH 7, 5, 10 mM KCL, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA och 1 x proteasinhibitorkomplex under 30 minuter. Lysaterna homogeniserades sedan och centrifunderades vid 750 × g under 10 minuter vid 4 ° C. Supernanten från de homogeniserade lysaten centrifunderades sedan vid 100 000 × g under 1 timme vid 4 ° C. Levermikrosomer återsuspenderades i 50 mM Tris-HCl, pH 7, 4, innehållande 0, 25 M sackaros och 1 mM ditiotreitol.

Enzym glukuronideringsaktivitet 4-MUB glukuronideringsaktivitet (UG1A6)

UGT-aktivitet med 4-MUB som substrat mättes i mikrosomerna som beskrivits tidigare 47 med användning av molekylär anordningspektra MAX GEMINI EM spektrofluorofotometer. 100 mikrosomala proteiner användes.

CDCA-24 glukuronidering (UGT1A3) och AZT glukuronidering (UGT2B7)

Inkubationsblandningarna bereddes i en total volym 100 | il, enligt följande: råttlevermikrosomer (0, 1 mg), 10 mM MgCl2, 4 mM UDPGA, UGT-specifikt sondsubstrat 67, 5 mikrometer CDCA för UGT1A3 och 100 mikrometer AZT för UGT 2B7. Reaktionen initierades genom tillsats av UDPGA och inkuberingar genomfördes vid 37 ° C i ett skakvattenbad under 60 minuter. Reaktionen avslutades genom tillsats av iskall metanol (100 ul). Inkubationsblandningarna centrifugerades vid 13 000 x g under 10 minuter. Alikvoter (3 mikroliter) injicerades sedan på LC / MS / MS-systemet. Glukuronider producerade från UGT-specifika substrat bestämdes med LC / MS / MS. Separation utfördes på Kinetex C18 (50 x 2, 10 mm inre diameter och 2, 6 um partikelstorlek). Den mobila fasen bestod av lösningsmedel A, vatten och lösningsmedel B, acetonitril, och båda lösningsmedlen innehöll 0, 1% myrsyra. Gradientkörningen startade med 10% lösningsmedel B under 1 min och höjdes sedan till 100% under 6 minuter, där det återstod under 1 min och återgick sedan till 10% B på 10 minuter och hölls sedan under 5 minuter. Flödeshastigheten var 0, 3 ml / min och körtiden var 15 minuter.

BPA-glukuronidering (UGT2B15)

Inkubationsblandningen innehöll BPA 100 μM som ett substrat, mikrosom (0, 2 mg), 10 mM MgCl2, 5 mM UDPGA i en slutvolym på 200 μL. Inkubering utfördes under 30 minuter vid 37 ° C och avslutades genom tillsats av 100 mikroliter 15% perklorsyra och toppning av vertex. Proverna centrifugerades vid 13 000 x g under 15 minuter och supernantanten injicerades i LC-MS / MS-analys. Kromatografiseparation utfördes med användning av en Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 2, 1 mm inre diameter, 3, 5 um partikelstorlek). Gradienteluering med vatten (lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B) med följande betingelser applicerades: 0% B under 1 min, följt av en linjär gradient till 90% B inom 5 minuter och återgå sedan till 0% B på 10 minuter och upprätthölls i 5 minuter. Flödet var 0, 4 ml / min och körtiden var 15 minuter.

En Agilent Technologies 6410 trippel quadrupol-masspektrometer utrustad med elektrosprayjonisering användes. Följande förhållanden användes för analys: kapillärspänning 4 kV, gastemperatur 300 ° C och gasflöde 10 1 / min. Prover analyserades med MRM-läge i negativt joniseringsläge. MRM-övergångarna av m / z 567, 4 till 391, 3 för CDCA-G, m / z 442, 1 till 125 för AZT-G och m / z 403 till 227 för BPA-G användes för analys.

Farmakokinetisk analys

De farmakokinetiska profilerna av VPA erhölls genom icke-avdelningsanalys med användning av WinNonlin version 5.2.1 (Pharsight, Sunnyvale, CA, USA). Området under plasmakoncentration-tidskurvan (AUC) beräknades med den linjära trapesformade metoden. Den maximala plasmakoncentrationen ( Cmax ) och tiden för att uppnå den maximala plasmakoncentrationen ( tmax ) beräknades från experimentdata. Eliminationshastighetskonstanten (Kel) uppskattades genom regressionsanalys från sluttningen linjen med bästa passning, och läkemedlets halveringstid (t 1/2 ) erhölls som 0, 693 / Kel. Dos / AUC-värden användes för att beräkna total plasmaclearance.

Statistiska överväganden

Farmakokinetiska data presenteras som medelvärde ± SD. Resultatens statistiska betydelse analyserades med användning av envägs ANOVA. Statistisk signifikans utfördes vid P <0, 05. * Skillnad mellan endast VPA och VPA plus sojabehandling, P <0, 05.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande data

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.