Sox2 reglerar självförnyelse och tumörgenicitet hos humana melanominitierande celler | onkogen

Sox2 reglerar självförnyelse och tumörgenicitet hos humana melanominitierande celler | onkogen

Anonim

ämnen

  • cancer

Abstrakt

Melanom är en av de mest aggressiva typerna av mänsklig cancer, kännetecknad av förbättrad heterogenitet och resistens mot konventionell terapi i avancerade stadier. Vi och andra har tidigare visat att signalering av HEDGEHOG-GLI (HH-GLI) krävs för melanomtillväxt och för överlevnad och expansion av melanominitierande celler (MIC). Nya rapporter indikerar att HH-GLI-signalering reglerar en uppsättning gener som typiskt uttrycks i embryonala stamceller, inklusive SOX2 ( könbestämmande region Y (SRY) -Box2). Här behandlar vi funktionen av SOX2 i humana melanom och MIC och dess interaktion med HH-GLI-signalering. Vi finner att SOX2 uttrycks starkt i stamceller från melanom. Knockdown av SOX2 minskar kraftigt självförnyelse i melanomsfärer och i förmodade stamceller med melanoom med hög aldehyddehydrogenasaktivitet (ALDH hög ). Omvänt förbättrar ektopiskt uttryck av SOX2 i melanomceller deras självförnyelse in vitro. SOX2-tystnad hämmar också celltillväxt och inducerar apoptos i melanomceller. Dessutom upphäver utarmning av SOX2 gradvis tumörtillväxt och leder till en signifikant minskning av tumörinitierande förmåga hos ALDH- höga MIC vid xenotransplantation, vilket antyder att SOX2 krävs för tumörinitiering och för kontinuerlig tumörtillväxt. Vi visar att SOX2 regleras av HH-signalering och att transkriptionsfaktorerna GLI1 och GLI2, nedströmseffektorerna för HH-GLI-signalering, binder till den proximala promotorregionen för SOX2 i primära melanomceller. I funktionella studier finner vi att SOX2-funktion krävs för HH-inducerad melanomcelltillväxt och MIC självförnyelse in vitro . Således är SOX2 en kritisk faktor för självförnyelse och tumörgenicitet hos MIC: er och en viktig mediator för HH-GLI-signalering i melanom. Dessa fynd kan utgöra grunden för nya terapeutiska strategier baserade på hämning av SOX2 för behandling av en undergrupp av humana melanom.

Introduktion

Melanom är en dynamisk och heterogen hudcancer, med negativa prognoser i avancerade stadier. En stor mängd bevis tyder på att inom den heterogena populationen som utgör ett melanom uppvisar vissa celltyper molekylära och funktionella egenskaper som liknar stamceller. Dessa förmodade melanominitierande celler (MIC) har obegränsad självförnyelse och multilineage-differentieringsförmåga och potential att initiera och upprätthålla tumörtillväxt. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Vidare tros MIC vara resistenta mot både konventionella kemoterapeutiska medel och mot nyutvecklade riktade läkemedel. 10, 11 Även om nyligen genomförda studier har börjat utforska sätt att rikta in sig på MIC, 12, 13, 14 har de molekylära spelarna som är involverade i underhåll av MIC ännu inte identifierats.

Vi och andra har tidigare visat att signalering av HEDGEHOG-GLI (HH-GLI) krävs för melanomtillväxt och stamhet. 7, 15, 16, 17, 18 Under fysiologiska förhållanden främjar Sonic igelkott utvecklingen av multipotenta neurala crest förfäder, 19 från vilka melanocyter härstammar; den modulerar också spridningen av mänskliga melanocyter. 15 På samma sätt reglerar den hjärnstamcellslinjer 20, 21 och hudstamceller. 22, 23 Vidare har HH-GLI-signalering visat sig reglera transkriptionsfaktorn SOX2 (könbestämmande region Y (SRY) -Box2) i flera sammanhang. 24, 25, 26, 27

SOX2 är medlem av gruppen med hög mobilitet domänfamilj som spelar en kritisk roll i embryonal utveckling och i att upprätthålla pluripotency och självförnyelse i embryonala stamceller 28, 29 och flera celllinjer såsom nervceller, 30 osteoblaster 31 och neural crest melanocyter . 32 Hos vuxna möss uttrycks Sox2 i olika epitelrum, i vilka det markerar celler med självförnyelsegenskaper, och dess målinriktade ablation stör dödligt epitelvävnads homeostas. 33 Dessutom är SOX2 en av de viktigaste transkriptionsfaktorerna som kan omprogrammera differentierade somatiska celler till inducerade pluripotenta stamceller (iPS). 34, 35, 36

Nya studier har pekat på en viktig roll som SOX2 i cancer. SOX2 förstärks i esophageal, orala och lunga skivepitelcancer och i småcelliga lungcancer. 37, 38, 39 SOX2 är involverad i flera typer av cancer, såsom glioblastom och osteosarkom, och lung-, bröst-, äggstocks-, pankreas-, prostata- och magcancer 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 och främjar tamoxifenresistens i bröstcancerceller. 49 SOX2 uttrycks i cirka 50% av melanom och endast i en minoritet av nevi. 50, 51, 52 Tystnad av SOX2 har visat sig minska A2058 melanomcelltillväxt in vivo men inte in vitro 50 och reducera melanomcellinvasion. 53 Det är dock för närvarande okänt om SOX2 är avgörande för att reglera MIC: er.

Här har vi grundligt undersökt SOX2: s roll i melanomcellsproliferation, stamhet och tumörgenicitet i en panel av patient-härledda MIC: er och dess interaktion med HH-signalering. Vi visar att tystnad av SOX2 leder till en anmärkningsvärd tillväxtundertryckning och apoptos i melanomceller. Det är viktigt att SOX2-upphävandet försämrar MIC: s förmåga att självförnya in vitro och att initiera och upprätthålla tumörtillväxt in vivo . Vidare finner vi att SOX2 regleras direkt av HH-GLI-signalering och fungerar som en mediator av HH i melanomceller.

Resultat

SOX2-tystnad hämmar tillväxt och inducerar apoptos i primära melanomceller

SOX2- uttryck undersöktes i 19 patient-härledda primära melanomceller, i A375 melanomcellinje och i normala humana epidermala melanocyter (kompletterande tabell S1). Kvantitativ realtid PCR (qPCR) avslöjade variabelt uttryck av SOX2 ; ungefär hälften av de primära melanomkulturerna visade höga / mellanliggande nivåer och halva inget / mycket lågt uttryck (figur la), i linje med tidigare immunohistokemiundersökningar. 50, 51, 52 SOX2- uttryck dokumenterades vid låga nivåer i normala humana epidermala melanocyter. Immunofluorescensanalys avslöjade SOX2-uttryck i kärnorna i primära melanomceller (kompletterande figur S1). Inget signifikant samband hittades mellan SOX2- uttryck och tumorkvalitet eller andra kliniska egenskaper.

SOX2-tystnad undertrycker celltillväxt och inducerar apoptos i primära melanomceller. ( a ) qPCR-analys av SOX2 i en panel med 19 patient-härledda melanomceller, A375 melanomceller och normala humana epidermala melanocyter. qPCR-värden återspeglar Ct-värden efter normalisering med två hushållningsgener ( GAPDH och ß-ACTIN ). ( b ) Western blottinganalys av SSM2c och M26c vidhäftande celler stabilt omvandlade med LV-c, LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2. HSP90 användes som lastkontroll. ( c ) Tillväxtkurvor för SSM2c- och M26c-melanomceller stabilt omvandlade med LV-c, LV-shSOX2-1 eller LV-shSOX2-2. Tre till fem tusentals transducerade celler / brunn pläterades i plattor med 12 brunnar och celler räknades på dag 3, 5 och 7. ( d ) Proliferationsindex uppmätt med CFSE-färgning i SSM2c och M26c melanomceller stabilt omvandlade med LV-c, LV-shSOX2-1 eller LV-shSOX2-2. ( e, f ) SSM2c och M26c celler transducerade med LV-c, LV-shSOX2-1 eller LV-shSOX2-2 analyserades genom flödescytometri för Annexin V + / 7-AAD - (tidig apoptos) och Annexin V + / 7 -AAD + celler (sen apoptos). ( g ) qPCR-analys av NOXA , TP73 , BCL-2 och GADD45A i M26c-celler transducerade med LV-c och LV-shSOX2-1. qPCR-värden återspeglar Ct-värden efter normalisering med två hushållningsgener ( GAPDH och ß-ACTIN ). ( h ) Western blotting-analys av p-yH2AX, p-Chk2 och poly ADP-ribosepolymeras (PARP) i M26c-celler, vilket visade ökad fosforylering av yH2AX vid Ser139 och PARP-klyvning i celler transfekterade med shSOX2 under 48 timmar. HSP90 användes som lastkontroll. Data som visas är medelvärdet ± sem av minst tre oberoende experiment. * P 0, 05; ** P 0, 01 vs LV-c.

Bild i full storlek

SOX2-tystnad har visat sig minska A2058 melanomcelltillväxt in vivo men inte in vitro . 50 För att klargöra dess funktion i melanom slog vi ner SOX2 i patient-härledda melanomceller med höga (SSM2c och M26c) och mellanliggande (M5 och A375 melanomcellinje) SOX2- nivåer med hjälp av två oberoende SOX2-shRNA: er (LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2). SOX2-tystnad ledde till en nästan fullständig förlust av SOX2-protein (figur Ib) och resulterade i en drastisk minskning av antalet livskraftiga celler i SSM2c, M26c (figur 1c), M5 och A375-celler (kompletterande figur S2). Analys av proliferationsindex, bestämt med karboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) -färgning, indikerade att SSM2c och M26c SOX2-utarmade celler växte långsammare än kontrollceller (figur 1d). Cellcykelanalys bekräftade en liten reduktion av celler i S-fas, men inga förändringar i fraktionen av celler i G0 / G1 efter SOX2-knockdown ( P <0, 05 i båda celltyperna; kompletterande figurer S3a och b). Dämpning av SOX2 ökade signifikant både tidig och sen apoptos, såsom visas med Annexin V / 7-aminoactinomycin D (7-AAD) färgning (figur 1e och f). Konsekvent inducerade SOX2-knockdown uttrycket av de apoptotiska markörerna TP73 och NOXA och åtföljande nedreglering av den anti-apoptotiska faktorn BCL-2 (figur 1g). Övergående tystnad av SOX2 inducerad fosforylering av yH2AX och befordrad poly ADP-ribosepolymeras (PARP) klyvning, vilket bekräftar tecken på DNA-skada och apoptos så snart som 48 timmar efter transfektion (figur 1h). Sammantaget indikerar dessa resultat att interferens med SOX2-funktion hämmar melanomcelltillväxt genom att befrämja apoptos och delvis genom att minska proliferationen.

SOX2-uttryck förbättras i melanomceller med stamcellfunktioner

Eftersom tumörsfäranalys tillåter anrikning av potentiella MIC: er, 1, 7, 54, 55, 56 jämförde vi SOX2- uttryck i melanomsfärer och i vidhäftande celler med qPCR. Vi fann att melanomsfärer erhållna från SSM2c och M26c-celler berikades kraftigt i uttrycket av SOX2 jämfört med motsvarande vidhäftande celler (figur 2a). Konfokal mikroskopi i sfärer visade SOX2-proteinuttryck i kärnan i SSM2c och M26c sfärbildande celler, med högre nivåer i en bråkdel av dem (figur 2b).

SOX2-uttryck förbättras i melanomceller med stamcellfunktioner. ( a ) SOX2 mRNA-expressionsanalys i vidhäftande celler och sfärer av SSM2c- och M26c-melanomceller uppmätt med qPCR. Ct- värden normaliserades med två hushållsgener, med värdena i vidhäftande celler likvärdade med 1. ( b ) Konfokala bilder av M26c- och SSM2c-melanom sfärer efter immunmärkning med anti-SOX2-antikropp. Kärnor försämrades med DAPI. Skala bar = 10 μm. ( c ) Western blottinganalys av FACS-sorterade ALDH- låga och ALDH- höga SSM2c- och M26c-celler som visar nivån av SOX2-protein. HSP90 användes som lastkontroll. Kvantifiering av förhållandet SOX2 / HSP90 visas med blått. ( d, e ) qPCR-analys av SOX2 , KLF4 , NANOG och OCT4- expression i FACS-sorterade ALDH- låga och ALDH- höga SSM2c- och M26c-celler. Ct- värden normaliserades med två hushållsgener, med värden i låga ALDH-celler likvärdiga med 1. * P -0, 05; ** P 0, 01.

Bild i full storlek

Som ett alternativt tillvägagångssätt för att analysera SOX2-uttryck i MIC: s sorterade vi melanomceller med hög aldehyddehydrogenasaktivitet (ALDH hög ), vilket har visat sig markera en population berikad för melanomstamceller. 6, 7, 57 SOX2-proteinnivå var 2-3 gånger högre i ALDH-högceller jämfört med ALDH-lågpopulationen i både SSM2c- och M26c-celler (figur 2c). Konsekvent var uttrycket av SOX2- mRNA i ALDH- höga celler 2, 7- och 3, 6-faldigt högre än i ALDH-lågpopulationen, respektive, i SSM2c- och M26c-celler (figurerna 2d och e). Dessutom observerades ökat uttryck av KLF4 , NANOG och i mindre utsträckning OCT4 , som har en roll i upprätthållandet av cancerstamceller (CSC), i ALDH-högpopulationen (figur 2d och e). Sammantaget indikerar dessa data att SOX2 uttrycks starkt i melanomceller med stamcellliknande funktioner.

SOX2 reglerar självförnyelse av stamceller från melanom

Eftersom SOX2 uttrycks starkt i ALDH-högpopulationen (figur 2), som berikas i CSC: er, utvärderade vi om SOX2 var involverad i upprätthållandet av förmodade ALDH- höga MIC: er. För att testa denna möjlighet mätte vi antalet ALDH- höga melanomceller efter SOX2-tystnad. Cytometrisk analys avslöjade en drastisk reduktion i fraktionen av ALDH- höga celler i SSM2c, M26c, M5 och A375 melanomceller transducerade med två olika SOX2-shRNA: er (figur 3a och kompletterande figur S4). Det är viktigt att SOX2-tystnad reducerade självförnyelse av ALDH hög men inte för ALDH- låga sfärer (figur 3b), i överensstämmelse med lägre nivåer av SOX2-uttryck i ALDH- låga celler (figur 2). Knockdown av SOX2 minskade signifikant storleken på ALDH hög och, i mindre utsträckning, av ALDH låga sfärer i både SSM2c- och M26c-celler (figur 3c), vilket antyder en effekt på spridning och / eller död av sfärbildande progenitorceller. Faktum är att analys av bromodeoxyuridin (BrdU) och Annexin V / 7-AAD-färgning indikerade att SOX2-tystnad minskar ALDH: s höga sfärstorlek genom att minska spridningen och genom att öka apoptos (tidigt och sent). Å andra sidan verkade den lilla minskningen av ALDH- låg sfärstorlek vid SOX2-knockdown mest bero på minskad spridning (figurerna 3d och e).

Knockdown av SOX2 minskar antalet och självförnyelse av ALDH-stamceller med högt melanom. ( a ) Kvantifiering av fraktionen av ALDH-högceller, bestämd genom Aldefluor-analys i SSM2c, M26c, M5 och A375 melanomceller transducerade med LV-c, LV-shSOX2-1 eller LV-shSOX2-2. Betydande reduktion i antalet ALDH- höga celler efter tystnad av SOX2 i alla de fyra celltyperna visas. ( b, c ) Antal ( b ) och storlek ( c ) av sekundära sfärer i ALDH- höga och ALDH- låga SSM2c- och M26c-celler efter tystnad av SOX2 med shSOX2-1. ( d, e ) Kvantifiering av inkorporering av BrdU ( d ) och av fraktionen av tidiga (Annexin V + / 7-AAD - ) och sent (Annexin V + / 7-AAD + ) apoptotiska celler ( e ) i ALDH hög och ALDH låga SSM2c och M26c sekundära sfärer transducerade med LV-c och LV-shSOX2-1. Data som visas är medelvärdet ± sem av minst tre oberoende experiment. * P 0, 05; ** P 0, 01.

Bild i full storlek

Som ett alternativt tillvägagångssätt för att testa SOX2: s roll i MIC: er utvärderade vi om moduleringen av SOX2 kan påverka beteendet hos melanomsfärer, som berikas i CSC: er och kan förnyas själv. Intressant nog korrelerade SOX2-uttryck med deras förmåga att bilda primära sfärer i begränsande utspädningsanalyser (kompletterande figurer S5a – c). Alla melanomsfärer som användes i denna studie kan bilda tumörer med hög penetrans när de injiceras i nakna möss (data visas inte) och uttrycker variabla nivåer av melanomstamcellsmarkörer , inklusive ABCB5 , JARID1B och CD271 (kompletterande figur S5d). För att testa SOX2-funktionen i melanomsfärer tystade vi först den. I både SSM2c- och M26c-sfärer reducerade LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2 SOX2-proteinnivåer med 90–95% jämfört med LV-c-kontroll (figur 4a). SOX2-tystnad inhiberade självförnyelse av SSM2c-, M26c-, M5- och A375-sfärer (figur 4b). Dessutom var SOX2-utarmade melanomsfärer betydligt mindre än kontrollerna (figur 4c och d). Knockdown av SOX2 i SSM2c och M26c melanom sfärer reducerade något cellproliferation, bestämd genom BrdU-inkorporering och CFSE-analys (figur 4e och kompletterande figur S6a), och ökad apoptos (figur 4f och kompletterande figur S6b). För att ytterligare bekräfta effekten av SOX2 i melanomsfärer, överuttryckte vi den i M33c-celler, som visar låga nivåer av SOX2 (figur 1a) och i SSM2c-celler. SOX2-överuttryck ökade signifikant antalet sekundära sfärer (figurerna 5a och b) och ökade något melanom sfärstorlek (figurerna 5c och d). Dessutom ökade SOX2 marginellt cellproliferation, bestämd genom CFSE-analys (kompletterande figur S7a), och minskade apoptos (kompletterande figur S7b) av SSM2c och M33c melanom sfärer. qPCR-analys visade att SOX2 inducerade uttrycket av NANOG och OCT4 i båda sfärtyperna och av KLF4 endast i SSM2c-sfärer (figurerna 5e och f). SOX2-överuttryck inducerade uttrycket av BCL-2 och i mindre utsträckning av BCL-XL (figurerna 5g och h). Sammantaget indikerar dessa resultat att SOX2 reglerar självförnyelse och främjar överlevnad av MIC: er.

Tystnad av SOX2 minskar självförnyelse av melanomsfär. ( a ) Western blotting-analys av SSM2c- och M26c-sfärer transducerade med LV-c-kontroll, LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2, vilket visar den nästan fullständiga förlusten av SOX2-protein med båda shRNA: er. HSP90 användes som lastkontroll. ( b ) Minskning av antalet sekundära melanomsfärer efter tystnad av SOX2. ( c ) Mätning av storleken på SSM2c och M26c sekundära melanomsfärer efter transduktion med i LV-c, LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2. ( d ) Representativa bilder av sekundära sfärer som anges i panel ( c ). Skalstång = 150 μm. ( e, f ) Kvantifiering av BrdU-inkorporering ( e ) och aktiverade Caspase-3 + -celler ( f ) i SSM2c och M26c melanom sfärer efter transduktion med LV-c, LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2. Åtminstone 10 oberoende fält av BrdU / DAPI och klyvda Caspase-3 / DAPI-märkta celler räknades per tillstånd. Data som visas är medelvärdet ± sem av minst tre oberoende experiment. * P 0, 05; ** P 0, 01 vs LV-c.

Bild i full storlek

Förbättrad SOX2-funktion ökar stamness i melanomceller. ( a ) Western blotting-analys visar SOX2-expressionsnivåer i kontroll (LV-c) och SOX2-stabilt transfekterade (LV-SOX2) SSM2c och M33c melanomceller. HSP90 användes som lastkontroll. ( b ) Ökning i antalet sekundära sfärer vid SOX2-uttryck. ( c ) Mätning av storleken på sekundära melanomsfärer i LV-c- och LV-SOX2-transfekterade SSM2c- och M33c-sfärer. ( d ) Representativa bilder av sekundära melanomsfärer såsom anges i panel ( c ). Skala bar = 100 μm. ( e - h ) Genuttrycksanalys av SOX2 , KLF4 , NANOG , OCT4 ( e, f ) och BCL-2 och BCL-XL ( g, h ) i LV-c och LV-SOX2 stabilt transfekterade melanomsfärer, mätt med qPCR. Ct- värden normaliserades med två hushållsgener, med värdena i kontroll sfärer lika med 1. Data som visas är medelvärdet ± sem av minst tre oberoende experiment. * P 0, 05; ** P 0, 01 vs LV-c.

Bild i full storlek

SOX2-tystnad reducerar tumörinitierande förmåga hos ALDH- höga melanomceller

För att ta itu med om SOX2-tystnad påverkar förmågan hos ALDH-högmodifierade MIC: er för att upprätthålla tumörtillväxt utförde vi seriella transplantationsanalyser med 10 000 ALDH- höga SSM2c- och M26c-celler transducerade med LV-c, LV-shSOX2-1 eller LV-shSOX2-2. I den första passagen minskade SOX2-knockdown signifikant tumörtillväxt i SSM2c och M26c xenografts jämfört med LV-c (figur 6a – c). I den efterföljande in vivo- passagen förlorade SOX2-utarmade celler sin potential att växa (figur 6a och b). Western blotting-analys bekräftade effekten av SOX2-nedreglering i LV-shSOX2-1 xenografts jämfört med kontrolltumörer (figur 6d). Konsekvent visade immunocytokemi av sektioner erhållna från tumörer dissekerade 40 dagar efter injektion en reduktion av SOX2-proteinuttryck i LV-shSOX2-1-tumörer jämfört med kontrollsektioner (LV-c) (figur 6e, vänsterpaneler). SOX2-utarmade tumörer visade en ökning i antalet apoptotiska celler, vilket avslöjades genom aktiverat caspase-3-immunfärgning (figur 6e, högra paneler), i överensstämmelse med in vitro- data (figur 3 och 4). Emellertid observerades inga förändringar i antalet Ki-67-positiva celler (data visas inte). För att ytterligare utvärdera om SOX2-knockdown skulle kunna påverka tumörinitieringsförmågan utförde vi begränsande utspädningsexperiment genom subkutan injektion av 1000, 100 eller 10 celler från ALDH- höga SSM2c- och M26c-celler transducerade med LV-c eller LV-shSOX2-1. SOX2-utarmade celler vid begränsande utspädning visade kraftigt reducerade tumörtagningshastigheter jämfört med kontrollceller i både SSM2c och M26c xenografts (figur 6f och g). Beräkning av tumörinitieringsfrekvens avslöjade 100- till 20-faldig reduktion i fraktionen av tumörinitierande celler i M26c respektive SSM2c xenografts vid SOX2-tystnad (figur 6h). Sammantaget tyder dessa data på att SOX2 krävs för att initiera och upprätthålla tumörtillväxt.

Tystnad av SOX2 försämrar in vivo tumörinitiering och tillväxt av ALDH-stamceller med högt melanom. ( a, b ) tumörtillväxt in vivo efter två passager av seriell xenotransplantation av FACS-sorterade ALDH- hög SSM2c ( a ) och M26c ( b ) celler transducerade med LV-c, LV-shSOX2-1 och LV-shSOX2-2. För varje grupp analyserades 10 tumörer. ( c ) Representativa bilder av subkutana xenotransplantat i atymiska nakna möss tagna samtidigt för varje grupp. ( d ) Western blotting för SOX2 i SSM2c och M26c xenografts. Observera minskningen av SOX2-immunreaktivitet i LV-shSOX2-xenografts jämfört med kontroll-LV-c, vilket bekräftar effekten av SOX2-knockdown. HSP90 användes som lastkontroll. ( e ) Expression av SOX2-protein och aktiverat Caspase-3 i paraffinsektioner av M26c-xenografts analyserade med immunocytokemi. Sektioner försänkts med hematoxylin (blå kärnor). ( f, g ) tumörtillväxt in vivo efter subkutan injektion av 1000, 100 och 10 FACS-sorterade ALDH- höga SSM2c- och M26c-celler transducerade med LV-c och LV-shSOX2-1. ( h ) Uppskattad tumörinitieringsfrekvens efter fyra oberoende serieutspädning (10 000, 1000, 100 och 10 celler) transplantationsförsök av FACS-sorterade ALDH- höga SSM2c och M26c-celler transducerade med LV-c och LV-shSOX2-1. Skalstång = 10 mm ( c ) och 80 μm ( e ). Data som visas är medelvärde ± sem

Bild i full storlek

SOX2-uttryck regleras av HH-GLI-signalering i melanomceller

HH-GLI-signalering har visat sig modulera SOX2-uttryck i flera sammanhang. 24, 25, 26, 27 Men det är inte känt om HH kan reglera SOX2 i melanomceller. qPCR-analys i 19 patient-härledda primära melanomceller avslöjade en positiv korrelation mellan uttrycket av SOX2 och av de två HH-målen GLI1 och PATCHED1 ( PTCH1 ), den bästa avläsningen av en aktiv HH-väg 58 (figur 7a). För att undersöka om HH kan reglera SOX2 i melanomceller modulerade vi HH-signalering och testade SOX2-uttryck. Hämning av HH-vägen genom att tystna transmembranreceptorn SMOOTHENED (SMO) eller nedströms transkriptionsfaktorn GLI1 avskaffade nästan SOX2-proteinuttryck i SSM2c-celler och reducerade SOX2 mRNA i melanomceller (figurerna 7b och c), vilket föreslår en reglering av SOX2 på transkriptionell nivå. Konsekvent ökade aktivering av HH-signalering genom tystnad av den negativa regulatorn PTCH1 SOX2- mRNA-nivåer, med en starkare induktion i celler med högre endogent SOX2- uttryck (kompletterande figurer S8a och b).

SOX2 regleras av HH-signalering och krävs för melanomcelltillväxt och MIC självförnyelse inducerad genom HH-aktivering. ( a ) Linjär korrelationsanalys av SOX2 med GLI1 och PTCH1- uttryck, mätt med qPCR, i melanomcellinjen A375 och i 19 patient-härledda melanomkulturer, varav 1 är från ett primärt melanom (Prim) och 18 kommer från metastaser (Met). Varje prov representeras av en punkt. Axlar i varje graf representerar uttryckningsförhållandet för gen / (GAPDH och p-ACTIN). Korrelationens omfattning indikeras av R- koefficient. ( b ) Western blotting-analys av SSM2c-celler transducerade med LV-c, LV-shGLI1 och LV-shSMO visar den dramatiska reduktionen av GLI1 och fullständig förlust av SOX2-protein vid hämning av HH-signalering. HSP90 användes som lastkontroll. ( c ) qPCR-analys av SSM2c-celler transducerade med LV-c och LV-shGLI1, vilket visar den drastiska reduktionen av GLI1 och SOX2- mRNA. qPCR-värden återspeglar Ct-värden efter normalisering med två hushållsgener, med värdena i kontrollen lika med 1. ( d ) qPCR-analys av ChIP-experiment visar bindning av GLI1 och GLI2 vid SOX2- promotor (−363 bp till −232 bp) i M26c melanomceller. ( e ) Plats för den förmodade GLI-bindande platsen på SOX2-promotor. Siffror anger positionen för bindningsstället relativt TSS. ( f ) Tillväxtanalys i M26c- och SSM2c-celler transducerade med LV-c, shSOX2-1, shPTCH1 eller shPTCH1 / shSOX2-1, vilket visar att SOX2-tystnad minskar ökningen i melanomcellproliferation inducerad av shPTCH1. ( g ) Analys med självförnyelse som visar att SOX2-ablation förhindrar ökningen av självförnyelse inducerad av shPTCH1 i M26c- och SSM2c-melanomsfärer. ( h ) Representativa bilder på panelen ( g ). ( i ) Proliferationsindex mätt med CellTrace Violet-färgning i SSM2c-sfärer stabilt omvandlade med LV-c, LV-shSOX2-1, LV-shPTCH1 eller LV-shSOX2-1 / LV-shPTCH1. ( j ) Kvantifiering av fraktionen av tidiga (Annexin V + / 7-AAD - ) och sen (Annexin V + / 7-AAD + ) apoptotiska celler i SSM2c-sfärer stabilt omvandlade med LV-c, LV-shSOX2-1, LV -shPTCH1 eller LV-shSOX2-1 / LV-shPTCH1. Skalstång = 100 μm ( h ). Data representerar medelvärden ± sem. Åtminstone tre oberoende experiment utfördes. * P 0, 05; ** P 0, 01.

Bild i full storlek

För att undersöka om transkriptionell reglering av SOX2 av HH-GLI var direkt eller indirekt, använde vi en webbaserad bioinformatisk strategi för att identifiera förmodade GLI-bindande platser i SOX2- promotor. Vi upptäckte en möjlig plats med konsensus GLI-bindande platser vid cirka 300 bp uppströms till SOX2- transkriptionsstartplats (TSS), inom kärnans proximala promotorregion i SOX2 (−528 och +238 från TSS). 59 Kromatinimmunutfällning (ChIP) i M26c melanomceller visade att både endogen GLIl- och GLI2-transkriptionsfaktorer bundna till SOX2- promotor vid cirka 300 bp uppströms om TSS (figur 7d och e).

SOX2 fungerar som förmedlare av HH-GLI-signalering vid reglering av melanomcellsproliferation och MIC-självförnyelse

Våra resultat tyder på att HH-GLI-signalering direkt reglerar SOX2-uttryck i melanomceller. För att undersöka om SOX2 fungerar som en nedströms mediator för HH-signalering vid reglering av melanomcelltillväxt aktiverade vi HH-vägen genom att tystna PTCH1 och slog ner SOX2 i melanomceller. Vi transducerade SSM2c och M26c-celler med LV-shPTCH1, 60, 61 ensam eller i kombination med LV-shSOX2, och vi bedömde spridning. I båda celltyperna ökade shPTCH1 cellantalet jämfört med LV-c, som redan rapporterats. 61 Tystnad av SOX2 minskade drastiskt antalet celler jämfört med LV-c, och det undertryckte ökningen av cellproliferation inducerad genom aktivering av HH-vägen (figur 7f). Dessa resultat stöder hypotesen att endogen SOX2 kan förmedla effekten av aktivering av HH-vägen vid reglering av melanomcellsproliferation.

Vi testade nästa för en möjlig roll av SOX2 för att kontrollera HH-medierad MIC självförnyelse med SSM2c och M26c melanom sfärer transducerade med LV-shPTCH1 och / eller LV-shSOX2. Tystnad av PTCH1 ökade med två gånger antalet melanomsfärer jämfört med LV-c (figur 7g och h), som förväntat. 61 Tystnad av SOX2 minskade antalet och storleken på melanomsfärer, och ännu viktigare, den återförde ökningen i självförnyelse och storlek inducerad av shPTCH1 (figurerna 7g och h, kompletterande figur S9a). SOX2-tystnad minskade något sfärproliferation och avskaffade effekten av aktivering av HH-vägen, såsom visas med proliferationsindexanalys (figur 7i och kompletterande figur S9b). Analys av färgning av Annexin V / 7-AAD indikerade att SOX2-knockdown ökade tidigt och sent apoptos, medan shPTCH1 ökade endast tidig apoptos i en rad (figur 7j och kompletterande figur S9c), vilket tyder på tecken på proliferativ stress. Dessa data antyder att SOX2 medierar, åtminstone delvis, effekten av aktivering av HH-vägen på regleringen av MIC-självförnyelse.

Diskussion

I denna studie beskriver vi för första gången en viktig roll för SOX2 i MIC: er. Vi visar att utarmning av SOX2 reducerar MIC självförnyelse in vitro och gradvis upphäver tumörtillväxt, vilket leder till en signifikant minskning av tumörinitierande förmåga in vivo . Vår studie antyder starkt att SOX2 vid melanom är nödvändigt för tumörinitiering och för tumörunderhåll. Dessutom tillhandahåller vi bevis på att SOX2 är direkt reglerad av transkriptionsfaktorerna GLI1 och GLI2 och att SOX2 fungerar funktionellt som en mediator för HH-signalering för att kontrollera melanomcelltillväxt och MIC självförnyelse.

Den viktigaste upptäckten av vår undersökning är den väsentliga rollen av SOX2 för att upprätthålla melanom stamceller. Detta resultat är i linje med den tidigare beskrivna SOX2-rollen i andra typer av cancer. 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 Våra data antyder att SOX2-uttryck inte bara är begränsat till melanomstamceller utan också är relevant i icke-stamcancerceller, där det krävs för att upprätthålla det proliferativa hastighet av melanomceller som utgör tumörvolymen. Men inte alla melanom är SOX2-positiva; faktiskt finner vi att SOX2 uttrycks i ungefär hälften av melanom, konsekvent med tidigare immunhistokemiska studier. 50, 51, 52 Dessutom visar vi att uttrycket av SOX2 korrelerar med aktivering av HH-vägen, vilket krävs för melanomcellsproliferation och självförnyelse av stamcellceller. 7, 15 Tillsammans antyder våra resultat att i denna delmängd av melanom är en HH – SOX2-axel avgörande för att bibehålla och överleva både tumörbulk och CSC-fack.

De molekylära mekanismerna bakom SOX2-medierad stamhet förblir i stort sett okända. I denna studie observerar vi induktion av NANOG , OCT4 och delvis KLF4 vid SOX2-uttryck. Detta kan vara en direkt transkriptionell effekt inducerad av SOX2 eller förmedlas av det faktum att SOX2 inducerar ett stamcellstillstånd som kännetecknas av uttryck av dessa faktorer. Den senare hypotesen överensstämmer med resultaten att SOX2 kan omprogrammera differentierade somatiska celler för att bli iPS-celler 34, 35, 36 och att SOX2 krävs i flera typer av CSC: er. 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 Dessutom har Sox2 posttranslational modifikationer visat sig påverka dess transkriptionella aktivitet och att samarbeta vid omprogrammering av embryonala fibroblaster till iPS-celler. 62, 63 Melanocyter och melanomceller kan också omprogrammeras till iPS genom kombination av Oct4, Klf4 och c-Myc men i frånvaro av ektopisk Sox2, vilket redan uttrycks i höga nivåer i dessa celler. 64 Förutom SOX2 kan andra stamessrelaterade faktorer vara kritiska för melanom. Till exempel kan OCT4 inducera epitelial dysplasi hos möss 65 och främja dedifferentiering av melanomceller. 66 Reglering av SOX2 genom HH-signalering, som ofta aktiveras i melanom, 15 väcker den utmanande möjligheten att SOX2, tillsammans med andra GLI-mål och stamfaktorer, kan ha en kritisk roll för att bestämma de stamliknande egenskaperna hos MIC: er, som bidrar till förvärvet av ett mer odifferentierat och aggressivt tillstånd genom en process som liknar omprogrammering.

Våra data indikerar att tystnad av SOX2 inducerar apoptos och tecken på DNA-skador i melanomceller och MIC. Dessa data antyder att SOX2 modulerar balansen mellan överlevnad och pro-apoptotiska faktorer. Ytterligare studier behövs för att i detalj undersöka mekanismerna för apoptos inducerad genom förlust av SOX2 och för att undersöka om BCL-2 , NOXA eller GADD45A är direkta transkriptionella mål för SOX2 vid melanom. In support of our data, a recent study identified SOX2-binding regions in BCL-2 , NOXA/PMAIP1 and GADD45A genes using a ChIP-sequencing approach in glioblastoma cells. 67 In previous experiments, it was found that SOX2 knockdown decreases tumorigenicity of A2058 melanoma cells. 50 Our xenotransplantation experiments using patient-derived primary melanoma cells fully confirm this finding. In addition, in our hands SOX2 knockdown also inhibits in vitro growth of primary melanoma cells and of A375 cell line.

HH-GLI pathway has been shown to regulate stemness in several contexts. For instance, ectopic expression of GLI1 in mouse Nestin+ progenitors drives neural stem cell self-renewal and induces the expression of several stemness genes, including Sox2 . 60 Nanog, which has been identified as a direct Hh target in neural stem cells, 68 is also a mediator of HH in glioblastoma cells. 69 Here we present evidence that HH signaling regulates SOX2 expression at transcriptional level and that this regulation might be direct, as suggested by the binding of GLI1 and GLI2 to SOX2 promoter. Interestingly, our results indicate that SOX2 function is required for the maintenance of melanoma cell proliferation and MIC self-renewal induced by the activation of HH signaling, suggesting that SOX2 acts as downstream mediator of HH in melanoma cells. In line with our results, SOX2 has recently been shown to be required in Sonic Hedgehog-associated medulloblastomas. 27 In basal cell carcinoma and tumor-initiating pancreatic cancer cells, HH-GLI and epidermal growth factor receptor signaling integration synergistically activates a number of cooperation response genes, including SOX2 and SOX9 . 25 In addition to being controlled by HH, SOX2 might also directly regulate HH signaling, contributing to create a HH-GLI-SOX2 regulatory loop, as suggested by the binding of Sox2 to the promoter of Shh in mouse developing brain 70 and of GLI2 , GLI3 and SHH in glioblastoma 67 and neural stem cells. 71

Although the possibility to selectively target SOX2 or other oncogenic transcription factors remains a challenge, recent studies began to evaluate new strategies to inhibit SOX2. For instance, a zinc finger-based artificial transcription factor approach has been used in breast cancer cells to selectively suppress SOX2 function 72 and a novel inhibitor of Sox2 DNA binding has been identified. 73 However, these strategies have yet limited use in vivo , and further studies are needed to explore novel approaches to effectively and safely target SOX2 in patients. Our study provides several pieces of evidence for the relevance of SOX2 as a therapeutic target in a subset of melanomas. First, we show that SOX2 silencing reduces proliferation and induces apoptosis in melanoma cells (Figure 1). Second, we demonstrate that SOX2 knockdown inhibits self-renewal and tumorigenicity of MICs (Figures 3, 4 and 6). Third, the HH-GLI signaling, which is active in melanomas and MICs, 7, 15 induces SOX2 expression (Figure 7 and Supplementary Figure S8).

Material och metoder

Patientprover och cellinjer

A375 melanoma cells (CRL-1619) were obtained from ATCC (Manassas, VA, USA) and normal human epidermal melanocytes from PromoCell (Heidelberg, Germany). Human melanoma samples (Supplementary Table S1) were obtained after approved protocols by the Ethics Committee. Fresh tissue samples were digested enzymatically using 1 mg/ml collagenase A and 20 μg/ml DNase I (Roche Applied Science, Basel, Switzerland) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F12 (Euroclone, Milan, Italy) and filtered, and cells were grown in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and epidermal growth factor (5 ng/ml) (Life Technologies, Paisley, UK). The identity of melanoma cells was verified by immunocytochemistry using anti-Melan A, anti-S100 and anti-Vimentin antibodies. 7 For melanoma sphere cultures, SSM2c, M5, M26c, M33c and A375 cells were seeded at a concentration of 5000 cells/ml either in DMEM/F12 serum-free medium with N2 supplement, 20 μg/ml insulin, 10 ng/ml epidermal growth factor and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (Life Technologies) or in human embryonic stem cell medium, as previously described. 1, 7 Puromycin (Sigma, St Louis, MO, USA) was used at 2 μg/ml.

RNA interference and lentivectors

Lentiviruses were produced in HEK-293T cells as previously reported. 60 Lentiviral vectors were pLKO.1-puro (LV-c) (Open Biosystems, Lafayette, CO, USA), pLKO.1-puro-shSOX2-1 (LV-shSOX2-1) targeting the 3′ untranslated region of SOX2 (targeting sequence 5′-CTGCCGAGAATCCATGTATAT-3′), pLKO.1-puro-shSOX2-2 (LV-shSOX2-2) targeting the coding region of SOX2 (targeting sequence 5′-CAGCTCGCAGACCTACATGAA-3′) and pSin-EF2-Sox2-Pur (LV-SOX2) (plasmid 16577, Addgene, Cambridge, MA, USA). pLKO.1-puro-shGLI1 (LV-shGLI1), pLKO.1-puro-shSMO (LV-shSMO) 7 and pLV-CTH-shPTCH1 (LV-shPTCH1) 60, 61 were previously described.

Self-renewal assay

For self-renewal assay, cells were transduced with LV-c, LV-shSOX2-1, LV-shSOX2-2 and LV-shPTCH1 lentiviruses or stably transfected with LV-SOX2 and let to form spheres. Primary melanoma spheres were dissociated and plated either in 96-well plates at 1 cell/well or in 12-well plates at 1 cell/μl dilutions. After 1 or 2 weeks, secondary spheres were counted. 7, 61 All the experiments were performed in triplicate and repeated at least three times.

Aldefluor assay, proliferation index and apoptosis

The separation of cells with high and low ALDH activity (ALDH high and ALDH low ) was performed using the Aldefluor kit (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) as already described. 7

For proliferation index experiments, cells were labeled with 10 μ M CFSE or CellTrace Violet (Life Technologies), seeded and allowed to proliferate for 48, 72 and 96 h and analyzed using flow cytometry. Data were normalized to controls arrested at the parent generation with 1ug/ml mitomycin C ( t =0 h), and proliferation index was calculated using the ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). For apoptosis analysis, cells were exposed to serum-deprived conditions, and apoptosis was measured after 48 h using an Annexin V–phycoerythrin/7-AAD apoptosis kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA).

BrdU incorporation assay and immunostaining

BrdU pulses in melanoma spheres were performed for 8 h (4 μg/ml). Spheres were plated on DMEM/Matrigel (1:40) (BD Biosciences) to allow attachment, fixed with 4% paraformaldehyde and processed as previously described. 60 For apoptosis, spheres were immunolabeled with a rabbit anti-cleaved Caspase3 (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA), followed by an anti-rabbit fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody. For SOX2 immunofluorescence, spheres were immunolabeled with a rabbit anti-SOX2 antibody (AB5603; Millipore, Billerica, MA, USA) and with an anti-rabbit fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody. Formalin-fixed paraffin-embedded sections were subjected to antigen retrieval (with citrate buffer pH 6.0), incubated with rabbit anti-SOX2 antibody (AB5603; Millipore) and rabbit anti-cleaved Caspase3 (Cell Signaling Technologies) and visualized using UltraVision Detection System (Lab Vision, Fremont, CA, USA) and diaminobenzidine (Dako, Carpinteria, CA, USA).

qPCR

Total RNA was isolated as already described. 61 Reverse transcription was performed with High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). QPCR amplifications were carried out at 60 °C using Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) on a 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) and analyzed by delta-C t method using GAPDH and β-ACTIN as housekeeping genes. Primersekvenser listas i kompletterande tabell S2.

Western blotting

Cells were lysed as previously described. 61 The following antibodies were used: rabbit polyclonal anti-SOX2 (AB5603) (Millipore), rabbit polyclonal anti-GLI1 (Ab49314) (Abcam, Cambridge, MA, USA), mouse anti-HSP90 (Heat Shock Protein 90) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), rabbit anti-phospho-γH2AX (Ser139), rabbit anti-phospho-Chk2 (Thr68), and rabbit anti-poly ADP-ribose polymerase (Cell Signaling Technologies). Chemiluminescent detection was used.

Chip

M26c cells were fixed with 1% formaldehyde and lysed. DNA was sonicated and diluted with ChIP Dilution Buffer, and Input Material (IM) (5%) was collected. Chromatin was incubated overnight at 4 °C with Dynabeads Protein G (Life Technologies) pre-conjugated with anti-GLI1 antibody (N-16) (Santa Cruz Biotechnology), anti-GLI2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) or a non-specific IgG control. DNA was purified, and qPCRs was carried out at 60 °C using Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies). ChIP primers are displayed in Supplementary Table S2.

Mouse xenograft assays

Six- to 8-week-old female athymic-nude mice (Foxn1 nu/nu) (Harlan Laboratories, Udine, Italy) were injected subcutaneously in lateral flanks with 10 000, 1000, 100 and 10 FACS (fluorescent-activated cell sorter)-sorted ALDH high patient-derived SSM2c and M26c melanoma cells transduced with LV-c, LV-shSOX2-1 or LV-shSOX2-2. For serial transplantation, primary tumors were dissected, dissociated and FACS-sorted ALDH high cells were re-injected. Cells were suspended in Matrigel (BD Biosciences)/DMEM (1/1) before inoculation. Animals were monitored daily, subcutaneous tumor size was measured every 2–3 days by a caliper (2Biological Instruments, Varese, Italy), and tumor volumes were calculated using the formula V = W 2 × L × 0.5, where W and L are, respectively, tumor width and length. Statistical analysis of tumor take was performed using the ELDA Web-based tool (//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/). 74

Statistisk analys

Data are presented as mean±sem for at least three independent experiments, unless otherwise stated. Statistical analysis of the data was performed by a two-tailed Student's t -test. * P 0.05; ** P 0.01.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

  3. 3.

    Kompletterande figur S3

  4. 4.

    Kompletterande figur S4

  5. 5.

    Kompletterande figur S5

  6. 6.

    Kompletterande figur S6

  7. 7.

    Kompletterande figur S7

  8. 8.

    Kompletterande figur S8

  9. 9.

    Kompletterande figur S9

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)