En somatisk pirnaväg i drosophila fettkroppen säkerställer metabolisk homeostas och normal livslängd | naturkommunikation

En somatisk pirnaväg i drosophila fettkroppen säkerställer metabolisk homeostas och normal livslängd | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • homeostas
  • Piwi-RNA
  • Transposition

Abstrakt

I gonadala vävnader bevarar den Piwi-interagerande (piRNA) -vägen genomisk integritet genom att använda 23–29 nukleotid (nt) små RNA komplex med argonauta proteiner för att undertrycka parasitiska mobila sekvenser av DNA som kallas transposerbara element (TE). Även om nyligen tyder på att piRNA-vägen kan vara närvarande i utvalda somatiska celler utanför gonaderna, är rollen som en icke-gonadal somatisk piRNA-väg inte väl karakteriserad. Här rapporterar vi en funktionell somatisk piRNA-väg i den vuxna Drosophila- fettkroppen inklusive närvaron av piRNA-effektorproteinet Piwi och kanoniska 23–29 nt långa TE-kartläggande piRNA. Piwi- mutanterna uppvisar utarmning av fettkropps-piRNA, ökad TE-mobilisering, ökade nivåer av DNA-skador och minskade lipidlagrar. Dessa mutanter är svältkänsliga, immunologiskt komprometterade och kortlivade, alla fenotyper associerade med kompromitterad fettkroppsfunktion. Dessa fynd visar på närvaron av en funktionell somatisk piRNA-icke-gonadväg i den vuxna fettkroppen som påverkar normal ämnesomsättning och total organisatorisk hälsa.

Introduktion

Transponerbara element (TE) parasiterar DNA från deras värdar och står för en stor del av eukaryota genom 1, 2 . För att bekämpa invasionen och utvidgningen av TE, har små RNA (smRNA) tystnadsvägar utvecklats för att undertrycka TEs över arter från växter till människor 3 . Den korta störande RNA-vägen undertrycker TEs i alla vävnader av växter och djur, medan aktiviteten för den Piwi-interagerande RNA-vägen (piRNA) -vägen antas vara primärt begränsad till gonaderna av metazoner 4, 5 . Förlust eller minskning av dessa vägar resulterar i genomisk instabilitet och cellulär dysfunktion orsakad av TE-reaktivering och transposition 6, 7, 8, 9 .

PiRNA-vägen är bäst känd för sin roll i gonadala vävnader där den skyddar mot genomisk skada orsakad av TE-reaktivering 4, 5 . Vägen tystar TEs genom att använda komplementära små RNA som kallas piRNA, genererade från stora TE-rika genomiska regioner som kallas piRNA-kluster. I flugor transkriberar dessa kluster långa enkelsträngade RNA-prekursorer som sedan bearbetas ytterligare till mindre 23–29 nukleotid (nt) piRNA. Dessa piRNA: er samarbetar med argonaute effektorproteiner (Piwi, Aubergine eller AGO3) som sedan kan tystna TEs via sin homologi till TE-transkript 4, 10 . Denna process genomförs med en av två tystnadsmekanismer. I den primära piRNA-vägen, som är aktiv i både könslinje och somvariska somatiska follikelceller, undertrycker Piwi TE-transkription genom att etablera heterokromatin 5, 11 . I den sekundära piRNA-vägen, aktiv endast i groddlinjen, tystnar Aubergine och AGO3 TEs transkriptionellt i cytoplasma via messenger-RNA-klyvning 4, 5, 10 . Även om rollen som piRNA-vägen tidigare antogs vara begränsad till gonaderna, tyder nyligen på bevis i en mångfald av organismer att denna väg också kan finnas i somatiska celler utanför gonaden 12 .

Under det senaste decenniet har nya bevis börjat avslöja icke-gonadala exempel på piRNA-vägen inklusive en roll för piRNA-vägen i stamcellsfunktion 12 . I planaria är piRNA-vägproteiner väsentliga för att bibehålla stamcellens pluripotens såväl som regenererande förmågan hos dessa djur 13 . piRNA-vägkomponenter är aktiva i flera typer av cancer 12, inklusive specifika cancer i däggdjur och flugor 12, 14, 15, 16, 17, 18, och i flugor har piwi visat sig bidra till malig tumörtillväxt 19 . Mindre information är tillgänglig för en roll av piRNA-vägen i normala differentierade somatiska vävnader, även om bevis för aktiviteten för den sekundära piRNA-vägen i specifika neuroner i den vuxna flughärnan har rapporterats 20 . När fler icke-gonadala exempel på ett aktivt RNA-interferenssystem upptäcks verkar det som om piRNA-vägen kan ha andra viktiga roller utöver dess kända funktioner i gonadal vävnad.

Här visar vi närvaron av en funktionell somatisk piRNA-väg i den vuxna flygfettkroppen. PiRNA-vägen i fettkroppen uppvisar alla de kanoniska egenskaperna hos en primär piRNA-väg och undertrycker aktivt TE-mobilisering i denna vävnad. Vi observerar att förlusten av denna sökväg korrelerar med försämrad fettkroppsfunktion och förkortad livslängd. Dessa fynd visar en ny roll för piRNA-vägen utanför gonaderna i en helt differentierad somatisk vävnad.

Resultat

Fettkroppen uppvisar komponenter i en intakt piRNA-väg

Med tanke på de senaste bevisen på att piRNA-vägen också kan vara aktiv i utvalda icke-gonadala somatiska celler 12, undersökte vi uttrycket av piRNA-vägsgener utanför gonaderna. Vi fann att undersökning av RNA-sekvenseringsbibliotek (RNA-seq) -bibliotek från vuxna fluga eviscererade buken, men inte huvuden eller bröstkorgen, hade signifikant anrikning av generna av piRNA-vägar relativt andra somatiska kroppssegment (fig. 1a, kompletterande fig. 1 och kompletterande Dataset 1). Immunofluorescerande mikroskopi visade specifik lokalisering av Piwi-proteinet till kärnorna i vuxna buk- och pericerebrala fettkroppsceller, men inte till cellerna från celler från andra vävnader utanför gonaderna eller i fettkroppar av homozygota piwi-nollmutanter (fig. 1b). Immunoblotting av isolerat renat fettkropp, bröstkorg och huvud visade också närvaron av Piwi-protein i fettkroppen (fig. 1c och kompletterande fig. 2). Närvaron av Piwi-protein i fettkroppen antyder möjligheten till en intakt piRNA-väg i denna vävnad.

( a ) Uttryck av primära och sekundära gener av piRNA-vägen genererade från totala RNA-sekvensbibliotek av huvud, bröstkorg, eviscererad buk och äggstock. piRNA-vägarna uttrycks mer kraftigt i den tappade buken än i huvudet eller bröstkorgen. Datavärden för äggstocksbibliotek som överskrider plottområdet visas ovanför varje relevant fält. RPKM, läser per kilobas per miljon. Felfält representerar sem; n = 3 replikera bibliotek. Vid jämförelse av den eviscererade buken med huvud- och bröstkontroller är 10 av 11 gener (exklusive tj ) statistiskt signifikanta ( P <0, 0001). Se kompletterande databas 1 för statistik. ( b ) Piwiprotein lokaliseras till kärnorna i bukfettkroppsceller. DAPI märker fettkärnkärnor. Färgning i membranet är autofluorescens typisk för fettkroppsceller. Skalstänger representerar 20 μm. ( c ) Piwi-protein finns i fettkroppen. Alla piRNA-argonauter finns i äggstocksproverna. Actin fungerar som en lastkontroll. ( d ) SmRNA-profil med fet kropp från oxiderade smRNA-sekvensbibliotek. Oxidation möjliggör anrikning av 2'- O- metylerade smRNA. Topp vid 21 nt representerar troligen en kort störande RNA (siRNA) -population. Bredare topp från 23 till 29 nt representerar förmodade piRNA för fettkroppar. Läser som är anpassade till rRNA och miRNA utesluts från analys. ( e ) Fettkropps-piRNA (23–29 nt) anpassade till flyggenomkarta främst till TEs. ( f ) Sekvenskomposition av TE-kartläggande fettkropps-piRNA (23–29 nt) visar en första position nukleotidförspänning för uracil.

Bild i full storlek

Aktiverade piRNA i funktionella piRNA-dämpningskomplex är 2'- O- metylerad vid deras 3'-terminaler och kan berikas selektivt och detekteras med användning av periodatoxidation 4, 21 . Vi hittade en bred piRNA-liknande topp av smRNA som sträckte sig från 23 till 29 nt i oxiderade små RNA-seq (smRNA-seq) -bibliotek från ren vuxen bukfettkropp (Fig. 1d), vilket tyder på närvaron av piRNA med 2'- O -metylering vid deras 3'-terminaler, vilket är typiskt för gonadala piRNA: er aktivt laddade i ett piRNA-argonaute-komplex 22 . Av de oxiderade fettkropps-piRNA: erna, kartlades 49% (23–29 nt smRNA) till TEs (fig. 1e) och dessa läser uppvisade en stark antisense-förspänning (kompletterande fig. 3a) och en kanonisk första position nukleotidförspänning för uracil 10 (Fig. . 1f), vilket indikerar att de sannolikt har kapacitet att rikta TE-transkript för tystnad. Oxiderade smRNA-bibliotek från renade bukfettkroppar från två avlägsna besläktade drosofilider, Drosophila simulans och Drosophila yakuba (kompletterande fig. 3b), visade också 23–29 nt piRNA som mappades till TEs (kompletterande fig. 3c – f) med antisense TE-kartläggning av piRNA som uppvisar en stark uracilförspänning i första positionen (kompletterande fig. 3 g, h), vilket visar att piRNA för vuxna fettkroppar bevaras över olika drosofilidarter. Tillsammans tyder dessa data på närvaron av fettkropps-piRNA som uppvisar kanoniska piRNA-egenskaper, är associerade med ett aktivt piRNA-argonaute tystnadskomplex och bevaras evolutionärt.

PiRNA-fettvägen undertrycker TE

Därefter undersökte vi om fettkroppens piRNA-bana uppvisar kanoniska kännetecken för en aktiv piRNA-väg. Förlust av Piwi i gonadala vävnader resulterar i en dramatisk reduktion av piRNA och en återpression av deras motsvarande TEs 11, 23 . I fettkropparna hos piwi-nollmutanter observerade vi en signifikant ökning av transkriptionsnivåerna för flera TEs och en motsvarande minskning av deras associerade piRNA (fig. 2a och kompletterande fig. 4). Totala piRNA minskade också (28, 1% minskning) liksom TE-kartläggning av piRNA (70, 5% minskning) (Fig. 2b, sidopanel). Vi använde en reporter för transposition för det endogena gypsy retrotransposon ( gypsy-TRAP ) 9, 24, ett känt mål för Piwi i äggstocken 25, för att upptäcka transposition i fettkroppsceller och fann att piwi- mutanta fettkroppar visade signifikant högre nivåer av zigenare transposition i förhållande till kontrollerna (fig. 2c). Tillsammans visar dessa data att en somatisk piRNA-väg aktivt undertrycker uttrycket och mobiliseringen av TEs i vuxna fettkroppsceller.

( a ) Värmekarta för log 2- faldig förändring av TE-transkriptnivåer (total RNA-sekv)> 1, 2-faldig förändring och motsvarande piRNA (smRNA-seq) i piwi- mutant ( piwi - / - ) jämfört med heterozygot kontroll ( piwi - / + ) fettkroppar; n = 3 replikera bibliotek. * False upptäcktsfrekvens (FDR) <0, 05. ( b ) SmRNA-storleksprofil för fet kropp från oxiderade smRNA-sekvensbibliotek av piwi- mutanta fettkroppar (röd) och heterozygota kontroller (svart). Visade är totala smRNA: er (överst), TE-kartläggning av smRNA: er (mitten) och 3′UTR-kartläggande smRNA: er (botten). Paneler till höger visar nivåer för 23–29 nt smRNA för varje genotyp. ( c ) En fet kroppspecifik transportrapporteringsrad , gypsy-TRAP / r4-GAL4 :: UAS-GFP , i en piwi- mutant bakgrund (se Metoder). GFP-positiva celler är celler där en transponeringshändelse har aktiverat reporterfunktion. De 10 dagar gamla piwimutanterna visar förhöjda nivåer av GFP-positiva celler jämfört med heterozygota kontroller. Bilderna är av representativa flugor som uppvisar höga, medelhöga och låga nivåer av GFP-positiva celler (vänsterpaneler). Skalstänger representerar 150 μm. Panelen till höger visar fördelningen av flugor för varje grupp efter genotyp; siffror inom varje stapel är motsvarande procenttal för varje grupp. Fishers exakta test jämförde de kombinerade "Höga" + "Medium" -grupperna och "Låg" -gruppen för varje genotyp. piwi - / + : n = 140 flugor; piwi - / - : n = 142 flugor; P <0, 0001. ( d ) Vikningsförhållande av unikt kartläggande klusterpiRNA i piwimutanter jämfört med heterozygota kontroller. Flamenco- klustret visar det största svaret på förlust av piwi . ( e ) Unik piRNA läser (23–29 nt) karta till flamenco locus i vildtyp (wt) och piwi heterozygoter och går förlorad i piwimutanter . ( f, g ) Unik piRNA läser (23–29 nt) karta till tj - genkroppen i wt- och piwi- heterozygoter och går förlorad i piwi- mutanter. Tjocka linjer i genmodell ( g ) representerar kodningssekvens, och tunna linjer representerar 5 'och 3'UTR. Se kompletterande databas 2 för rådata.

Bild i full storlek

Det är känt att piRNA: er som riktar sig och undertrycker TEs i ovarievävnader kommer från genomiska regioner som kallas piRNA-kluster 10 . Kartläggning av fettkropps-piRNA till tidigare annoterade fluga-piRNA-kluster visade att många kartlägger till flamenco- klustret, vilket är känt för att vara specifikt för somatiska follikelceller (fig. 2d, e) 10, 11 . I överensstämmelse med studier av ovariella follikelceller 10, 11 tappades piRNA-mappningar till flamenco i fettkropparna hos piwi- mutanter (fig. 2d, e). Dessa data stöder vidare närvaron av en funktionell fi-kropps piRNA-bana där piRNA produceras från somatiska piRNA-kluster parar med Piwi för att undertrycka TEs som den primära piRNA-vägen gör i äggstocksfollikelceller 10, 11 .

Tidigare studier på flugor har visat att primära piRNA också härrör från de 3 ′ otranslaterade regionerna (UTR: er) i kodande gener 26, 27 . Vi observerade att 17% av fettkropps-piRNA från det oxiderade fettkroppsbiblioteket mappades till kodande gener (fig. 1e) och att 3′UTR-senskartläggande piRNA tappades i piwimutanter (17, 5% minskning; fig. 2b, sidopanelen) . Dessa 3'UTR-härledda piRNA: er är mellan 78% ( piwi - / + ) och 87% (vikt) senskartläggning, vilket förväntas av geniska piRNA: er (kompletterande fig. 5a). Fettkropps-piRNA som mappats till 3′UTR för trafikstockning ( tj ), en känd källa för geniska piRNA i äggstocksfollikelceller 26, 27, tappades i piwi- mutanter (fig. 2f, g och kompletterande databas 2) tillsammans med andra 3 ′ UTR-härledda piRNA: er (kompletterande fig. 5b – e och kompletterande databas 2). Tillsammans ger dessa data bevis på 3′UTR-härledda genetiska piRNA-fettkroppar, ett annat kännetecken för den primära piRNA-vägen.

För att utesluta möjligheten att piRNA med fettkroppar är resultatet av förorening av äggstocksvävnader under dissektion och biblioteksförberedelse utförde vi smRNA-sekvens på oxiderade fettkroppsbibliotek isolerade från ovo D1- flugor. På grund av en dominerande kvinnlig-steril mutation i ovo- genen uppvisar dessa flugor svårt degenererade äggstockar, vilket således avsevärt minskar sannolikheten för att eventuella piRNA isolerade från fettkroppen hos dessa djur skulle bero på kontaminering från ovarievävnader. Vi observerade i både vildtyp och ovo D1- fettkroppar 23–29 nt smRNA som kartlades unikt till flamenco- lokuset (Kompletterande figur 6a, b), vilket antyder att piRNA som observerats i oxiderade fettkroppsbibliotek verkligen härstammar från denna vävnad och inte ett resultat av äggstockskontaminering. Dessutom demonstrerar immunoblotting närvaron av Piwi-protein i den eviscererade buken och den isolerade fettkroppen hos ovo D1- flugor (kompletterande figur 6c). Dessa data, i kombination med vår observation av Piwi-proteinet i kärnorna i fettkroppsceller (fig. 1b och kompletterande fig. 2), stöder starkt närvaron av en funktionell kanonisk piRNA-väg i fettkroppen.

DNA-skada och metabolisk dysregulation hos piRNA-mutanter

Den replikerande rörligheten hos TEs kan bidra till mutagenes via deras förmåga att infoga i nya genomiska loci 6 . TE-reaktivering och transposition har visats korrelera med kromosomala omarrangemang, dubbelsträngade DNA-brytningar och apoptos 7, 8 . Fosforylering av histonvarianten H2A.v (y-H2A.v) under DNA-reparation tjänar som en pålitlig markör för dubbelsträngade DNA-brytningar och har visat sig korrelera med ökad TE-aktivitet i fettkroppen 9, 28 . Med användning av immunofluorescerande mikroskopi observerade vi en ökning av intensiteten av y-H2A.v-färgning i piwi- mutanter i förhållande till kontrollerna (fig. 3a, b). Dessa data antyder att fettkroppens piRNA-väg normalt skyddar fettkroppsceller från ansamlingen av DNA-skador som kan orsakas av TE-reaktivering.

( a ) Representativa bilder av y-H2A.v-färgning i piwi- mutanter och heterozygota kontroller. piwi- mutanter uppvisar högre nivåer av y-H2A.v-färgning jämfört med heterozygota kontroller. Skalstänger representerar 20 μm. ( b ) Kvantifiering av y-H2A.v-färgning i ( a ). piwi - / + och piwi - / - : felstaplar är sem Studentens två-svansade t- test jämfört med heterozygot kontroll; n = 104 kärnor per genotyp. * P <0, 0001. ( c ) Representativa bilder av nollröd färgning av fettkroppslipiddroppar i piwi- mutanter och heterozygota kontroller. piwi- mutanter uppvisar mindre lipiddroppar i förhållande till heterozygota kontroller. Skalstänger representerar 20 μm. ( d ) Kvantifiering av lipiddråpsfärgning i ( c ). piwi - / + : n = 6 flugor, piwi - / - : n = 5 flugor. Se kompletterande databas 3 för rådata. ( e ) Boxdiagram som visar distribution av lipiddroppar> 200 μm 2 från ( d ) jämför piwi- mutanter med heterozygota kontroller. ( f - i ) Mätningar av helkroppsvuxna fluga TAGs ( f, g ) och glykogen ( h, i ) av piwi ( f, h ) eller flamenco ( g, i ) mutanter jämfört med heterozygota kontroller. Data normaliserades till total proteinkoncentration för varje prov och representerade som en procent av den heterozygota kontrollen. Felfält är sem För varje analys är n = 5 biologiska replikat per genotyp. Studentens två-tailed t- test jämfört med heterozygot kontroll. * P <0, 01; ** P <0, 001. Alla analyser utfördes med 10 dagar gamla flugor.

Bild i full storlek

Fluefettkroppen är en funktionell analog av däggdjurslever och fettvävnad, varvid en av dess primära roller är lagring av lipider och glykogen 29 . Vår iakttagelse av att piwi- mutanta fettkroppsceller visade ökad TE-mobilisering och förhöjda nivåer av DNA-skador (fig. 2c och 3a, b) ledde till att vi antagit att detta skulle kunna leda till störande fettkroppsfunktion. Nilröd färgning av fettkroppens lipiddroppar avslöjade en minskning av lipiddråpsstorleken hos piwi- mutanter jämfört med kontroller, med större lipiddroppar (> 200 μm 2 ) avsevärt minskade i deras överflöd (Fig. 3c – e och kompletterande databas 3). Dessa data korrelerar med en signifikant reduktion av två av de viktigaste lagringsmetaboliterna i fettkroppen, triacylglycerider (TAG) och glykogen, i både piwi- och flamenco- mutanter (fig. 3f – i och kompletterande fig. 7a, b). Nästa frågade vi om dessa fenotyper korrelerade med ett förändrat fettkroppstranskriptom eftersom transkription av TEs enbart kan orsaka RNA-toxicitet och bidra till cellulär dysfunktion 8 . Vi genererade RNA-seq-bibliotek från piwi-mutant- och kontrollfettkroppar och fann att många differentiellt uttryckta gener i metabolismassocierade vägar ändrades signifikant (kompletterande figur 7c). Dessa data stöder en modell där en förlust av funktionen av piRNA-vägen resulterar i en minskning av lipider och lagrade metaboliter, störning av metabolisk homeostas och en minskning av cellfunktionen, möjligen på grund av reaaktivering av TEs.

piRNA-mutanter visar förändrad fettkroppsfunktion och livslängd

Fluefettkroppen spelar en viktig roll i att motstå stressfaktorer som fasta och, genom sin roll i medfödd immunitet, i att motstå patogena infektioner 29 . Vi observerade att piwi- mutanter var mycket känsliga för svältförhållanden såväl som infektion med en patogen insektbakterie (fig. 4a, b och kompletterande tabell 1). På grund av den centrala roll som fettkroppen spelar för att reglera livslängden 30, 31 undersökte vi nästa effekten av att störa piRNA-vägen på livslängden. Vi fann att mutationer i antingen piwi eller flamenco locus dramatiskt förkortar livslängden (fig. 4c, d och kompletterande tabell 1). Slutligen testade vi om den förkortade livslängden för mutanter av piRNA-vägen var beroende av TE-aktivitet. Många TEs i Drosophila är retrotransposoner, inklusive zigenare , och beror på omvänt transkriptas för deras replikerande rörlighet 32 . Administrering av en känd omvänt transkriptasinhibitor, 3TC, hämmar den normala åldersrelaterade ökningen av zigenarmobilisering och förlänger den förkortade livslängden för Dcr-2- mutanter, ett annat tillstånd där degpression av TEs uppstår 9 . Vi administrerade 3TC till flamenco- mutanter och observerade en signifikant livslängdsförlängning (fig. 4e och kompletterande tabell 1), vilket antydde att en förkortad livslängdsfenotyp är åtminstone delvis beroende av TE-mobilisering. Dessa resultat tyder på att förlust av fettkroppens piRNA-väg och en ökning av TE-aktivitet och mobilisering korrelerar med komprometterad fettkroppsfunktion inklusive dess förmåga att på annat sätt mildra de skadliga effekterna av miljöstressorer.

( a ) Överlevnadskurvor för svält av piwi- mutanter och heterozygota kontroller. piwi- mutanter är mer känsliga för svält än heterozygota kontroller. Loggningstest jämfört med heterozygota kontroller; n ≈50; P <0, 0005. ( b ) Överlevnadskurvor för immunutmaning av piwi- mutanter och heterozygota kontroller. piwi- mutanter är mer känsliga för infektion än heterozygota kontroller. Flugor infekterades antingen med en hålig EtOH-kontroll (-) eller en odling av E. carotovora (+). Log rank-test jämfört med heterozygot eller hålig EtOH-kontroll (-); n ≈50; P <0, 0005. ( c ) Överlevnadskurvor för piwi- mutanter och heterozygot kontroll. piwi- mutanter är kortare levande jämfört med heterozygota kontroller. Wilcoxon rank sumptest jämfört med heterozygot kontroll; n ≈250; P <0, 0005. ( d ) Överlevnadskurvor för flammutanter och heterozygot kontroll. flammutanter är kortare levande jämfört med heterozygota kontroller. Wilcoxon rank sumptest jämfört med heterozygot kontroll; n ≈250; P <0, 0005. ( e ) Överlevnadskurvor för flammutanter matade 10 mM 3TC. flammutanta flugor som matas med 3TC lever längre än obehandlade kontroller. Wilcoxon rangsummatest jämfört med kontroll; n ≈250; P <0, 0005. Se kompletterande tabell 1 för analysparametrar och statistik. Alla analyser upprepades två gånger med liknande resultat.

Bild i full storlek

Diskussion

Här har vi visat bevis för en fullt funktionell piRNA-väg i en icke-gonadal somatisk vävnad, den vuxna fluganfettkroppen, som troligen kommer att vara nödvändig för korrekt vävnadsfunktion och total organisatorisk hälsa. Dessa resultat visar att piRNA-vägen för vuxna fettkroppar uppvisar kanoniska egenskaper som finns i gonadala somatiska celler, och dess aktivitet påverkar troligen positivt funktionen hos en vävnad som är viktig för metabolisk homeostas och fysiologisk hälsa. Även om vi inte helt kan utesluta ett bidrag från den gonadala piRNA-vägen till fettkroppsfunktion, är många av de fenotyper som vi observerar motsatta de som vanligtvis ses hos djur med försämrad gonadal vävnadsfunktion och representerar därför sannolikt effekten av en förlust av den feta kroppens piRNA-väg. Exempelvis visar den förkortade livslängden och reducerade lipidlagrar i piRNA-banvägsmutanter att piRNA-vägen är väsentlig för hälsan och funktionen i somatiska vävnader som inte är gonadala, eftersom reduktion eller ablation av gonadal funktion i flugor ofta förlänger livslängden och ökar lipidlagren snarare än minskande livslängd och fettlagring 31 . Nyligen genomförda studier av vildtypflugor har också visat en viktig koppling mellan TE-aktivitet och livslängd 9, och våra studier som visar delvis räddning av den förkortade livslängden hos flamenco- mutanter vid administrering av en omvänd transkriptionsinhibitor stödjer ytterligare denna förening.

Intresset för en funktion för piRNA-vägen i soma har ökat nyligen när nya roller för den här vägen belyses. PiRNA-banans förening med vävnader som upprätthåller en grad av odödlighet som liknar den som visas i groddlinjen är av särskilt intresse 12 . Exempelvis upprätthåller de somatiska stamcellnischerna hos Hydra en aktiv piRNA-väg som undertrycker TE, eventuellt bidrar till den organismens anmärkningsvärt långa livslängd 33 . Dessa studier, tillsammans med våra resultat, antyder att närvaron av en piRNA-väg i normala somatiska vävnader kan ge ett ytterligare cellförsvar mot TE-reaktivering och möjlig somatisk genomisk skada. Vårt upptäckt av en roll för piRNA-vägen för att bevara metabolisk homeostas och den övergripande hälsan hos flugan antyder den potentiella betydelsen av piRNA-vägen i andra somatiska vävnader. Slutligen kan ingrepp som specifikt förstärker piRNA-vägen ge betydande fördelar för att upprätthålla genomisk integritet, vävnadsfunktion och hälsosam livslängd.

metoder

Flygbestånd och jordbruk

Drosophila- bestånd upprätthölls alla på standardmedier (30, 5 g l - 1 autolyserad jäst, 121, 8 g l - 1 sackaros, 52, 3 g l - 1 majsmjöl, 8, 75 g l - 1 agar och 2, 62 g l - 1 tegosept, alla viktprocent) vid 25 ° C med en 12-timmars ljus / mörk cykel vid 60% relativ fuktighet. Såvida inget annat anges, samlades flugor som användes i alla experiment under en 48-timmarsperiod, placerades i täthetskontrollerade flaskor med blandat kön och åldrades under 10 dagar på mat innehållande 150 g 1 - 1 autolyserad jäst, 150 g - 1 sackaros och 20 gl - 1 agar, alla viktprocent. Om inte annat anges utfördes alla experiment med parade honflugor odlade under dessa betingelser.

Labbestånd av Canton S eller w 1118 användes för vildtypsexperiment. flam KG / FM4 (Bloomington 16453) erhölls från Bloomington Drosophila Stock Center vid Indiana University. Lager av D. yakuba och D. simulans tillhandahölls av Drosophila Stock Center vid University of California, San Diego. Reporterlinjen för pypi-mutantfett- gypsy-TRAP genererades från gypsy-TRAP- linjen tillhandahålls av Joshua Dubnau 24, r4-GAL4 (Bloomington 33832), UAS-GFP (Bloomington 1522) och piwi 2 / CyO- linjen från Haifan Lin. ovo Dl- mutanter som saknade äggstockar genererades genom att korsa hanar av ovo Dl ( ovo Dl v 24 / C (1) DX, y 1 w 1 f 1 ) (Bloomington 1309) till jungfruliga kvinnor från Kanton S.

RNA och smRNA-seq-bibliotekspreparat

Flugor frystes på torr is och segment av huvud och bröstkropp dissekerades på ett 20 ° C kallblock och lagrades vid -80 ° C. Uppsatta buken och rena fettkroppar för vuxna dissekerades från bukväggen i kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lagrades också vid -80 ° C.

Totalt RNA extraherades från relevanta fluevävnader med användning av mirVana miRNA Isolation Kit (ThermoFisher Scientific AM1560). För preposition av RNA-seq-bibliotek användes 100 ng totalt RNA som input för Ovation Universal RNA-seq System-kit (Nugen 0343), med Drosophila ribosomal RNA (rRNA) -utarmningsmodul, enligt tillverkarens instruktioner. Tre biologiskt oberoende bibliotek gjordes för varje vävnad. För smRNA-seq-bibliotek oxiderades 2 μg totalt RNA i 25 mM natriumperiodat med 30 mM borax och 30 mM borsyra (pH 8, 6) under 30 minuter vid rumstemperatur (Phillip Zamore Lab Illumina TruSeq Small RNA Cloning Protocol April 2014 ; //www.umassmed.edu/zamore/resources/protocols/). RNA utvanns sedan med RNA Clean & Concentrator-5-kit (Zymo Research R1015) och användes som input till NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set för Illumina (New England Biolabs E7300), med modifieringar anpassade från 34 (2S rRNA block oligo tillsattes före 5'-ligeringssteg för att minska rRNA-läsningarna i det slutliga biblioteket).

Tissue RNA-seq

Läsningar mappades till dm3 genom genom att använda Tophat. Bioconductor R-paketet easyRNASeq användes för att räkna läsningar (med användning av 'genModels' sammanfattningsparameter) och beräkna normaliserade läsningar per kilobas per miljon (RPKM) -värden. De fel som presenteras representerar sem med tre oberoende biologiska replikat för varje tillstånd. De falska upptäcktshastighetsvärdena i kompletterande databas 1 beräknades med användning av Bioconductor edgeR-paketet, med en GLM-korrigering för batcheffekter som beskrivs i vinjetten.

smRNA-storlekar och nukleotidförspänning

Oxiderade små RNA-bibliotek trimmades först av adaptorsekvenser med användning av cutadapt och justerades sedan mot Drosophila rRNA-sekvenser med användning av Bowtie för att avlägsna rRNA-justeringsläsningar. För cirkeldiagram anpassades läsningarna först till dm3-genomet, varvid endast läsningar var i linje. Läsningar mappades nästa efter varandra till följande genomiska fack med användning av Bowtie (−v 1): sno + tRNA, microRNA (miRNA), TEs, exons och intergeniska regioner (alla sekvenser laddas ner från FlyBase, förutom TEs som kom från Repbase). Läsningar som anpassades till varje fack räknades för att skapa ett diagram.

För totala små profiler av RNA-storlek (se till exempel fig. 1d) togs först miRNA med hjälp av Bowtie (−v 1), och återstående läsningar matades därefter in i ett Perl-skript som räknade antalet läsningar för varje olika längd mellan 18 och 50 nukleotider. För storleksprofiler för TE-kartläggningsläsningar (kompletterande fig. 2) anpassades läsningarna till uppsättningen Repbase Drosophila konsensussekvenser med användning av Bowtie (−v 1 −k 1 - bäst), och sorterades till förnuft / antisense (med avseende på TE) använder samtools. Justeringar konverterades sedan tillbaka till FASTQ-filer med hjälp av sängkläder och storleksprofiler beräknades såsom beskrivits ovan. För D. simulans och D. yakuba cirkeldiagram och storleksprofiler utfördes analys enligt beskrivningen med användning av relevanta genomiska fack för varje art som laddats ner från Flybase. För transponerbara element användes uppsättningen för alla transponeringar från Drosophila- arter från Repbase.

För beräkningar av nukleotidförspänning konverterades 23–29 bp TE-kartläggande antisense-justeringar till FASTA-format med hjälp av sängkläder och EMBOSS, trimmades till en enhetlig längd på 23 bp med FASTX-verktygssats och användes som input för WebLogo 3-programmet 35 .

TE och kodande genanalys

För att korrekt redogöra för RNA-seq-läsningar med flera kartläggningar vid analys av TE: er använde vi RepEnrich-metoden 36 för att kvantifiera läsantal för varje TE. Detta tillvägagångssätt kombinerar alla instanser av varje antecknad TE i genomet och räknar en läsning om den anpassar sig till någon av dem minst en gång, vilket tillåter korrekt kvantifiering av läsningar som annars skulle kasseras på grund av mappning till flera platser. Läs räknatabeller från RepEnrich behandlades med edgeR-paketet för att utföra normalisering och beräkna log 2- faldig ändring. För små RNA-seq-bibliotek justerades avläsningarna med hjälp av RepEnrich och räkningarna normaliserades med användning av unika anpassningar till cisNATs och strukturerade loci, såsom beskrivs i ref. 11. Logg 2- faldiga ändringar ( piwi - / - / piwi + / - ) beräknades med hjälp av normaliserade läsantal. TEs med RNA-seq log 2- faldiga förändringar> 0, 263 (1, 2 × gånger ökning) i piwi- mutanter jämfört med heterozygota kontroller plottades på värmekartan tillsammans med motsvarande piRNA-seq-förändring för varje element. Värmekartor genererades med gplots-paketet i R.

För att skapa TE-justeringsprofiler (kompletterande fig. 4) mappades läsningar unikt till den relevanta TE Repbase-konsensussekvensen med hjälp av Bowtie (−v 1 −m 1). Läsdjupet över TE-konsensussekvensen bestämdes med användning av genomecov-kommandon för sängkläder, med användning av totala unika kartläsningar i biblioteket för att normalisera för skillnader i biblioteksstorlek. Tomter skapades i R.

För normal kodande genanalys användes edgeR för att bestämma differentiellt uttryckta gener vars uttryck signifikant förändrades i totala RNA- sekvensbibliotek i piwi- mutant fettkropp relativt heterozygota kontroller. Sedan utförde vi en KEGG-bananalys på dessa gener med Flymine.org 37 .

piRNA-klusteranalys

För att bestämma överflödet av små RNA-läsningskartläggningar till antecknade piRNA-kluster, justerades 23–29 bp stora läsningar unikt med genomet med hjälp av Bowtie (−v 1 −m 1). piRNA-klusterspecifika avläsningar extraherades med användning av sängkläder med användning av de 15 mest uttryckta piRNA-klusteren, såsom definieras i refs 10, 11. Specifika klustertäckningsplott beräknades med användning av sängkläder genomecov, normaliserade till totalt unikt anpassande läsningar (exklusive små nukleolära RNA, överför RNA och miRNA), och planerad med Sushi R-paketet från Bioconductor 38 .

För att analysera geniska piRNA-avläsningar separerades 23–29 bp inriktade läsningar i 5′UTR, kodande sekvens och 3′UTR-regioner för varje gen (Flybase-anteckningar) och räknades och sorterades sense / antisense med hjälp av sängkläder. För utvalda gener med stort antal antisense-piRNA i 3UTR (se till exempel Fig. 2g) beräknades täckningen såsom beskrivits ovan. Täckning och genmodeller planerades med hjälp av Sushi 38 .

immunoblotting

Flygkroppssegment och vävnader dissekerades som i 'RNA / smRNA-seq Library Preparations.' Helcellslysatprover framställdes i RIPA-buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 1% Triton-X-100, 1% Na-deoxykolat, 0, 1% SDS och 2, 5 μg ml - 1 Pepstatin A, Leupeptin, Antipain, Aproptinin och Chymostatin). Därefter laddades 15 μg totalt protein och kördes på en 12% polyakrylamid – SDS-gel. Proteiner överfördes sedan till polyvinylidendifluoridmembran och membranet blockerades över natten i Tris-buffrad saltlösning med 0, 1% Tween-20 i 5% mjölk vid 4 ° C. Membran skars först mellan en 75 och 50 kDa markör och hälften av membranet med lägre molekylvikt inkuberades med anti-Actin (mus 1: 2 000; EMD Millipore MAB1501). Den övre molekylviktshalvan av membranet inkuberades med anti-Piwi (mus 1: 200; Santa Cruz sc-390946), anti-Aubergine (kanin 1: 2 000) eller anti-AGO3 (kanin 1: 3 000). Innan blotting med antingen Aubergine eller anti-AGO3 och mellan varje reprobing strippades fläcken med strippningsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 6, 8, 20 g - 1 SDS och 0, 8% p-merkaptoetanol) vid 60 ° C. Efter behandling med varje primär antikropp inkuberades membran med antingen pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus (get 1: 5, 000; ThermoFisher 31430) eller anti-kanin (get 1: 5, 000; ThermoFisher 31460). Anti-AGO3- och anti-Aubergine-antikropparna var gåvor från Phillip Zamore. Oklippta bilder av de ursprungliga immunblottarna kan hittas i kompletterande figur 2.

Immunofluorescensanalyser och lipidfärgning

Flugor doppades kort i EtOH och blottades, fixerades i 4% paraformaldehyd i PBS under 20 minuter, tvättades med PBS på is och inbäddades i Tris-buffrad saltlösning Tissue Freezing Medium (Fisher Scientific 15-183-13). Formarna frystes på torris och lagrades vid –80 ° C. Formar gjordes kryosektionerade i 10 mikrometer och tvättades försiktigt med PBS. För anti-Piwi-immunofluorescens inkuberades objektglas med anti-Piwi-antikropp (mus 1:50; Santa Cruz sc-390946) under 1 timme vid rumstemperatur, tvättades med PBS, inkuberades med anti-mus Alexa Fluor-568-konjugerad antikropp ( get 1: 2 000; ThermoFisher A-11031) under 1 timme vid rumstemperatur och tvättades sedan igen med PBS. Anti-Piwi-primära och sekundära antikroppar utspäddes båda i 5% normalt getserum och 0, 1% Triton X-100. För lipidfärgning inkuberades sektioner med Nile Red (0, 5 ug ml - 1 ; ThermoFisher N-1142) under 1 timme vid rumstemperatur och tvättades med PBS. För anti-y-H2A.v immunofluorescens tvättades objektglas i PBS och blockerades under 30 minuter vid rumstemperatur i 5% normalt getserum och 0, 5% Triton X-100. Objektglas sköljdes sedan kort i PBS, inkuberades med anti-y-H2A.v-antikropp (mus 1:20; DSHB unc93-5.2.1) under 2 timmar vid rumstemperatur, tvättades med PBS + 0, 1% Tween-20 (PBST), inkuberad med anti-mus Alexa Fluor-568-konjugerad antikropp (get 1: 1 000; ThermoFisher A-11031) under 1 timme vid rumstemperatur och tvättades två gånger med PBST följt av en sista tvättning med PBS. Anti-y-H2A.v primära och sekundära antikroppar utspäddes båda i 5% normalt getserum och 0, 1% Tween-20. Alla objektglas monterades och färgades med 4, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; ThermoFisher P36935).

Bilder av Piwi förvärvades med ett Zeiss LSM 510 metakonfokalt laserskanningsmikroskop och y-H2A.v och lipidfärgning med ett Zeiss AxioImager.Z1 ApoTome mikroskop. Bilder av representativa kärnor, proteiner och lipider valdes och bearbetades med ImageJ och Adobe Photoshop. y-H2A.v-intensiteten mättes och kvantifierades med användning av ImageJ enligt metoden publicerad i ref. 28. Lipiddroppstorlek mättes och kvantifierades med användning av ImageJ från sektioner av enskilda flugor. För y-H2A.v fluorescensintensitet och kvantifiering av lipid droppstorlek utfördes Students två-tailed t- test för att bestämma betydelse.

gypsy-TRAP transposition reporter

Reporterlinjen för pypi-mutantfettsiggaing -TRAP genererades med hjälp av linjerna som nämns i "Fly Stocks and Husbandry." Kortfattat rekombinerades först den fettkroppspecifika r4-GAL4-förarlinjen med en UAS-GFP- linje som genererade en ny stabil linje som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) exklusivt i fettkroppen. Denna linje korsades sedan med gypsy-TRAP- reporterlinjen 24, en linje innehållande en GAL80 som drivs av en tubulinpromotor separerad av ett ovo- bindningsställe som lockar till sig zigenare TE som undertrycker GFP-uttryck tills TE-transposition aktiverar reporterfunktionen. När den nya linjen var stabil, korsades den sedan ytterligare in i en piwi 2 / CyO-mutantbakgrund , varigenom den slutliga piwi- mutanta fettkroppens zigenare-TRAP-reportringslinje genererades. Blandade kön heterozygota och homozygota flugor från denna linje åldrades sedan tillsammans i 10 dagar. Flugor separerades sedan med piwi- genotyp och honflugor av varje piwi- genotyp separerades ytterligare under ett fluorescerande dissekeringsomfång i tre grupper enligt det ungefärliga antalet GFP-celler som synligen fluorescerade under den ventrale bukväggen. Grupperna var som följer: låg (inga synliga GFP-positiva celler), medium (50% bukområde som visade GFP-positiva celler). Fishers exakta test utfördes för att bestämma signifikans mellan de kombinerade medium + höga grupperna och den låga gruppen.

As was demonstrated for adult mushroom body neurons 24, we found that the GFP-positive cells in the fat body were dependent upon endogenous gypsy insertion as mutant ovo binding sites in the wild-type gypsy-TRAP / r4-GAL4::UAS-GFP reporter line resulted in no GFP-positive cells as expected 9 . All representative images were taken from heterozygous piwi mutant fat body gypsy-TRAP flies.

Metabolic assays

Assays were performed as in ref. 39 with the following modifications. Biological replicates for each genotype assayed were generated using five whole adult flies. All data were normalized to total protein concentration and calculated as a percent relative to the control genotype. For each assay, Student's two-tailed t -test was performed to determine significance.

TAG assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBST buffer. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBST and 15 μl of heat-treated homogenate or glycogen standard (Standbio 2103-030) were incubated with 200 μl of Trigylceride Reagent (Thermo Scientific TR22421) for 5 min at 37 °C. Absorbance was measured at 540 nm and TAG content of samples was calculated based on a standard curve of TAG that was run in parallel with experimental samples.

Glycogen assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBS. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBS and 90 μl of heat-treated homogenate were incubated with either 20 μl of amyloglucosidase (Sigma-Aldrich A7420) or 20 μl of PBS. To create a glycogen standard curve, 50 μl of glycogen standards (Ambion AM9510) were treated with either 50 μl of amyloglucosidase or 50 μl of PBS. All samples were incubated at 37 °C for 1 h. Then, 30 μl of each sample was added to a 96-well plate. Next, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Thermo TR15421) was added to all samples and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and normalized by subtracting the absorbance of the free glucose of untreated samples from the absorbance of the total amount of glucose present in samples treated with amyloglucosidase. Glycogen content was then calculated based on the normalized glycogen standard curve.

Trehalose assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold trehalose buffer (5 mM Tris-HCl, pH 6.6, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl). The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with trehalose buffer and 90 μl of heat-treated homogenate were incubated with either 20 μl of trehalase (Sigma-Aldrich T8778) or 20 μl of trehalose buffer. To create a trehalose (Sigma-Aldrich T9531) standard curve, 50 μl of standard were incubated with either 30 μl of trehalase or 30 μl of trehalose buffer. A free glucose (Fisher Scientific 50-99-7) standard curve was also generated. All samples were incubated at 37 °C overnight. Then, 30 μl of each sample was added to a 96-well plate. To all samples, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Thermo TR15421) was added and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and normalized by subtracting the absorbance of free glucose present in untreated samples from the total amount of glucose present in samples treated with trehalase. Trehalose and free glucose content were calculated based on standard curves of trehalose and glucose respectively.

Glucose assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBS. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBS and 30 μl of supernatant was then added to a 96-well plate. To all samples, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Fisher Scientific TR15421) was added and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and glucose content was calculated based on a standard curve of glucose (Fisher Scientific 50-99-7).

Starvation assay

Before permanent starvation, flies were synchronized in their feeding by fasting on 2% agar for 4 h followed by a final period of feeding for 2 h. Flies were then sorted under CO 2 anaesthesia into separate sex vials containing 2% agar at a density of 10 males or 10 females per vial, with a total of 5 vials ( n ≈50) for each genotype. Dead flies were scored and counted every 6 h. Starvation analyses were performed and log rank statistics calculated using the online application OASIS 40 . Starvation assays were repeated at least twice.

Immune challenge assay

A bacterial culture of Erwinia carotovora (Gram-negative insect/plant pathogen), a gift from Neal Silverman, was grown overnight in Luria broth, shaking at 220 rpm on a platform shaker at 37 °C. The culture was allowed to reach OD 600nm ≈2.0 before removing 1 ml for centrifugation at 2, 000 × g for 2 min. The supernatant was removed and the bacterial pellet gently washed with 1 ml of 10 mM MgSO 4 to remove traces of culture media. The wash was removed and the pellet resuspended in 10 μl of fresh 10 mM MgSO 4 . A 0.15 mm needle was then dipped into 80% EtOH and flame sterilized. Flies were sorted under CO 2 anaesthesia and inoculated by dipping the needle into either the bacterial suspension or EtOH for mock infection controls, and inserting the needle midway into one side of the thorax. Flies were then sorted into separate sex vials at a density of 10 males or 10 females per vial, with a total of 5 vials ( n ≈50) for each condition/genotype, and passed to fresh food at least every other day. Dead flies were scored and counted every 24 h. Immune challenge analyses were performed and log rank statistics calculated using the online application OASIS 40 . Immune challenge assays were repeated at least twice.

Lifespan assay

Flies used in lifespan experiments were collected upon eclosion over a 48 h period and were sorted under CO 2 anaesthesia and placed in food vials at a density of 25 males and 25 females per vial, with a total of 10 vials ( n ≈250) for each genotype. Lifespan food consists of 50 g l − 1 autolysed yeast, 50 g l − 1 sucrose and 20 g l − 1 agar (all w/v). For the flamenco 3TC lifespans, flamenco homozygous mutant flies were collected and aged on either food containing 150 g l − 1 autolysed yeast, 150 g l − 1 sucrose and 20 g l − 1 agar, (all w/v) or identical food with 10 mM lamivudine (3TC). Flies were passed to fresh food every other day, and dead flies scored and counted. Lifespan analyses were performed and Wilcoxon rank sum test statistics calculated using the online application OASIS 40 . Lifespan assays were repeated twice.

Data tillgänglighet

The data sets generated and analysed in this study have been deposited and are available in the GEO database, under the series accession number GSE89260. Additional relevant data sets and computer code are available either in this published article (and its Supplementary Information Files) or are available from the corresponding author on reasonable request.

Additional information

How to cite this article: Jones, BC et al . A somatic piRNA pathway in the Drosophila fat body ensures metabolic homeostasis and normal lifespan. Nat. Commun. 7, 13856 doi: 10.1038/ncomms13856 (2016).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures and Supplementary Tables.

  2. 2.

    Peer Review File

Excel-filer

  1. 1.

    Supplementary Data 1

    FDR values for all pairwise comparisons between somatic body segments and tissues for all genes reported in Fig. 1 and Supplementary Fig 1.

  2. 2.

    Supplementary Data 2

    Fat body genic piRNAs.

  3. 3.

    Supplementary Data 3

    Raw data of fat body lipid droplet quantification for piwi mutants and heterozygous controls.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.