Små rnas: biologins modiga nya värld | naturmetoder

Små rnas: biologins modiga nya värld | naturmetoder

Anonim

Liten RNA-upptäckt och profileringsinsatser omformar dramatiskt grundläggande koncept för hur gener regleras och leder till nya verktyg för att studera genfunktion.

Dubbelsträngade RNA: s förmåga att tystna gener beskrevs först i Caenorhabditis elegans 1998 - en upptäckt som skulle tjäna Andrew Fire och Craig Mello Nobelpriset 2006 i fysiologi eller medicin. Vår kunskap om cellens lilla RNA-värld och dess förmåga att reglera gener genom tystnad har kraftigt utvidgats under den korta tiden sedan dess med identifiering av många RNA-klasser som små störande RNA (siRNA) och mikroRNA (miRNA) och en klass av RNA som är associerat med Piwi-familjen av Argonaute-proteiner (piRNA). Även om deras mål och handlingsmekanismer i många fall fortfarande inte är tydliga, är det som blir säkert att många av dessa små RNA spelar stora roller i grundläggande biologiska processer.

När forskarna går in i det andra decenniet av liten RNA-forskning är den goda nyheten att ny teknik och verktyg börjar ge svar på grundläggande frågor kring liten RNA-distribution i celler, uttrycksmönster och handlingsmekanismer. Men när svaren dyker upp, gör det också en rad nya frågor.

Kartlägga det outforskade landet

År 2006 beslutade David Bartel, professor i biologi vid Massachusetts Institute of Technology och en utredare vid Whitehead Institute i Cambridge, Massachusetts, USA tillsammans med sina kollegor att använda den höga kapaciteten för pyrofosfat sekvenseringsmetod utvecklad av 454 Life Sciences (Branford, Connecticut, USA), nu ett Roche-företag, för att kika in i den lilla RNA-världen av C. elegans . Deras fem sekvenseringskörningar profilerade 394 926 små RNA-sekvenser vilket resulterar i identifiering av 18 nya miRNA och flera endogena siRNA samt en helt ny klass av icke-kodande piRNA i C. elegans som kallas 21U-RNA 1. Samtidigt som vi utvidgar vår kunskap om liten RNA-sammansättning i masken markerade arbetet också potentialen att använda sekvensering som ett upptäcktsverktyg.

"Det var bara en första titt i C. elegans , och vi hittade alla möjliga saker eftersom fram till dess hade små RNA verkligen varit det outforskade landet, " säger Chad Nusbaum, som är co-chef för Genome Sequencing and Analys-programmet vid Broad Institute of MIT och Harvard i Cambridge, Massachusetts, USA och en medförfattare på tidningen 1 . Enligt Nusbaum är upptäckten av små RNA: er en utmaning som bäst passar en sekvenseringsmetod.

Sekvensering fungerar när det gäller små RNA-upptäckter av två huvudsakliga skäl. "Faktum är att ingen kunskap om tidigare sekvens krävs och det dynamiska intervallet är nästan obegränsat, " säger Roland Wicki, direktör, Applied Biosystems SOLiD Application Development vid Life Technologies i Foster City, Kalifornien, USA. Detta nästan obegränsade dynamiska intervall är det direkta resultatet av förmågan att öka antalet sekvenseringsläsningar för att hitta även mycket sällsynta små RNA i celler och vävnad.

Många forskare hävdar att de senaste nästa generations sekvenseringsplattformar som Applied Biosystems SOLiD3 och Genome Analyzer från Illumina i San Diego är särskilt väl lämpade för små RNA-upptäcktapplikationer eftersom de kan producera miljoner kortläsningar, var och en runt 50–75 bas. par långa, under en relativt snabb tidsperiod.

Shawn Baker, en ledande produktchef för RWA-analys vid Illumina, säger att forskarna med Genome Analyzer ofta kommer att generera två till fem miljoner läsningar när de är intresserade av att utforska en population av små RNA. Men när det gäller mer detaljerade inspektioner av RNA-populationer, applikationer som kräver ett ökat dynamiskt intervall, kan forskare höja upp några av de nyare plattformarna för att generera 40 miljoner eller fler läsningar.

Image

Chad Nusbaum misstänker att små RNA-upptäckt och profilerande experiment kommer att migrera mot sekvensering i framtiden. Bild: M. Nemchuk, Broad Institute

Att utforska RNA-världen genom sekvensering var många utvecklare i åtanke från början. "Det lilla RNA-upptäcktsystemet var en av de första applikationerna som vi skapade för Genome Analyzer, " konstaterar Baker. Det första steget i alla sekvenseringsmetoder för liten RNA-upptäckt är att isolera RNA av specifika storlekar som kan användas för att konstruera ett sekvenseringsbibliotek genom att fästa specifika adaptrar på molekylernas ändar. Biblioteket med litet RNA används sedan som mallen för mycket djup sekvensering. Även om steget för skapande och sekvensering av biblioteket börjar bli rutinmässigt med tillgängligheten till förbättrade satser och protokoll, är det det slutliga dataanalyssteget som ofta kan vara svårt för forskare. "Ju kortare den lilla RNA-sekvensen är, desto svårare är det att hitta en unik kartläggbar plats, " förklarar Wicki och tillägger att mångfalden av små RNA-typer, från miRNA till piRNA till siRNA, tillsammans med de omfattande sekvensvariationerna för många miRNA-arter gör identifiering och klassificering svårt. Både Life Technologies och Illumina tillhandahåller programvara till forskare för att hjälpa till med att kartlägga dessa korta sekvenser tillbaka till genomet, och akademiska forskare som Nikolaus Rajewsky och hans kollegor i Berlin som nyligen beskrev en ny algoritm som heter miRDeep för identifiering av miRNA från djup sekvenseringsdatasätt 2, lägger också till de små RNA-analysalternativen.

Profilering av ett multiplayer-spel

Medan forskare tittar på nästa generations sekvenseringsplattformar när det gäller upptäckten, är profileringen av uttrycksmönstren för små RNA ett multiplayer-spel med forskare som använder metoder som sträcker sig från pärlbaserade analyser till de som använder mikrofluidiska kort. Men det är den traditionella mikroarrayen som återstår alternativet att välja framför sekvensering, åtminstone för tillfället.

Utvecklingen av mikroinnehåll med mycket innehåll av miRNA har exploderat under det gångna året när forskare fortsatte att upptäcka fler miRNA från människor och andra arter, och när utvecklare förbättrade prestandan för dessa korta strängar av nukleinsyra på matriser. "Profilering med mikroarrayer är svårt eftersom de konventionella metoderna som används för märkning och sondesign inte fungerar bra med att miRNA är så liten, " säger Hui Wang, forskningsforskare vid Agilent Technologies i Santa Clara, Kalifornien, USA. För att övervinna utmaningen med att profilera miRNA-populationer med matriser, utvecklade Wang och hennes kollegor på Agilent en metod för direkt märkning av miRNA med användning av RNA-ligas under specifika förhållanden och designade sond-sekvenserna på matriserna baserat på smälttemperaturer för att maximera specificiteten och känsligheten. "Filosofin bakom den direkta märkningsstrategin är att vi har minimal störning av provet, så du mäter exakt vad som finns där utan ytterligare bearbetningssteg som förstärkning eller storleksfraktionering som potentiellt kan snedvrida miRNA-innehållet, " förklarar hon.

Image

Illumina's Genome Analyzer har använts i ett antal små RNA-upptäcktinsatser. Bild: Illumina

Agilent Technologies erbjuder nu sin direkta märkningssätt med olika miRNA-mikroarrayer som täcker människor, möss, råttor och andra arter. Andra företag, inklusive Life Technologies och Illumina, tillsammans med Exiqon i Vedbaek, Danmark och Genosensor Corporation i Tempe, Arizona, USA erbjuder också olika miRNA-mikroarray-alternativ för profileringsändamål.

Teknologiska framsteg gör mikroområden mer produktiva och robusta, men ekonomi och hastighet är fortfarande deras största fördelar jämfört med annan teknik. "Om du vet vad du letar efter, förblir matriser det billigare alternativet, " säger Nusbaum. Kostnaderna för att producera mikroarrayer och tillhörande märkningssatser har minskat under det senaste året. Faktum är att Illuminas Baker säger att för några av Illuminas hela genommikroplattor och märkningsreagens är kostnaderna för närvarande under 100 USD per prov, betydligt mindre än kostnaden för en enda körfält i en flödescell på deras Genome Analyzer.

Även om den låga förbrukningsbara kostnaden utgör ett stort incitament för många forskare, kan tidsbesparingar vara en ytterligare fördel med matriser över sekvensering. Joshua Levin, forskare vid Broad Institute, studerade nyligen den tid som krävs för ett typiskt nästa generations sekvenseringsprojekt. Levin säger att från RNA-isolering till Illumina tar cDNA-biblioteket cirka tio arbetsdagar. Därifrån kan den faktiska sekvenseringen ta var som helst från 3 till 4 dagar, i fallet med parvis sekvensläsning, till en vecka eller 8 dagar när du får parade läsningar. Bearbetning av sekvenseringsdata kräver ytterligare en dag, följt av analys, som ofta kan ta minst ett par dagar till, även om forskarna vet de exakta analyserna de tänker utföra. Efter att ha övervägt alla stegen kan det i många fall ta upp till en månad att använda sekvensering för att profilera. Arrays, däremot, kräver inte ett steg för att skapa bibliotek och har genomgått åratal av standardisering och bioinformatikutveckling. I de flesta fall tillåter detta forskare att utföra experiment från början till slut på drygt en vecka.

Microarrays har dock sina nackdelar - ett faktum som tillåter sekvensering att få ett litet fotfäste inom samhället när det gäller profilering. Som ett resultat av deras begränsade dynamiska intervall är mikroområden väsentligt mindre kvantitativa än sekvensering. "Du är ganska mycket begränsad med mikroarrayer till i allmänhet 3 till 4 loggar av dynamiskt intervall, " säger Illuminas Baker, "och det är mycket svårt att öka det intervallet." Därför när det gäller mycket sällsynta små RNA, bör sekvensering ge en tydligare bild av uttrycksmönstret än mikroarrayer.

När det gäller att titta på flera prover samtidigt minskar till och med fördelarna med hög kapacitet för matriser när forskare utvecklar tekniker för att öka antalet prover som nästa generations sekvenser kan analysera. "Streckkodning tillåter flera prover att förhöras i en enda sekvenseringskörning, " säger Wicki. Flera utvecklare, inklusive Life Technologies och Illumina, erbjuder nu streckkodning eller indexeringslösningar som möjliggör profilering av flera prover samtidigt i samma flödescellfält och därigenom minskar både kostnaden för analysen och ökar antalet prover som kan förhöras i en enda körning.

Image

Life Technologies SOLiD3-system, som använder en ligeringssekvenseringsmetod, har kapacitet att profilera tiotals miljoner små RNA. Bild: Life Technologies

Även det ekonomiska argumentet kanske bara kan driva mikroarrayer så länge. "Jag tror att klyftan verkligen minskar, " säger Nusbaum. "Det är saker jag gör nu med sekvensering som jag skulle ha gjort förra året med array." Medan detta delvis drivs av de kraftigt sjunkande kostnaderna för sekvensering som matriser inte kan matcha, noterar Nusbaum också att sekvenseringsteknik lätt kan generaliseras, vilket han misstänker så småningom kommer att driva alla DNA-avläsningar mot sekvensering.

Från upptäckten kommer verktyg

Medan upptäckt- och profilinsatser främjar vår förståelse av den lilla RNA-världen, finns det fortfarande ett stort intresse bland forskare att använda dessa molekyler för att studera genfunktion. Och när det gäller små RNA-verktyg är siRNA gruppens äldre statsman.

Syntetiska siRNA har visat sig effektiva i gendämpande studier under de senaste 6 åren. Men att ta reda på det bästa sättet att designa siRNA för maximal tystnadseffektivitet och förstå effekter utanför målet är fortfarande en utmaning för många forskare enligt Devin Leake, chef för forskning och utveckling på Thermo Fisher Scientific Dharmacon Products i Lafayette, Colorado, USA.

siRNA består av en känsla och en antisenssträng: den förra strängen fungerar som en passagerare, och den senare tas upp av det RNA-inducerade tystnadskomplexet (RISC) för att förmedla gen-tystnad. Att utforma en antisense-sträng så att den företrädesvis tas upp av RISC är kärnan i många siRNA-designalgoritmer som optimerar siRNA-sekvenser så att de två strängarna är termodynamiskt olika, varvid antisense-strängen gynnas av komplexet för upptag och effektiv tystnad. Flera online-siRNA-designprogram finns för forskare att använda i sina designinsatser, inklusive siDESIGN Center från Dharmacon Thermo Fisher Scientific, RNAi Designer från Clontech (Mountain View, Kalifornien, USA), siRNA Target Finder från Ambion (Austin, Texas, USA) och BIOPREDsi från Qiagen (Valencia, Kalifornien, USA). Leake noterar också att vissa kemiska modifieringar såsom 2'- O- metylmodifieringar i specifika positioner på siRNA-molekyler och sammanslagningssätt har också visat sig förbättra både specificitet och styrka.

Men även med förbättrade designverktyg undrade Chiang Li, en utredare vid Beth Israel Deaconess Medical Center i Harvard Medical School i Boston och president för det Boston-baserade företaget Boston Biomedical, under flera år varför det var så utmanande att utforma bra siRNA för att tystna några av de gener som hans grupp studerade. Denna nyfikenhet ledde till att Li och hans kollegor tittade igen på siRNA: s grundstruktur. Först försökte de förkorta längden på flera siRNA, men fick snabbt reda på att allt kortare än 19 baspar tappade aktivitet mycket snabbt i händerna. Därefter försökte de asymmetriska konfigurationer, där den ena RNA-strängen var längre än den andra, och plötsligt förändrades allt enligt Li. "Så fort du byter till den asymmetriska konfigurationen kommer du ut ur en tunnel och ser denna andra värld, " säger han - en värld där dessa mycket kortare asymmetriska RNA inte bara resulterar i ökad tystnad utan också minskade off-target-effekter som liksom minskat immunsvar i testade celler.

Arbetet, som visar användningen av 15-baspar-asymmetriska RNA: er (aiRNA) för att förmedla tystnad i däggdjursceller, publicerades nyligen i Nature Biotechnology 3 . "Många har frågat mig" varför har aiRNA sådana tystnadsfördelar när molekylen bara är några baspar kortare än siRNA? ", Säger Li. Han misstänker att det allt har att göra med hur aiRNA-molekylen laddas in i RISC: "På grund av den asymmetriska strukturen är senssträngen kortare, vilket gör den strukturellt olämplig att behållas av RISC."

En ny verktygssats

miRNA-verktyg och hämmare blir också mer allmänt tillgängliga för nyfikna forskare. "Många forskare på området har svårt att koppla en specifik miRNA till en fenotyp, " säger Leake. Han misstänker starkt att detta är resultatet av de subtila fenotyperna som kan uppstå när miRNA är störda eftersom till skillnad från siRNA, som riktar sig till en enda gen för tystnad, kan miRNA rikta sig till hundratals gener.

"En fantastisk ny applikation av miRNA-verktyg använder virala vektorer", säger Leake. För forskare som är intresserade av effekterna av specifika miRNA, erbjuder virala vektorer en effektiv metod för att uttrycka ett moget miRNA i många celltyper. Flera företag erbjuder nu virala vektorer och miRNA-bibliotek för forskare, inklusive Open Biosystems i Huntsville, Alabama, USA, som erbjuder specialiserade retrovirala vektorer samt en samling mänskliga miRNA: er klonade i lentivirala uttrycksvektorer och System Biosciences of Mountain View, Kalifornien, USA, som erbjuder lentivirusbaserade miRNA-expressionsvektorer.

Men forskarna i Leakes grupp har tagit ett annat synsätt för att studera miRNA-funktion och utvecklat syntetiska miRNA-hämmarmolekyler. "Vi utvärderade prestandan hos traditionella hämmare och bestämde att kemiska modifieringar ensamma inte skulle vara tillräckliga för att förbättra hämningen, " säger Leake. Istället fann gruppen att om de skapade en molekyl med mycket strukturerade ändar, har hämningsnivån förbättrats 4 .

Små RNA har gett forskare ett nytt sätt att titta på genreglering tillsammans med en verktygssats för att studera genfunktion. Med allt som har lärt sig under det första decenniet och den nya tekniken som finns tillgänglig nu är det svårt att föreställa sig de underverk som RNA-världen kommer att avslöja under de kommande tio åren. Se bordet

Full storlek bord