Enkelmolekylundersökningar avslöjar funktionen hos ett tredje polymeras i replikomet | naturstruktur och molekylärbiologi

Enkelmolekylundersökningar avslöjar funktionen hos ett tredje polymeras i replikomet | naturstruktur och molekylärbiologi

Anonim

ämnen

  • Bakterie
  • Replisome
  • Strukturell biologi

Abstrakt

Escherichia coli- replisen innehåller tre polymeraser, en mer än nödvändig för att duplicera de två föräldrasträngarna. Med hjälp av enkelmolekylundersökningar avslöjar vi två fördelar som det tredje polymeras ger. Först är dipolymerasreplosom ineffektiva för att syntetisera försenade strängar, vilket lämnar enkelsträngiga luckor, medan tripolymerasreplosomer fyller strängar nästan till fullbordande. För det andra är tripolymeras-repliker mycket mer processiva än dipolymeras-repliker. Dessa funktioner står för den oväntade trepolymerasstrukturen hos bakteriella repliker.

Huvudsaklig

Under 40 år har det antagits att replisomer innehåller två DNA-polymeraser, en för varje tråd vid en replikationsgaffel 1, 2 . Emellertid har E. coli- replikas Pol III * nyligen visat sig innehålla tre Pol III-kärnor 3 . Dessutom har nyligen stöd in vivo för ett tripolymeras (TriPol) -replosom tillhandahållits genom slimfield-mikroskopi, vilket visade att E. coli- replikationsgafflar innehåller tre Pol III-kärnor, inte två 4 .

Misslyckandet med att förutse den trepolymerasstrukturen i bakterierekomplementet är hänförlig till särdragen hos E. coli dnaX- genen, som kodar för två proteiner, t och y. Proteinet t är fullängdsprodukten och y trunkeras av en translationell ramförskjutning 5 . De C-terminala sekvenserna av t binder Pol III-kärnan (och DnaB-helikaset), men den avkortade yen binder inget protein. E. coli- klämlastaren innehåller tre kopior av DnaX-proteinet och antogs sålunda innehålla två t och en y för att ge det 'klassiska' dipolymeras-replisen, vilket också förklarar varför E. coli producerar y (det vill säga för att förhindra bindningen av en onödig tredje Pol III-kärna). Men att blanda alla subenheter ger samtidigt en Pol III * med tre τ och tre Pol III-kärnor, med undantag av y3. Vidare visar mutation av dnaX att y inte krävs för E. coli- livskraft, medan t är väsentlig 6 . Vi antar att E. coli producerar y för att bilda en endast y-klämlastare som monterar p-klämmor på DNA för användning av andra enzymer förutom Pol III.

Varför skulle ett replisom innehålla tre polymeraser när det bara finns två DNA-strängar att replikera? För att ta itu med denna fråga använde vi totalmolekylens totala reflektionsfluorescensmikroskopi för att övervaka beteendet hos E. coli- repliker som innehåller antingen två eller tre polymeraser (DiPol III * kan monteras genom att tvinga en y att byta ut med en τ). Vi monterade DnaB-helikas, DiPol III * eller TriPol III *, och p-klämman på en 5'-biotinylerad 100-mer rullande cirkel-DNA för att bilda TriPol- och DiPol-repliker (se fig. 1a och kompletterande metoder) 7 . Vi fästade sedan replisome-DNA-komplexet till en lipid-tvåskikt i en flödescell. Obundet proteiner tvättades bort och det hydrodynamiska flödet gjorde det möjligt för replisome-DNA-komplexen att migrera i tvåskiktet och ackumuleras längs en diffusionsbarriär 7, 8 . Replikering initierades genom att flöda en buffert som inkluderade dNTP och NTP.

( a ) Schema för enkelmolekylförsök. För tydlighetens skull illustreras bara DiPol-replisen. ( b ) DNA-produkter från antingen DiPol (vänster) eller TriPol (höger) replisom, med användning av 250 nM primas. Slutpunkterna för två representativa DNA-produkter är markerade med pilspetsar. ( c ) DNA-längdfördelningshistogram. Siffror representerar den en-exponentiella anpassningen ± sem av det totala antalet ( N ) analyserade molekyler. Grå staplar representerar DNA-stränglängder under 15 kb som undersamplades eftersom de doldes av diffusionsbarriärens bredd. Vänster, DiPol-repliker, höger, TriPol-repliker. ( d ) Processivitet för DiPol- och TriPol-repliker, där det indikerade polymeraset är närvarande eller frånvarande från buffertflödet.

Bild i full storlek

Vid replikering av rullande cirklar blir den nyligen bildade ledande strängen mallen för syntes med släpsträng, vilket producerar en duplex "svans" som består av de nyligen syntetiserade ledande och släpande trådarna. I vår studie kopplades duplex-svansen vid diffusionsbarriären, och replikering gav en växande 'gardin' av DNA som visualiserades i realtid med YO-PRO-1, en fluorescerande intercalator (fig. 1b och kompletterande videor 1 och 2 ). Primase, P och SSB ingår i bufferten eftersom de behövs upprepade gånger under lagringsträngssyntes 9 . Men vi utelämnade Pol III * och DnaB-helikas från buffertflödet, så om någon av dessa proteiner dissocierades från det immobiliserade DNA, skulle de avlägsnas genom flödet och tillväxten av den specifika DNA-molekylen skulle avbrytas.

Jämförelse av DNA-produkterna från DiPol- och TriPol-replikerna avslöjade att TriPol-replisomet syntetiserar mycket längre DNA-produkter än DiPol-replisen är (Fig. 1b). Kvantifiering av nästan 2 000 DNA-molekyler i varje reaktion demonstrerade att produkterna från TriPol-repliker är nästan dubbelt så långa som de från DiPol-replisomer (84, 9 ± 6, 8 kilobaser (kb) mot 48, 5 ± 2, 1 kb, respektive fig. 1c). Vi drar slutsatsen att närvaron av ett tredje polymeras väsentligt förbättrar processiviteten för replisen.

Vi övervägde om ökningen av TriPol-replisomprocessivitet jämfört med DiPol-processivitet beror på de tre t-subenheterna i TriPol (mot två τ-subenheter i DiPol), som binder DnaB-helikas 10 och därmed kan stabilisera Pol III * och / eller DnaB-helikas vid gaffel. För att bestämma detta upprepade vi experimenten men inkluderade antingen TriPol III * eller DiPol III * i buffertflödet. Med Pol III * i buffertflödet bör endast DnaB-dissociation avbryta replikering eftersom varje Pol III * som dissocierar kan ersättas med en annan Pol III * från lösningen. Om DnaB stabiliseras av TriPol III *, bör längre produkter följas jämfört med DiPol III *. Faktum är att inkludering av antingen TriPol III * eller DiPol III * i buffertflödet gav längre DNA-produkter, men TriPol-replikerande produkter var fortfarande mycket längre än DiPol-produkter, vilket indikerar att TriPol III * stabiliserar DnaB mer än det stabiliserar DiPol III * (Fig 1d). Med tanke på att det tredje polymeraset höjer den effektiva koncentrationen av Pol III-kärnan vid gaffeln, kan den förbättrade processiviteten för TriPil jämfört med DiPol hjälpa till genom att reservpolymeraset ersätter ett dissocierat polymeras (på den ledande eller släpande strängen) och återupptar gaffelprogression.

Längre DNA-produkter kan också uppstå om TriPol-replisen rör sig snabbare än DiPol-replisen. För att bestämma hastigheten på gaffelprogression utvecklade vi en pärlbaserad analys med en minirullningscirkel som endast innehåller tre dNMPs på endera strängen, vilket gör att vi specifikt kan följa tillväxten av den ledande strängen och bestämma hastigheten för replisen. Vi monterade antingen DiPol- eller TriPol-repliker på 5 ′ biotinylerad mini-rullande cirkel-DNA, kopplade DNA: t till streptavidin-magnetiska pärlor, tvättade sedan pärlorna för att ta bort obundna proteiner innan initiering av replikering (se schema i fig. 2a). Vår produktanalys visade att DiPol- och TriPol-replikerna avancerade i samma takt (Fig. 2b). De längre DNA-molekylerna som framställts av TriPol-repliker kommer följaktligen från den större processiviteten för TriPol jämfört med DiPol-replikerna och inte från en högre hastighet för gaffelprogression. Medan denna rapport pågår observerades en annan studie en skillnad i produktlängd mellan DiPol och TriPol-repliker, som en följd av att undersöka en annan fråga 11 .

( a ) Schema för den pärlbaserade analysen; DiPol-replisen illustreras för enkelhet. ( b ) Dipol- och Tripol-repliker replikerar DNA med liknande hastigheter. Vänster, autoradiogram av 0, 8% alkalisk agarosgelanalys av reaktioner, med användning av antingen Tripol III * (20 nM) eller DiPol III * (80 nM); DnaG-primaskoncentrationen var 200 nM. Rätt, plot av DNA-längd kontra tid. ( c ) Vänster, ledande och släpsträngande replikationsprodukter från pärlbaserade reaktioner, upplöst på denaturering av agarosgeler med användning av 320 nM DnaG-primas. Rätt, kvantifiering av syntes- och ledningssträngssyntes, normaliserad till produkterna från TriPol-replisen.

Bild i full storlek

Vårt arbete visar att pärlbaserade analyser kräver fyra gånger mer DiPol III * än Tripol III *, eftersom vi konsekvent observerade mindre total DNA-syntes med DiPol kontra TriPol-repliker (kompletterande figur 1). Detta beror troligen på den lägre stabiliteten hos DiPol III * vid replikationsgaffeln, vilket resulterar i dissociation från DNA under de omfattande tvättstegen. Lägre stabilitet hos DiPol III * överensstämmer med den lägre processiviteten för DiPol jämfört med TriPol-repliker (se fig. 1).

Därefter undersökte vi de två replikerna med avseende på skillnader i syntes med lagringssträng. I dessa experiment tillfogade vi en DNA-fälla efter tvättstegen för att säkerställa att något polymeras som dissocierades inte återställde rullningscirkelsubstratet. Vi blev förvånade över att skillnaderna i DNA-syntes mellan DiPol- och TriPol-replisen var ännu större på den släpande strängen än på den ledande strängen (fig. 2c). Detta resultat innebär att DiPol-repliker lämnar ensträngad DNA (ssDNA) -gap på den släpande strängen. DiPol-replisen kanske inte fullbordar förlängningen av Okazaki-fragment, eller det kan vara bristfälligt vid användning av primer. För att testa hypotesen att DiPol-repliker lämnar luckor på den släpande strängen undersökte vi DNA-produkter under mikroskopet. YO-PRO-1-interkalatorn binder endast till dubbelsträngat DNA (dsDNA), så ssDNA-luckor visas som mörka regioner mellan fluorescerande segment av dsDNA. Pixelupplösningen för vår experimentella installation motsvarade cirka 600 bp. Därför skulle ssDNA-gap mindre än 600 bp inte observeras som mörka pixlar, vilket kräver indirekta metoder för att analysera deras pixelintensitet. Ändå observerade vi några ssDNA-luckor som var tillräckligt stora för att sträcka sig över en eller flera pixlar (fig. 3a). Dessa direkt observerade ssDNA-luckor var fem gånger vanligare med användning av DiPol-replisen än med TriPol-replisen (kompletterande figurerna 2 och 3). Eftersom dessa luckor var små och sällsynta när vi använde TriPol-repliken, ändrade vi förhållandena för att gynna längre Okazaki-fragment och därmed oftare luckor, vilket gjorde det möjligt att göra mer exakta mätningar för att jämföra DiPol- och TriPol-repliker.

( a ) Förstorad vy av DNA-produkter genererade av DiPol- och TriPol-repliker; de ljusa och mörka regionerna motsvarar dsDNA-segment och ssDNA-luckor. ( b ) Jämförande histogram som visar procentandelen DNA-strängar med luckor (grönt) och utan luckor (lila). ( c ) Histogram som visar fördelningen av mellanrumslängden (i μm) med DiPol (röd) och TriPol (blå) repliker. ( d ) Modell av TriPol och DiPol replikerande verkan. Pol III-kärnor representeras som högerhänder; med ß-klämman (röd), klämlastaren (mörkgrön), DnaB-helikas (blå hexamer), primas (ljusgrön) och SSB (lila). De t-subenheterna C-terminala domänerna (IV och V) illustreras som fogade linjer som förmedlar anslutningar till DnaB-helikas- och Pol III-kärnor. Klämlastarens χψψ underenheter utelämnas för tydlighet. TriPol-replisen visar två Pol III-kärnor som sträcker sig två Okazaki-fragment samtidigt, även om det finns andra sätt som en TriPol-replik kan användas (se text). Den vänstra bilden visar en släpande Pol III-sträckning som sträcker sig en RNA-primer (röd) för att producera en DNA-sträng (gul), och den andra släpande Pol III-kärnan sträcker DNA (blå) för att fylla ett ssDNA-gap.

Bild i full storlek

De hittills beskrivna experimenten genomfördes med användning av 250 nM primas, vilket genererar 1-2 kb Okazaki-fragment, medan sänkning av primaskoncentrationen till 4 nM ger> 20 kb Okazaki-fragment 9 . Undersökning av DNA-produkter med användning av 3 nM-primas visade många ssDNA-luckor producerade av DiPol-replisen (59, 2% av DNA-molekylerna) jämfört med TriPol-replisen (endast 7, 2% av molekylerna) (fig. 3a, b och kompletterande videor 1 och 2) . Vi analyserade också fördelningen mellan gapstorleken (Fig. 3c). Detta visade en ännu mer uttalad skillnad mellan DiPol och TriPol-repliker. Av de analyserade 640 DNA-strängarna (fig. 3b) lämnade DiPol-repliker 731 luckor, medan TriPol-repliker bara lämnade 78 luckor. Dessutom fanns det inga långa luckor i TriPol III * -replicerat material. Nukleotidstorleken för ssDNA-luckor är svår att fastställa eftersom ssDNA är bundet till SSB och dess konturlängd är dåligt definierad och skiljer sig från dsDNA och ssDNA. Därför rapporterar vi mellanrumslängden i mikron (fig. 3c).

Den markanta minskningen i längden och antalet ssDNA-luckor visar att TriPol-replisen, med dess extra polymeras, utför en mer effektiv lagringsträngssyntes än DiPol-replisen gör. Man kan fråga sig om primas är mer aktivt med TriPol-replisen. I detta fall kan primade platser ligga längre ifrån varandra för DiPol-repliker och därmed producera längre Okazaki-fragment och / eller ssDNA-luckor. Vår tidigare studie noterade något längre Okazaki-fragment producerade av DiPol kontra TriPol-repliker, vilket tyder på att primas är något mer aktivt med TriPol-replikomet 3 . Skillnaden är dock för liten för att förklara den stora skillnaden i ssDNA-gap mellan DiPol- och TriPol-replikerna som observerats i denna rapport.

För att säkerställa att luckorna vi observerade verkligen var ssDNA genomförde vi flera kontrollexperiment. I ett kontrollexperiment stoppade vi buffertflödet, vilket resulterar i DNA-återkylning och startade sedan om flödet för att sträcka DNA igen (tilläggsvideo 3). Både dsDNA-regioner (fluorescerande) och luckor (icke-fluorescerande) rekylerades och förlängs igen tillsammans, vilket stödjer uppfattningen att luckorna och dsDNA finns på en kontinuerlig DNA-molekyl. För det andra använde vi fluorescerande SSB istället för YO-PRO-1. Om luckorna var ssDNA, bör vi observera fluorescerande SSB associerade med DiPol-replikomprodukterna. Detta var verkligen fallet (kompletterande video 4). Eftersom vissa SSB förknippas med lipid-tvåskiktet nonspecifikt stoppade vi buffertflödet, och SSB på DNA återbelastades som förväntat. Dessutom använde vi överskott av Pol III * i buffertflödet, vilket skulle fylla och ta bort eventuella ssDNA-luckor, och faktiskt försvann luckorna (kompletterande figur 3). För att säkerställa att våra resultat inte påverkades av 1, 5-pN-kraften som utövades på DNA av det hydrodynamiska flödet (100 μL min −1 ) upprepade vi experimenten med två lägre flödeshastigheter, 30 μL min −1 och 10 μL min −1, motsvarande krafter på ~ 0, 4 pN respektive ~ 0, 1 pN. Dessa lägre krafter förändrade inte prevalensen av ssDNA-luckor (kompletterande figur 4).

En förklaring till ssDNA-luckor är tillfällig för tidig terminering av Okazaki-fragment, benämnd "signal release" 11, 12, 13, 14, 15 . Faktorerna som bidrar till signalutgivningsmekanismen är inte väl förståda. Bakteriofag T4- och T7-repliker, som tros innehålla endast två polymeraser, använder ofta signalfrigöringsmekanismen under replikation 13, 15 . Kanske tillåter det cellulära replikatet av E. coli två av tre polymeraser att förlänga lagringssträngade fragment och minskar förekomsten av signalfrisättning. I synnerhet visade en EM-studie av T4-systemet tre polymeraser vid gaffeln i cirka 6% av DNA-molekylerna 16 . Några av de luckor som vi observerade var ganska långa och kan tillskrivas ineffektiv användning av RNA-primrar av DiPol-replisen än till signalfrigöring. Ett TriPol-replik med dess ytterligare DNA-polymeras kan effektivare fånga RNA-primrar. Faktum är att alla tre Pol III-kärnor i TriPol kan vara aktiva samtidigt 3 . Emellertid indikerade in vivo- studien att endast två polymeraser fungerar samtidigt 4, så frekvensen med vilken alla tre polymeraser används samtidigt är inte säker.

Det kan tyckas onödigt att producera ett replisom med ett tredje Pol III för att fylla ssDNA-luckor kvar av ett DiPol-replisom (fig. 3d), med tanke på att dessa luckor helt enkelt skulle kunna fyllas i kölvattnet av gaffeln av andra polymeraser som är rikliga i E coli , inklusive höghållbarhet Pol I (400 kopior per cell) 1 . Å andra sidan innehåller E. coli- bakterier också höga nivåer av Pol II med lägre trohet (40 kopior per cell 17 ) och av Y-familjen Pol IV-translesionspolymeras med mycket låg trohet (250 kopior per cell 18 ). Således kommer ett TriPol-replikom som innehåller tre högkvalitativa Pol III-kärnor att öka den effektiva koncentrationen av detta glesa enzym (10–20 molekyler per cell). Sammanfattningsvis pekar våra observationer på slutsatsen att ett tredje polymeras vid gaffeln kan vara normen snarare än undantaget. Vi tycker att det kommer att bli spännande att avgöra om detta fynd också kan generaliseras till eukaryota system.

Den aktuella studien visar att TriPol-replisen har två distinkta fördelar jämfört med DiPol-replisen: ökad processivitet och ökad effektivitet vid syntes med lagringssträng. Ett mer processivt och effektivt replisom är särskilt viktigt för en cell som måste kunna snabba duplicering av celler för att överträffa andra organismer under det intensiva selektiva trycket av konkurrens och överlevnad samtidigt som det replikerar genomet från ett enda ursprung.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande text och figurer

    Kompletterande figur 1–4 och kompletterande metoder

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande video 1

    Replikering utförd av Dipol-repliker. Ett exempel på en film som visar realtidsobservation av kopplad ledande / släpande strängreplikation av ett minirullningscirkelsubstrat med E. coli Dipol-repliker. Kraften i det hydrodynamiska flödet pressar DNA-lipidkomplexet till en diffusionsbarriär etsad i glasytan och koncentrerar många DNA-molekyler i det visuella fältet som visas här. Bredden på det synliga området i flödesriktningen är 73 μm (motsvarande 220 kb) och flödesriktningen är från topp till botten. Individuella DNA-molekyler visualiserade med det fluorescerande färgämnet Yo-Pro1 sträckes av buffertflödet (100 ul / min) och avbildas genom total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mot slutet av filmen stoppas buffertflödet, låter strängarna återkylas, sedan startas buffertflödet igen. Filmen innehåller ungefär 7 '30' experimentella data som återges med 20 bilder per sekund (originalinhämtning är 1 ram / s vid 100 ms exponering per bildruta).

  2. 2.

    Kompletterande video 2

    Replikering utförd av Tripol-repliker. Videon visar inspelningen av en replikationsreaktion utförd av Tripol-repliker. Filmen innehåller ungefär 5 '30' experimentella data gjorda med 20 bilder per sekund (originaldatainsamling är 1 ram / s vid 100 ms exponering för varje ram).

  3. 3.

    Kompletterande video 3

    DNA-molekyler som har duplexregioner innehåller luckor på samma molekyl. Videon visar en inspelning i slutet av en replikationsreaktion med ett DiPol-replik. Buffertlösningens flöde stoppas och startas om igen, vilket gör att DNA-strängarna kan sträcka sig och sedan återkylas till sin utgångspunkt.

  4. 4.

    Kompletterande video 4

    Användning av fluorescerande SSB för att identifiera ssDNA i DNA-produkter. Videon visar tre på varandra följande inspelningar av olika DNA-produkter av DiPol-repliker, i vilka reaktioner innehöll fluorescerande märkt SSB. De tre på varandra följande inspelningarna är lätta att identifiera eftersom de har olika dimensioner. Videorna visar att DNA-produkter innehåller fluorescerande märkt E. coli SSB (med Oregon Green488 Maleimide). Duplex-DNA: t visualiseras inte eftersom Yo-Pro1 utelämnas från buffertflödet för dessa experiment. För att särskilja SSB bundet till DNA från SSB som binder icke-specifikt till ytan av flödescellen, stoppas buffertflödet alternativt och startas om för att observera återbelastningen av DNA-strängarna. Fluorescerande SSB bundet till DNA-rekyler och förlängs igen i synkroni med förändringarna i buffertflödet (medan icke-specifikt bunden SSB inte ändrar position).