En enkel metod för att härleda funktionella mscs och tillämpas för osteogenes i 3d-ställningar | vetenskapliga rapporter

En enkel metod för att härleda funktionella mscs och tillämpas för osteogenes i 3d-ställningar | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biomaterial - celler
  • Biomedicinskt material
  • Mesenkymala stamceller
  • Stamcellsforskning

Abstrakt

Vi beskriver en enkel metod för benkonstruktion med användning av biologiskt nedbrytbara ställningar med mesenkymala stamceller härledda från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPS-MSC: er). HiPS-MSC: er uttryckte mesenkymala markörer (CD90, CD73 och CD105), hade multipotens kännetecknad av tri-linjedifferentiering: osteogen, adipogen och kondrogen, och förlorad pluripotens - sett med förlust av markörer OCT3 / 4 och TRA-1 -81 - och tumörgenicitet. Dessa iPS-MSC: er är fortfarande positiva för markören NANOG. Vi undersökte vidare den osteogena potentialen för hiPS-MSC: er i syntetiska polymerpolykaprolakton (PCL) ställningar eller PCL ställningar funktionaliserade med naturlig polymer hyaluronan och keramisk TCP (PHT) både in vitro och in vivo . Våra resultat visade att dessa iPS-MSC: er är funktionellt kompatibla med de två testade 3D-ställningarna och bildade vanligtvis förkalkade strukturer i byggnadsställningarna. Sammantaget föreslår våra resultat att iPS-MSC: er som härrör från denna enkla metod bibehåller full osteogen funktion och ger en ny lösning mot personlig ortopedisk terapi i framtiden.

Introduktion

Mesenkymala stamceller (MSC), som har en multilineage potential att differentiera till mesenkymala vävnader såsom ben, fett och brosk, utgör en viktig förnybar cellkälla för ortopedisk terapi 1 . De kliniska tillämpningarna av autolog transplantation av MSC: er som härrör från vuxna vävnader, såsom benmärg och fettvävnad, hindras emellertid av deras begränsade spridningskapacitet, vilket minskar med ökande givarålder 2 .

Inducerade pluripotenta stamceller (iPS), genererade genom ektopiskt uttryckande av vissa transkriptionsfaktorer (vanligtvis Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-Myc 3 ), liknar ES-celler i ett pluripotent tillstånd 4 . Metoder för omprogrammering av mänskliga somatiska celler till iPS-celler har dramatiskt förbättrats under de senaste fem åren 5 . Icke-integrerande metoder med t.ex. direkt mRNA eller transfektion av proteiner och virus med integrationsbrist är föredragna för kliniskt kompatibla tillämpningar 6, 7, 8, 9 . Mesenkymala stamceller härledda från mus- eller humana iPS-celler (iPS-MSC: er) har rapporterats av flera grupper 10, 11 och används för osteogenes både in vitro och in vivo 12, vilket gör iPS-MSC till en lovande cellkälla för att studera ortopediska sjukdomar, regenerativ ortopedisk terapi och patientspecifik cellterapi. Dessutom har iPS-MSC: erna större kapacitet för cellproliferation än benmärgs-härledda MSC: er (som är mer än 10 gånger högre i telomerasaktivitet) och har möjlighet att sprida sig till 120 fördubblingar av befolkningen utan att förlora självförnyelsekapacitet och MSC-egenskaper 13 .

De flesta MSC-derivat uppnås genom bildandet av tredimensionella embryoidkroppar, som är mödosamma, ineffektiva och okontrollerbara för spontan differentiering 14 . Yen et al. har beskrivit en enkel metod för att differentiera mänskliga ES-celler (hESC: er) till MSC genom att byta hES-celler från ES-medium till definierat medium, som bestod av DMEM-låg glukos, 10% FBS och 1% Penicillin / Streptomycin, följt av trypsiniseringsbaserat passering 15 . I denna studie undersökte vi om denna metod kan tillämpas på mänskliga iPS-celler. Vi undersökte också potentialen för att kombinera iPS-MSC och 3D ortopediska byggnadsställningar tillverkade av biologiskt nedbrytbara polymermaterial för benutveckling.

Resultat

Generering av mänskliga iPSC: er (hiPSC) genom mRNA-omprogrammering

Vi genererade först mänskliga iPSC: er genom mRNA-omprogrammering, vilket är icke-integrerande och kliniskt relevant. Vi transfekterade humana IMR90-fibroblaster ( fig. La ) med modifierade mRNA-cocktails. Expression av Oct4, Sox2 och Klf4 observerades i transfekterade celler 16 timmar efter transfektion ( kompletterande figur 1 ). Kolonier av human ES-cellmorfologi (iPSC-kloner) blev först synliga 12 dagar efter transfektion med en modifierad mRNA-omprogrammeringscocktail och på dag 20 observerades ungefär 100 iPSC-kloner. Kloner med typisk morfologi av humana ES-celler valdes för expansion ( Fig. Ib ). IPS-cellerna var positiva för pluripotent markör OCT4 ( fig. 1c ) och NANOG ( fig. 1d ), i paritet med H7 ES-cellinjen ( fig. 1e och 1f ), och kunde bilda teratom in vivo när de injicerades i immunsupprimerad mus ( fig. 1 g ).

Image

Fas-kontrastbild av mänskliga fibroblaster (a) och mogna iPSC-klon (b). (c – d) Immunohistokemi för pluripotensmarkörer: OCT4 (c) och NANOG (d) i iPSC: er. (e – f) Immunohistochemistry of pluripotency markers: OCT4 (e) and NANOG (f) in H7 lines. (g) Teratom som bildades i SCID-möss 8 veckor efter injektion med iPS-celler.

Bild i full storlek

Ett-stegs derivat av fibroblastliknande celler från hiPSC

För att differentiera iPSC: erna till MSC: ar bytte vi iPS-cellerna från iPS-medium till medium bestående av DMEM-låg glukos (Biologiska industrier), 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin och 10% FBS (Gibco) som beskrivits tidigare 16 . IPSC: erna började förlora den typiska iPSC-morfologin och förvärvade en spindelformad morfologi vid gränsen till kolonierna på några dagar ( Fig. 2a och 2b ). Efter två veckors differentiering överfördes de differentierade iPSC: erna med trypsin / EDTA och resulterade i en fullständig morfologisk förändring av cellerna till en fibroblastisk form efter passering tre gånger ( fig. 2c ).

Image

Fas-kontrastbild av långvarig odlad iPSC-klon före differentiering (a) mellanfas för att differentiera iPS-cellerna i MSC: er (b) och fullständigt differentierade fibroblastliknande celler (passage 3) (c). (d – h) Flödescytometrisk analys av mesenkymmarkörer (en representant för tre enskilda passager, figuren som visas var från passage 7 hiPS-MSC: er). Svarta histogram: anti-CD90 (d) anti-CD73 (e) och anti-CD105 (f) och negativa markörer: anti-CD34 (g) och anti-CD45 (h). Grå histogram: motsvarande isotypkontroller (d – h). (i) karyotyp av passage 17 iPS-MSC: er.

Bild i full storlek

Karaktärisering av hiPS-MSC: er

För att undersöka om de fibroblastliknande cellerna som skiljer sig från iPSC: er var MSC: er, analyserades dessa celler (tre passager: 3, 5 och 7) genom flödescytometri för humana mesenkymala tillverkare (CD90 +, CD73 +, CD105 +, CD34 -, och CD45 - ). De iPS-härledda cellerna var verkligen positiva för CD90, CD73 och CD105 och negativa för CD34, och CD45 i alla tre testade passagerna ( Fig. 2d – 2h, resultat från passage 7). Dessa hiPS-MSC: er prolifererades aktivt och karakteriserades ytterligare som karyotypiskt normala efter splittring in vitro under 17 passager ( fig. 2i ). För att testa om dessa celler förlorar pluripotensen hos iPSC: er, mätte vi uttrycket av Oct3 / 4, NANOG och TRA-1-81 i två olika passager (8 och 12) av iPS-MSC genom flödescytometri-analys. HiPS-MSC: erna var negativa för OCT3 / 4 och TRA-1-81, dock positiva för NANOG ( fig. 3 ). Vi testade dessutom de hiPS-MSC-liknande cellerna för MSC-pluripotens genom att undersöka deras förmåga osteogenes, adipogenes och kondrogenes. För osteogenes odlades hiPS-MSC: er (passage 4) i osteogent medium och var positiva för alkaliskt fosfatas (ALP) från dag 7 ( kompletterande fig. 2b ) men inte kontrollmedium ( kompletterande fig. 2a ) och började mineralisera den extracellulära matrisen (ECM) som bestämdes med Alizarin-röd färgning på dag 14 ( fig. 4a ). För adipogenes visade oljedöd O-färgning små lipiddroppar i cytoplasma hos differentierade hiPS-MSC: er ( fig. 4b ). Efter 3 veckors odling i kondrogent medium visade pelletskulturer av hiPS-MSC: er röd-lila proteoglykanrik extracellulär matris med toluidinblå färgning ( fig. 4c ), vilket antyder att de iPS-härledda cellerna har MSC: s egenskaper och pluripotens.

Image

Flödescytometrisk analys av pluripotenta markörer: OCT3 / 4, NANOG och TRA-1-81. Grönt histogram: okontrollerad cellkontroll; Blått histogram: isotopkontroll; Rött histogram: färgat med markörer mot OCT3 / 4, NANOG respektive TRA-1-81.

Bild i full storlek

Image

(a) Alizarinröd färgning av osteogen mineralisering (dag 21). (b) Röd oljefärgning av små lipiddroppar (dag 21). (c) Toluidinblå färgning av broskpositiva celler (dag 21).

Bild i full storlek

HiPS-MSC: erna bildade förkalkade strukturer i ställningar in vitro

Vi undersökte vidare möjligheten att använda hiPS-MSC för osteogenes i 3D-ställningar. Först funktionaliserade vi PCL-ställningar med hyaluronan, vilket kunde påskynda vävnadsreparation genom att främja migration och differentiering av mesenkymceller 17 och införlivade den oorganiska komponenten ß-TCP för att förbättra osteokonduktiviteten och förbättra benvävnadsbildning 18 . Efter tillverkning av PHT-ställningar täckte Hyaluronan / TCP-matrisen homogent och anslutna PCL-ställningsfibrerna, såg med SEM-skanning ( fig. 5a ).

Image

(a) SEM-bild av PHT-ställning visar hyaluronan / TCP-matrisbeläggningar och ansluter PCL-ställningsfibrerna. (b, c) Konfokala mikrografer av cellviabilitet med CellTracker grön och Hoechst-färgning på PHT-ställningar efter en dag (b) och 7 dagars kultur (c). Gröna pixlar: levande celler; röda pixlar: kärnor. (d – f) Mätning av ALP-aktivitet (d), kalciuminnehåll (e).

Bild i full storlek

Först undersökte vi livskraften hos celler odlade på PHT-ställningar genom konfokal mikroskopi med CellTracker-grön och Hoechst-färgning. En dag efter tillsats av hiPS-MSC: er (passage 4) till PHT-ställningar fästes alla celler väl till fibrerna ( fig. 5b ). Dessutom, efter odling i proliferationsmedium under en vecka, HiPS-MSC: er fästa vid och prolifererades längs fibrerna från ställningar ( fig. 5c ). Detta indikerar att PHT-ställningar är lämpliga för tillväxt av hiPS-MSCs med tanke på att det underlättar initialt fäste av hiPS-MSC på ytan, spridning och efterföljande spridning.

Vi undersökte sedan den osteogena kapaciteten för iPS-MSC: erna i PHT- eller PCL-ställningar genom att mäta ALP-aktiviteten och kalciumavsättningen under en osteoinduktionsperiod (21 dagar). Relativ ALP-aktivitet beräknades genom normalisering till DNA-innehåll ( fig. 5d ). Såsom ses i fig. 5d ökade HiPS-MSCs-utsäde ställningar odlade i osteogent medium avsevärt ALP-aktivitet under hela osteoinduktionsperioden, oavsett ställningar. Noterbart ökade ALP-aktiviteten också i hiPS-MSCs-utsäde ställningar odlade i proliferationsmedium, vilket antyder att PCL- eller PHT-ställningar är kapabla att inducera ALP-uttryck i MSC. Emellertid observerades högre ALP-aktivitet i hiPS-MSC-ympade PHT- eller PCL-ställningar odlade i osteogent medium än i proliferationsmedium från dag 7 och framåt ( fig. 5d ). PHP-ställningens ALP-aktivitet var signifikant högre än för PCL i osteogent medium dag 21 ( fig. 5d ). Kalciuminnehåll mättes för att bedöma omfattningen av matrismineralisering på byggnadsställningarna. Det totala kalciuminnehållet var signifikant (p <0, 05) högre på dagarna 14 och 21 ställningar i osteogent medium jämfört med det i proliferationsmedium ( fig. 5e ). Återigen observerade vi att hiPS-MSCs-ympade PHT-ställningar hade högre kalciumavsättning än motsvarande PCL-ställningar (p <0, 05). Vi mätte också uttrycket av osteogenesrelaterade gener efter induktionen av osteogenes. Öka uttrycket av osteoblastmarkörer, transkriptionsfaktorn Runx2 , alkaliskt fosfatas ( ALP ), extracellulär matris och strukturproteiner som kodar genen Col1a1 och den benspecifika protein-osteocalcin-kodande genen ( OC ) observerades i hiPS-MSC-seedade PHT eller PCL ställningar odlade i osteogent medium än i spridningsmedium ( fig. 6 ). Högre induktion av ALP-expression observerades i PHT än i PCL-ställningar, vilket överensstämmer med resultaten från ALP-aktivitetsanalysen.

Image

Uttrycket av Runx2, ALP, Col1a1 och OC bestämdes med qPCR under osteo-differentiering (triplikat experimentell upprepning). Genuttryck av tidsförlopp (7, 14 och 21 dagar) analyserades i hiPS-MSCs-ympade PCL- eller PHT-ställningar odlade i proliferationsmedium (kontroll) eller osteogent medium (OM). *, statistiskt signifikant mellan PCL-OM och PCL-kontroll, PHT-OM och PHT-kontroll; #, statistiskt signifikant mellan PCL-OM och PHT-OM.

Bild i full storlek

Vi kännetecknade dessutom bildandet av ECM på dag 21 av SEM. Byggnadsställningar (PCL eller PHT) ympade med iPS-MSC: er och odlas i basalt spridningsmedium har ett tydligt cellulärt nätverk med tillhörande ECM fäst på stavarna och sträcker sig över porrarna i ställningen ( fig. 7a och 7b ). ECM-bildning observerades i PCL- eller PHT-ställningar odlade osteogent medium ( fig. 7c och 7d ) eller i kontrollmedium ( fig. 7a respektive 7b ). PCL-ställningen är ett kalciumfritt ställning ( fig. 7a ). De novo- kalciummineralisering detekterades på PCL-ställningar som samodlades med iPS-MSC i osteogent medium med energispridande röntgen-spektrometer / EDX ( fig. 7c ). PHT-ställningen innehåller kalcium på grund av TCP. Således detekterades kalcium både i proliferation och osteogent medium ( fig. 7b och 7d ).

Image

SEM-bilder visar extracellulär matrisbildning i hiPS-MSC: er Uttrycket av utsäde PCL (a) eller PHT (b) byggnadsställningar i proliferationsmedium (kontroll) och hiPS-MSCs utsäde PCL (c) eller PHT (d) ställningar i osteogent medium (OM) efter 21 dagars kultur. Energidispersiv röntgen-spektrometeranalys av förkalkad bildning på ställningar visades i den högra panelen. S, ställning; ECM, extra cellulär matris.

Bild i full storlek

iPS-MSC bildar ektopiskt ben i ställningar in vivo

Slutligen utvärderade vi om iPS-MSCs utsäde ställningar kunde främja ektopisk benbildning in vivo . Vi implanterade subkutant en PCL- eller PHT-byggnadsställning med och utan födsedda hiPS-MSC: er (passage 5) in på varje sida av en naken mus ( fig. 8a ). Fyra möss användes för varje typ av byggnadsställningar. Tolv veckor efter implantation var byggnadsställningarna väl integrerade i de omgivande värdvävnaderna, och viktigast av allt observerades inget teratom. Bildning av fibros observerades i alla ställningar implanterade med trikromfärgning, med en indikation på hög fibros i cellfröade ställningar än kontrollställningar ( fig. 8b – 8e ). Mineralisering upptäcktes endast i ställningar (PCL och PHT) utsäde med hiPS-MSC: er ( fig. 8d och 8e ). Vi använde vidare mikro-CT för att kvantifiera den ektopiska benbildningen. Nybildade ben och typiskt stavliknande trabeculae observerades i alla fyra grupperna ( Fig. 9 , vänster panel ). Dessutom var det ektopiska benet från PHT-iPS-MSCs-gruppen mer enhetligt än andra grupper ( fig. 9 , höger panel ). Vi kvantifierade sedan mikroarkitekturerna bland dessa fyra grupper ( kompletterande tabell 2 ). På grund av det begränsade antalet använda djur var emellertid de enda signifikanta skillnaderna som fanns i fallet med trabekulär separering och trabekulärt antal mellan iPS-MSC-utsäde PCL-ställningar och kontroll-PCL-ställningar.

Image

Bild av nakna möss med subkutan implantation av byggnadsställningar (a). Trichrome and Alizarin Red staining of cell-free PCL (b) cell-free PHT (c) iPS-MSCs seeded PCL (d) and iPS-MSCs seeded PHT scaffolds (e) efter implantering i nakna möss under 12 veckor. S, byggnadsställningar; Positiv Alizarin Red-färgning i (d) och (e) pekades med stjärnor.

Bild i full storlek

Image

Tredimensionell rekonstruktion av mikro-CT-bilder för de fyra grupperna visas i vänster panel, tunna lager med 5 skivor (50 mikrometer) visas i mitten och höger paneler för illustrationsändamål. De nybildade benen fördelades fint i 3D-utrymme inom ställningar och trabeculae var typiskt stavliknande.

Bild i full storlek

Diskussion

Under de senaste åren har anmärkningsvärda framsteg gjorts när det gäller att generera kliniskt kompatibla och säkrare mänskliga iPSC: er med hjälp av virus- och / eller vektorfria metoder. IPSC: erna som vi genererade genom mRNA-omprogrammering sammanfattade noggrant egenskaperna hos mänskliga ESC: er och är jämförbara med iPSC: erna som genererats med samma metod från andra grupper 7, 8 . Vi i denna studie visade vidare att dessa iPSC: er är en attraktiv stamcellskälla för att härleda mesenkymala stamceller mot ortopediska applikationer.

Bildning av embryoidkroppar (EB) är en av de mest använda metoderna för att inducera embryonala stamceller (ESC) eller iPSC: er mot mesenkymdifferentiering. Emellertid är den initiala EB-medierade differentieringen spontan och därmed komponerar alla typer av somatiska celler tillsammans med MSC: erna. Anrikning av MSC med hjälp av odling i MSC-inducerande medium följt av FACS krävs vanligtvis efter EB-differentiering 10, 12, 19, 20 . Embryoida kroppsoberoende mesenkymala differentieringsmetoder har utvecklats och optimerats under de senaste åren för att underlätta induktion av MSC från mänskliga ESC: er / iPSC: er. Barberi et al. 2005 beskrev en enkel metod för att härleda funktionella multipotenta mesenkymala prekursorer från hESC genom odling av hESC på OP9-matare i närvaro av 20% värmeinaktiverat FBS i alfa-MEM-medium följt av CD73-baserade FACS 21 . Effektiviteten för CD73-positiva celler som uppnåddes genom deras studie var relativt låg, i genomsnitt 5%. Lims grupp använde en modifierad metod genom odling av enskilda hESC på gelatinbelagda plattor i villkor som är lämpliga för MSC: s tillväxt, vilket kraftigt har förbättrat effektiviteten för att härleda funktionella MSC: er 22, 23 . Upprepad genomgång genom trypsinisering har visat sig berikade MSC: s befolkning 16, 22 . Andra modifikationer, såsom ytbeläggning av vävnadsodlingsplatta med fibrillar kollagen 24 eller kompletterande små molekylinhibitor 25, har visats för att underlätta MSC: s differentiering från hESC: er / hiPSC: er. HiPS-MSC-derivatmetoden som vi använde i denna studie liknar Yen et al. , som användes för att härleda hES-MSC: er 16 .

HiPS-MSC: erna som vi genererade närmade sig nästan 100% positiva för CD73 (från passage 3), rekapitulerade mesenkymala stamcellsmarkörer och kunde differentieras till mesenkymala linjer (osteoblaster, adipocyter och kondrocyter), i överensstämmelse med rapporten från Yen et al. 16 . Viktigast av allt är iPS-MSC: er kompatibla med och funktionella för osteogenes i 3D-ställningar både in vitro och in vivo , vilket antyder att dessa celler kan hjälpa till att utvärdera och förbättra utvecklingen av nya nano-utrustade ställningar i framtiden. Mekanismer för varför funktionella MSC: er eller mesenkymala progenitorceller benämnda av Yen et al. i sin studie 16 kan effektivt härledas från iPSC: er genom serieodling och trypsinisering behöver ytterligare undersökningar. En möjlighet kan vara förknippad med serumet som vi använde. Men eftersom vi använde en annan mängd serum från Yen et al. (även från olika leverantörer), vi spekulerar i att serumeffekten inte bör vara huvudeffektor. Valet och effekten av serum för hiPS-MSC: s differentiering behöver dock undersökas i en framtida studie. Vi har också undersökt om denna iPS-MSCs differentieringsmetod kan tillämpas på iPSC: er genererade med annan omprogrammeringsmetod snarare än mRNA-omprogrammering. Samma funktionella hiPS-MSC: er genererades framgångsrikt från tre rader av mänskliga iPSC: er producerade genom lentivirusbaserad omprogrammering (data visas inte).

Mänskliga pluripotenta stamceller härledda mesenkymala stamceller har samma in vitro- och in vivo- egenskaper som MSC: er som härrör från vuxna vävnader, såsom benmärg, fett, navelsträng, och andra 26, 27 . Det har emellertid konstant observerats att ESC / iPSC: er härledda MSC: er har en framsteg i tillväxt jämfört med vuxna MSC: er 13, 28 . Högre telomerasaktivitet och mindre senescens observerades i pluripotenta stamceller härledda MSC jämfört med vuxna MSC 13 . I denna studie har vi karakteriserat förlusten av pluripotency - sett med förlusten av OCT3 / 4 och TRA-1-81 - tillsammans med förlusten av tumörgenitet hos iPS-MSC: erna. Vi observerade dock fortfarande uttrycket av Nanog i dessa iPS-MSC: er. Nanog positiva MSC för vuxna eller iPS-MSC har rapporterats tidigare 25, 29 . Nyligen genomförd studie av Han et al. fann att uttryck av Nanog i MSC: er var avgörande för att upprätthålla MSC-spridningskapacitet och myogen differentieringspotential 30, vilket tyder på uttryck av Nanog i hiPS-MSC härrörande genom vår metod bevarar den proliferativa och mesenkymala potentialen till MSC i viss utsträckning.

Metallimplantat används ofta vid ortopedisk kirurgi, men de är inte bioresorberade och har risk för skador på det omgivande benet på grund av spänningsavskärmning 31 . Bionedbrytbara material har fått ett ökat intresse som byggnadsställningsmaterial eftersom de kan tillverkas för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar med hög bearbetbarhet, kontrollerad nedbrytning, justerbara mekaniska egenskaper och möjlighet till modifiering 32 . Även om ställning av polykaprolakton (PCL) är ett populärt material eftersom dess nedbrytning sker naturligt i kroppens ämnesomsättning och nedbrytningsföreningarna inte skadar omgivande vävnad 33, är PCL inte biologiskt aktivt, det stimulerar inte stamcellsbenbildning. I denna studie fann vi också att tillägg av hyaluronan och ß-TCP till PCL-ställningar (benämnda PHT-ställningar) kan förbättra den osteogena kapaciteten för iPS-MSC: er, inklusive öka ALP-aktiviteten, kalciummineralisering och ECM, samt mer enhetlig ektopisk benbildning in vivo . Mer prekliniska (hos stora djur som grisar) eller till och med kliniska spår av PHT-ställningar kan tillåta detta nya ställning att servera som nytt biomaterial för ortopediska applikationer. Kombinationen av iPS-MSC: er och ställningar har stor potential för patientspecifik ortopedisk terapi, eftersom det visades att differentierade celler från syngenetiska iPSC: er kunde kringgå värdens immunsvar 34 . Denna ansökan bör dock kräva mycket mer preklinisk utvärdering och testning, inklusive säkerhetsbedömning och säkrare tillvägagångssätt som i andra aspekter 28 . Bortsett från det tyder våra data och många andra studier på att iPSC: erna är en stor källa för stamceller mot patientspecifik mesenkymal stamcellsterapi.

metoder

Omprogrammering av humana fibroblaster (IMR90)

Humana primära fibroblaster IMR90 erhölls från ATCC (katalog CCL-186). Omprogrammeringsexperiment utfördes i vävnadsodlingsplattor med 6 brunnar belagda med humana matare från GlobalStem vid en celldensitet av 2, 50 x 105 per brunn. IMR90-cellerna pläterades (100 K per brunn) i Pluriton-medium (Stemgent) kompletterat med 200 ng / ml B18R (interferoninhibitor från eBioscience) genom den modifierade mRNA-omprogrammeringen av cocktailtransfektion. En RNA-dos på 1, 2 μg levererades till varje brunn med användning av RNAiMAX (Invitrogen) 4 timmar före den dagliga medietändringen. RNAiMAX-transfektionscocktails sammansattes genom utspädning av 100 ng / uL RNA 5X och 5 ul RNAiMAX per mikrogram RNA 10X separat i DPBS utan kalcium eller magnesium. Kloner av iPS-celler selekterades och överfördes till färska humana matarbelagda plattor efter 18–20 dagar av modifierad mRNA-transfektion.

Mesenkymal differentiering av iPSC utan EB-bildning

För härledningen av iPSC-MSC ersattes iPS- medium tre dagar efter delning med MSC-medium, som bestod av DMEM-låg glukos (Biologiska industrier), 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin och 10% FBS ( Gibco). MSC-mediet byttes varannan dag. Efter 14 dagars odling trypsinerades cellerna (0, 25% trypsin / 1 mM EDTA, Difco-Sigma) och expanderades i MSC-medium på 0, 1% gelatinbelagda skålar (Becton Dickinson). När sammanflödet (3-5 dagar) skördades cellerna med 0, 025% trypsin-EDTA och passerade sedan regelbundet i ett förhållande 1: 3. Vanligtvis, efter den tredje trypsiniseringen, blev en morfologiskt homogen population av fibroblastliknande celler uppenbar och användes i analysen av MSC-fenotypiska egenskaper och differentieringspotential.

Ytantigenanalys av iPS-MSC: er

Cellytantigener från humana iPS-MSC analyserades med flödescytometri. Celler (passage 3, 5 och 7) skördades genom trypsinisering från T150-kolven följt av två tvättar med PBS (med 2% FBS). Totalt färgades 5 x 105 celler i en slutlig volym av 100 ul PBS / 2% FBS under 30 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Följande murina anti-humana antikroppar användes i tillverkarens rekommenderade koncentration: anti-CD45 BD Horizon V450, anti-CD90 FITC, anti-CD105 PerCP-Cy5.5, anti-CD73 PE och anti-CD34 APC (alla från BD Biosciences, San Jose, CA). Som kontroller användes fluorokrom och koncentration matchade isotoper (alla IgG1, BD biovetenskaper). Efter två tvättar i PBS / 2% FBS återsuspenderades cellerna i 1% formaldehyd i PBS under virvelblandning. Celler analyserades med användning av en FACSAria ™ III (BD Biosciences) utrustad med en 375 nm, 488 nm, 561 nm och 633 nm laser. För varje prov samlades 30 000 celler och analyserades därefter med hjälp av FlowJo-programvaran (v. 9.3.3, TreeStar Inc., Ashland, OR).

In vitro multipotent differentiering av iPS-MSC: er

Multipotens av iPS-MSC testades med avseende på differentiering längs de osteogena, kondrogena och adipogena linjerna. Mediet ersattes var 3-4: e dag under 21 dagar. Cellerna odlade i basalmedium tjänade som kontroll. För att inducera osteogen differentiering odlades cellerna i osteogen differentieringsmedium bestående av DMEM-hög glukos (Invitrogen) kompletterat med 10% FBS (Gibco), 290 nM askorbinsyra-2-fosfat (Merck), 5 mM p-glycerofosfat (Sigma) och 100 nM dexametason (Sigma) under 3 veckor. Kalciumavsättning upptäcktes av Alizarin red S (Sigma) enligt tillverkarens instruktioner. Alkaliskt fosfatas (ALP) färgades med variaminblått B-salt (Fluka) och 1-naftylfosfatnatriumsaltmonohydrat (Merk). Adipogen differentiering inducerades med hjälp av adipogenesinducerande medium innehållande DMEM-hög glukos (Invitrogen), 15% hästserum (Sigma) och 100 nM dexametason (Sigma). Celler undersöktes med avseende på närvaro av lipidvakuoler genom oljedöd O-färgning med användning av standardtekniker såsom tidigare beskrivits (18). För kondrogen differentiering centrifugerades 2, 5 x 105 celler i ett 15-ml polypropylen Falcon-rör för att bilda en pellet som odlas i kondrogent medium, bestående av DMEM-hög glukos (Invitrogen), 50 mg / ml askorbinsyra, 100 nM dexametason, 1: 100 ITS förblandning (BD Biosciences, San Jose, CA), 40 | ig / ml L-prolin (Sigma-Aldrich), 10 ng / ml human rekombinant TGFp3 (FoU-system). Närvaro av proteoglycan (PG) dokumenterades med hjälp av toluidinblå färgning.

Subkutan implantation kirurgisk procedur

Sju veckor gamla NMRI-Nude-möss köptes från Taconic, Ejby Danmark och hölls under patogena fria förhållanden vid Core Animal Facility på Aarhus University. Alla procedurer utfördes i enlighet med djurvårds- och användningsutskottets riktlinjer vid Aarhus universitet och godkändes av det danska experimentella djurinspektoratet (licens nr 2007 / 561-1407). Möss bedövades med inhalerat isofluran 3, 75%. Efter induktion av generell anestesi gjordes två längsgående hudinsnitt på ryggytan hos varje mus, och två subkutana fickor skapades, i vilka en iPS-MSC-ställningskonstruktion och ett acellulärt kontrollställning infördes. Huden stängdes med avbrutna 6-0 nylonsuturer. Posturgisk smärtbehandling utfördes genom att tillsätta buprenorfin till dricksvattnet (Temgesic®, Reckitt Benckiser Healthcare, England) i en dos motsvarande 0, 7-1, 4 mg / kg under två dagar. Efter 12 veckor avlivades djur och implantaten fixerades i 10% neutralt buffrat formalin för histologisk analys och mikro-CT-analys.

Andra metoder som användes i denna studie tillhandahölls i en kompletterande fil. Primers som användes för Q-PCR listades i tilläggstabell 1 .

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    kompletterande metod, material, tabeller, figurer och figurlegender

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.