Signalomfattande rnai-skärm identifierar gba1 som en positiv mediator för autofagisk celldöd | celldöd & differentiering

Signalomfattande rnai-skärm identifierar gba1 som en positiv mediator för autofagisk celldöd | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • lysosomer
  • Macroautophagy

Abstrakt

Att aktivera alternativa celldödvägar, inklusive autofagisk celldöd, är en lovande riktning för att övervinna apoptosresistensen som observerats i olika cancerformer. Huruvida autofagi fungerar som en dödsmekanism genom överkonsumtion av intracellulära komponenter är fortfarande kontroversiell och förblir odefinierad på ultrastruktur och mekanistisk nivå. Här identifierade vi tillstånd under vilka resveratrol-behandlade A549 lungcancerceller dör genom en mekanism som uppfyller den tidigare definitionen av autofagisk celldöd. Cellerna uppvisade en stark och långvarig induktion av autofagiskt flöde, celldöd förhindrades genom att slå ner autofagiska gener och döden inträffade i frånvaro av apoptotisk eller nekroptotisk vägsaktivering. Detaljerad ultrastrukturell karaktärisering avslöjade ytterligare kritiska händelser, inklusive en kontinuerlig ökning över tid i antalet autofagiska vakuoler, särskilt autolysosomer, som upptar de flesta cytoplasma i terminalstadier. Detta följdes av förlust av organeller, störning av intracellulära membran inklusive svullnad av perinuclear utrymme och ibland en unik typ av kärnkraftsutjämning. En signalombredd shRNA-baserad livskraftskärm applicerades för att identifiera positiva mediatorer av denna typ av autofagisk celldöd. En av de främsta träffarna var GBA1 , Gauchers sjukdom-associerade gen, som kodar glukocerebrosidas, ett enzym som metaboliserar glukosylceramid till ceramid och glukos. Intressant nog höjdes glukocerebrosidasuttrycksnivåerna och aktiviteten, samtidigt med ökade intracellulära ceramidnivåer, som båda korrelerade i tid med utseendet på de unika dödsegenskaperna. Transfektion med siGBA1 dämpade ökningen av glukocerebrosidasaktiviteten och de intracellulära ceramidnivåerna. Det viktigaste är att GBA1-knockdown förhindrade den starka ökningen av LC3-lipidering, och många av de ultrastrukturella förändringarna som är karakteristiska för denna typ av autofagisk celldöd, inklusive en signifikant minskning av cytoplasmatiskt område upptaget av autofagiska vakuoler. Tillsammans belyser dessa fynd GBA1: s kritiska roll för att förmedla förbättrad egenförbrukning av intracellulära komponenter och endomembraner, vilket leder till autofagisk celldöd.

Huvudsaklig

Autophagy är en mycket konserverad process där dubbla membraninneslutna vesiklar bildas för att konsumera bulkcytoplasma och organeller. Det inträffar på ett konstitutivt sätt för att möjliggöra omsättning av långlivade proteiner, avlägsnande av skadade organeller och falsade proteiner och som en försvarsmekanism mot patogener. 1 Det framkallas under cellstress, näringsberövande eller tillbakadragande tillväxtfaktor, när dess kataboliska roll är avgörande för att återvinna och generera cellulära byggstenar och energi. Således är autofagi viktigt för upprätthållande av homeostas och överlevnad av celler. Men under specifika omständigheter kan autofagiska vägar främja celldöd. Den autofagiska maskinen och / eller autofagosomen kan fungera som plattformar för kaspasaktivering eller bildning av RIP1-RIP3-komplex, vilket leder till respektive apoptos och nekroptos. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Autophagy kan också sensibilisera celler för apoptos eller nekroptos genom selektiv nedbrytning av antiapoptotiska proteiner eller överlevnadsproteiner. 7, 9, 10, 11 Det kan också driva ferroptos, en järnberoende form av nekros, genom autofagisk nedbrytning av det cellulära järnlagringsproteinet Ferritin. 12 I alla dessa exempel underlättar autofagi celldöd som en indirekt orsak.

Frågan återstår om den autofagiska maskinen i sig kan leda till celldöd, utan inblandning av alternativa celldödvägar, genom överförbrukning av intracellulära komponenter. Detta koncept föreslogs för flera decennier sedan, främst baserat på ultrastrukturella observationer gjorda under insektmetamorfos, 13 däggdjursembryogenes 14 och inblandning av däggdjur eller prostata efter amning eller kastrering. 15 Senare inrättades en uppsättning kriterier för att definiera autofagisk celldöd, varvid dödsstimulus måste utlösa en ökning av autofagiskt flöde utan aktivering eller beroende av andra programmerade celldödvägar och att det kan blockeras av störningar av olika autofagiska proteiner. 16, 17 Autofagisk celldöd i utvecklingen har beskrivits slutgiltigt i lägre modellorganismer, såsom Dictyostelium discoideum och Drosophila melanogaster. I Dictyostelium induceras autofagi som svar på svält, och när det kombineras med exponering för en andra signal DIF-1, resulterar autofagisk celldöd. 18 I Drosophila förmedlar apoptos-oberoende utvecklingscelldöd under metamorfos midguttagning genom autofagi. 19, 20 Hos däggdjur har flera rapporter rapporterats om autofagisk celldöd. Exempelvis var hypoxi / ischemi-inducerad hippocampal neuronal celldöd i vuxna möss beroende av autofagi-genen ATG7 och oberoende av apoptos. 21 En annan autofagisk celldödväg, benämnd autos, inducerades av en cellpermeabel peptidaktiverande Beclin-1 22 och observerades på samma sätt i patofysiologiska miljöer, såsom svält in vitro och hypoxi-ischemi och aneroxia-nervosa in vivo . 22, 23 Celldöd genom autos, som var oberoende av apoptos eller nekroptos, förmedlades av Na + / K + -ATPase, vilket antydde att förändringar i jontransport och / eller cellulär osmolaritet orsakade celldöd. 22

Att förstå vad som omvandlar autofagi från en skyddsmekanism till en dödlig begränsas för närvarande av bristen på morfologisk och molekylär karakterisering av processen. Frågor som om autofagisk celldöd resulterar från selektiv nedbrytning av faktorer som är nödvändiga för cellöverlevnad eller från överaktivering av icke-selektiv autofagi som leder till irreversibel sönderdelning av cellen har inte lösts. Dessutom är det inte känt om inaktivering av regleringsprocesser som vanligtvis tjänar till att begränsa autofagiskt flöde i stressade celler är tillräckligt för att leda till celldöd eller om ytterligare molekylvägar behöver aktiveras samtidigt i analogi med DIF-1 sekundssignalen i Dictyostelium . Att identifiera specifika molekylära mekanismer är ett viktigt steg för att underbygga förekomsten av autofagisk celldöd.

För att ta itu med dessa problem och identifiera positiva reglerare / exekverare av autofagisk celldöd på ett systematiskt sätt genomförde vi en funktionell RNAi-baserad positiv skärm för att identifiera gener som är nödvändiga för dödlig autofagi i ett cellsystem som uppfyller den strikta definitionen av autofagcell död och visar ultrastrukturella förändringar som resulterar i cellulär demontering. Skärmen ledde till identifiering av GBA1- genen som kodar glukocerebrosidas (GCase). GCas-protein och enzymatisk aktivitet förhöjs i sena stadier under autofagisk celldöd, vilket resulterar i uppreglering av intracellulära ceramidnivåer. Molekylär och morfologisk bedömning av GBA1 knockdown-celler (KD) innebar att uppregleringen av GCase är avgörande för den förbättrade självförbrukningen av intracellulära komponenter, vilket leder till endomembran katastrof och celldöd.

Resultat

Resveratrol (RSV) inducerar autofagisk celldöd

Modellcellsystemet som valts för att dissekera molekylära aspekter av autofagisk celldöd utnyttjade RSV-behandling av A549 humana lungkarcinomceller, eftersom det uppfyllde den strikta definitionen av autofagisk celldöd. RSV inducerade en dosberoende induktion av LC3-lipidering i A549-celler, vilket indikerar autofagi-aktivering (figur la). Ökningen i LC3-lipidering korrelerade omvänt med cellviabilitet, vilket kraftigt minskade vid höga RSV-koncentrationer (figur la). Det var en kontinuerlig tidsberoende ökning av LC3-lipidering vid dödlig dosering (200 mikrometer RSV) och nådde maximala nivåer med 48 timmar (figur Ib). En klonogen överlevnadsanalys visade att 48 timmars behandling med 200 μ M RSV-behandling signifikant undertryckte den kolonidannande aktiviteten hos A549-celler (figur 1c). Anmärkningsvärt ökade LC3-lipideringsnivåerna vid samtidig behandling med RSV och den lysosomala hämmaren Bafilomycin Al (BafA1) under 4 timmar, jämfört med endera medlet enbart, vilket indikerar att den förbättrade LC3-lipideringen berodde på inducerad autofagosom-biogenes, och inte ett block i autofagosom avstånd (figur 1d). Dessutom försämrades den autofagiska receptorn p62 vid RSV-behandling, vilket blockerades av BafA1 (figur 1d). Ökat autofagiskt flöde hölls upp till 48 timmar (figur 1e), tidpunkten då dörande celler observerades (se nedan). Autofagiskt flöde övervakades också genom transfektion med mRFP-EGFP-LC3. RSV-behandlade celler visade en hög täthet av röda puncta, som representerar autolysosomer, varvid GFP-signalen släckes av den sura miljön (figur 1f). Således aktiverar RSV autofagi-flöde och celldöd i A549-celler.

RSV inducerar autofagisk celldöd. ( a ) A549-celler behandlades med olika koncentrationer av RSV under 48 timmar. Celllysat underkastades Western blotningsanalys av LC3B och GAPDH som belastningskontroll. Diagram visar omvänd korrelation mellan RSV-inducerad LC3-lipidering (röd) och cellviabilitet (blå), bestämd med CellTiter-Glo-analys. Data representerar medelvärde ± SD för tre replikat-experiment. ( b ) A549-celler behandlade med 200 mikrometer RSV under 4, 8, 24 och 48 timmar underkastades Western blotting-analys med LC3B och GAPDH. ( c ) Representativa bilder av klonogen analys av A549-celler behandlade med 200 μM RSV under 48 timmar följt av tillväxt i ytterligare 7–10 dagar. ( d och e ) Celler behandlades med 200 mikrometer RSV under 4 timmar ( d ) eller 48 timmar ( e ) i frånvaro och närvaro av 100 respektive 5 nM BafA1, och westernblottade för LC3B, p62 och GAPDH. ( f ) Representativa bilder av A549-celler transfekterade med tandem RFP-GFP-LC3 och behandlade med eller utan RSV (200 μM , 24 timmar). Skala bar, 10 μm

Bild i full storlek

Noterbart fanns det inga bevis för aktivering av apoptos och / eller nekroptos i RSV-behandlade A549-celler. Cellerna visade inte några apoptotiska egenskaper, såsom kärnkondensation eller fragmentering (kompletterande figur S1a). Dessutom klyvdes / aktiverades inte caspase-9, caspase-8 och caspase-3 vid RSV-behandling, i motsats till den positiva kontrollen, TRAIL och cycloheximid-behandlingen (figur 2a). På samma sätt fanns det inga detekterbara tecken på förbättrad MLKL-fosforylering på T357 / S358, en markör för nekroptos och RIPK3-aktivitet, till skillnad från i den positiva kontrollen, HT-29-celler behandlade med TNF a , IAP-antagonisten BV6 och z-VAD 24 (figur 2b). Vidare räddade varken pan-caspase-hämmaren Q-VD eller RIPK1-hämmaren Necrostatin-1 och MLKL-specifik hämmare nekrosulfonamid (NSA) RSV-inducerad celldöd (figur 2c). Undersökning av ROS-nivåer med användning av cellpermeabel H2 DCFDA indikerade en ökning efter 48 timmar RSV-behandling (kompletterande figur Sb). Samtidig behandling med RSV- och ROS-rensare N- acetylcystein lyckades inte rädda cellviabilitet (kompletterande figur S1c), vilket indikerar att ROS-signalering inte är en hastighetsbegränsande händelse vid RSV-inducerad celldöd.

RSV inducerar apoptos- och nekroptosoberoende celldöd. ( a och b ) Immunoblotanalys av apoptotiska ( a ) och nekroptotiska ( b ) markörer i RSV (200 mikrometer ; 48 timmar) behandlade A549-celler. A549-celler behandlade med 100 ng / ml TRAIL och 20 μg / ml cykloheximid (CHX) under 2 timmar användes som en positiv kontroll för apoptos, och HT29-celler behandlade med 100 ng / ml TNF, 1 μM IAP-antgonist BV6 och 20 μM Z-VAD (TBZ) under 8 timmar fungerade som en positiv kontroll för nekroptos. Den klyvda caspase-3-bloten omprövades med caspase-8-antikropp. Fosforylerad MLKL (pMLKL) -bläck reproberades med total MLKL-antikropp. ( c ) A549-celler behandlade med RSV (200 μM ; 48 h) i närvaro och frånvaro av pan-kaspasinhibitor Q-VD (10 μM ), MLKL-hämmare NSA (10 μM ) eller RIPK1-hämmare nekrostatin-1 ( Nec-1, 10 μM ) utvärderades med avseende på cellviabilitet med hjälp av CellTiter-Glo-analys. Data representerar medelvärde ± SD för tre replikat-experiment. ( d ) A549-celler transfekterade med antingen ATG7 eller ATG12 siRNA behandlades med RSV (200 mikrometer ; 48 timmar) och utsattes för Western blotting-analys för LC3B-lipidering. Cellviabilitet bedömdes med användning av CellTiter-Glo-analys och representerades som vikningsförändring i RSV-behandlade celler jämfört med obehandlade celler. Data representerar medelvärde ± SD för fyra replikat-experiment; statistisk signifikans bedömdes med användning av envägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukey's post hoc- test, ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( e ) A549-celler transfekterade med antingen Beclin 1 eller ULK-1 siRNA behandlades med RSV (200 mikrometer ; 48 timmar) och utsattes för Western blotting-analys för LC3B-lipidering. Cellviabilitet bedömdes med användning av CellTiter-Glo och representerades som ett förhållande av ATP-nivåer i RSV-behandlade celler kontra obehandlade celler. Data representerar medelvärde ± SD för tre oberoende experiment, statistisk signifikans bedömdes med användning av envägs ANOVA följt av Tukey's post hoc- test; NS: icke-signifikant. ( f ) A549-celler behandlades med RSV (200 mikrometer ; 8 timmar) i frånvaro eller närvaro av Brefeldin A och utsattes för western blotting. Visad är en representativ immunblot för nedbrytning av p62. ( g ) GFP-LC3 och mCherry-GalT-uttryckande A549-celler behandlade med RSV (200 mikrometer ; 24 timmar) behandlades för att bestämma kolokalisering mellan GFP-LC3-positiva och mCherry-GalT-positiva punkter. Pilarna pekar på regioner av Golgi som visar kolokalisering med GFP-LC3 puncta i RSV-behandlade celler

Bild i full storlek

Betydligt minskade KD för väsentliga autofagi-gener ATG7 och ATG12 av siRNA RSV-inducerad LC3-lipidering, som förväntat, och viktigast av allt, ökad cellviabilitet (figur 2d). På liknande sätt lindrades dödssvar genom KD för ATG4B och MAP1LC3B , utförda som en del av en siRNA-skärm (se figurerna 5b och c nedan). Sammantaget indikerar dessa data att RSV-inducerad celldöd skiljer sig från apoptos och nekroptos och i stället kräver det funktionella basmaskineriet för autofagi och aktivt autofagiskt flöde, vilket därför klassificeras som autofagisk celldöd.

Intressant nog förhindrades inte LC3-lipidering och celldöd inducerad av RSV genom utarmning av uppströmsregulatorer Beclin-1 och ULK1 (figur 2e), vilket antyder att RSV aktiverar icke-kanonisk autofagi. Nya rapporter har identifierat Golgi som en huvudmembrankälla för icke-kanonisk autofagi. 25, 26 Följaktligen blockerades autofagiberoende nedbrytning av p62 av RSV delvis av Golgi-destabiliseringsmedlet, Brefeldin A (figur 2f). Samtransfektion av A549-celler med GFP-LC3 och Golgi-markören mCherry-GalT, följt av behandling med RSV under 24 timmar, visade viss överlappning mellan mCherry-GalT och GFP-LC3, vilket stödde möjligheten att Golgi fungerar som en källa för autofagosom biogenes i RSV-inducerad autofagi (figur 2g).

RSV leder till förbättrad bildning av autolysosom

Ultrastrukturell undersökning av TEM av RSV-behandlade A549-celler avslöjade dramatiska förändringar som återspeglade olika temporära stadier av autofagisk celldöd. Även om kontroll A549-celler visade normal ultrastruktur, innehöll mitokondrier, ER och Golgi med få autofagiska vakuoler (AVs) (figur 3a), men RSV-behandlade celler (48 timmar) hade många AV: er, inklusive dubbelmembranbundna strukturer (autofagosomer) och enkel- membranbundna strukturer med elektronstätt material i lumen (autolysosomer) (figur 3b och c och kompletterande figur S2d). Undersökning av AV-innehållet avslöjade nedbrutna mitokondrier, intracellulära membran och cytoplasmatiskt material (figurerna 3b, c och g), vilket indikerar att bulkmakroautofagi inträffade i dessa celler. Kvantifiering av AV: erna indikerade en gradvis ökning av det genomsnittliga antalet AV: er per cell och en ökning i procent av AV kontra cytoplasmatiskt område per cell från 8 till 48 timmar (figur 3e och f). De flesta celler behandlade med RSV under 8 timmar uppvisade en måttlig ökning i antalet AV: er och svullna Golgi, men behöll ändå normal ER, mitokondrier och nukleär morfologi (kompletterande figur S2a). Vid 24 timmar, utöver den fortsatta ökningen i antalet AV, var flera kännetecken för cellspänning framträdande, inklusive tomma vakuoler, onormala mitokondrier, svullna Golgi och ER och förstorat perinuclear utrymme, som i de flesta celler, var enhetligt runt kärnan (Kompletterande figur S2b). Noterbart hittades många av AV: erna i närheten av Golgi (kompletterande figur S2c). Vid 48 timmar fortsatte antalet AV och procent av AV-området kontra cytoplasmatområdet att öka (figurerna 3b, c, e och f och kompletterande figur S2d) tills de flesta organeller och cytosol konsumerades genom autofagi (kompletterande figur S3b) och lämnar tomma vakuoler. Det perinucleara utrymmet svälldes ytterligare, vilket skapade en stor åtskillnad mellan de inre och yttre kärnmembranen (figur 3c och d, och kompletterande figur S2d). Anmärkningsvärt, och i motsats till apoptotiska och nekrotiska celler, var RSV-behandlade celler starkt vidhäftande, även i de sista dödsstadierna. Plasmamembranet förblev intakt i de flesta celler, vilket dokumenterades av bristen på PI-färgning upp till 48 timmar (visas inte). Ibland detekterades kärnkraftsutjämning, vilket lämnade bakom spöket av döda celler fästa vid plattan (figur 3h). Detta var också synligt under ljusmikroskopi utan cellfixering (figur 3i) och var unik för RSV-inducerad autofagisk celldöd.

Ultrastrukturella egenskaper hos RSV-inducerad autofagisk celldöd. A549-celler behandlades med 200 mikrometer RSV under 48 timmar och betraktades av TEM. ( a ) Kontrollceller med normal ultrastruktur. ( b - d ) Representativa RSV-behandlade celler som visade ökat antal AV: er, defekta mitokondrier ( b ) och ökat perinukleärt utrymme (PNS, c och d ). ( e och f ) Kvantifiering av AV-nummer per cell ( n = 30-50 celler) och procentandelen cytoplasmatiskt område som täcks av AV: er ( n = 10 celler) för kontroll- och RSV-behandlade celler (200 μM för 8, 24 och 48 h). Data representerar medelvärde ± SD för tre replikat-experiment; statistisk signifikans bedömdes med användning av envägsanalys av varians följt av Tukey's post hoc- test, * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( g ) Representativa bilder av AV: er med delvis nedbrutna mitokondrier, cytoplasmatiskt material och subcellulära membran. ( h ) Representativa bilder av kärnceller som observerats vid RSV-inducerad autofagisk celldöd. Asterisk betecknar det cellulära området som tidigare varit upptaget av kärnan. ( i ) Representativ bild av flytande kärnor (indikerade med pilar) omgiven av cellulärt skräp fäst vid plattan

Bild i full storlek

Därefter färgades RSV-behandlade celler med Lysotracker Red DND-99, som avger röd fluorescens inom sura vakuoler. Lysotracker Rödfärgning ökade i RSV-behandlade celler och dispergerades genom cytoplasma, i motsats till kontrollceller, som visade perinuclear kluster (figur 4a och b). BafA1-behandlade celler uppvisade inte positiv lysotrackerröd färgning (kompletterande figur S3a). Omfördelningen av sura fack i RSV-behandlade celler överensstämmer med det ökade AV-antalet. För att bestämma om de tomma vakuolerna var autolysosomer i sent stadium där cellinnehållet försämrades (kompletterande figur S3b) utförde vi immunogold-märkning av A549-celler transfekterade med LAMP1-GFP eller RFP-GFP-LC3 och behandlades med RSV under 24 timmar. Både tomma vakuoler och vakuumer med en enda membran innehållande last var positiva för LAMP1 (figur 4c och kompletterande figur S3c) och LC3 (figur 4d och kompletterande figur S3d), vilket stödde den autolysosomala naturen hos dessa vakuoler. Tillsammans överensstämmer den ultrastrukturella morfologin och den ökade lysosomfärgningen som motsvarar rikliga autolysosomer med förbättrad autofagisk nedbrytning, vilket stödjer hypotesen att överdriven konsumtion / hyperautofagi ledde till celldöd.

RSV förbättrar autolysosomaltal. ( a ) Kontroll och RSV (200 mikrometer , 24 timmar) behandlade A549-celler färgades med Lysotracker Red och visualiserades med ljus (vänsterpaneler) och fluorescerande mikroskopi. Panelen till höger är förstoringen av det boxade området i mittpanelen. ( b ) Kvantitativ representation av procenttal celler som visar perinuclear kluster eller spridd Lysotracker Röd färgning i frånvaro eller närvaro av RSV under 24 timmar. Värdena uttrycks som medelvärde ± SD för tre experiment, med> 200 celler räknade per experiment. ( c och d ) Immunogold-märkning för LAMP1-GFP ( c ) och mRFP-EGFP-LC3 ( d ) i 24 timmar RSV-behandlade A549-celler. Paneler som visas på botten är förstoringar av rutor som visas ovan. Pilar indikerar guldpartiklar associerade med membranet hos tomma vakuoler. MT, mitokondrier

Bild i full storlek

RNAi-skärm för att identifiera nya modulatorer av autofagisk celldöd

För att identifiera gener och vägar involverade i RSV-inducerad autofagisk celldöd utfördes en shRNA-baserad överlevnadsscreen med användning av Cellecta's Lentiviral shRNA Library Module 1 riktad till 5043 signalvägsassocierade gener (~ 5 shRNA / gen). Skärmen baserades på hypotesen att celler som uttrycker shRNA som är inriktade på gener som är nödvändiga för autofagiska celldödvägar skulle visa en reproducerbar överlevnadsfördel för dödsignalen. Dessa shRNA: er skulle vara överrepresenterade jämfört med deras respektive nivåer före behandling vid beräkning med shRNA-streckkodsanalys (kompletterande figur S4a). A549-celler transducerades med biblioteket och behandlades sedan med 200 mikrometer RSV under 4 dagar, följt av en 4 dagars återhämtning. Fördelningen av alla shRNA i dessa prover (T8), jämfört med transducerade men obehandlade celler (T0), analyserades med användning av djup sekvensering. Data erhållna för alla shRNA: er normaliserades till medelvärdet av shRNA: er som riktade sig till luciferas, som tjänade som en intern kontroll. Data från biologiska duplikat visade en god grad av korrelation (kompletterande figur S4b). Fällförändringsförhållandena för de normaliserade läsantalet för alla shRNA beräknades genom att dela de RSV-behandlade värdena (T8) med motsvarande referensprovvärden (TO). De härledda vikningsförändringsförhållandena logtransformerades och plottades. Från de 10% högst poängsatta shRNA: erna, var träffar begränsade till 55 kandidatgener (figur 5a och kompletterande tabell S1), baserat på följande kriterier: (1) anrikning av tre eller flera oberoende shRNA per gen, (2) gånger förändring ≥1, 5, (3) P <0, 05 och (4) FDR <0, 1 (kompletterande figur S4a). Anmärkningsvärt var ATG4B , en nyckel autofagigen som modulerar lipidering av LC3B och andra ATG8-homologer, bland de bästa träffarna. Genontologianalys av de 55 bästa generna indikerade småmolekylmetabolism, negativ reglering av glukuronosyltransferasaktivitet och lipidmetabolism som signifikant berikade termer (kompletterande figur S4c). Generna som är involverade i lipidmetabolism, transport och bindning är särskilt intressanta med tanke på cellmembranförändringarna som åtföljde RSV-inducerad autofagi. Dessutom visade KEGG-vägsanalys anrikning av gener associerade med metaboliska vägar, cancervägar och lysosomen (kompletterande figur S4c). Inkluderade i den senare gruppen var CTSE och GBA1 , kodande lysosomala enzymer cathepsin E respektive GCase. Framväxten av UGT1A9, som kodar UDP-Glucuronosyltransferas 1A9, kan vara kopplad till upptäckten att detta enzym kan glukuronidera RSV och ändra dess biotillgänglighet och effektivitet. 27, 28 Transferrin ( TF ), ett järnbindande transportprotein som är involverat i ferroptos, identifierades också bland de positiva träffarna, vilket tyder på att förändringar i cellulärt järninnehåll kan vara kritiska för denna form av autofagisk celldöd. 29, 30

RNAi-medierad skärm för modulatorer av autofagisk celldöd. ( a ) Grafisk representation av poolade Lentiviral shRNA-baserade primära skärmresultat, rangordnade från mest berikade till mest utarmade. Y- axeln representerar det genomsnittliga log2-vikningsändringsvärdet (T8 / T0) från två replikatskärmar. Cirkeldiagram representerar topp 10% signifikanta träffar erhållna från den poolade shRNA-skärmen. Totalt togs 55 gener med ≥3 shRNA-hits överrepresenterade i T8-prov jämfört med T0-prov för ytterligare analys. ( b ) Anpassade körsbärsplockade siRNA-biblioteksplattor (96 brunn) framställda från högt rankade träffar transfekterades och 48 timmar senare, behandlades med RSV under ytterligare 48 timmar. Cellviabilitet mättes med CellTiter-Glo, och vikförändringarna normaliserades till RISC-fria siRNA-transfekterade brunnar. Visade är KD: erna vilket resulterar i minst 50% räddning av celldöd (avgränsad med prickad linje). Värden är medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment; resultaten från individuella experiment visas till vänster. KD-förhållanden som visar> 50% räddning indikeras i rött, medan siRNA KD som visar <50% räddning visas med blått. ( c ) Diagram som jämför graden av räddning i cellviabilitet hos den positiva kontrollen MAP1LC3B med negativ kontroll. Data representerar vikningsändring som medelvärde ± SEM för tre replikat-experiment. Statistisk betydelse bestämd med två-tailed oparad Studentt-test, * P <0, 05

Bild i full storlek

För att ytterligare prioritera träffarna applicerades en summa av rankad standardiseringsresultat algoritm 31 och de bästa 24 träffarna valdes för ytterligare validering i en siRNA-baserad sekundär skärm (figur 5b och kompletterande tabell S2). A549-celler transfekterades omvänt med ett anpassat siRNA-bibliotek riktat mot dessa gener och med ytterligare kontroller. siRNA mot autofagi-genen MAP1LC3B inkluderades som en positiv referens. Cellviabilitet bedömdes efter 48 timmar RSV-behandling med hjälp av CellTiter Glo-analysen. Data erhållna från biologiska triplikat visade en hög grad av korrelation (kompletterande figur S4d). Denna kortsiktiga analys, som var strängare än det initiala positiva valet på lång sikt, minskade listan till åtta gener vars KD gav> 50% ökning av cellviabilitet (dvs. RSV / obehandlat förhållande ≥1, 5) (figur 5b) . KD av fyra gener från denna lista, specifikt TF , UGT1A9 , ATG4B och GBA1 , räddade cellviabilitet i en utsträckning som kan jämföras med KD för MAP1LC3B (figur 5c).

GCase reglerar autofagisk celldöd

GCase, som kodas av GBA1 , metaboliserar glukosylceramid (GlcCer) till ceramid och glukos i lysosomen. Lysosomal ceramid omvandlas vidare till sfingosin med sur ceramidas, som sedan lämnar lysosomen och kan omvandlas till ceramid genom ceramidsyntaser på ER. 32 I överensstämmelse med GBA1: s status som en toppfunktionell träff höjdes GCas-proteinnivåerna ~ 3 gånger i närvaro av RSV under autofagiska celldödinducerande förhållanden (200 μM RSV; 48 timmar) (figur 6a). Denna höjd inträffade mellan 24 och 48 timmar då antalet AV: er var maximalt (kompletterande figur S5a, jämför figur 3e och f). Liknande ökningar av GCas observerades i ytterligare cellinjer som inducerade autofagi som svar på RSV, inklusive HeLa, SH-SY5Y, HEK293 och PC3 (kompletterande figur S5b). Det är viktigt att dos-svarskurvan för GCas-induktion av RSV i A549-celler matchade den observerade reduktionen i cellviabilitet (kompletterande figur S5c, jämför med figur 1a). Intressant nog förändrades inte GCas-nivåerna i A549-celler svälta av näringsämnen, som genomgår kanonisk överlevnadsautofagi (kompletterande figur S5d). I överensstämmelse med förändringarna i proteinuttryck förhöjdes GCase-enzymaktivitet också med RSV vid 48 timmar (figur 6b). Analys av sfingolipidprofilen med masspektrometri avslöjade att långvarig exponering (48 timmar) för RSV resulterade i en total ökning av alla undersökta sfingolipider, inklusive ceramid, sfingosin och sfingosin-1-fosfat (S1P) (figur 6c, e och f). Ceramiden som ökade inkluderade en mängd acylkedjor (kompletterande figur S5e). Inga signifikanta förändringar i ceramidnivåer detekterades vid 24 timmar, när expressionsnivåerna för GCase-protein var relativt låga (kompletterande figurer 5a och f). GlcCer-nivåerna förhöjdes av RSV och nådde en 6, 4-faldig ökning jämfört med basnivåerna (figur 6d). Sphingomyelin-nivåerna ökades också något (1, 37-faldigt, kompletterande figur S5g), i överensstämmelse med en möjlig stimulerande roll för RSV vid de novo- sphingolipidsyntes, som tidigare rapporterats. 33 Vikningsökningen var emellertid signifikant lägre än för GlcCer, vilket antydde att den senare kan tjäna som en källa för ceramid-, sfingosin- och S1P-produktion via förhöjda GCas-nivåer.

RSV inducerar autofagisk celldöd genom GCas-reglerad sfingolipidmetabolism. ( a ) Western blotting av GCase i obehandlade och RSV (200 μM ; 48 h) behandlade A549-celler (vänster) och kvantifiering genom densitometri av GCas-nivåer representerade som medelvärde ± SD för fyra oberoende experiment, med obehandlade nivåer inställda på 1. ( b ) GCase-aktivitet uppmätt i obehandlade och RSV (200 μM ; 48 h) behandlade celler. Värden är medel ± SD för tre oberoende experiment. ( c - f ) Lipidmasspektrometrisk analys av ceramid ( c ), GlcCer ( d ), sfingosin ( e ) och S1P ( f ) från obehandlade och RSV (200 μM ; 48 h) behandlade A549-celler. Paneler ( c - f ) representerar medelvärde ± SD för två oberoende experiment; statistisk signifikans bestämd med två-tailed oparad students t- test, * P <0, 05; ** P <0, 01

Bild i full storlek

KD av GBA1 av siRNA ablaterade RSV-induktionen av GCase-protein och enzymatisk aktivitet (figur 7a och b). Det är viktigt att RSV-inducerad autofagisk celldöd dämpades av GBA1 KD (figur 7c), i överensstämmelse med resultaten från den ursprungliga skärmen. Dessutom blockerade GBA1 KD den starka ökningen i LC3-lipideringsnivåer som upptäcktes vid 48 timmar RSV-behandling jämfört med icke-målriktad (NT) KD (figur 7b). Sphingolipidprofilanalys med masspektrometri visade att RSV-inducerade ökningar i ceramid, specifikt C16: 0, C18: 0, C20: 0 och C24: 1 acylkedjearter, sphingosin och S1P dämpades vid GBA1 KD (figurerna 8a – c och e ). Dessa resultat korrelerar förändringarna i sfingolipidprofilen med LC3B-lipidering och celldöd och indikerar att GCas-aktivitetsnivåer är kritiska för dessa lipidförändringar. Noterbart observerades ingen signifikant ökning i GlcCer-nivåer vid KD för GBA1 , varken i obehandlade eller RSV-behandlade celler (figur 8d), liknande den tidigare dokumentationen i GBA (+/−) mushjärnor som visade minskad GCase-aktivitet. 34, 35

GBA1 KD hämmar RSV-inducerad autofagisk celldöd. ( a ) GCase-aktivitet i siNT- och siGBA1-transfekterade celler behandlade med eller utan RSV (200 μM ; 48 h). Data representerar medelvärde ± SD för tre replikat-experiment; statistisk signifikans bedömdes med användning av envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Tukey's post hoc- test, *** P <0, 001. ( b ) Western blotting av GCase och LC3-lipidering i siNT- och siGBA1-transfekterade celler behandlade med eller utan RSV (200 μM ; 48 h). ( c ) Cellviabilitet bestämdes genom CellTiter-Glo-analys efter 48 timmar RSV-behandling i siNT- och siGBA1-transfekterade A549-celler. Data representeras som ett förhållande av ATP-nivåer i RSV-behandlade celler till obehandlade celler i siNT- och siGBA1-transfekterade A549-celler. Data representerar medelvärde ± SD för sex replikat-experiment. Statistisk signifikans bestämd med två-tailed oparad students t- test, *** P <0, 0001. ( d ) Kvantifiering av det totala cytoplasmatiska området täckt av AV: er ( n = 10 celler) för siNT- och siGBA1-celler obehandlade eller behandlade med RSV (200 μM , 24 timmar). ( e ) Representativa bilder av siNT och siGBA1 KD-celler behandlade med RSV under 24 timmar. Data representerar medelvärde ± SD för tre replikat-experiment. Statistisk signifikans bedömdes med användning av envägs ANOVA följt av Tukey's post hoc- test, *** P <0, 001

Bild i full storlek

GBA1 KD ändrar sphingolpidnivåer. ( a - e ) Lipidmasspektrometrisk analys av ceramid ( a ), sfingosin ( b ), S1P ( c ), GlcCer ( d ) och olika kedjelängd ceramidarter ( e ) i siNT- och siGBA-transfekterade celler behandlade med och utan RSV (200 μM ; 48 h). Data representerar medelvärde ± SD för två replikat-experiment. Statistisk signifikans bedömdes med användning av envägsanalys av varians följt av Tukey's post hoc- test, ** P <0, 01

Bild i full storlek

Slutligen indikerade ultrastrukturanalyser en signifikant minskning av cytoplasmatisk AV-område i RSV-behandlade GBA1 KD-celler jämfört med NT KD-celler (figur 7d). Den ökade GCase-aktiviteten som svar på RSV bidrar således till den observerade ökningen av LC3B-lipidering och det resulterande överflödet av AV: er. Det är viktigt att ultrastrukturell morfologianalys visade att många av de RSV-inducerade kännetecknen för autofagisk celldöd minskade genom utarmning av GBA1; RSV-behandlade GBA1 KD-celler visade många normala mitokondrier, Golgi och ER, jämfört med RSV-behandlade NT KD-celler (figur 7e). Sammantaget bevisar dessa resultat den kritiska betydelsen av ökade GCas-nivåer och de tillhörande förändringarna i sfingolipider vid reglering av autofagisk celldöd.

Diskussion

I detta arbete valde vi RSV-behandlade A549-celler som ett modellsystem för att studera autofagisk celldöd, baserat på våra fynd att de visade en stark ökning av autofagisk flöde och massiv celldöd, som inte involverade apoptos eller nekroptos men krävde autofagin generna Atg4B , Atg7 , Atg12 och MAP1LC3B . Till skillnad från autos, varvid celldöd inte var beroende av de sena nedbrytande stadierna inom autolysosomen, kvarstod 22 massiv nedbrytning av autolysosomen i detta system tills celldöd var uppenbart. Dessutom indikerade ultrastrukturanalys att AV: erna upptog minst 25% av cytoplasmatiskt område; detta är sannolikt en underskattning eftersom denna kvantifiering inte inkluderade de tomma vakuolerna som visade sig vara autolysosomer i sen fas genom immunogold märkning. Sådan djupgående autofagisk aktivitet överensstämmer med en självförbrukningsmekanism som leder till celldysfunktion. Dessutom observerades endomembranfel. Det är inte klart om detta är resultatet av utarmning av membrankällor på grund av deras omväg för att stödja den betydande autofagosombiogenesen eller från autofagosomberoende konsumtion av cellmembran. Fenotypen skilde sig ytterligare från den tidigare beskrivna autosen genom att membranbundna elektrontäta strukturer inte observerades i det perinucleara utrymmet och plasmamembranskada inte var framträdande. 22, 36 Sammantaget ger detta arbete för första gången en detaljerad ultrastrukturell karaktärisering av celler som dör genom egenförbrukning via stark kontinuerlig autofagisk flöde.

Den Beclin-1- och Ulk1-oberoende karaktären av autofagi-aktiveringen och dess beroende av Golgi tyder på att RSV inducerade icke-kanonisk autofagi-beroende celldöd, i överensstämmelse med tidigare fynd. 37 Icke-kanonisk autofagi som involverar aktivering av de ubiquitinliknande konjugeringsvägarna och de novo autofagosomsyntes utan inmatning av uppströmsignaler från mTOR, Ulk1 och Vps34 har tidigare beskrivits. 25, 26 Uppenbarligen kringgår dessa system de tidigare rapporterade återkopplingsmekanismerna i kanonisk autofagi som begränsar egenförbrukning, såsom återaktivering av mTOR, hämmar AMPK 38 eller försämrar ULK1, Beclin-1 och Vps34. 39, 40 Huruvida icke-kanoniska autofagi-system som använder andra typer av bromsar bör undersökas ytterligare. Ändå visar vårt arbete att, under autofagisk celldöd, är en kontinuerlig ostörd ökning av det autofagiska flödet upp till terminalstegen väsentligt.

För att bestämma om, i analogi med Dictyostelium , 18, 41, 42, det upprätthållna autofagiska flödet fungerar i tandem med andra inducerade molekylvägar som tillsammans omvandlar överlevnads-autofagi till autofagisk celldöd, applicerade vi här för första gången en opartisk funktionell shRNA-skärm för att upptäcka essentiella gener som förmedlar autofagisk celldöd. Vår signalomfattande skärm ledde till identifiering av det lysosomala enzymet GCase, kodat av GBA1- genen, som en signifikant träff som validerades i en sekundär siRNA-skärm. RSV-inducerad autofagisk celldöd åtföljdes av en ökning av GCas-uttryck och aktivitet och ansamling av ceramid vid sena tidpunkter då de ultrastrukturella kännetecknen för celldöd var framträdande. Viktigast av allt minskade GBA1 KD LC3B-lipidering och räddades från onormala cellulära ultrastrukturförändringar och celldöd. Detta framträdande resultat av GBA1 KD indikerar att den GCas-medierade vägen är hastighetsbegränsande för att driva systemet mot autofagisk celldöd.

De direkta målen för GCas-härledda ceramider involverade i den ökade LC3-lipideringen behöver fortfarande identifieras. C18-ceramid på mitokondriella membran visade sig fungera som en receptor för LC3-II på autofagosomer eller autolysosomer, vilket ledde till dödlig mitofagi. 43 Men i vårt system är den självförstörelse som räddats av GBA1 KD inte begränsad till mitokondrier. Tidigare rapporter om ceramid-medierade signalvägar såsom aktivering av Beclin-1 av JNK-medierad fosforylering av dess hämmare, Bcl-2, 44 eller genom uppreglering av Beclin-1-uttryck 45 är uppenbarligen inte relevanta i vårt system. Spännande, förutom en potentiell roll i signalering, kan sfingolipidinnehållet i membran påverka deras fusionsförmåga och krökning, 46 höjer hypotesen att de GCas-medierade förändringarna i sfingolipider kan påverka andra steg i autofagosom / autolysosombildning, utöver förbättringen av bildningen LC3-lipidering. Noterbart indikerar tidigare rapporter att ceramider också kan utlösa apoptos i olika cancercellinjer genom att bilda kanaler i mitokondriell membran vilket leder till aktivering av caspase-3. 47, 48 Emellertid har RSV visat sig inducera dihydroceramider i vissa celler, 49 som kan hämma bildning av ceramidkanal och induktion av apoptos. 50 Dessutom kan den tidiga och massiva konsumtionen av mitokondrier genom det förbättrade autofagiska flödet inducerat av RSV förhindra aktivering av mitokondriabaserad apoptos. Således beror det slutliga cellulära resultatet på den totala cellsignaleringsmiljön som induceras av den initiala utlösaren, inklusive de typer av producerade ceramider och deras intracellulära lokalisering.

GCase har för närvarande fått betydande uppmärksamhet eftersom GBA1 -funktionsförlustmutationer, som leder till Gauchers sjukdom, också är en viktig riskfaktor för att utveckla Parkinsons sjukdom. 51 Den senare anslutningen har tillskrivits minskad basal autofagisk aktivitet efter GBA1- inaktivering, vilket leder till ackumulering av a- synuklein. 52 I vår studie, i motsats till Gauchers sjukdom, är GBA1- medierad autofagi skadlig på grund av dess överaktivering över basnivåerna. Således konceptet att förlust av funktion och hyperaktivering av GCase båda kan förändra subcellulära ceramidnivåer vilket leder till felreglering av autofagi, med skadliga konsekvenser för cellen, placerar GBA1 i en kritisk hastighetsbegränsande övergång.

Avslutningsvis främjar våra data fältet autofagisk celldöd genom att tillhandahålla en detaljerad ultrastrukturell karaktärisering av de döende cellerna och en mekanistisk insikt som belyser två kritiska händelser: en kontinuerlig aktivering av autofagiskt flöde över tid utan bromsar och induktion av GCase-uttryck och dess enzymatiska aktivitet, som driver systemet mot överförbrukning och membrankatastrof.

Material och metoder

Kemikalier, cellodling och transfektioner

RSV och cyklohexamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), BafA1 (LC Laboratories, Woburn, MA, USA), Q-VD-OPH (BioVision, Milpitas, CA, USA), LysoTracker Red DND-99 ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), H 2 DCFDA (Invitrogen), Hoechst 33342 (Invitrogen), NSA (EMD Millipore, Billerica, MA, USA), TRAIL (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), NBD-C6- GluCer och NBD-C6-Cer (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) erhölls från de angivna leverantörerna. TNF (Ybdy, Seoul, Sydkorea), pan-caspase-hämmare z-VAD.fmk och bivalent IAP-antagonist BV6 (Wuxi Apptec, Shanghai, Kina) tillhandahöll vänligen professor David Wallach, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel och Brefeldin A (Calbiochem, San Diego, CA, USA) av Dr. Yifat Merbl, Weizmann Institute of Science, Israel. Om inte annat anges köptes alla andra kemikalier och reagens från Sigma-Aldrich.

A549 lungadenokarcinomceller och humana HT29 kolorektala cancerceller erhölls från ATCC (Manassas, VA, USA) och bekräftades vara mycoplasma-fria genom periodiska PCR-tester. De bibehölls i DMEM respektive McCoys 5A-medium (Biologiska industrier, Cromwell, CT, USA). Båda medierna kompletterades med 2 mM glutamin (Gibco, Saint Aubin, Frankrike), 100 U / ml penicillin och streptomycin (Gibco) och 10% FBS (Hyclone, Logan, UT, USA). Övergående transfektioner av siRNA och DNA utfördes med användning av Lipofectamine2000 (Invitrogen) enligt tillverkarens instruktioner. siRNA-valideringsskärm utfördes i ett 96-brunnarsformat i omvänd transfektionsläge med användning av DharmaFect1-transfektionsreagens (Dharmacon, Lafayette, CO, USA).

Klonogen överlevnad och cellviabilitetsanalyser

A549-celler obehandlade eller behandlade med 200 μ M RSV under 48 timmar tvättades, trypsiniserades, räknades och pläterades i plattor med 12 brunnar. Celler fick växa och bilda kolonier under 1 vecka följt av färgning med en blandning av 6, 0% glutaraldehyd och 0, 5% kristallviolett under 30 minuter. Plattorna sköljdes sedan med vatten och fick torka vid rumstemperatur. Tallrikar med kolonier skannades med HP Scanner (HPE, Ra'anana, Israel).

Cellviabilitet mättes med användning av luminescensbaserad CellTiter-Glo-analys enligt tillverkarens instruktioner (Promega, Madison, WI, USA). Luminescens avlästes i en Veritas mikroplattluminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA). I siRNA KD-experiment beräknades cellviabilitet genom att dela luminescens från RSV-behandlade brunnar med deras motsvarande vehikelbehandlingsbrunnar, som ytterligare normaliserades till deras respektive siNT (icke-målriktning) negativ kontroll.

Levande cellfärgning och fluorescensmikroskopi

A549-celler transfekterade med RFP-GFP-LC3-konstruktion (en snäll gåva från professor Tamotsu Yoshimori, Osaka University, Japan) eller samtransfekterad med GFP-LC3 och mCherry-GalT (en snäll gåva från Professor Orly Reiner, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) pläterades på poly-L-Lysine (Sigma-Aldrich) belagda 13 mm glasskydd. Efter fästning behandlades cellerna med 200 μ M RSV (Sigma Aldrich) under ytterligare 24 timmar. Celler fixerades i 3, 7% paraformaldehyd och betraktades genom fluorescensmikroskopi (Olympus BX41, Olympus, Tokyo, Japan) med 60 × (NA 1, 25) UPlan-Fl oljedypningsmål. Control and RSV (200 μ M; 48 h) treated cells were incubated with LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen) at a final concentration of 100 nM and imaged by fluorescence microscopy. Approximately 200 cells per sample were counted for quantification of pattern of LysoTracker Red staining in triplicate experiments. Cell death by apoptosis was determined by Hoechst 33342 nuclear fragmentation assay as previously described. 53 Briefly, cells treated with or without RSV (200 μ M; 24 and 48 h) and 100 ng/ml TRAIL with 20 μ g/ml CHX were incubated in 100 ng/ml Hoechst 33342 for 15 min in dark followed by rinsing in PBS and imaged by fluorescence microscopy. Control and RSV (200 μ M; 48 h) treated cells were incubated with ROS detector H 2 DCFDA at a final concentration of 10 μ M for 30 min, washed and imaged by fluorescence microscopy. Digital images were obtained using DP50 CCD camera with the ViewfinderLite and StudioLite software (Olympus, Tokyo, Japan). A549 cells transfected with LAMP1-GFP (Addgene, Cambridge, MA, USA) or RFP-GFP-LC3 constructs in parallel were treated with or without RSV 24 h, followed by fixation for immunoelectron microscopy.

TEM, immunogold labeling, and morphometric analysis

A549 cells treated with or without RSV for 8, 24 and 48 h were fixed with 3% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer containing 5 mM CaCl 2 (pH 7.4), followed by 1% osmium tetroxide supplemented with 0.5% potassium hexacyanoferrate tryhidrate and potasssium dichromate in 0.1 M cacodylate (1 h), stained with 2% uranyl acetate in water (1 h), dehydrated in graded ethanol solutions and embedded in Agar 100 epoxy resin (Agar Scientific Ltd., Stansted, Essex, UK). Ultrathin sections (70–90 nm) were cut and processed for imaging. Immunogold labeling was performed in cells fixed in 4% paraformaldehyde with 0.1% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer (pH=7.4) for 1 h at room temperature. Fixed cells were pelleted and embedded in gelatin, soaked overnight in 2.3 M sucrose and rapidly frozen under liquid nitrogen. Frozen ultrathin (70–90 nm) sections were cut with a diamond knife at −120 °C on a Leica EM UC6 ultramicrotome (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). The sections were collected on 200-mesh Formvar-coated nickel grids. Sections were blocked with a solution containing 1% BSA, 0.1% glycine, 0.1% gelatin and 1% Tween 20. Immuno-labeling was performed using affinity-purified anti-GFP antibodies (1 : 50, Abcam, Cambridge, MA, USA), overnight at 4 °C, followed by exposure to goat anti-Rabbit IgG coupled to 10-nm gold particles (1 : 20, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), for 30 min at room temperature. Contrast staining and embedding were performed as previously described. 54 The sections were viewed and photographed with a FEI Tecnai SPIRIT (FEI, Eindhoven, The Netherlands) transmission electron microscope operated at 120 kV and equipped with an EAGLE CCD Camera (FEI, Eindhoven, The Netherlands).

Morphometric measurements were performed on digital micrograph images using the Image J software (FEI, Eindhoven, The Netherlands). The number of AVs per cell area was quantified by double blind analysis. AV area and cytoplasmic areas edges were traced and density was determined. The amount of cytoplasmic area occupied by AVs was determined by dividing the observed densities of AV area by cytoplasmic area of the cell.

immunoblotting

Cells were lysed in PLB buffer (0.1 M sodium phosphate, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate) supplemented with 1% protease inhibitors and 1 mM PMSF. In experiments in which phosphorylated proteins were analyzed, 1 mM sodium orthovanadate was added to the lysis buffer. Proteins separated on SDS-PAGE were blotted onto nitrocellulose membranes, which were blocked and incubated with antibodies for LC3B, ATG7 and GBA1 (Sigma-Aldrich), cleaved caspase-3, caspase-8 and cleaved caspase-9 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p62 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Atg12 (MBL Life Science, Woburn, MA, USA), Beclin 1 (SantaCruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), ULK1 (Abcam). Total MLKL (Gene Tex, Irvine, CA, USA) and phospho MLKL (S358) antibody (Abcam) were a kind gift from Professor David Wallach, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel. Detection was performed with goat anti-mouse or goat anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch), followed by chemiluminescence using EZ-ECL Solution (Biological Industries).

Primary shRNA screen

A549 cells were transduced with DECIPHER 27 K Pooled shRNA library-Human Module 1 (Cellecta, Mountain View, CA, USA). The library consists of 27 500 shRNAs targeting 5043 genes (approximately five or six shRNAs per gene) in the pRSI12-U6-(sh)-HTS4-UbiC-TagRFP-2A-Puro expression vector. In the pRSI12 expression vector, the shRNA is expressed under wild-type U6 RNA polymerase III promoter and TagRFP (Evrogen, Moscow, Russia) and puromycin resistance genes under human ubiquitin C promoter. In addition, all shRNAs have unique, optimized 18-nt barcode sequences, which facilitate High-Throughput Sequencing data analysis and identification of functional shRNAs. Seventy million cells were transduced with the shRNA library at MOI of 0.3 (allowing each individual shRNA of the library with the complexity of 27 500 to be delivered to at least 700 cells). After 48 h, infected cells were selected with puromycin (2 μ g/ml) for an additional 48 h. On completion of puromycin treatment, cells were washed, trypsinized, counted and split into two populations. The first population was snap frozen on dry ice and stored at −80 °C refrigerator as T0 reference time point. The second population was treated with 200 μ M RSV for 4 days. After RSV treatment, surviving cells were seeded at optimal density (5 million cells per 15 cm plate) and allowed to proliferate for another 4 days. Later, the cells were pelleted, snap-frozen and stored at −80 °C refrigerator as T8 time point. The frozen samples (T0 and T8) were submitted to Cellecta, Inc. for genomic DNA extraction, bar code amplification, high-throughput sequencing and deconvolution analysis.

Data analysis was performed for all samples by normalizing each individual sample to 20 million reads, followed by dividing it by the mean of the shRNAs targeting Luciferase gene. At individual shRNA level, Student's t -test for each shRNA was performed and genes with three or more shRNAs showing a significant abundance (fold change ≥1.5 or Log 2 fold change ≥0.58; P ≤0.05 and FDR<0.1) were considered as positive hits. Fifty five genes that passed the set criterion as mentioned above were passed through a sum of ranked standardization score algorithm 31 to rank the hits. The genes were ranked based on gene scores obtained by the formula: μ /( σ /√ n ), where μ is the mean log 2 fold-change ratios of shRNAs targeting the gene of interest, σ denotes the variance of the log 2 fold-change ratios and n corresponds to number of shRNAs targeting the gene. The top 24 hits emerging from this analysis were taken forward for the secondary siRNA-based validation screen.

siRNA validation screen

A549 cells were reverse transfected in 96-well plates with 50 nM indicated siGENOME siRNA pools (Dharmacon) using DharmaFECT1 transfection reagent (Dharmacon). Cells were treated 48 h posttransfection with 200 μ M RSV for an additional 48 h. Cell viability was measured using CellTiter-Glo assay kit (Promega), as described above. siRNA targeting MAPLC3B (Dharmacon) was used as a positive control, while non-targeting pool 2, RISC-free siRNA, non-targeting 5 (NT5) and Mock transfection served as negative controls. An identical protocol was used for siGBA1 validation experiments using ON-TARGET plus siRNA pools (Dharmacon). For three independent biological replicates of the siRNA validation screen, relative luminescence units was obtained by normalizing the RSV-treated sample plate with the corresponding vehicle-treated plate. The ratio of RSV-treated wells to their corresponding vehicle-treated wells was calculated for all the wells, and the data were further normalized to the respective RISC-free siRNA negative control. Positive hits were defined as genes whose KD led to a significant increase (fold-change 1.5; P ≤0.05) in cell viability in comparison to the corresponding RISC-free siRNA control.

GCase activity

GCase was assayed as described 55 with some modifications. Briefly, 8 μ M C6-NBD-GlcCer was incubated with 5 μ g of a cell lysate in a final volume of 250 μ l McIlvaine's buffer (pH 4) for 1 h at 37 °C. The reactions were terminated by addition of chloroform:methanol (1 : 2, vol:vol), lipids extracted 56 and separated by thin layer chromatography using chloroform:methanol: 9.8 mM CaCl 2 (60 : 35 : 8, vol:vol:vol) as the developing solvent. NBD-GlcCer and NBD-ceramide were imaged using Typhoon 9410 Variable Mode Imager and bands quantified using Image-QuantTL (GE Healthcare, Rehovot, Israel).

Sphingolipid analysis

Untransfected and siRNA-transfected A549 cells treated with or without RSV were snap frozen under liquid nitrogen and dried by lyophilization. LC-ESI-MS/MS was performed using an ABI 4000 quadrupole linear ion trap mass spectrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 57, 58 using sphingolipid internal standards from Avanti Polar Lipids.

Statistisk analys

The statistical significance of differences between means was assessed either by standard Student's t -test or by one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, as mentioned in the figure legends. Values with P <0.05 were considered significant.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

  2. 2.

    Kompletterande tabell 2

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

  4. 4.

    Kompletterande figur 4

  5. 5.

    Kompletterande figur 5

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

    Supplementary Information accompanies this paper on Cell Death and Differentiation website (//www.nature.com/cdd)