Sgk1 påverkar run / ranbp1 / rangap1 via sp1 för att spela en kritisk roll i kärnkraftsexporten före mirna: en ny väg för epigenomisk reglering | vetenskapliga rapporter

Sgk1 påverkar run / ranbp1 / rangap1 via sp1 för att spela en kritisk roll i kärnkraftsexporten före mirna: en ny väg för epigenomisk reglering | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Cancergenomik
  • Cell signalering
  • RNA-transport

Abstrakt

Det serum- och glukokortikoidreglerade kinaset (SGK1) styr celltransformation och tumörprogression. SGK1 påverkar mitotisk stabilitet genom att reglera uttrycket av RANBP1 / RAN. Här demonstrerar vi att SGK1-fluktuationer indirekt modifierar mognaden för pre-miRNA genom att modulera jämvikten på RAN / RANBP1 / RANGAP1-axeln, huvudregulatorn för nukleo-cytoplasmatisk transport. Nivåerna av pre-miRNA och mogna miRNA utvärderades genom qRT-PCR, i totalt extrakt och efter differentiell kärnkrafts / cytoplasmisk extraktion. RANBP1-uttrycket är det begränsande steget i regleringen av SGK1-SP1-beroende kärnkraftsexport. Dessa resultat validerades i icke-relaterade tumörmodeller och primära humana fibroblaster och bekräftades i tumörinstruerade nakna möss. Nivåerna av pri-miRNA, DROSHA, DICER och sektionens fördelning av XPO5 dokumenterades. Experiment med användning av RANGTP-konformationella antikroppar bekräftade att SGK1, genom RANBP1, sänker nivån för det GTP-bundna tillståndet för RAN. Denna nya mekanism kan spela en roll i den epigenomiska regleringen av cellfysiologi och öde.

Introduktion

Det serum- och glukokortikoidreglerade kinas 1 (SGK1) är ett serin / treoninkinas som tillhör AGK-kinasfamiljen och delar strukturella och funktionella likheter med AKT, PKC och S6K 1, 2, 3 . SGK1 reglerar jonkanaler och bärare 4, 5, pumpar 6, enzymer 7, 8 och transkriptionsfaktorer 9, 10, 11, 12 och medierar tillväxtfaktorberoende cellöverlevnad och tillväxtsignaler 5 . SGK1 regleras av mTOR-beroende fosforylering av det hydrofoba motivet (H-motiv) på serin 422 13, följt av fosforylering och full aktivering av 3-fosfoinositidberoende kinas-1 (PDK1) 14 . SGK1 regleras av cAMP 15, insulin 7, 15, 16, 17, 18, 19, 20, glukokortikoider 4, IL-2 21, IGF-1 22 och TGFp 23 och främjar överlevnad och proliferativa signaler i normala celler och cancerceller. SGK1-uttryck och / eller aktivitet ökas i flera humana tumörer, inklusive bröst 24, 25, tunga 26, äggstocks 27 och prostata 28 cancer, multipelt myelom 29 och icke-småcellig lungcancer 30 . SGK1-utsläppsmodeller har visat resistens mot kemisk karcinogenes 31 . SGK1 reglerar cellöverlevnad, spridning och differentiering via fosforylering av Mouse Double Minute 2 (MDM2), vilket leder till p53 ubiquitylering och proteosomal nedbrytning 32 . Dessutom påverkar SGK1 mitotisk stabilitet i koloncancerceller genom att reglera uttrycket av RANBP1, den huvudsakliga regulatorn för RAN GTPas. SGK1 förbättrar transkriptionen av RANBP1 via SP1-aktivering och fosforylering av serin 59 och påverkar således Taxol-känslighet i dessa celler 10 . Nyligen screenade vi en familj av dubbla SRC / ABL små molekylinhibitorer som kännetecknas av en substituerad pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-ställning för deras förmåga att hämma SGK1- och AKT1-kinasaktivitet, tävlande med ATP för dess bindningsdomän 33 . Bland dessa molekyler visade sig SI113 vara särskilt selektiv för hämning av SGK1-kinasaktivitet men svagt effektiv mot AKT1. I själva verket visade den dosberoende kurvan för SI113-beroende SGK1- och AKT1-hämning att hämning av SGK1-aktivitet sker med ett IC50-värde av 600 nmol / L, med en selektivitet som är nästan 1000 gånger högre än för AKT1 33 . På liknande sätt visar SI113 dålig hämning av andra kinaser (t.ex. ABL och SRC) som ursprungligen ansågs vara förmodade mål för SI113 34 .

Dessutom inducerar SI113 celldöd och förändrar tillväxthastigheten för olika maligna cellinjer. SI113 inducerar apoptos i RKO kolonkarcinomceller vid användning antingen ensamt eller i kombination med paklitaxel 34 och hämmar tumörtillväxt i hepatocarcinommodeller in vitro och in vivo 35 och i glioblastomcellinjer, vilket visar en synergistisk effekt med strålbehandling 35 . Proteomövergripande biokemiska analyser har visat att SI113 nedreglerar nivåerna av nedströmsmål för SGK1 med definierade roller i neoplastisk transformation, såsom MDM2, NDRG1 och RAN nätverksmedlemmar 36 . Under senare år har Ran-nätverket (t.ex. RAN-GTP / BNP, RANGAP1 och RANBP1) antagits för att vara involverat i kontrollen av mitotisk stabilitet 10, 37, kromosomsegregation 38 och proliferation 39 och i resistens mot olika läkemedel som fungerar i pro-metafas 10, 40 . Under intervall distribueras emellertid detta proteinkomplex längs en brant gradient av GTP / BNP-förhållandet vid kärnporen och reglerar kärnimport / export av proteiner och ribonukleinsyror 41, 42 . Detta system involverar funktionen av specialiserade proteiner (importiner och exportiner), som också är väsentliga för kärntransport och extranukleär mognad av mikroRNA-prekursorer 43 . Molekylkomplexet RAN: GTP: Exportin - 5 anses nu vara motorn för 44, 45-export före miRNA. I synnerhet migrerar pre-miRNA / XPO5 / RANGTP-komplexet till cytoplasman, där pre-miRNA frisätts som svar på hydrolysen av RANGTP till RANGDP, stimulerad av RANGAP1 och andra erforderliga kofaktorer 43, 46 . Det har nyligen visats att SGK1-hämning av GSK 650394 försvårar kärnkraftsexporten av influensa vRNP till cytoplasma i A549-celler 47 . Icke desto mindre återstår de mekanismer genom vilka SGK1 reglerar kärnkraftsexporten av ribonukleoproteiner att belysas. I den aktuella studien demonstrerar vi för första gången att SGK1, som verkar genom SP1-beroende transkriptionell och funktionell reglering av RANBP1 och RANGAP1, påverkar bindningsstatusen för GTP / BNP för RAN såväl som RANBP1 / RANGAP1 proteinmängd och lokaliseringen av XPO5, vilket således förbättrar kärnkraftsexport och mognad av pre-miRNA, utan att påverka pri-miRNA-nivåer markant, i en cellulär modell av HCC och i flera neoplastiska och icke-tumörala primära cellinjer. Denna process reverseras antingen genom SI113-beroende eller sh-medierad SGK1-hämning / utarmning. Denna SGK1-beroende reglering av pre-miRNA demonstrerades ytterligare in vivo genom SI113-behandling av humana HCC-tumörer xenograftade i NOD / SCID-möss. Vi definierade en hierarkisk modell genom vilken SGK1 modulerar den RANBP1 / RANGAP1-beroende regleringsaktiviteten för RAN, en central regulator för transporten av kärnan till cytoplasma av pre-mikroRNA. Dessutom tillhandahöll vi ytterligare data som stöder en avgörande roll för RANBP1 i verkningsmekanismen för SI113, en ny SGK1-hämmare som visar anticanceregenskaper i flera neoplastiska modeller.

Resultat

Effekter av SGK1-modulering på före / mogen-miRNA-omvandling i en hepatocarcinomcellmodell

För att verifiera om SGK1-modulering påverkar kärnkraftsexporten av korta icke-kodande RNA (miRNA) inom RAN: GTP: Exportin - 5-komplex 44 genom att modulera aktiviteten för RAN / RANBP1-vägen 10, 45, använde vi först qRT-PCR för att undersöka nivåerna av 85 mikroRNA involverade i cancer i en levercarcinom-härledd HUH7-cellinje behandlad med antingen SI113 eller enbart vehikel (DMSO). SGK1-hämning resulterade i en signifikant minskning av uttrycket av 57 mikroRNA, med det relevanta undantaget från hsa-let-7d, som visade förbättrad expression (fig. 1A), ingen signifikant variation observerades för de andra undersökta mikroRNA (data visade inte) . För att bedöma om den observerade effekten var hänförlig till en reglering av före / mogen-miRNA-omvandling snarare än till en förändring i transkriptionell modulering av miRNA, valde vi ut 4 miRNA (miR-103a, miR-182, miR-191, miR-223 ) 48, 49, 50, 51, 52, 53 som spelade olika roller i utvecklingen av hepatocellulärt karcinom och utvärderade de relativa uttrycksnivåerna för varje pre-miRNA jämfört med uttrycket i motsvarande mogna former (fig IB). Bland de undersökta miRNA: erna observerades en stor ökning av pre-miRNA-uttryck, medan motsvarande mogna former tycktes vara fullständigt nedreglerade vid SGK1-hämning. Liknande erhölls i HUH7-celler stabilt tystade för SGK1 (fig. 1C), vilket således visade specificiteten av SGK1-hämningen (kompletterande figurerna Ib och 2c) för att reglera nivåerna av prekursor och mogna former av de testade miRNA. Uppregleringen av SGK1-uttryck (kompletterande fig. 1a) via en lentiviral-medierad metod (fig. 1D) resulterade i ett annat uttrycksmönster (72 timmar efter infektion), kännetecknat av en nettoökning av både mogna och föregångare miRNA-former . I en oberoende uppsättning experiment jämförde vi expressionsmönstren i SI113-behandlade celler eller stabilt tystade SGK1-HUH7-celler (shSGK1) med de i SGK1-överuttryckande celler (fig. 1E och F). Varje tillstånd normaliserades till ortologkontrollen (dvs. fordonet ensamt, Scrambled, EGFP, respektive). I SGK1-överuttryckande HUH7-celler var uttrycket av miRNA-prekursorer tydligt nedreglerade, medan uttrycket av mogna miRNA tycktes vara uppreglerat jämfört med det i SI113-behandlade celler eller shSGK1-HUH7-celler, vilket tyder på att SGK1-aktivitet är väsentlig och begränsande för omvandlingen av de pre / mogna formerna av de undersökta miRNA: erna.

( A ) Kvantitativ RT-PCR-analys av mogna mikroRNA-nivåer i HUH7-celler behandlade med antingen SI113 (12, 5 μM under 72 timmar) eller DMSO. En hundreledel av den totala mängden cDNA syntetiserad från 50 ng av totalt RNA amplifierades via realtid PCR med 2X SYBR TM Green master mix (Exiqon) i en miRCURY LNA TM Cancer Focus microRNA PCR Panel 96-brunnsplatta, V1. MI (Exiqon). Värden, kalibrerade med kalibrator mellan plattan och normaliserade till SNORD49A, uttrycks som vikningsuttryck ± SD för fyrdubbla prover och analyseras med t- test. ( B ) Kvantitativ RT-PCR-analys av fyra mikroRNA (hsa-miR-103a, hsa-miR-182, hsa-miR-191 och hsa-miR-223), i deras mogna och föregångande former, i SI113-behandlade HUH7-celler och HUH7-kontrollceller. Mogna mikroRNA amplifierades med användning av specifika miRCURY LNA TM PCR-primersatser (Exiqon). För prekursorerna utsattes 1 μg av totalt RNA för omvänd transkription med användning av cDNA-omvänd transkriptionssats med hög kapacitet (Applied Biosystems) enligt instruktionerna som beskrivs i ref. 68, med en 1 mikrometer antisense-grundkoncentration (tabell 1) 67 . Amplifiering utfördes såsom rapporterats i metoderna. Resultaten, normaliserade till SNORD49A, representeras som Log 10 för viktsuttryck ± SD för triplikatbedömningar och utvärderades med användning av t- testet. ( C ) Kvantitativ RT-PCR-analys av mogna och föregångande mikroRNA i stabilt tystade SGK1-HUH7-celler genom lentiviral transduktion. Analysen utfördes som ovan. ( D ) Kvantitativ RT-PCR-analys av mogna och föregångande mikroRNA i HUH7-celler stabilt överuttryckande EGFP-SGK1 genom lentiviral transduktion. Analysen utfördes som ovan. ( EF ) Kvantitativ RT-PCR av mogna och föregångande mikroRNA i HUH7-celler stabilt överuttryckande EGFP-SGK1 och HUH7-celler behandlade med 12, 5 mikrometer SI113 under 72 timmar eller stabilt tystnad för SGK1, respektive. Resultaten uttrycks som Log 10 för viktsuttryck efter subtraktion av den relativa kontrollen och presenteras som förhållandet mellan de värden som observerats i SGK1-uttryckande celler och de i celler behandlade med 12, 5 μM SI113 under 72 timmar eller stabilt tystnad för SGK1. Statistisk betydelse visas längst upp i diagrammet. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

SGK1-hämning påverkar pre-miRNA / miRNA-omvandling i flera neoplastiska och normala primära cellinjer

Vi utvidgade vårt tillvägagångssätt för flera cancercellinjer: ADF (human glioblastoma cell line), PC3 (human prostate cancer cell line) and OVCAR3 (human ovarian carcinoma cell line). I alla de undersökta cellinjerna sammanfattade resultaten av SI113-beroende SGK1-hämning resultaten som erhölls i HUH7-celler, dvs en ökning av föregångare och en nettoreduktion i de mogna formerna av de undersökta miRNA: erna (fig. 2A – C). Intressant nog erhölls samma resultat i primära icke-tumörcellinjer (HDFA-human dermal fibroblast) (fig. 2D), vilket antyder en allmän roll för SGK1 i cellfysiologin för miRNA nukleo-cytoplasmatisk transport.

Kvantitativ RT-PCR-analys av fyra mikroRNA (hsa-miR-103a, hsa-miR-182, hsa-miR-191 och hsa-miR-223), innefattande både deras mogna och prekursorformer, i ADF ( A ), OVCAR3 ( B ), PC3 ( C ) och primära HDFa ( D ) cellinjer, behandlade med antingen SI113 (12, 5 μM under 72 timmar) eller DMSO. qRT-PCR utfördes såsom tidigare beskrivits, och resultaten för båda formerna normaliserades till SNORD49A och presenteras som Log 10 för viktsuttryck ± SD för triplikat. Statistisk betydelse bestämdes med hjälp av t- testet och rapporteras längst upp i diagrammet. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

SGK1 är väsentlig och hastighetsbegränsande vid kontrollen av kärnkraftsexport av prekursor

För att verifiera om effekterna av SGK1 på pre / mogna miRNA-omvandling var beroende av aktiv reglering av föregångare av nukleär export, utförde vi differentiell kärn- och cytoplasmatisk RNA-extraktion. Nivåerna av prekursor och mogna miRNA utvärderades i båda avdelningarna via qRT-PCR. Vi fann att SI113-beroende SGK1-hämning resulterade i en dramatisk reduktion av det cytoplasmiska uttrycket av både pre-miRNA och mogna miRNA, medan inga signifikanta förändringar i nivåerna av kärnprekursorer registrerades (fig. 3A). Omvänt orsakade SGK1-överuttryck (fig. 3B) (kompletterande fig. La) cytoplasmisk ackumulering av prekursorer (72 timmar efter infektion), med en relativ ökning av deras mogna former och en liten men signifikant minskning av uttrycket av kärnprekursorer vid minst i två av de fyra miRNA som beaktats. För att verifiera specificiteten för vår modell utfördes en liknande differentiell kärna / cytoplasmaseparation i HUH7-celler stabilt tystnad för SGK1. Effekten av SGK1-tystnad var liknande den som observerades med SI113-behandling: en skarp och dramatisk reduktion i de cytoplasmiska nivåerna hos både pre-miRNA: s mogna miRNA och en kärnansamling av pre-miRNA på listan i två av de fyra miRNA som beaktades (fig. 3C). Bona fide kärnkraftsekstraktion bekräftades genom frånvaron av detekterbara mogna miRNA i kärnan, medan den lilla nukleolära RNA SNORD49A lätt detekterades och förstärktes. Sammantaget tyder dessa data starkt på att SGK1-uttryck och aktivitet påverkar exporten och indirekt mogningen av de undersökta miRNA: erna i HUH7-celler, troligen genom att reglera RAN-systemet.

( A ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursor och mogna mikroRNA i de nukleära och cytoplasmiska fraktionerna av SI113-behandlade HUH7-celler. Isolering och rening av både cytoplasmatiskt och nukleärt RNA från celler genomfördes med användning av ett specifikt kit (NorgenBiotek Corp., Thorold, ON, Kanada). För att undvika genomisk DNA-kontaminering, speciellt i kärnfraktionen, utfördes spjälkning av DNase I (TURBO TM DNase, Ambion, Life Technologies, Paisley, UK) enligt tillverkarens instruktioner. RT-PCR utfördes såsom tidigare beskrivits. ( B ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursor och mogna mikroRNA i kärnorna och cytoplasma av HUH7-celler stabilt överuttryckande SGK1. Analysen utfördes såsom beskrivits ovan. ( C ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursor och mogna mikroRNA i kärnorna och cytoplasma av HUH7-celler stabilt tystnad för SGK1. Analysen utfördes såsom beskrivits ovan. Statistisk betydelse rapporteras högst upp i diagrammet. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

SGK1 reglerar kärnexporten före miRNA på ett RANBP1-beroende sätt genom signalering genom SP1

De observerade effekterna kan tillskrivas den SGK1-beroende regleringen av RANBP1 och RAN 10, 54 uttryck, vilket påverkar kärnkraftsexporten av miRNA 41 . För att underbygga vår hypotese erhöll vi RANBP1-överuttryckande celler genom transient transfektion (kompletterande figur 1d) och bedömde nivåerna av föregångare och mogna former av miRNA antingen i närvaro eller frånvaro av SI113 (12, 5 μM, 72 h). Vi fann att RANBP1 överuttryck nedreglerade nivåerna av miRNA-prekursorer och antagoniserade effekten av SI113 till viss grad när den användes i kombination (fig. 4A, vänster panel). Intressant nog vred uttrycksmönstret för mogna miRNA under samma förhållanden perfekt i närvaro av SI113, vilket orsakade signifikant nedreglering av dessa former, medan RANBP1 förbättrade nivåerna av mogna miRNA när de användes som ett enda medel och antagoniserade effekterna av SI113 till viss grad när den används i kombination (Fig. 4A, höger panel). Resultaten av RANBP1-tystnad (kompletterande fig. 1e och 2b) speglade effekterna av RANBP1-överuttryck, vilket ledde till en signifikant minskning av uttrycket av mogna miRNA, som antagoniserades av SGK1-överuttryck till viss grad. I själva verket visade differentiell kärnkrafts- och cytoplasmatisk extraktion att RANBP1-tystnad resulterade i en jämn minskning av nivåerna av miRNA-prekursorer i det cytoplasmiska facket och hög kärnansamling av dessa molekyler; dessa effekter antagoniserades delvis av SGK1-överuttryck (fig. 4B), vilket förmodligen förstärkte det kvarvarande RANBP1-uttrycket. Det cytoplasmiska uttrycket av mogna miRNA modifierades genom RANBP1-tystnad som förväntat. Nivåerna av mogna miRNA minskade signifikant vid RANBP1-tystnad, en effekt endast delvis antagoniserad av samtidigt SGK1-överuttryck (kompletterande figur 3). Sammantaget tyder dessa data starkt på att RANBP1 förmedlar den SGK1-beroende kontrollen av kärnkraftsexport och omvandling av pre-miRNA. Noterbart var denna effekt specifik för RANBP1, eftersom överuttryck av RANGAP1 (kompletterande fil 1d), RANBP1-interaktorn i RAN-GTPas-komplexet 55, hade ingen mätbar effekt på prekursor / mogna miRNA-omvandling i frånvaro av RANBP1-överuttryck (Fig. 4C). På liknande sätt kunde RANBP1 rädda HUH7-celler från den anti-proliferativa effekten som utövades av SI113 (12, 5 μM, 72 h), vilket bekräftade våra tidigare observationer 10 (kompletterande fig. 4a). Däremot motverkade RANGAP1-överuttryck inte effekten av SI113 förutom om RANBP1 också var överuttryckt (kompletterande fig. 4b). I vårt tidigare arbete 10 visade vi att SGK1 kunde reglera RANBP1 och indirekt RAN: s funktion genom serin 59-fosforylering av SP1, som är den huvudsakliga RANBP1-transkriptionsregulatorn. För att bestämma om SGK1 modulerar kärnkrafttransporten av pre-miRNA genom SP1 och RANBP1 utförde vi specifik tystnad av SP1 i närvaro eller frånvaro av SGK1-överuttryck (Fig. 4D). SP1-tystnad (kompletterande fig. 2a) orsakade en ökning i miRNA-nivåerna hos prekursorer och en minskning av de mogna formerna, på samma sätt som erhållits genom SI113-beroende SGK1-hämning. Under SP1-tystnad kunde dessutom överuttryck av SGK1 inte motverka effekterna av SP1-tystnad på kärnkraftsexporten av pre-miRNA, vilket tyder på att SP1 är nödvändigt för denna specifika SGK1-beroende aktivitet (se ovan).

( A ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursor och mogna mikroRNA i HUH7-celler som överuttrycker GFP-RANBP1 eller GFP, med eller utan 12, 5 μM SI113-behandling under 72 timmar, jämfört med GFP-kontrollcellinjen. ( B ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursormikroRNA i kärnorna och cytoplasma av HUH7-celler stabilt överuttryckande EGFP-SGK1 eller EGFP, med eller utan övergående tystnad RANBP1 (shRANBP1). ( C ) Kvantitativ RT-PCR-analys av fyra prekursormikroRNA (hsa-miR-103a, hsa-miR-182, hsa-miR-191 och hsa-miR-223) i HUH7-RANGAP1-celler, med eller utan SI113-behandling (12, 5 μM under 72 timmar) och HUH7-RANGAP1 / RANBP1-celler jämfört med kontrollceller, med eller utan samma behandling. ( D ) Kvantitativ RT-PCR-analys av prekursor och mogna mikroRNA i HUH7-celler stabilt överuttryckande EGFP-SGK1 eller EGFP, med eller utan övergående tystnad SP1 (shSP1), jämfört med EGFP / SCR-kontrollcellinjen. Resultaten plottas som vikuttrycket och analyserades via envägsanalys av varians (ANOVA), följt av Bonferroni-medeltestet för flera jämförelser. Analyserna utfördes såsom beskrivits ovan. * P ≤   0, 05; ** P ≤   0, 01; *** P ≤   0, 001. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

SGK1-hämning påverkar uttrycket av RANBP1 / RANGAP1, vilket orsakar förändringar i miRNA-kärntransport i HCC-tumörer uppbyggda i NOD / SCID-möss

SI113-beroende hämning av SGK1 i HUH7-celler resulterar i reduktion av RANBP1-uttryck, som detekteras genom bedömningar av RNA och protein via qRT-PCR respektive / eller WB (fig. 5A, B). Liknande resultat erhölls i HUH7-tumörer uppbyggda i NOD / SCID-möss behandlade med antingen SI113 eller enbart vehikel 54 (fig. 5C, D). I denna uppsättning experiment noterade vi, förutom RANBP1, RANGAP1-uttryck kontrollerades också av SGK1. I själva verket har SI113-beroende SGK1-hämning nedreglerade RANBP1- och RANGAP1-RNA- och proteinnivåer i HUH7-celler odlade i kultur (fig. 5A, B) eller utformade i NOD-SCID-möss (fig. 5C, D). Dessutom ökade uttrycket av alla testade miRNA-föregångare signifikant, medan den mogna formen reducerades med SI113 i HUH7-celler uppbyggda i NOD-SCID-möss (fig. 5E), vilket bekräftar de resultat som erhölls i HUH7-celler i kultur. Vi drar slutsatsen att SGK1 är en central regulator för både RANBP1- och RANGAP1-uttrycket och modulerar kärnkraftsexport och därmed påverkar miRNA-omvandling / transport.

( A ) Kvantitativ RT-PCR-analys av RANBP1- och RANGAP1-mRNA-nivåer i SI113-behandlade HUH7-celler jämfört med kontrollceller. Resultaten, normaliserade till HPRT-hushållningsgenen, representeras som vikuttrycket ± SD för triplikatbedömningar och utvärderades med användning av t- testet. ( B ) Western blot-analys av proteiner från HUH7-celler med eller utan 12, 5 μM SI113-behandling under 72 timmar. Cellextrakt (50 μg alikvoter) bedömdes via SDS-polyakrylamidgelelektrofores, följt av immunblotting med användning av en RANBP1-antikropp, en RANGAP1-antikropp och en GAPDH-antikropp. ( C ) Kvantitativ RT-PCR-analys av RANBP1- och RANGAP1-mRNA-nivåer i tumörvävnader hos HCC-xenotransplantat i NOD / SCID-möss med eller utan SI113-behandling. HCC-musen xenograftmodell och behandlingsschema utvecklades som tidigare rapporterats 54 . ( D ) Western blottinganalys av proteiner från mustumörvävnader med eller utan SI113-behandling. ( E ) Kvantitativ RT-PCR-analys av både mogna och föregångande mikroRNA i mustumörvävnader med eller utan SI113-behandling. Värdena ritas som Log 10 för viktsuttryck ± SD och utvärderas med t- testet. Analysen utfördes såsom beskrivits ovan. Statistisk betydelse rapporteras högst upp i diagrammet. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. Beskurna geler visas och gelar i full längd ingår i SF: er. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

SGK1 är en central regulator för GTP / BNP-status för RAN genom RANBP1 / RANGAP1-modulering och påverkar GTP-kärnkraftsgradienten och exporteffektiviteten

Pre-miRNA utsätts för dynamisk omvandling och bearbetning medierad av DROSHA och DICER som kan ha en roll i de observerade förändringarna i mängder och mognad av pre-miRNA. Vi kontrollerade expressionen av dessa proteiner genom Western blot-analys i närvaro av antingen SI113-beroende SGK1-hämning eller SGK1-överuttryck. Det fanns inga variationer i DROSHA- eller DICER-uttryck under dessa förhållanden (Fig. 6A). För att utesluta en möjlig transkriptionell effekt på miRNA-uttryck utvärderades uttrycket av pri-miRNA i SGK1-överuttryck samt i SGK1-tystade celler eller behandlades med SI113. Under alla dessa tillstånd kunde vi inte upptäcka signifikanta variationer i uttrycket av pri-miRNA. De små förändringar som observerades, om några, var inte relaterade till en specifik genetisk eller farmakologisk manipulation (Fig. 6B). Vi drar slutsatsen att transkriptionella effekter inte kan beaktas för att förklara de SGK1-beroende effekterna på miRNAs transport och mognad. Den SGK1-beroende regleringen av RANBP1- och RANGAP1-proteinuttrycket förväntas ge en mätbar påverkan på GTP / BNP-bunden status för RAN. Vi använde en RAN-GTP-specifik konformationell antikropp och en Ran-specifik antikropp för att immunutfälla RANGTP respektive RAN i närvaro av antingen SI113-beroende SGK1-hämning eller SGK1-överuttryck. SGK1-hämning resulterade i en ökning av mängden GTP-bundet RAN på ett tidsberoende sätt, med en topp vid 24 timmar efter tillsatsen av hämmaren. Omvänt reducerade exogent SGK1-överuttryck mängden GTP-bundet RAN (fig. 6C). Dessa resultat bekräftades genom immunofluorescensförsök med användning av HUH7-celler. SI113-behandling ökade mängden ackumulerat GTP-bundet RAN i den perinucleara cytoplasma, medan överflödet av total RAN minskades dramatiskt, vilket antydde att det mesta av RAN var i den GTP-bundna formen när SGK1 hämmades. I kontrollceller var den GTP-bundna formen närvarande på mycket lägre nivåer, och dess distribution var mestadels kärnkraft. Ett kännetecken som var ännu tydligare i celler som uttryckte SGK1 där de flesta av RAN var i BNP-bunden form (fig. 6D och kompletterande fig. 5a och b). Som väntat avskaffade behandling med SI113 den cellulära färgningen av RANBP1 och RANGAP1 fullständigt, vilket orsakade fullständig cytoplasmatisk utarmning, medan överuttryck av SGK1 inducerade en betydande uppreglering av båda proteinerna med stark cytoplasmisk ackumulering (fig. 6E och kompletterande figur 5a och b).

( A ) Western blot av proteiner från HUH7-celler, behandlade med SI113 (12, 5 μM; 72 h) eller vehikel (vänster), eller omvandlas med EGFP-SGK1 eller EGFP (höger). Cellextrakt separerades, blottades och dekorerades med DROSHA, DICER och GAPDH antikroppar. ( B ) Kvantitativ RT-PCR-analys av pri-mikroRNA i HUH7-celler stabilt överuttryckande EGFP-SGK1 eller EGFP (övre panel), i SI113-behandlade HUH7 och kontrollceller (mittpanel), i shSGK1 och shScrl HUH7-celler (botten panel). Analysen utfördes som ovan. Resultaten representeras som log 10 för viktsuttryck ± SD och utvärderas med användning av t- test. ( C ) Immunutfällning av RAN-GTP från HUH7-celler behandlade med SI113 (12, 5 mikrometer; 24 timmar och 72 timmar) eller vehikel eller omvandlas med ett lentivirus kodande p-HIV-EGFP eller p-HIV-EGFP-SGK1. Immunutfällning utfördes såsom beskrivits i metoder. Immunutfällningarna (vänster) och motsvarande totala extrakt (höger) blottades och dekorerades av anti-Ran totala polyklonala getantikroppar. GAPDH användes som en lastkontroll (höger). ( D ) Representativ immunofluorescensanalys av HUH7-celler antingen behandlade med SI113 (12, 5 μM) eller överuttryckande SGK1 (pcDNA4-TO-SGK1) jämfört med kontrollceller. Prover inkuberades med antingen en konformationell Active-RAN monoklonal antikropp eller med en anti-Ran total get polyklonal antikropp och DAPI (0, 05% μg / ml 1 ). Eftersom ingen variation i fluorescens observerades mellan de olika experimentella kontrollerna; endast en kontroll visas i panelen. (Leica TC SP2-mikroskop med ett x63-mål och Leica-konfokalprogramvara). ( E ) HUH7-celler behandlade som ovan färgades med antingen en anti-RANBP1 get-polyklonal antikropp eller en anti-RANGAP1 monoklonal antikropp och DAPI (0, 05% μg / ml). ( F ) HUH7-celler behandlade med SI113 (12, 5 μM; 72 h) eller vehikel (vänster) eller omvandlas med EGFP-SGK1 eller EGFP. Efter kärnkrafts / cytoplasmatisk separering separerades solubiliserade extrakt (50 μg och 25 μg för cytoplasmatiska respektive kärnfraktioner) med SDS-polyakrylamidgelelektrofores, dekorerad av XPO5, α-Tubulin, H1-antikroppar. ( G ) Schematisk beskrivning av den SGK1-beroende kärntransportmekanismen före miRNA. Beskurna geler visas och gelar i full längd ingår i SF: er. Resultaten är det genomsnittliga ± SD för tre oberoende experiment varje körning i triplikat.

Bild i full storlek

Vi förväntade oss också se förändringar i lokaliseringen och mängden Exportin-5, den slutliga transportören inom kärnkrafttransporten före miRNA, i samband med RAN-nätverket. I HUH7-celler behandlade med SI113 detekterades XPO5 huvudsakligen i kärnfacket, medan i SGK1 överuttryckande HUH7-celler detekterades XPO5 huvudsakligen i cytoplasma (fig 6F).

Diskussion

Underlättad transport genom karyopheriner kräver energi tillhandahållen av RAN-GTP-bindande proteiner, som fungerar som molekylmotorer som växlar från ett aktivt GTP-bundet tillstånd till ett BNP-bundet tillstånd 56 . RANBP1 är den huvudsakliga regulatorn för RAN GTPas: det samarbetar med RANGAP1 (RAN GTPas-aktiverande protein) för att främja GTP-hydrolys med RAN; dessutom har RANBP1 visat sig binda till RANGTP, vilket således reglerar dess associering eller dissociation från effektorer från familjen av kärntransportreceptorer (till exempel Exportin 5 / XPO5, Importin Beta och Exportin1 / CRM1) 44, 45, 55, 57 . RANBP1 är en nyckelregulator för RAN-beroende signaler i alla nedströmsreglerade händelser, inklusive kärnimport och export av kärnkraft, mitotisk spindelbildning och kärnkraftspost-mitos 58, 59, 60, 61 . Liksom andra medlemmar i RAN-nätverket är RANBP1 transkriptionellt reglerad under cellcykeln. Den transkriptionella kontrollen av RANBP1 är beroende av E2F- och SP1-reglerade promotorelement 62 . Störningen av cellcykelreglerad RANBP1-transkription påverkar mitotiska processer: RANBP1-överuttryck leder till multipolära spindlar och fragmenterade centrosomer 58, medan RANBP1 nedreglering underlättar mikrotubulärstabilisering, vilket försämrar dynamisk spindelaktivitet 37, 38 . RANGAP1 och RANBP1 är huvudsakligen lokaliserade i cytoplasma, där de fungerar för att skapa en RANGTP-gradient som är nödvändig för att kontrollera effektiviteten och riktningen för kärntransport, med en högre koncentration av RANGTP i kärnan och en högre koncentration av RANGDP i den cytoplasmiska fack 56, 63, 64 . I den här rapporten har vi visat att SI113-beroende SGK1-hämning inducerar en generaliserad nedreglering av miRNA-uttryck i hepatocellulära karcinomceller. Detta fenomen är resultatet av den minskade omvandlingen av miRNA-prekursorer till mogna miRNA, som är beroende av mängden RANBP1-protein som finns tillgängligt i celler. Eftersom detta fenomen har observerats i cancercellinjer såväl som i en icke-cancerös primär fibroblastcellinje, kan SGK1 och RANBP1 delta i den allmänna fysiologiska kontrollen av miRNA-transport och mognad, vilket ökar den totala effekten och det biologiska värdet av data. Den allmänna kontrollen av omvandling och kärntransport före miRNA verkar vara beroende av cellnivån hos RANBP1. Alla bevis som samlats här indikerar att effekterna av SGK1 på kärnkraftsexport och mognad före mRNA kräver närvaron av SP1 och RANBP1. Denna mekanism medieras av SGK1, vilket framgår av resultaten av kemisk hämning, tystnad och överuttryck.

SI113-beroende hämning av SGK1, liksom SGK1-tystnad, leder till en imponerande minskning av de cytoplasmiska nivåerna för både föregångare och mogna miRNA, ett tillstånd som perfekt speglas av SGK1-överuttryck. RANBP1-överuttryck underlättar i hög grad konverteringen av föregångare till mogna miRNA, en effekt som motverkas av SI113-behandling till viss grad, vilket antyder att överflödet av RANBP1 är den begränsande faktorn i denna process. Däremot verkar RANGAP1 inte spela en begränsande roll, eftersom när RANGAP1 är överuttryckt påverkar det varken uttrycket för miRNA-föregångare eller aktiviteten för SI113. Våra data antyder att RANBP1, en transaktivator av RANGAP1-aktivitet, är uppströms och begränsar för funktionen av RANGAP1, även om RANGAP1 verkar vara modulerad och fellokaliserad som svar på SGK1-fluktuationer parallellt med RANBP1. Hela systemet, som förväntat 10, är under SP1-transkriptionskontroll. Tystnad för SP1 resulterar i en fullständig omvändning av SGK1-beroende kärntransportreglering före miRNA. Intressant nog tycks mängden RANBP1 vara en begränsning även för de anti-proliferativa effekterna av SI113. Som stöd för dessa fynd antydde differentiell RNA-kärnkrafts / cytoplasmatisk extraktion att SGK1-aktivitet påverkar transporten av pre-miRNA och därmed deras exakta fördelning mellan kärnan och cytoplasma, med indirekta effekter på miRNA-mognad. För att bekräfta denna hypotese presenterar vi bevis för att moduleringen av SGK1-aktivitet inte har någon specifik effekt på proteinuttrycket av DROSHA och DICER, varken på mängden pri-miRNA, vilket ytterligare antyder en roll för nukleo-cytoplasmatisk transport, snarare än bearbetning eller transkription, i förändringarna i för-miRNA / miRNA-förhållandet. I den här rapporten visar vi också att SGK1 aktiverar transkriptionen av RANGAP1. Som tidigare visats för RANBP1 10 är denna effekt sannolikt också en konsekvens av SP1-fosforylering. Faktum är att SGK1 aktiverar och fosforylerar SP1 på serin 59, en regulator för nukleocytoplasmat-relaterade gener 65 . Relevansen av dessa fynd bekräftades av in vivo- resultat erhållna med användning av HCC xenograftat i NOD SCID-möss. SI113-behandling av dessa möss ledde till en signifikant minskning av uttrycket av RANBP1 och RANGAP1 och en förändring av de pre / mogna miRNA-nivåerna, en bona fide markör för förändrad kärnexport. En mer funktionell eller mekanistisk tolkning av våra observationer tillhandahölls tentativt av de resultat som erhölls genom immunutfällning och immunofluorescensförsök med användning av RANGTP konformationella antikroppar. SGK1-hämning resulterade i cytoplasmatisk ansamling av GTP-bundet RAN, vilket var en förväntad konsekvens av det reducerade uttrycket av RANBP1 och RANGAP1. Den cytoplasmiska ackumuleringen av GTP-bundet RAN stör den RANGTP-nukleo-cytoplasmatiska gradienten, som är nödvändig för nukleo-cytoplasmisk handel 56, och stör den lokaliseringen och frisättningen av pre-miRNA: er bundna till XPO5 / RAN 45, 66 (fig. 6G) .

Sammanfattningsvis förväntas SGK1-hämning avsevärt minska kärnkrafttransport genom SP1-beroende reduktion av uttrycket av RANBP1, RANGAP1 och RANGTP. Tumörer som överuttrycker SGK1 kan emellertid kännetecknas av avreglerad och olämplig kärnexport som så småningom kan gynna cellproliferation. Dessutom postulerar vi att den allmänna regleringen av kärntransporter före miRNA genom SGK1 kan ge nya insikter i vår förståelse av de epigenomiska justeringar som påverkar cellmetabolism och öde som en följd av miRNA-bildning och omsättning.

metoder

Celllinjer

Den humana HCC HUH7, human embryonal njure HEK293T och humant prostatacancer PC3-cellinjer odlades i DMEM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), den primära humana dermala fibroblast HDFa, humant äggstockscancer OVCAR3 och human glioblastom ADF-cell linjer odlades i RPMI-1640 (Life Technologies). Odlingsmedier kompletterades med 10% fetalt bovint serum och en 1% penicillin-streptomycinlösning (Aurogene, Rom, Italien). Cellerna odlades vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 5% CO2 och 95% luft. Cellinjer erhölls från ATCC (Georgetown University i Washington, DC), exklusive ADF-cellinjen, som vänligen tillhandahölls av Dr. Marco Paggi (Regina Elena Cancer Institute, Rom, Italien).

SI113-behandling

SI113 användes som tidigare rapporterats 33 . Läkemedlet späddes i dimetylsulfoxid (DMSO) i en 10 mM initial koncentration och lagrades vid -20 ° C. Celler transfekterade med pRANBP1-GFP, GFP och pRANGAP1 eller den tomma vektorn behandlades 6 timmar efter transfektion, cellpellets uppsamlades efter 72 timmar.

plasmider

Plasmider som kodar för pRANBP1-GFP, pGFP och pHHS10B-RANGAP1 tillhandahölls vänligen av Dr. Lavia P. 58 och transfekterades till celler som rapporterats någon annanstans 10 . Sekvenserna som kodar för vildtyp SGK1 klonades in i pcDNA4-TO-expressionsvektorn (Invitrogen, Milan, Italien) såsom tidigare beskrivits 21 . Den kodande sekvensen av vildtyp SGK1 inom PcDNA4-TO subklonades in i pHIV-EGFP-expressionsvektorn (Addgen-plasmid 21373) för att erhålla en självinaktiverande lentiviral plasmid för samuttryck av SGK1 och EGFP, såsom beskrivs på annat håll 54 . p-HIV-EGFP- SGK1 eller pHIV- EGFP (negativ kontroll), såväl som pLKO.1-puro-shSGK1 och shScrl (SIGMA SHC002V) användes för att generera lentivirala partiklar i HEK293T-förpackningsceller, såsom tidigare rapporterats 54 . Tystnad av RANBP1 och SP1 uppnåddes via shRNABP1 (sc-41848) respektive shSP1 (sc-29487-SH) plasmidtransfektion.

Kvantitativ PCR i realtid

RNA-extraktion utfördes med användning av miRNeasy ® Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Cytoplasmatisk och nukleärt RNA renades med ett specifikt kit (# 21000, NorgenBiotek Corp., Yhorold, ON, Kanada) enligt tillverkarens instruktioner och behandlades med DNase I (TURBO TM DNase, Ambion, Life Technologies, Paisley, UK) såsom indikerats i protokollet för att undvika kontaminering med genomiskt DNA i kärnfraktionen. RNA kvantifierades med användning av en Multiskan Go-spektrofotometer (Thermo Scientific, Madison, WI, USA). Kvaliteten på RNA analyserades genom att bestämma absorbansförhållandet 260/280 och genom formaldehyd-agarosgelelektrofores. För mogna mikroRNA utsattes 50 ng totalt RNA för omvänd transkription med miRCURY LNA TM Universal cDNA-syntespaket (Exiqon, Vedbaek, Danmark), enligt tillverkarens instruktioner. One hundredth of the total amount of cDNA was amplified via real-time PCR using 2X SYBR TM Green master mix (Exiqon) in a miRCURY LNA TM Cancer Focus microRNA PCR Panel 96-well plate, V1.MI (Exiqon), following the manufacturer's instructions. Each sample was evaluated in quadruplicate. Mature miR-103a, miR-182, miR-191, miR-223 and SNORD49A were amplified using a specific miRCURY LNA TM PCR primer set (Exiqon). For the miR-103a, miR-182, miR-191, miR-223 67 and SNORD49A precursors (pri-miRNAs and pre-miRNAs), 1 μg of total RNA was subjected to reverse transcription using the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the instructions reported previously 68, but modifying the concentration of the antisense primer cocktail (listed in Table 1) to 1 μM. For the RANBP1, RANGAP1 and SGK1 mRNAs, 1 μg of total RNA was subjected to reverse transcription using the High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. One microliter of cDNA was amplified via real-time PCR using Promega SYBR green (Promega, Madison, WI, USA) and 10 pmol of specific primers (Tables 1 and 2).The obtained values were normalized to the house-keeping gene HPRT using specific primers 69 .

Full storlek bord

Full storlek bord

Real-time PCR assays were performed in triplicate in a total volume of 20 μl using a Bio-Rad iQ TM 5 apparatus under the following conditions: initial denaturation step at 95 °C for 3 minutes, followed by 40 cycles of 10 s at 95 °C and 1 minute at 60 °C (for miRNA precursors) or 57 °C (for RANBP1 and RANGAP1 mRNAs). The specificity of the PCR products was determined through melting curve analysis.

Nuclear and cytoplasmic protein extraction

Nuclear and cytoplasmic EGFP/SGK and SI113 proteins from treated or untreated HUH7 cell lines were extracted using the NE-PER kit (#78833, Thermo Scientific). The cells (1 × 10 6 ) were washed with PBS (1X), and the pellet was re-suspended in CER-I buffer. After 10 minutes on ice, CER-II buffer was added to the sample. The re-suspended cell pellet was then centrifuged, and the supernatant was collected (cytoplasmic extract) and placed on ice. The nuclear pellet fraction was subsequently re-suspended in ice-cold NER buffer and placed on ice for 40 minutes. After washing (4 times) and centrifugation, the supernatant (nuclear extract) was recovered. Nuclear and cytoplasmic proteins were separated by western blot.

Immunoblotting and immunoprecipitation

Cells were processed as indicated in a previous report 10 and probed with a goat polyclonal RANBP1 antibody (sc-1160, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), a mouse monoclonal RANGAP1 antibody (sc-28322, Santa Cruz Biotechnology), a rabbit polyclonal GAPDH antibody (sc-25778, Santa Cruz Biotechnology), a mouse monoclonal DROSHA antibody (sc-393591, Santa Cruz Biotechnology), a rabbit polyclonal DICER antibody (sc-30226, Santa Cruz Biotechnology), a goat polyclonal antibody for total RAN (sc-1156 Sant Cruz), a goat polyclonal XPO5 antibody (sc-34619, Santa Cruz Biotechnology), a mouse monoclonal H1 antibody (sc-8030, Santa Cruz Biotechnology), a rabbit polyclonal α-TUBULIN antibody (sc-5546, Santa Cruz Biotechnology) and a rabbit polyclonal SP1 antibody (sc-14027, Santa Cruz Biotechnology) and a rabbit polyclonal SGK1 antibody (cat# 07-315 EDM Millipore Corporation, CA, USA).

Immunoprecipitation of the RAN-GTP form from HUH7 cell protein lysates was conducted using a pre-linked gamma-bound G-Sepharose (GE Healthcare 17-0885-01) conformational antibody recognizing the GTP-bound form of RAN (26915 NewEast Bioscience). After overnight incubation at 4 °C on a rotating wheel, samples were pre-cleared with normal mouse IG for 2 h at room temperature and washed. The immunoprecipitates were separated by gradient SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose and decorated with a goat polyclonal antibody for total RAN (SC-1156 Santa Cruz). The corresponding input was loaded in the same gel and incubated with the same antibody or with a rabbit polyclonal GAPDH antibody as a loading control.

immunofluorescens

The immunofluorescence analysis of the RAN-GTP conformation was performed as follows. SI113-treated and control HUH7 cells as well as SGK1 and EGFP HUH7 cells grown on coverslips were washed with 1X PBS and permeabilized in 1% Triton-X100 PHEM (45 mM HEPES pH 6.9, 45 mM PIPES pH 6.9, 10 mM EGTA, 5 mM MgCl 2, 1 mM PMSF) for 1 minute at room temperature. After an additional wash with 1X PBS, the cells were incubated with a conformational monoclonal Active-RAN antibody (26915, NewEastBioscences) diluted 1:50 in PBS/0.1% Tween containing 3% BSA for 2 h at room temperature. The cells were then fixed with 3.7% formaldehyde and 30 mM sucrose for 10 minutes, washed twice with 1X PBS, post-fixed with ice-cold methanol and re-washed twice with 1X PBS. The prepared samples were incubated with TRITC-conjugated goat anti-mouse Ig (A11004, Molecular Probes diluted 1:250) to detect Active-RAN in dilution buffer containing 3% BSA for 30 minutes and, finally, incubated with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (0.05% μg/ml) for 1 minute at room temperature to stain DNA. The samples were washed three times with PBS/Tween 0.1% before images acquisition. Samples were visualized under a Leica TC SP2 microscope (Leica, Wetzlar, Germany) with a x63 objective and processed with Leica confocal software. The digital zoom is indicated by the scale bar. Immunofluorescence analyses of RANBP1 and RANGAP1 were performed as follows. HUH7 EGFP cells, HUH7 cells treated with SI113 or DMSO for 24 h and HUH7 cells overexpressing SGK1 were grown on coverslips in 6-well culture dishes in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen). The cells were subsequently fixed in 3.7% formaldehyde for 20 minutes, permeabilized in 0.5% Triton X-100 for 5 minutes and washed with phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.4). Next, the samples were incubated with a goat polyclonal antibody for total RAN (Santa Cruz sc-1156, 1:250 dilution), a goat RANBP1 antibody (sc-1160, Santa Cruz, 1:250 dilution) and a mouse RANGAP1 antibody (sc-28322, Santa Cruz, 1:250 dilution) for 2 h at room temperature in PBS (pH 7.4) containing bovine serum albumin (1 mg/ml) and Tween-20 (0.2%). The cells were then washed in PBS 1X and incubated with FITC-conjugated donkey anti-goat Ig (sc-2024, Santa Cruz) to detect RAN, TRITC-conjugated donkey anti-goat Ig (705-586-147, Jackson Immunoresearch) to detect RANBP1 and a TRITC-conjugated goat anti-mouse antibody (molecular probes A11004) to detect RANGAP1, in the presence of 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (0.05% μg/ml). The samples were finally visualized under a Leica TC SP2 microscope (Leica, Wetzlar, Germany) with a x63 objective and processed with Leica confocal software. The digital zoom is indicated by the scale bar.

Viability assay

Celler (1, 5 x 104 ) pläterades i 60 mm vävnadsodlingsskålar och fick fästa under 24 timmar. Kontroll (EGFP-tom vektor), pRANBP1-EGFP och pRANGAP1-EGFP HUH7-celler inkuberades därefter i frånvaro eller närvaro av 12, 5 μM SI113 under 72 timmar. Cellproliferation och livskraft bedömdes med användning av en Countess ™ automatiserad cellräknare (katalognr. C10227, Invitrogen) med trypanblå färgning.

Muskel xenograftmodell

Kvinnliga NOD / SCID-möss (4 veckor gamla, Harlan, Indianapolis, IN) hölls under patogenfria förhållanden och gavs mat / vatten ad libitum . Vid 6 veckors ålder injicerades möss subkutant med 2, 5 x 106 HUH7-celler, behandlades och behandlades såsom beskrivs i ref. 54.

Statistisk analys

Alla tester utfördes åtminstone i tre exemplar, och alla experiment utfördes minst tre gånger. Resultaten uttrycks som medelvärden ± standardavvikelse (SD). Skillnaderna mellan grupperna analyserades med hjälp av Students t- test eller envägsanalys av varians (ANOVA), följt av Bonferronis test för flera jämförelser. Analysen genomfördes med användning av GraphPad Prism-mjukvara (San Diego, CA, USA) och skillnaderna ansågs vara signifikanta vid * P <0, 05, ** P <0, 01 och *** P <0, 001.

Etiskt uttalande

Experimentprotokollen har godkänts av forskningsutskottet för avdelningen för human hälsa (University “Magna Graecia” i Catanzaro). Djurförsök genomfördes i enlighet med Catanzaro University Institutional Animal Care and Use Committee riktlinjer med användning av ett godkänt protokoll.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln: Dattilo, V. et al . SGK1 påverkar RAN / RANBP1 / RANGAP1 via SP1 för att spela en kritisk roll i kärnkraftsexporten före miRNA: en ny väg för epigenomreglering. Sci. Rep. 7, 45361; doi: 10.1038 / srep45361 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.