En andra skärmkromosomomarrangemang: t (9; 14) (q34.3; q11.2) i t-cellneoplasi | leukemi

En andra skärmkromosomomarrangemang: t (9; 14) (q34.3; q11.2) i t-cellneoplasi | leukemi

Anonim

NOTCH1 kodar ett transmembran signalprotein som spelar nyckelroller i utveckling och neoplasi. Dess leukemogena engagemang avslöjades först genom analys av t (7; 9) (q34; q34.3) i en T-cell akut lymfocytisk leukemi (T-ALL) -cellinje (SUP-T1), som sammanställer trunkerad NOTCH1 med TCRB, att styra överuttryck av N-terminalt trunkerade polypeptider (granskad i Grabher et al. 1 ). NOTCH1 av vildtyp klyvs ursprungligen (S1-klyvning) till tvåpolypeptider: en extracellulär N-terminal underenhet (NEC) och en transmembran C-terminal underenhet (NTM). Bindning av NOTCH-ligander till den epidermala tillväxtfaktorliknande upprepade regionen av NEC främjar metalloproteas-klyvning av NTM (S2-klyvning) för att skapa membranbundna NTM * I-monomerer (figur la). Dessa klyvs i tur och ordning (S3-klyvning) vid flera ställen inom heterodimeriseringsdomänen (HD) som binder extracellulära och transmembrane subenheter av y-sekretas (GS) -proteaskomplexet för att frisätta den intracellulära domänen (ICN1), som bildar en ternär komplex stimulerande effekt transkription. 1 ICN1 innehåller regulator för aminosyrametabolism (RAM), ankyrinupprepnings- och transkriptionsaktiveringsdomäner och en C-terminal polypeptid berikad med prolin, glutamat, serin och treonin (PEST). Ankyrin- och transkriptionsaktiveringsdomäner krävs för induktion av T-ALL hos möss. 2 Medan y-sekretasinhibitorer (GSi) kan visa sig effektiva mot T-ALL-underuppsättningar, är de flesta T-cellinjer resistenta, inklusive SUP-T1. 3 Vi beskriver en andra NOTCH1-omarrangemang, t (9; 14) (q34.3; q11.2), i T-ALL-cellinjer, HD-MAR 4 och HT-1, 5 båda mycket GSi-känsliga trots överuttryckning av trunkerad NOTCH1 .

Image

Cytogenetisk och molekylär brytpunktanalys av t (9; 14) (q34; q11). ( a ) Brytpunktsdata, klonkartor och de genomiska strukturerna för NOTCH1, inklusive proteindomänschema, och TRAD Observera brytpunkter för intra-heterodimeriseringsdomän (HD) i HD-MAR / HT-1 nedströms S2 metalloproteas-klyvningsstället, och cis -HD-brytpunkt i SUP-T1. ( b ) Kromosommålning av t (9; 14) och ( c och d ) FISK-analyser av NOTCH1 respektive TRAD i HD-MAR 4 och HT-1. 5 TRAD / NOTCH1 brytpunktsförbindelsekvenser bestämda av långväga invers (LDI) -PCR visas i ( e) respektive ( f) . Nukleotider visas i rött, grönt och svart för att indikera TRAD, filler-DNA respektive NOTCH1 med brytpunkter som visas som svarta prickar. LDI-PCR utfördes såsom beskrivits på annat håll. 6 grundföljder ges i de kompletterande uppgifterna.

Bild i full storlek

Cytogenetisk analys avslöjade t (9; 14) (q34.3; q11.2) i både HD-MAR- och HT-1-celler, med NOTCH1-brytpunkter inuti fosmid 80019F4 åtföljd i HD-MAR-celler genom borttagning av ∼ 80 kbp motsvarande NEC (Figur 1a – d). Fluorescens in situ- hybridisering (FISH) visade också 14q11.2-brytpunkter i både HD-MAR och HT-1-celler inom TRAV-lokuset. Dessa observationer definierar en hittills olistad omarrangemang (//atlasgeneticsoncology.org/index.html), t (9; 14) (q34.3; q11.2) som sammanställer de intragena regionerna i både NOTCH1 och TRAV. Långdistans invers (LDI) -PCR bekräftade och utökade dessa fynd, vilket avslöjade svans-till-svans-fusioner av intron-27 i NOTCH1 vid 138 516 818 och 138 516 905 bp, med 5'-TRAV40 (21 852 526 bp) och intron-1 av TRAV5 (21 287 494 bp) i HD-MAR respektive HT-1 (figur 1e och f, kompletterande figur SI A / B). t (9; 14) i HD-MAR- och HT-1-celler placerar NOTCH1, trunkerade inuti HD (förutsagda 5 aminosyror trans - från S2-klyvningsstället), under transkriptionell kontroll av TRAV (figur 1a). TRAV-40-brytpunkten i HD-MAR ligger nära den proximala Eδ-förstärkaren, medan den i HT-1 vid TRAV-5 ligger ∼ 600 kbp uppströms nära ett kluster av DNase-I överkänsliga platser kända för att driva onkogen transkription i T-ALL . Således bär båda t (9; 14) cellinjer brytpunkter placerade inuti HD, i kontrast till den som ligger uppströms ( cis -) av HD i t (7; 9) SUP-T1-celler. 1

Protein (western blot) -analyser av de minimala transformerande regionerna, ankyrin och transkriptionell aktiveringsdomäner, tillsammans med TM / RAM-domäner i T-ALL-celler visas i figur 2a (övre / mitten). Högproteinuttryck av NOTCH1 (∼ 300 kDa i full längd) och NTM (∼ 120 kDa) detekterades i icke-translokationscellinjer med undantag av TALL-1-celler, som är monosom för kromosom 9. I kontrast, i NOTCH1-translokationscellinjer, ∼ 300-kDa band var svagt (HD-MAR, HT-1) eller frånvarande (SUP-T1), vilket indikerar translokationsdriven uttryck däri (figur 2b). N-trunkerade NTM i båda t (9; 14) -cellerna underskrider 116 kDa vildtypspolypeptid (figur 2a överst), i kontrast till t (7; 9) SUP-T1-celler, som också översatte längre arter som antyder försämrad klyvning däri. På motsvarande sätt tas ∼ 110 TM / RAM + -former i t (9; 14) -celler för att representera ICN1. Svaga TM / RAM-signaler i cis -HD-brytpunkt SUP-T1-celler (figur 2a botten) innebär också nedsatt GS-klyvning, eftersom Ab8925-epitoper kräver tidigare GS-exponering. Dessa fynd, som kopplade peri-HD-brytpunktsplats till avvikande proteinuttryck, föranledde ytterligare undersökning av effekten av GSi-behandlingar på NOTCH1-signalering och spridning.

Image

NOTCH1-proteinuttryck i T-cell akut lymfocytisk leukemi (T-ALL) cellinjer med t (9; 14). ( a ) Western-analys av T-ALL-cellinjer: NOTCH1-ANK-domänantikropp (Ab) till mN1A (överst), bTAN20 Ab till transkriptionsaktiveringsdomäner (TAD) (mitten) och Ab8925 (aktiverad NOTCH1) till TM / RAM (regulator av aminosyrametabolismen) (botten). Ab8925-epitoper inkluderar ett ospecifikt band (stjärna) och kräver tidigare exponering av y-sekretas (tillverkarens data). Notera de svaga TM / RAM-epitoperna i SUP-T1 NTM, som kan hänföras till försämrad y-sekretas klyvning. ( b ) Western-analys av NOTCH1 i full längd vid längre exponering: notera det svaga (HD-MAR / HT-1) eller frånvarande (SUP-T1) NOTCH1-bandet i full längd, vilket innebär translokationsdrivet uttryck. Western blots genomfördes efter lysering med 50 ul RIPA-buffert (1 pl aprotinin (1 mg / ml), 5 pl PMSF (20 ng / ml) och 50 ul 2 x SDS). Antikroppar som användes: NOTCH1 (mN1A; BD Biosciences, San Diego, CA, USA, bTAN-20; Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA och Ab8925; Abcam, Cambridge, Storbritannien). Laddningen kontrollerades med användning av Ponceau-färgämne och anti-human-MSH6 Ab (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland).

Bild i full storlek

behandling med y-Secretase-hämmare åstadkom dosberoende minskningar av celltillväxt och livskraft i HD-MAR och HT-1, medan SUP-T1-celler sparades (figur 3a). GSi-känsligheten för båda t (9; 14) -cellinjerna överskred signifikant den för T-ALL1, som tidigare beskrivits som känslig. 3 Proliferationsstopp i HD-MAR och HT-1 parallellt dosberoende ökningar i G0 / G1-arresteringen efter GSi-behandlingar, vilket visade sig successivt svagare svar i TALL-1- och SUP-T1-celler (figur 3b). För att undersöka dessa differentiella GSi-känsligheter mättes nedregleringen av NOTCH1-transkriptionella målgener, HES1 respektive MYC, i HD-MAR (92, 66%), HT-1 (94, 79%) och SUP-T1 (75, 39%) ) celler. Differential Gsi-känsligheter för NOTCH1-effektorgenuttryck parallellt sålunda både överlevnad av celler och cellcykelprogressionsändpunkter (figurerna 3c och d), vilket bekräftar det större GS-beroendet av NOTCH1-signalering i intra-HD-brytpunktceller.

Image

Svar från t (9; 14) -celler på y-sekretasinhibitorer (GSi) -behandling. T-ALL-cellinjer odlades under 96 timmar med de angivna koncentrationerna av DAPT eller mock-behandlade med dimetylsulfoxid (DMSO). Cellulär proliferation och DNA-innehåll mättes med 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromidanalys ( a ) och med flödescytometri ( b ) efter färgning med propidiumjodid. Observera GSi-överkänslighet för HD-MAR och HT-1 t (9; 14) -celler vid båda ändpunkterna. För att analysera effekterna av GSi på NOTCH1-signalering behandlades t (9; 14) och t (7; 9) celler under 16 timmar med 2 μM DAPT och analyserades därefter med RQ-PCR för att mäta uttryck av HES1 ( c ) och MYC ( d ), båda visas i svart. DMSO-kontrollen sattes till 100% (grå). Barer visar standardavvikelser. Notera igen det största HES1 / MYC-beroendet av NOTCH1-signalering i t (9; 14) -celler. För kvantitativ omvänd transkription (RQ) -PCR syntetiserades cDNA från 5 μg totalt RNA extraherat från 2 × 10 6 celler med TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) genom slumpmässig priming i 20 ul med användning av Superscript II (Invitrogen). RQ-PCR använde 7500 realtidssystem (Applied Biosystems, Darmstadt / Tyskland). Expression av HES1, MYC och kontrollgenen TBP analyserades med användning av kommersiella primerset (Applied Biosystems). För att analysera effekterna av GSi på NOTCH1-polypeptider utfördes western-analys på HD-MAR- och HT-1-celler behandlade med 2 μM DAPT under de angivna tiderna. ( e ) NOTCH1-polypeptider immunutfälldes från hela cellextrakt med antikroppar som igenkände antingen den intracellulära domänen för NOTCH1 (mN1A) eller den GS-klyvda formen av NOTCH1 (ab8925). Fästen visar fyra ackumulerade ankyrin-positiva (ANK +) arter (tagna som NTM / NTM * I) och samtidig förlust av TM / RAM + (regulator för aminosyrametabolism-positiva) arter (tagna som ICN1) efter GSi-behandling. En femte avkortad ∼ 100 kDa NTM / NTM * ackumuleras i HT-1-celler (pil). Det stjärnmärkta bandet är ospecifikt. ( f ) Effekter av GSi på nukleär lokalisering av NOTCH1-polypeptider i HD-MAR och SUP-T1. Celler behandlade under 24 timmar med DMSO (vänster) eller 2 mikrometer DAPT (höger) färgades med den intracellulära domänen för NOTCH1 (mN1A) Ab. Retikulär färgning efter GSi-behandling återspeglar omfördelningen av NOTCH1-polypeptid till cellmembranet.

Bild i full storlek

Hämning av klyvning genom GS-beroende (GSi) -behandling åstadkom ackumulering av fyra ANK + -arter (105–116 kDa) tagna som NTM / NTM * I (figur 3e-parenteser) och spridning av ∼ 110 kDa TM / RAM + (ICN1), att är en bild som överensstämmer med interkonversion. Detta resultat understryker beroendet av TM / RAM-uttryck på GS-aktivitet i t (9; 14) celler. En femte avkortad ∼ 100 kDa NTM / NTM * I ackumulerades i HT-1-celler (pil). Immunfarvning avslöjade större ansamling av perimembrana NOTCH1 på bekostnad av intranukleära former i HD-MAR än i SUP-T1 (figur 3f). Sammantaget avslöjade GSi-behandlingar ökat beroende av intra-HD-brytpunktsceller av GS-aktivitet för NOTCH1-uttryck, signalering och spridning. Den förbättrade TM / RAM-epitopsexponeringen av båda t (9; 14) cellinjerna (figur 2a botten) antyder en proteinstrukturell bas som ligger under det reducerade beroendet av GS-klyvning av tidigare S2-klyvning på grund av deras intilliggande brytpunkter. Korrelationen av GS-känslighet med intra-HD-brytpunktplacering överensstämmer med data från en andra t (7; 9) cellinje CUTLL1 med en intra-HD-brytpunkt, även känslig för GSi. 7

I T-ALL förekommer mutationer i F-boxproteinet FBXW7 (alias FBW7, hCdc4), som upphäver dess bindning till NOTCH1, vilket påverkar NOTCH1 livslängd och GSi-svar. Analys av HD-MAR-, HT-1- och SUP-T1-celler visade emellertid normala sekvenser runt Arg465, Arg 479 och Arg 505- hotspots, vilket diskonterade ett stort bidrag i att modulera GSi-känslighet därigenom, fokusera rampljuset på GS-klyvning.

Alla de tre molekylärt karyotypade t (9; 14) (q34; q11) fallen rapporterar TRAD / NOTCH1-engagemang (Gesk et al. , 8 denna rapport). Alla de fem åldersregistrerade fallen (9; 14) har hittills beskrivits hos unga vuxna (tabell 1), medan alla fyra fallen (7; 9) är pediatriska (//atlasgeneticsoncology.org/), vilket väcker frågan om olika åldersgrupper kan vara riktade. Emellertid har endast ett fåtal delvis fall beskrivits för antingen translokation och ytterligare mappade exempel krävs för att avgränsa brytpunkter i både t (9; 14) och t (7; 9) T-ALL och hjälpa till att fastställa det kliniska förhållandet mellan de cytogenetiska enheterna .

Full storlek bord

Våra fynd belyser rollen för intern-HD NOTCH1-brytpunktsplatser för att främja ligandoberoende transkription och översättning av GSi-känsliga polypeptider. Förhöjd GSi-känslighet som beviljas av sådana intra-HD-brytpunkter kan återspegla ökad molekylär exponering nära HD-regionen vilket underlättar klyvningen av NOTCH1. Oberoende från ligandförmedlad klyvning kan tjäna till att främja "icke-onkogenberoende" av intra-HD-brytpunktsceller på GS-klyvning för NOTCH1-signalering.

Sammanfattningsvis har vi karakteriserat en ny NOTCH1-förändring, t (9; 14) (q34; q11), i T-ALL, som bara är den andra neoplastiska NOTCH1-kromosomomställningen som hittills beskrivits. Våra data belyser brytpunkter i peri-HD-regionen vid bestämning av GS-aktivitet och svar på hämmare. Celllinjemodeller för den enhet som beskrivs här tillhandahåller enskilda verktyg för att undersöka den leukemiska rollen för NOTCH1, ett ämne som har ett starkt kliniskt och vetenskapligt intresse.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1 A / B

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegend

  2. 2.

    Kompletterande data

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)