Rna-seq-analys av det hypotalamiska transkriptomet avslöjar nätverk som reglerar fysiopatologiska framsteg i diabetisk gk-råtta | vetenskapliga rapporter

Rna-seq-analys av det hypotalamiska transkriptomet avslöjar nätverk som reglerar fysiopatologiska framsteg i diabetisk gk-råtta | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Genomics
  • Diabetes typ 2

Abstrakt

Goto-Kakizaki (GK) råtta är en djurmodell av icke-fetma typ 2-diabetes (T2D). GK-råtta genererades genom införandet av olika genetiska mutationer från kontinuerlig inavel; dessa råttor utvecklar diabetes spontant. De muterade generna i GK-råttor kan spela nyckelroller i regleringen av diabetes. Hypothalamus spelar en central roll i systematisk energihomeostas. Här undersöktes de hypotalamiska transkriptomerna i GK- och Wistar-råttor vid 4, 8 och 12 veckor med RNA-sekvens, och flera varianter och genuttrycksprofiler erhölls. Antalet identifierade varianter från GK-råttor var signifikant större än hos Wistar-råttor, vilket indikerar att många varianter var fixerade och ärftliga i GK-råttor efter selektiv inavel. Differentialgenuttrycksanalysen indikerade att GK-råttor hade ett dysfunktionellt hypotalamiskt melanokortinsystem och dämpning av den hypotalamiska glukosavkänningsvägen. Dessutom genererade vi integrerade gennätmoduler genom att kombinera protein-protein-interaktion (PPI) -nätverk, samuttrycksnätverk och mutationer i GK- och Wistar-råttor. I modulerna kan GK-specifika gener, såsom Bad , Map2k2, Adcy3, Adcy2 och Gstm6 , spela nyckelroller i hypotalamisk reglering i GK-råttor. Vår forskning ger en omfattande karta över avvikelserna i GK-råtthypotalamus, som avslöjar de nya mekanismerna för patogenes av T2D.

Introduktion

Diabetes av typ 2 (T2D), som kännetecknas av hyperglykemi, insulinresistens hos målvävnader och otillräcklig insulinutsöndring från pankreatiska ß-celler, är en världsomspännande epidemi som drabbar mer än 415 miljoner människor 1 . Cirka en av fyra fall av diabetes över hela världen förekommer i Kina. Dessutom utvecklas T2D vid betydligt lägre BMI-värden i den kinesiska befolkningen jämfört med den i västra vita populationer 2, 3 .

Goto-Kakizaki (GK) råtta är en av de bäst karakteriserade djurmodellerna av icke-överviktiga T2D och visar hyperglykemi, ß-celldefekter och insulinresistens. GK-råttor utvecklar spontant diabetes och genererades genom upprepad inavel av Wistar-råttor utvalda vid den övre gränsen för normalfördelningen för glukostolerans 4 . Patogenesen för GK-råttan kan bero på förlust av p-celler och försämring av p-cellfunktionen, vilket beror på olika genetiska faktorer och vissa transgenerationsepigenetiska stimuli 5, 6, 7 . Känslighetsplatserna som innehåller gener som ansvarar för flera diabetiska egenskaper kan spela grundläggande roller i utvecklingen av T2D i GK-råttor 7 . GK-råttembryon transplanterade i Wistar-råttor utvecklade fortfarande diabetes, vilket indikerar att genetiska faktorer spelar mycket viktigare roller i patogenesen än graviditetsmiljön 8 . Förutom hyperglykemi, ß-celldefekter och insulinresistens uppvisade GK-råttor också hyperfagi, men den genomsnittliga kroppsvikten var 10–30% mindre än den hos Wistar-råttor 6, 9, 10, 11 .

Hypotalamusen styr matintag och spelar en central roll i energihomeostas 12 . Dessutom påverkar hypothalamus perifera organ för att kontrollera graden av energiförbrukning och matningsbeteende genom att avkänna hormoner, såsom insulin, leptin och ghrelin, frisatta från perifera vävnader, och näringsämnen, såsom glukos, aminosyror och fettsyror, från cirkulationscirkulationen system 13, 14 . En tidigare studie rapporterade att ökade Npy- mRNA-nivåer i hypotalamus ledde till hyperfagi i GK-råttorna 11, men det reglerande nätverket i GK-råtthypotalamus är oklart. Dessutom spelar hypotalamus en viktig roll i fetma och kan öka risken för diabetes 15, 16, 17 . Dessutom kan dysfunktion av hypotalamus leda till en serie metaboliska störningar, och hypotalamus roll i den icke-feta GK-råttmodellen är oklar.

För att undersöka rollen för hypotalamus i T2D-patogenesen i GK-råttor, analyserade vi transkriptomerna för GK-råtthypotalamus vid 4, 8 och 12 veckor med RNA-seq. De fixerade mutationerna och differentiellt uttryckta gener analyserades. Genom att kombinera protein-proteininteraktioner (PPI) nätverk, samuttrycksnätverk och mutationer genererade vi integrerade nätverksmoduler berikade för GK-mutationsgener. Dessa moduler kan hjälpa till att belysa genreglering av hypotalamus och hypotalamusens roller i patogenesen av diabetes hos GK-råttor.

Resultat

Varianter i GK och Wistar råtthypothalami

Variationerna i GK-råttor spelar nyckelroller i utvecklingen av T2D eftersom de diabetiska GK-råttorna upprättades genom upprepad inavel av Wistar-råttor med glukosintolerans som ett selektionsindex 4 . Här bestämdes varianterna i GK- och Wistar-råttor genom att kartlägga deras läsningar till de verifierade referens-mRNA-sekvenserna för Rattus norvegicus (Norge råtta). Antalet varianter från GK-råttor var signifikant större än hos Wistar-råttor (p <0, 001, Student's t-test; Fig. 1A), vilket indikerar att många varianter var fixerade och ärftliga i GK-råttor efter selektiv inavel.

( A ) Antalet varianter från GK (orange) och Wistar-råttor (cyan). ( B ) Venn-diagram som representerar överlappningen av vanliga varianter mellan GK- och Wistar-råttor i mRNA-regionerna. ( C ) De vanliga varianterna mellan GK- och Wistar-råttor i de kodande regionerna och detaljerna för GK-specifika och Wistar-specifika mutationer listas. ( D ) Gener med varianter i GK- och Wistar-råttor.

Bild i full storlek

Vi hittade 22 783 och 25 582 vanliga varianter hos 15 Wistar-råttor respektive 15 GK. Sammantaget detekterades 31 380 varianter i hypotalamiska transkript. Bland dem hittades 16 952 överlappande varianter hos både Wistar och GK-råttor. Det fanns 5831 respektive 8630 specifika varianter i Wistar- och GK-råttor (fig. IB). Bland alla varianter erhöll vi 16 685 varianter i de kodande regionerna, och 9284 överlappande varianter hittades i både Wistar och GK-råttaprover. GK-råttor hade 4483 specifika varianter, inklusive 3239 synonyma mutationer, 1215 missense-mutationer, 28 indels och 1 nonsensmutation. Wistar-råttor hade 2922 specifika varianter, innefattande 2099 synonyma mutationer, 798 missense-mutationer, 23 indels och 2 nonsens-mutationer (Fig. 1C). Efter analysen detekterades 1316 gener med varianter endast i GK-råttor, vilka definierades som GK-specifika gener; medan antalet Wistar-specifika gener var 767 (fig. 1D). Bland de GK-specifika generna hade 488 gener minst en missense- eller indelmutation, och dessa gener var mer benägna att påverka utvecklingen av T2D i GK-råttorna, åtminstone på aminosyranivån. Detaljerad information om varianterna och motsvarande gener listas i tabell S1.

Olika uttryckta gener och deras förhållande till det hypotalamiska melanokortinsystemet och glukosavkännande väg

För att bedöma effekten av hypotalamisk reglering på T2D-utvecklingen i GK-råttor erhölls de differentiellt uttryckta generna för hypotalamus vid 4, 8 och 12 veckor genom bioinformatiska analyser. Totalt detekterades cirka 13 600 gener med uttryck i hypotalamus [medel FPKM (fragment per kilobas exon per miljon fragment kartlagt)> 1]. Specifikt detekterades 13.626, 13.698 och 13.654 gener efter 4, 8 respektive 12 veckor. Jämfört med Wistar-råttor, hittades 1119, 1381 och 1702 differentiellt uttryckta gener i GK-råttor vid 4, 8 respektive 12 veckor (med p <0, 05, FDR-korrigering). Jämförelsen av genuttryck mellan Wistar och GK-råttor visas i tabell S2.

Hypotalamiskt melanokortinsystem

De fysiologiska data visade att kroppsviktema för GK-råttor var signifikant lägre än hos Wistar-råttor från 4 veckor och framåt (fig. 2A), och de genomsnittliga kroppsviktema för GK-råttor var mindre än de hos Wistar-råttor, från 5, 4% (4) veckor) till 16, 7% (12 veckor), vilket motsvarade tidigare GK-råttstudier 9, 10 . Dessutom var matintaget av GK-råttor signifikant högre än hos Wistar-råttor efter 10 veckor (Fig. 2B). Efter justering för kroppsvikt, var det faktiska matintaget av GK-råttor liknande det för Wistar-råttor efter 4 och 6 veckor, men betydligt högre än för Wistar-råttor från 8 veckor till 12 veckor (Fig. 2C). Avvikelsen i livsmedelskonsumtionen från 8 veckor kan ha en stark korrelation med metaboliska störningar hos GK-råttor. I hypotalamus kontrollerar melanocortinsystemet energihomeostas och matningsbeteende 12 (Fig. 2D). I våra data hittade vi många differentiellt uttryckta gener i melanocortinsystemet, och de detaljerade genomsnittliga FPKM och p-värdena för dessa gener visas i Fig. 2E, F. Bland dem var Pomc (proopiomelanocortin) i GK-råtthypotalamus signifikant lägre än hos Wistar-råtthypothalamus efter 8 veckor (p = 0, 0026, DFR-korrigering), vilket kan resultera i den hyperfagi som observerades i GK-råttor. Agrp (agouti-relaterad neuropeptid) och Npy (pro-neuropeptid Y-preproprotein) i GK-råtthypotalamus var signifikant högre än de för Wistar-råttor i hypothalamus efter 12 veckor ( Agrp p = 0.017, FDR-korrigering; Npy p = 0.012), vilket kan leda till ökat matintag hos GK-råttor. Dessutom förändrades uttrycket Agrp och Npy över tiden. Jämfört med uttrycket vid 4 veckor minskade Agrp och Npy båda vid 8 och 12 veckor (p <0, 05, tvåvägs ANOVA-test, tabell S2), och relativt livsmedelsintag visade samma trend som Agrp och Npy (fig. 2C) ), vilket indikerade en positiv korrelation mellan Agrp / Npy och matintag efter justering för kroppsvikt.

( A ) Kroppsvikt (gram) GK- och Wistar-råttor. ( B ) Dagligt matintag (gram) GK- och Wistar-råttor. ( C ) Daglig livsmedelskonsumtion (mg) justerad för kroppsvikt (gram). Data visas som medelvärde ± SD. Svart = Wistar, röd = GK. *** p <0, 01. ( D ) Hypotalamiska melanokortinvägar. Agrp / Npy-nervcellerna uttrycker ghrelinreceptorer, som specifikt kan upptäcka ghrelin, och positivt reglera uttrycket av Agrp / Npy . Agrp / Nny-neuroner uttrycker också leptin- och insulinreceptorer, som upptäcker leptin respektive insulin och reglerar negativt AgRP / NPY-neuronaktiviteten. Agrp / Nny-neuronerna släpper Agrp och Npy , reglerar negativt det anorexigeniska systemet och ökar matintaget. Däremot producerar subtyper av Pomc-neuroner antingen leptin- eller insulinreceptorer som känner av adipos-härledd leptin eller pancreas-härledd insulin, uttrycker Pomc och producerar sedan a-MSH genom enzymatisk bearbetning. Slutligen svarar α-MSH positivt på de anorexigena molekylerna och svarar negativt på orexigeniska nervceller och minskar matintaget ytterligare. Dessutom kan y-amino-smörsyra (GABA) frisatt av Agrp / Npy-neuroner hämma Pomc-neurons aktivitet. ( E ) Genuttrycksmönstret i hypotalamiskt melanokortinsystem. ( F ) Vikningsförändringen och motsvarande p-värde för varje gen i GK jämfört med Wistar-råttor.

Bild i full storlek

Hypotalamisk glukosavkänningsväg

Astrocyter är nödvändiga för hypotalamisk glukosavkänning, som är en del av regleringen av energihomeostas 13, 14 (fig. 3A). I vår studie visade flera gener involverade i glukosavkänning skillnader mellan GK- och Wistar-råttor. FPKM, vikningsändring och motsvarande p-värde för glukosavkännande generna visas i fig. 3B, C. Slc16a1 och Slc6a3 , även känd som Mct1 respektive Mct3 , kan transportera laktat, den huvudsakliga molekylen för glukosavkänning i neuroner, från astrocyter till det extracellulära utrymmet. I våra data var uttrycket av Slc6a3 mycket lågt (medelvärde FPKM <1), medan Slc16a1 nedreglerades under alla perioder i GK-råttor (p <0, 01). Gap-korsningsgenerna Gja1 och Gjb6 ( Cx43 och Cx30 ), som deltar i transport av glukos och laktat mellan astrocyter och neuroner, uttrycktes differentiellt mellan GK- och Wistar-råttor. Gja1 var lägre i GK-råtthypothalamus i alla steg, med nedreglering vid 4 och 8 veckor (p = 0, 019 och p = 0, 0078 med FDR-korrigering), medan Gjb6 nedreglerades endast vid 12 veckor (p = 0, 028). Slc1a2 och Slc1a3 ( Glt1 och Glast ), som främjar frisättning av glutamat från glukoskänsliga neuroner (GSN) till astrocyter, detekterades. Uttrycket av Slc1a2 minskade i GK-råtthypothalamus vid 8 och 12 veckor (p = 0, 013 och p = 0, 015 med FDR-korrigering), medan Slc1a3 inte uppvisade någon skillnad mellan GK- och Wistar-råttor. Slc2a1 (även känd som Glut1 ), som hittades i endotelceller i centrala nervsystemet (CNS) blodkärl och astrocyter i råtta hjärnan 18 och är en bärare som transporterar glukos från blodet till astrocyter, minskades vid 12 veckor (p = 0, 01 med FDR-korrigering). De gener som beskrivs ovan uttrycktes i astrocyter, och deras nedreglering i GK-råttor skulle försvaga överföringen av glukos, laktat eller glutamat i astrocyter, vilket indikerade att glukosavkänning i GK-råttens hypotalamus skulle kunna försämras. Dessutom kan nedsättning av glukosavkänning troligen störa energihostostasen i hypotalamus och perifera organ.

( A ) Den glukosavkännande vägen i kapillär-astrocytter-neuronaxeln. Blodglukos i kärlen når hypotalamus genom endotel Slc2a1 (även känd som Glut1 ). Slc2a1 , också uttryckt i astrocytisk endefet runt blodkärlen, kan upptäcka och transportera glukos till astrocyterna. Efter transport in i cellerna fosforyleras glukosen snabbt av hexokinas ( Hk1 / 2 ) eller glukokinas ( Gck ) i astrocyterna. Fosforyleringen av glukos resulterar sedan i anrikning av Gja1 (känd som Cx43 ) i den astrogliska endefet som omsluter blodkärlen. Laktat, som metaboliseras av glukos i en serie enzymatiska steg, kan korsa in i astrocyterna av både Gja1 och Gjb6 ( Cx30 ) gapskors eller alternativt kan transporteras till det extracellulära utrymmet med hjälp av astroglial Slc161 / 3 ( Mct1 / 3 ). Slutligen transporterades det extracellulära laktatet genom Slc16a7 (Mct2) in i de glukoskänsliga neuronerna (GSN). Oxidationen av laktat reglerar ytterligare den elektriska GSN-aktiviteten. Dessutom kan Slc2a3 (Glut3) , som uttrycktes i GSN, detektera och transportera glukos frisatt från astrocyterna genom Gja1 eller den fritt diffunderande glukosen på endotelområdet. Vid neuronal aktivering kommer glutamatfrisättningen från GSN att detekteras och transporteras in i astrocyterna av astroglial Slc1a2 eller Slc1a3 , och det kommer att ytterligare påverka uttrycket av Gja1 i astrocyterna. ( B ) Genuttrycket i den hypotalamiska glukosavkänningsvägen. ( C ) Vikningsförändringen och motsvarande p-värde för varje gen i GK-råttor jämfört med Wistar-råttor.

Bild i full storlek

Integrerade gennätverk i GK-råtthypothalamus

Enda omicsdata bara kunde inte klargöra sjukdomsmekanismen helt. Därför är det viktigt att integrera omicsdata på olika nivåer för att effektivt identifiera nya mekanismer. Här använde vi PPI och samuttrycksnätverk av transkriptomerna vid 4, 8 och 12 veckor, tillsammans med mutationer i GK- och Wistar-råttor för att generera starkt anslutna moduler som berikades för genmutationer i GK-råttor med MAGI (sammanslagning påverkade gener i integrerade nätverk) 19 . Resultaten från MAGI PathwaySelect visade att utsädesvägen med den högsta poängen, inklusive åtta gener, Gpx3, Gstm6, Cyp2s1, Gstm4, Aldh3b2, Carns1, Aldh9a1 och Akr1b1 , var anrikat betydligt i KEGG-vägarna glutationmetabolism (p = 1.6E- 2, Bonferroni-korrigering) och metabolism av xenobiotika genom cytokrom P450 (p = 2.3E-2, Bonferroni-korrigering) och GO-annotationsoxidationsreduktion (p = 4.5E-2, Bonferroni-korrigering). Dessutom, bland alla lokala optimala lösningar i MAGI, definierade vi modulen med den högsta poängen som den bästa modulen ( M_Best ) och definierade gener som visade sig i> 5% av de suboptimala modulerna som M_Extended . Så småningom, genom att kombinera frövägarna och upprepa modulupptäckten, identifierade vi två distinkta osammanhängande moduler (M1 och M2), som kan vara förknippade med diabetogen utveckling i GK-råttor (fig 4 respektive 5).

( A ) Gennätverket i M1_Extended. Specifikt återspeglar nodfärger antalet mutationer i GK-råttor: den mer intensiva orange färgen indikerar ett högre antal mutationer, medan vit indikerar ingen mutation i GK-råttor. Kanter (blå linjer) mellan två noder representerar gener som interagerar med varandra enligt PPI-nätverket, och kanternas vikt representerar koxpressionskoefficienten r2. Genen i den innersta cirkeln detekterades i> 99% av de suboptimala modulerna. Gener i efterföljande koncentriska cirklar hittades i> 80%, 20% och 5% (M1_Extended) av de suboptimala modulerna. Noder med röda konturer representerar generna som tillhör M1_best. Gennamnen i noderna som är upp-relaterade och ned-relaterade i GK-råttor jämfört med Wistar-råttor betecknas med rött respektive grönt. ( B ) Värmekartan för uttrycket av M1_Extended gener (FPKM) hos varje individ. ( C ) Den signifikanta KEGG-vägsanrikningen i M1_Extended, genantalet och p-värdet korrigerat av Bonferroni visas.

Bild i full storlek

( A ) Gennätverket i M2_Extended . ( B ) Värmekartan för expression av M2_Extended- generna (FPKM) i varje individ. ( C ) Anrikning av vägar i KEGG-vägar i M2_Extended . Genantal och Bonferroni-korrigerade p-värden visas.

Bild i full storlek

Modul 1

För modul 1 (fig. 4A) innehåller M1_best 49 gener, varav 36 gener hittades i M1_Extended . M1_Extended innehåller 99 gener med 164 kodande-synonyma och 70 missense-mutationer i GK-råttor. Bland M1_Extended- gener, 4 gener, Bad (1 missense), Gstm4 (2 missense), Pik3c2b (8 synonym och 2 missense) och Nt5c3b (1 synonym), var signifikant uppreglerade i GK-råttor jämfört med Wistar-råttor under alla perioder från 4 till 12 veckor. Nio gener var signifikant nedreglerade inklusive Entpd2 , Itgb4 (2 synonym och en missense), Ppp1r3c (3 synonym och 1 missense), Aldh7a1 (1 missense), Gstp1 (1 synonym), Mapk12 , Alox5 , Akr1b1 (1 missense) och Prim1 (1 missense) (tabell 1). FPKM för alla gener i M1 från alla individer visas i en värmekarta i fig. 4B. Det fanns 17 vägar starkt associerade med M1_Extended (p <0, 05, Bonferroni-korrigering, fig. 4C), och 9 av dem berikades också signifikant i M1_best . Dessa vägar var GnRH, VEGF, neurotrofin, insulinsignaleringsvägar, melanogenes, långvarig potentiering, fosfatidylinositolsignaleringssystem, gapskorsning och purinmetabolism. Det är välkänt att melanogenes, progesteron-medierad oocytmognad, GnRH och insulinsignaleringsvägen tillhör det endokrina systemet, som är nära besläktat med diabetes. Neurotrofin-signalvägen och långvarig potentiering / depression tillhör nervsystemet, som kan delta i reglering av perifera vävnader genom hypotalamus. Signaltransduktionen innehåller ErbB, kalcium, MAPK-signalvägen och fosfatidylinositol-signalsystemet, som är mycket viktiga för att kontrollera och upprätthålla en normal fysiologisk balans i kroppen. Varje onormal förändring i signaltransduktion kan påverka den organismala operationen. Gap-korsningar, VEGF-signalvägen och vaskulär glatt muskelkontraktion bidrar sannolikt till hypotalamisk glukosavkänning 14 .

Full storlek bord

Modul 2

Efter att ha uteslutit mutationer och gener i M1_Best , omorganiserade vi MAGI och upptäckte en andra modul, M2 (Fig. 5A, B). I modul 2 innehöll M2_best 48 gener, varav 45 gener hittades i M2_Extended. M2_Extended innehöll 86 gener innefattande totalt 113 SNP i GK-råttor (55 synonyma och 58 missense-mutationer). Bland M2_Extended gener var fyra gener, Gstm4 (2 missense), Ifit1 (1 synonym och 2 missense), Pla2g12a och Eif3c (4 synonym och 1 missense) signifikant uppreglerade i GK-råttor; nio gener var signifikant nedreglerade: Aldh7a1 (1 missense), Gstp1 (1 synonym), Tdp2 (1 missense), Alox5 , Glb1 , Tm7sf2 (1 missense), Akr1b1 (1 missense), Nit2 (1 missense) och Hmgcs2 ( 1 missense) (tabell 1). I KEGG-vägen upptäcktes 18 vägar med p-värden <0, 05, och de flesta av dem tillhör metabolism (Fig. 5C). Bland dem berikades 7 vägar signifikant med p <0, 05 efter Bonferroni-korrigering, inklusive metabolism av xenobiotika genom cytokrom P450, läkemedel, glutation, butanoat, arachidonsyra, retinol och linolsyra-metabolism (sorterat efter p-värde) och de 4 bästa vägarna är överlappade i M2_best . Genererna i M1 och M2 anrikades för GK-råttmutationer och hög samuttryck i GK-råtthypotalamus. De vägar som anrikas i dessa gener kan spela avgörande roller i regleringen av GK-råtthypotalamus.

Undermoduler för tidskurs

För att avslöja de biologiska förändringarna från 4 till 12 veckor i hypothalamus och dess bidrag till diabetesutveckling hos GK-råttor, omorganiserade vi MAGI vid varje steg på 4, 8 och 12 veckor och genererade två betydande undermoduler (M1 och M2) för 4, 8 och 12 veckor (tabell 1 och tabell S3). Detaljerad information om modulerna presenteras i tabell S3. Efter KEGG-anrikningsanalysanalys av sub M1 och M2 i varje period observerade vi banorna som klusterats såsom visas i fig. 6. I delmodul 1 liknade de gemensamma vägarna i alla perioder M1-vägsanrikning (relaterad till det endokrina systemet, nervsystem och signaltransduktionsvägar) (Fig. 6A). De vanliga vägarna i undermodul 2 liknade också M2-vägar (anrikning i metabolismrelaterade vägar), men vägar berikade i delmodul 2 var mer komplexa (fig. 6B). Vägarna som anrikades betydligt i alla stadier kan vara viktiga för T2D-utveckling hos GK-råttor. Vissa vägar dök emellertid upp i bara 1 eller 2 perioder, och skillnaderna i anrikningsförfarandet i varje steg kan bero på förändringar i in vivo- miljöer, såsom kronisk hyperglykemi (tilläggsmaterial figur S1A), ß-cellmassaförlust, dysfunktion -inducerad minskning av insulinutsöndring (tilläggsmaterial figur S1B), inflammation i perifera organismer, insulinresistens och oxidativ stress 7 . I allmänhet var de biologiska framstegen liknande mellan 4 och 12 veckor men skilde sig vid 8 veckor. Detta fenomen kan förklaras av en dynamisk process med dysfunktioner (4 och 12 veckor) och kompensationer (8 veckor) vid diabetesutveckling hos GK-råttor. Denna förklaring föreslogs också i en tidigare GK-råttleveranalysanalys 20 .

Den signifikanta KEGG-banvägen i submoduler M1 ( A ) och M2 ( B ) vid 4, 8 och 12 veckor.

Bild i full storlek

Diskussion

Denna studie är den första som rapporterar hypotalamisk transkriptom och populationsvariationer i GK-råttor. Moduler med integrerad PPI, transkriptomisk profil och GK-råttmutationsdata konstruerades för att heltäckande belysa hypotalamisk reglering vid diabetisk progression hos GK-råttor.

Orsakerna till diabetesutveckling hos GK-råttor är hyperglykemi, nedsatt insulinutsöndring, överproduktion av glukos i lever och perifer insulinresistens 9 . Den grundläggande orsaken, som kan bero på de fasta varianterna i samband med glukosintolerans, kom emellertid från upprepande avel av glukosintoleranta Wistar-råttor 4 . Flera gener detekterades med missense- eller indelmutationer endast i GK-råttor, såsom Bcl2-antagonist av celldöd ( Bad ), som innehöll en G> T-variant vid position 276 i den kodande regionen (en missense-mutation av Gln92His). Det har rapporterats att dåliga funktioner har dubbla funktioner i apoptos och glukosmetabolism 21, 22 och kan påverka glykolysen och glukoneogenesen i lever 23 och metabolismen av glukos i hjärnan 24 . Tillväxthormonsekretagreceptor ( Ghsr ), som hade en variant av T> A i den kodande regionen och en motsvarande missense-mutation av V153E, är receptorn för ghrelin. Ghrelin har visat sig vara en orexigen peptid som motverkar leptinverkan 25 . Andra gener, såsom Agt 26, Inppll 27, Ide 28 och Sucla2 29, var relaterade till insulinfunktioner eller glukosmetabolism och hade missense-mutationer i GK-råttor. Dessa gener kan bidra till utvecklingen av T2D. Men varianterna erhölls endast i de kända transkripten i hypotalamus. Varianterna i vissa vävnadsspecifika gener, nya gener eller intryckta gener var utanför vår studie. Dessutom upptäcktes effekterna av varianter i transkriptionsfaktorbindande regioner inte i vår studie.

Generna i melanocortinsystemet i hypothalamus reglerar den centrala energimetabolismen. Till exempel kan Pomc uppreglera anorexigena nervceller och nedreglera orexigeniska nervceller i hypotalamus och därmed minska matintaget och öka energiförbrukningen, medan Agrp / Npy kan negativt reglera anorexigena nervceller och öka matintaget och minska energikostnaderna 12 . I vår studie kunde den signifikanta nedregleringen av Pomc vid 8 veckor och den signifikanta uppregleringen av Agrp / Npy vid 12 veckor delvis förklara den hyperfagi som observerades i GK-råttor från 8 till 12 veckor (Fig. 2 och Supplerande material Figur S2A ). Npy- ökningar av GK-råttor har också rapporterats efter 11 veckor 11 . Neuronspecifik störning av insulinreceptorn ( Insr ) eller minskande hypotalamisk Insr skulle orsaka hyperfagi 30, 31 . Insr reglerar positivt uttrycket av Pomc och reglerar negativt Agrp / Npy via insulinsignaleringsvägen i hypotalamus 12 . Till skillnad från Insr , reglerar tillväxthormonets secretagogue-receptor ( Ghsr ) positivt uttrycket av Agrp / Npy och reglerar Pomc 12, 32 negativt . NK2 homeobox 1 ( Nkx2-1) aktiverar Agrp- genuttryck men hämmar Pomc- transkriptionell aktivitet genom att binda till motsvarande cisverkande element i Agrp- och Pomc -genpromotorer 33, 34 . Den hjärnspecifika homeobox-transkriptionsfaktorn ( Bsx ) kan utlösa Agrp men inte Pomc- genuttryck 35 . Uppregleringen av Insr och nedreglering av Ghsr , Nkx2-1 och Bsx i våra data (Fig. 2E, F) bör resultera i nedreglering av Agrp / Npy och uppreglering av Pomc . Emellertid ökades Agrp och Npy och Pomc minskades i den aktuella studien (Fig. 2E, F), vilket var i överensstämmelse med de tidigare studierna. Dysfunktion i det hypotalamiska melanokortinsystemet från GK-råtta hittades i den aktuella studien, vilket resulterade i hyperfagi hos GK-råttor och ytterligare störde energihomeostas.

Astrocyterna i hypotalamus kan transportera glukos eller laktat in i GSN, och sedan kommer GSN att initiera anpassningsbara svar för att kontrollera glukosproduktion i lever 14 . K ATP- kanaler är distribuerade i stor utsträckning i hypotalamus och har varit inblandade i hjärnglukosavkännande 13, 36 . Detektion av glukos i hypotalamus kan reglera glukosproduktionen i lever via K ATP- kanaler 37, 38 . Hos GK-råttor ökade glukosproduktionen i lever 39 . Våra resultat indikerade att glukosdetektion i astrocyterna kan försämras i hypotalamus. Uttrycket av glukosavkännande gener i astrocyter, såsom transportgenerna ( Slc1a2, Slc2a1 och Slc16a1 ) och gapövergångsgenerna ( Gja1 och Gjb6 ), minskade (fig. 3 och tilläggsmaterial figur S3B), vilket kan försvaga transporten av glukos och laktat till glukoskänsliga nervceller. Försämringen av den hypotalamiska glukosavkänningsvägen hos GK-råttor kan ytterligare påverka glukosproduktionen i lever.

Dåligt var närvarande i M1_best och alla M1-undermoduler (Tabell 1 och Fig. 4A). Dålig är uppströmsignalen från K ATP- kanalen i hjärnan som styr neuronal excitation 24 . Fosforylering av serin 155 vid Bad BH3-domänen kan öka glukos och minska K ATP- kanalaktivitet 24 . Stängning av K ATP- kanalen resulterar i ökad GABA i hypothalamus 40 och påverkar också uttrycket av Pomc och matintag. Dåligt reglerades signifikant i GK-råtthypotalamus (tabell S2 och tilläggsmaterial figur S2C), vilket indirekt kan minska Pomc (fig. 2E, F) och öka matintaget (fig. 2C) hos GK-råttor. Missense-mutationen i dåliga i GK-råttor (G276T) var inte i BH3-regionen (position 442 till 486); därför behövs ytterligare studier för att bestämma om denna missense-mutation påverkar fosforylering av serin 155.

Det fanns 11 gener ( Raf1, Map2k2, Prkcg, Prkcb, Prkaca, Mapk9, Mapk8, Calm3, Calm1, Adcy3 och Adcy2 ) som dök upp minst 7 gånger i 17 M1 betydande vägar (tabell S3). Bland dem var Map2k2 (1 missense), Adcy3 (4 synonym och 1 missense) och Adcy2 (1 synonym och 1 missense) GK-specifika gener som endast hade mutationer i GK-råttprover. Mutationen G876A i Map2k2 är en dbSNP (id: 8158310), vilket resulterar i en aminosyraändring från Val till Met. Denna mutation är i den katalytiska domänen för proteinkinaset med dubbelspecificitet och kan påverka katalysen av mitogenaktiverat protein (MAP) eller extracellulärt signalreglerat kinas (ERK) kinas. Map2k2 är involverad i många signalöverföringsvägar och bidrar till intracellulära signaleringskaskader. Map2k2 är också involverad i insulinsignaleringsvägen och har korrelerats med metaboliska egenskaper, såsom kroppsmassaindex, fastande glukos och fastande insulin, vilket kan reglera steroidogenes och glukoshomeostas 41 . Adcy3 och Adcy2 är båda adenylylcyklaser som katalyserar syntesen av 3'-5'-cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP). Genetiska polymorfismer i Adcy3 var associerade med fetma 42, 43 . Dessutom kan förlust av Adcy3 i mushypotalamus leda till fetma 44 . Dessa studier indikerade att Adcy3 spelar en viktig roll i regleringen av kroppsvikt 45 . I vår studie hade Adcy3 fyra mutationer. Bland dem var T803C ett missense som orsakade en Leu till Pro-förändring i Adcy3-transmembranområdet (från 754 till 816). Adcy3 ökades i GK-råtthypothalamus efter 10 veckor 46 . Enligt våra data hade Adcy3 samma resultat efter 12 veckor (p = 0, 015) men inte vid 4 och 8 veckor, vilket indikerade att Adcy3 kan spela en nyckelroll för att förhindra fetma hos GK-råttor trots hyperfagi från 8 veckor. Nio gener, inklusive Cyp3a9, Ugt1a8, Gsttl, Gstpl, Gstm6, Gstm5, Gstm4, Gsta4 och Adh, dök upp minst 3 gånger i 7 M2 signifikanta vägar (tabell S3). Endast Gstm6 (3 synonyma och 1 missense-mutationer i GK-råttor) var en GK-specifik gen. De fyra mutationerna i Gstm6 var i det provisoriska glutation-S-transferasområdet (positionerna 118 till 717), inklusive missense-mutationen G319A (Val> Ile), och kan påverka polypeptidbindningen. Gstm6 reglerades ned i GK-råttor i alla stadier och är relaterad till metabolism av xenobiotika genom cytokrom P450, läkemedelsmetabolism och glutathionmetabolismvägar. Gstm6 minskades både hos diabetiska och insulinresistenta möss och kan vara involverad i utvecklingen av syndromet från insulinresistens till typ 2-liknande diabetes 47 . Även om omfattande moduler och mekanismer i GK-råtthypothalamus erhölls genom att integrera PPI, transkriptomiska profiler och mutationer i GK-råttor, är en begränsning av metoden att de aktuella databaserna för proteininteraktionsnätverk är i stort sett ofullständiga och inte alla biologiska interaktioner involverade har kommenterats .

Råttor med hög fetthalt-diet inducerade inflammation i hypothalamus den första dagen 17, vilket är avgörande för utveckling av fetma T2D 15, 16 . Bland vägarna i M1 och M2 var endast Fc epsilon RI-signalvägen relaterad till immunsystemet. Uttrycket av pro-inflammatoriska faktorer, såsom Il-1b , Tnf och Il-6 , var låga (FPKM <1) och skilde sig inte signifikant mellan GK- och Wistar-råttor, vilket bekräftades med qPCR (Supplemental Material Figure S3), som indikerade att det inte fanns någon inflammation i GK-råtthypotalamus i det tidiga stadiet. Den hypotalamiska regleringen av GK-råttor och dieter med hög fetthalt tycks vara annorlunda. Dessutom visade uttrycket av dåliga i ob / ob-möss inga signifikanta skillnader jämfört med kontrollerna i hypotalamus (data från GEO-datasätt: GSE10785 48, GSE61436 och GSE62013 49 ), medan dåligt uttryck var mycket högre i GK-råttor än i Wistar-råttor . Dåliga knockout-möss har minskat glukos och ökad metabolism av ketonkroppar i hjärnceller, vilket gav en markant ökning av aktiviteten för metaboliskt känsliga K ATP- kanaler i neuroner 24 . Dessutom visade dåliga knockout-möss och lever-specifika Bad knockdown-möss fastande hyperglykemi, minskade glykolys och överdriven glukosproduktion i levern 23, vilket indikerar de olika funktionerna hos Bad i hjärnan och levern. GK-råttor hade också fastande hyperglykemi och ökad glukosproduktion i lever, men Bad var överuttryckt både i hypotalamus (Supplemental Material Figure S2C) och levern (data från GSE13271 50 ). Rollen för dåligt överuttryck i GK-råtthypotalamus är oklart, är det kompensation eller förvärring? De förvirrande skillnaderna mellan GK-råttor och andra modeller indikerar komplexiteten hos diabetogen reglering.

Hypothalamus kan känna flera hormoner, såsom insulin, ghrelin och leptin, och kan också känna näringsämnen, såsom glukos. Dessa signaler kan ytterligare utlösa aktivering eller hämning av flera hypotalamiska nervceller, vilket kan leda till många fysiologiska svar från melanocortinsystemet och glukosavkänningssystemet. Vi upptäckte störningen i melanocortinsystemet och försämringen av glukosavkänningsvägen hos GK-råttor, vilket kan leda till hyperfagi, hindra signaler till glukoskänsliga nervceller och ytterligare påverka regleringen av glukosproduktion i lever. Flera gennätmoduler, som är anrikade för mutationer i GK-råttor, innehöll olika vägar som involverar hypotalamisk funktion. Ytterligare studier behövs emellertid för att bestämma huruvida och vilka varianter i GK-råttor påverkar hypotalamus regleringsnätverk, vilket leder till dysfunktionell energihomeostas och diabetisk fenotyp av GK-råttor.

Slutsats

Denna studie är den första som analyserade hypotalamiska transkriptomer vid 4, 8 och 12 veckor och populationsvariationer i GK-råttor. Modulerna som använder integrerad PPI, transkriptomisk profil och mutationsdata konstruerades för omfattande analys av GK-råtthypotalamus. GK-råttan hade dysfunktion i det hypotalamiska melanokortinsystemet och dämpning av den hypotalamiska glukosavkänningsvägen. De GK-specifika generna, såsom Bad , Map2k2, Adcy3, Adcy2 och Gstm6 , kan spela nyckelroller i hypotalamisk reglering i GK-råttor. Vår forskning ger en omfattande karta över avvikelserna i GK-råtthypothalamus och avslöjar nya mekanismer för patogenes i T2D.

metoder

Djur och vävnader

GK- och Wistar-råttor (3 veckor gamla) köptes från SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Råttor hölls i ett P3-rum med en 12-timmars: 12-timmars ljus: mörk cykel, en temperatur av 20 till 25 ° C och 60 ± 5% atmosfärisk fuktighet vid Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals. Alla djur hade fri tillgång till mat och vatten. All djurmanipulation och vård utfördes 1, 5 till 3, 5 timmar efter att lamporna var på. Denna studie godkändes av den institutionella granskningsnämnden för Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals, och alla protokoll genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) [Etisk certifikat nr: IACUC2014029]. Matintag och kroppsvikt hos alla djur mättes två gånger varje vecka. Djur narkotiserades genom pentobarbitalnatrium (3%, 0, 2 ml / 100 g) och avlivades genom abdominal aorta-exsanguination. Plasma framställdes från blodet med EDTA (4 mM slutlig koncentration) genom centrifugering (2000 × g, 4 ° C, 10 minuter) och lagrades vid -80 ° C. Tissues from the hypothalamus were harvested and frozen in liquid nitrogen immediately and finally were transferred into a −80 °C freezer.

Measurement of plasma glucose and insulin levels

Plasma glucose was measured using a GLU Assay Kit (KOFA, China) using enzymatic methods with an automatic biochemistry analyser (Hitachi 7020, Tokyo, Japan). Plasma insulin was measured by a Luminex MAGPIX using a Milliplex MAG Rat Metabolic Magnetic Bead Panel Kit (insulin kit, Milliplex, Germany).

RNA extraction, purification and sequencing

In total, 30 hypothalamus samples from 15 GK and 15 Wistar rats at 4, 8 and 12 weeks were prepared for RNA-seq. Total RNA was extracted using TRIzol Reagent (Cat#15596-018, Life Technologies, USA) following the manufacturer's instructions and the RNA integrity was assessed using RIN (RNA Integrity Number) with an Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA). Qualified RNA samples were further purified with a RNeasy Micro kit (Cat#74004, Qiagen, Germany) and a RNase-Free DNase Set (Cat#79254, Qiagen, Germany). For RNA-seq analysis, mRNA samples were prepared by using the TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, USA). The mRNA samples were purified first-strand cDNA and second-strand cDNA were synthesized, and the double-stranded DNA underwent end repair. After adenylation of the 3′ ends and ligation of the adapters, PCR was performed to enrich the cDNA templates. Finally, the sequencing library was used for cluster generation (guided by the cBot User Guide) and sequencing on the Illumina HiSeq 2500 system (Illumina, USA) following the HiSeq 2500 User Guide. With the standard paired-end sequencing protocol, 125 bp paired-end raw reads were generated. The kits and equipment used in RNA-seq are listed in Table S4.

Reads filtering

Low quality reads were filtered using stringent criteria by FASTX (version:0.0.13, //hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/): (1) reads with more than 50% of bases with quality <20; (2) the base quality is <10 at the 3′ end of the reads; (3) reads with overrepresented adaptors; (4) reads having an 'N' base; (5) reads shorter than 20 bp. After these quality control and filtering steps, clean reads were obtained and used to align the reference mRNA and genome sequences.

Variant calling

The reads of 15 GK and 15 Wistar rats were mapped to the verified rat reference mRNAs using Bowtie2 51 with the parameters of -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S, 1, 0.50 -a –no-mixed, which indicates a sensitive end-to-end read alignment programme, outputting with a report of all alignments, and suppressed unpaired alignments for paired reads. The rat mRNA (last updated on November 17, 2014) data were downloaded from NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/R_norvegicus/mRNA_Prot/), and the verified mRNAs were kept after filtering the mRNAs with PREDICTED. After filtering by allowing 4 mismatches, 4 gap opens and 4 gap extensions in the alignment and no less than 100 bp alignment reads length, variants were called for each individual by the SAMtools of Version: 0.1.19-44428cd (Tools for alignments in the SAM format) 52 . A variant identical in all 15 GK rats was defined as common GK variants. Similarly, variants unique to the 15 Wistar rats were defined as common Wistar variants. Mutation types of common variants, including coding-synonymous, missense, nonsense and indel, in the coding regions were classified. Then, the genes with common variants present only in GK rats were described as GK-specific genes, and the genes with common variants only in Wistar rats were defined as Wistar-specific genes.

Differentially expressed genes

Clean data of pair-end reads from each individual were aligned to the Rattus norvegicus reference genome (Genome build: rn6) plus transcript indexes by Hisat2 2.0.0-beta 53, with the parameters of –dta-cufflinks and -sensitive (report alignments tailored specifically for Cufflinks and with sensitive alignment). The mean overall alignment rates were approximately 95% (Table S5). The genome file of Rattus_norvegicus.Rnor_6.0.dna.toplevel.fa (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-80/fasta/rattus_norvegicus/dna) and its corresponding annotation file of Rattus_norvegicus.Rnor_6.0.80.gtf (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-80/gtf/rattus_norvegicus) were downloaded from the Ensembl database 54 . Cufflinks v2.2.1 55 was used to process the alignment files and assemble the transcripts. Ballgown 56, a Bioconductor package, finally estimated the abundance of the assembled transcripts and annotated the genes with FPKM. After these analyses, the gene expression profile with a time-course in rat hypothalamus was determined. Differentially expressed genes between Wistar and GK rats in each period were processed with a Bayes-regularized paired t-test with a FDR correction using Cyber-T bayesreg.R code 57 . For the time-course multiple comparisons, two-way ANOVA tests were applied using TukeyHSD in R.

Modules

The PPI network was composed of the union of StringDB 58 v10 rat (organism ID 10116) interactions that were experimentally verified (experimental scores > 400) with high confidence scores (>700), together with the gene-gene relationships of Rattus norvegicus in the KEGG pathway database (//www.kegg.jp/). Four co-expression networks were constructed from the normalized RNA-seq FPKM values at 4, 8, and 12 weeks and all periods. The coefficient r in each pair of genes across all the time points was calculated by R with the Pearson correlation. The modules were detected by integrating PPI, co-expression networks and gene mutations of GK and Wistar rats using MAGI 19 . MAGI first calculated a score for each gene in the networks (by scoring function based on the number of missense and indel mutations and the gene length), selected seed pathways with high scores based on an extension of the color-coding algorithm, and finally improved the modules by adding or removing single genes using a local search 19 . The results of MAGI were contained in M_Best , the module that maximizes the score and M_Extended , a set of genes that appear in more than 5% of the suboptimal modules (modules with scores within the top 1 percentile that also overlap M_Best ). To examine whether other distinct modules could be identified, the other genes, which excluded genes in M_Best , were used to determine M2_best and M2_Extended by MAGI. The parameters with MAGI Cluster were as follows: -m 20 -l 35 -u 50 -a 0.6, which indicates the upper bound on control mutations is 20, the lower bound on the size of the module is 35, the upper bound on the size of cluster is 50 and the minimum ratio of seed score allowed is 0.6. The module genes were displayed as graph nodes using Cytoscape 59, and r 2 in co-expression networks was set as the edges' weights. The database for annotation, visualization, and integrated discovery (DAVID) was used to interpret the genes in all modules 60 .

RT-qPCR verification

Real time quantitative PCR was used to verify the differentially expressed genes using SYBR ® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa, Japan) with a LightCycler 96 system (Roche, Switzerland). Relative mRNA expression in GK rats was quantified using Wistar rats as the controls and beta-actin ( Actb ) as a housekeeping gene (by the 2 −∆∆Ct method). The primers for these genes are listed in Table S6.

Data tillgänglighet

The RNA-seq raw data were available in NCBI SRA database (//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR3923805/).

ytterligare information

How to cite this article : Meng, Y. et al . RNA-seq analysis of the hypothalamic transcriptome reveals the networks regulating physiopathological progress in the diabetic GK rat. Sci. Rep. 6, 34138; doi: 10.1038/srep34138 (2016).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell S1

  2. 2.

    Kompletterande tabell S2

  3. 3.

    Kompletterande tabell S3

  4. 4.

    Supplementary Table S4

  5. 5.

    Supplementary Table S5

  6. 6.

    Supplementary Table S6

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.