Reversibel induktion av translationella isoformer av p53 vid glukosdeprivation | celldöd & differentiering

Reversibel induktion av translationella isoformer av p53 vid glukosdeprivation | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • Tumördämpande proteiner

Abstrakt

Tumorsuppressorprotein p53 är en mastertranskriptionsregulator, som är nödvändig för att kontrollera flera cellulära vägar. Tidigare arbete i vårt laboratorium ledde till identifiering av strukturell IRES-struktur med dubbla interna ribosominträngningar ( p53 mRNA) som reglerar översättning av p53 och Δ40p53 i full längd. IRES-medierad translation av båda isoformerna förbättras under olika stressförhållanden som inducerar DNA-skador, joniserande strålning och endoplasmatisk retikulumspänning, onkogeninducerad senescens och cancer. I denna studie behandlade vi näringsmedierad translationell reglering av p53- mRNA med användning av glukosutarmning. I cellinjer inducerade denna näringsnedbrytningsspänning relativt inducerade p53 IRES-aktiviteter från bicistronic reporterkonstruktioner med samtidig ökning i nivåerna av p53-isoformer. Överraskande fann vi ställning / matrisfästningsregionbindande protein 1 (SMAR1), ett övervägande kärnprotein är rikligt i cytoplasma under glukosdeprivation. Viktigare under dessa förhållanden polypyrimidin-bindande protein, visade ett etablerat p53 ITAF inte kärncytoplasmisk omlokalisering som framhöll nyheten med SMAR1-medierad kontroll i stress. Studier in vivo på möss avslöjade svältinducerad ökning av SMAR1-, p53- och Δ40p53-nivåer som var reversibelt vid påfyllning av kosten. SMAR1 associerad med p53 IRES-sekvenser ex vivo , med en ökning av interaktionen vid glukos svält. RNAi-medierad-transient SMAR1-knockdown minskade p53 IRES-aktiviteter under normala förhållanden och under glukosdeprivation, vilket återspeglas i förändringar i mRNA i p53- och Δ40p53-målgenerna involverade i cellcykelstopp, metabolism och apoptos såsom p21, TIGAR och Bax . Denna studie ger en ny fysiologisk inblick i regleringen av denna kritiska tumörsuppressor vid näringsämnes svält, vilket också antyder viktiga funktioner för p53-isoformerna under dessa tillstånd som framgår av nedströms transkriptionsmålaktivering.

Huvudsaklig

p53 är en mastertranskriptionsfaktor och tumörsuppressor. Bortsett från post-translationella modifieringar av p53 och samtidigt protein-protein-interaktioner av p53 med olika faktorer, spelar translationskontroll av p53- mRNA också en viktig roll under stressförhållanden. 1

p53 och dess N-terminalt trunkerade isoform Δ40p53 (även känd som ΔN-p53 eller p53 / 47) översätts av intern ribosominföringsplats (IRES) -medierad översättningsinitiering från samma mRNA under olika stressförhållanden som inducerar DNA-skada, joniserande strålning och endoplasmatisk retikulum (ER) stress, onkogeninducerad senescens och cancer. 2, 3, 4, 5, 6, 7 Således har p53 mRNA en dubbel IRES-struktur. 8 För deras funktion förlitar sig dessa IRES: er på IRES- transaktionsfaktorer (ITAF). Polypyrimidin-traktbindande protein (PTB) visade sig ha differentiell affinitet för de två IRES: erna för p53 och reglerade p53-IRES-funktioner genom att translokera från kärna till cytoplasma på doxorubicin-inducerad DNA-skada. 3 Denna PTB-medierade kontroll av p53-IRES har nyligen visat sig spela en roll i p53-fibrillarin-rRNA-metyleringsnätverket. 9, 10 Enkelnukleotidpolymorfismer i p53 5'UTR 11 eller i den kodande regionen för p53 IRES 7, 11, 12 minskade p53 IRES-aktivitet genom att förändra PTB, MDM2 eller hnRNPC1 / C2-interaktioner med denna reglerande region i p53 mRNA. Annexin A2 och PTB-associerade skarvfaktorproteiner (PSF) -proteiner, förmodade p53 ITAF: er, interagerar med p53-IRES ex vivo på ett stressinducerat sätt, vilket visar större koppling till IRES: erna vid thapsigarginbehandling. 13 En eIF4G-homolog, dödsassocierat protein 5 (DAP5) visades binda till p53 IRES och reglera det andra IRES-medierade uttrycket av Δ40p53, medan en sådan reglering med DAP5 av det första IRES-medierade uttrycket av p53 var mer subtilt. 14 hnRNPQ visade sig binda till p53 5'UTR och kontrollera dess översättningseffektivitet. 15 Förutom olika ITAF, är p53 5'UTR också känt för att binda flera proteiner såsom RPL26, 16 nukleolin, 17 PDCD4 18 och RNPC1. 19

Näringsämne-begränsning eller svält är också känt för att inducera cellulär stress. I Drosophila under dåliga näringsförhållanden förmedlar FOXO (en Forkhead-box-transkriptionsfaktor) ackumulering av INR via IRES-medierad translation av INR- mRNA. 20 Näringsstyrning av transkription / translation via modulering av IRES-aktivitet exemplifieras också av det cellulära svaret på begränsad aminosyratillgänglighet. 21, 22 Aminosyrautarmning inducerar GCN2-kinasmedierad fosforylering av eIF2a, vilket leder till en global minskning av proteinsyntes och induktion av ett adaptivt överlevnadsprogram. 21, 23 Under detta tillstånd inträffar IRES-medierad translation av Cat-1 och SNAT2-mRNA: er, 24, 25 och därmed förbereder cellerna för att transportera aminosyror när de blir tillgängliga. Metioninsyntas, ett viktigt enzym som rensar intracellulär homocystein, induceras av dess kofaktor, vitamin B12, på en translationell nivå genom en IRES i 5'UTR av mRNA. 26 Som svar på glukosberövning, har haploida Saccharomyces cerevisiae celler dramatiskt nedreglerat översättning av de flesta cellmeddelanden, 27, 28 men flera jästgener som krävs för invasiv tillväxt, en utvecklingsväg inducerad av näringsämnesbegränsning, innehåller potenta IRES. 29 Serum svält av däggdjurscellkulturer visade induktion av Bcl-2 IRES 30 och aktiverad translation av XIAP mRNA. 31 IRES-medierad translation av p27 Kip1 mRNA bidrar till upprätthållande av G1-fasen i cellcykeln och uttrycket av p27 Kip1 befanns vara järnkänsligt. 32, 33

Dessa studier avslöjar en ny aspekt av aktivering av IRES-medierad översättning av eukaryota mRNA på grund av näringsbrist, vilket resulterar i syntesen av proteiner som är nödvändiga för cellöverlevnad eller apoptos. Därför är det viktigt att undersöka IRES-aktivitet av p53 mRNA under näringsberövade förhållanden. I den aktuella studien tyder resultaten på att glukosutarmning relativt inducerar p53-IRES-aktivitet, vilket ses i bicistronic reporteranalyser. Det finns rapporter som har implicerat p53-protein för att binda sitt eget RNA. 34 E3-ubiquitin-ligaset MDM2 är ett välkänt mål för p53, bildar en återkopplingsslinga och reglerar p53-nedbrytning. Intressant nog har MDM2 också visat sig interagera med kodningssekvensen för IRES i p53 mRNA. 12, 35, 36 Ett nyligen genomfört arbete föreslog stressberoende bildning av ett ternärt komplex av tre proteiner: p53, MDM2 och SMAR1, 37 ett annat transkriptionsmål för p53 som kan modulera p53-transaktiveringspotential. 37, 38 Vi finner nu att SMAR1, ett övervägande kärnprotein blir rikligt i cytoplasma under glukosberövning. Således kan glukosberövning, en form av näringsnedbrytningsstress, inducera p53 IRES och ökar också cytoplasmisk överflöd av SMAR1 som i sin tur binder till p53 IRES, vilket indikerar SMAR1: s roll i att kontrollera translation av p53-isoformer. Denna ökning i p53-isoformer är också reversibel vilket antyder att övergående glukos eller dietberövande kan påverka reversibelt på p53-signalering, vilket föreslås av p53-måltransaktivering.

Resultat

Glukosberövning ökar p53 IRES-aktivitet

p53-null H1299-celler transfekterades med luciferas-bicistroniska konstruktioner innehållande p53 1-25 RNA i den intercistroniska regionen. 7, 8, 11 Kontrollceller och glukos-svaltade celler skördades 4, 8, 20 och 30 timmar efter transfektion. Det var en jämn ökning av den relativa IRES-aktiviteten vid alla dessa tidpunkter efter glukosdeprivation, med en 1, 7-faldig ökning i aktivitet med 20 timmar (figur 1a, H1299-panelen och kompletterande tabell S1). Liknande experiment utfördes på A549-celler (med endogent p53) och resultaten bekräftade observationen i H1299-celler. Den relativa IRES-aktiviteten ökade med 2, 3 gånger 20 timmar och förhöjd IRES-aktivitet hölls vid 30 timmar efter glukosdeprivation i A549-celler (figur la, A549-panel och kompletterande tabell S2). I både H1299- och A549-celler återspeglar den relativa ökningen av IRES-aktivitet också en samtidigt minskning av lock-beroende translation av Renilla luciferas, vilket är mer tydligt i de p53-positiva A549-cellerna, eftersom glukosdeprivation inducerar eIF2 a- fosforylering. 39 Såsom framgår av dessa avläsningar är vikningsminskningen i cap-beroende översättning (R-Luc) mycket högre jämfört med viktsminskningen i cap-oberoende översättning (F-Luc), som kan tolkas som en situation där IRES-funktionen upprätthåller översättning av F-Luc. För att adressera den relativa effekten av glukosdeprivation på p53 IRES1 och IRES2 transfekterades bikistroniska plasmider innehållande den första (1–134) eller den andra (135–251) IRES RNA-modulen av p53 till H1299-celler. Liknande försöksregim som ovan visade att vid 30 timmar med glukosberövning ökade aktiviteten för det första IRES-området 2, 4 gånger (figur 1b och kompletterande tabell S3) medan den för den andra IRES-modulen ökade 1, 7 gånger (figur 1c och kompletterande tabell S3), en jämn ökning vid alla tidpunkter är ett vanligt inslag i båda IRES: erna. Svaret på glukosdeprivation var IRES-specifik, relativ aktivitet av VEGF IRES (figur 1d och kompletterande tabell S4), men inte HIF1a eller HCV IRES (figur 1e och f och kompletterande tabeller S5 respektive S6) var högre under dessa förhållanden .

Image

Image

Glukosberövande inducerar p53 IRES-aktivitet. ( a ) Schematisk representation av det bicistroniska konstruktet pRp53 (1–251) F som innehåller 1–251 IRES RNA. Relativ IRES-aktivitet representeras av Fluc / Rluc-förhållandet vid olika tidpunkter för H1299 och A549-celler, n = 6. ( b ) Schematisk representation av det bicistroniska konstruktionet pRp53 (1–134) F som innehåller den första IRES för p53, motsvarande 134nt i 5'UTR. Vik förändring i Fluc / Rluc-förhållande som mått på IRES-aktivitet, från fjärde timmars ostärkta celler inställda vid enhet, vid olika tidpunkter i H1299-celler, n = 6. ( c ) Schematisk representation av den bicistroniska konstruktionen pRp53 (135–251) F som innehåller den andra IRES för p53, motsvarande den första 117nte av kodningssekvensen. Vik förändring i Fluc / Rluc-förhållande som mått på IRES-aktivitet, från fjärde timmars ostärkta celler inställda vid enhet, vid olika tidpunkter i H1299-celler, n = 6. ( d - f ) Relativ VEGF ( d ), HIF1a ( e ) och HCV ( f ) IRES-aktivitet representeras av Fluc / Rluc-förhållandet vid olika tidpunkter för H1299-celler, n = 6 för varje. ( g ) Western blot från H1299-cellextrakt transfekterade med 14A-plasmid som uttrycker både p53 och Δ40p53 genom IRES-medierad translation följt av glukosberövning under 8 och 30 timmar. Grafer visar p53- och Δ40p53-nivåer normaliserade till aktin. ( h ) Western blot från H1299-cellextrakt transfekterade med 14A-plasmid som uttrycker både p53 och Δ40p53 genom IRES-medierad translation, följt av glukosberövande under 30 timmar och 50 μg / ml cykloheximid (CHX) -behandling för nästa 0, 60 och 120 min. Grafer visar spårvisa p53- och Δ40p53-nivåer normaliserade till aktin. ( i ) Luciferasreporteranalys för p21-promotortransaktivering från H1299-celler efter 24 timmar av pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmidtransfektion och 8 timmar av glukosdeprivation, n = 6. Schematisk representation av p21 (WAF1) promotor-eldfluxcykas och CMV- Renilla luciferas, senare fungerar som transfektionskontroll, visas. Western blot i insättning visar induktion av p53- och Δ40p53-nivåer efter 8 timmars glukosberövning från samma lysater. ( j ) Western blot av H1299-cellextrakt transfekterade med 14A-M1 eller 14A-M2-plasmid (se Resultatavsnitt för beskrivning). Cellerna utsattes för glukos under 8 och 30 timmar

Bild i full storlek

För att studera effekten av glukosdeprivation på p53 IRES-medierad translation transfekterades pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA (14A) -plasmid som uttrycker både p53 och Δ40p53 genom IRES-medierad translation i H1299-celler följt av glukosberövande för 8 timmar och 30 timmar. Det var märkbar ökning i stabilitetsnivåerna för båda isoformerna i dessa tidspunkter (figur 1g). För att undersöka huruvida en sådan ökning berodde på ökad stabilitet av dessa isoformer efter glukosberövning, genomfördes tidsberoende behandling med cykloheximid (CHX, translation-initiation blocker) 30 timmar efter glukosberövning. Intressant nog upphävdes induktionen i stabilitetsnivåerna för p53 och Δ40p53 (figur 1h, spår 1 mot 4) fullständigt efter CHX-behandling (figur 1h, spår 5 och 6), vilket antyder att sådan induktion möjligen är på översättningsnivå initiering, vilket är IRES-medierat i denna experimentella miljö. Nedströms till glukosdeprivationsmedierad p53-induktion befanns p21-promotor signifikant aktiveras i en luciferasreporteranalys (figur 1i).

Den första transaktiveringsdomänen (TAD-I) för p53-protein är dockningsstället för MDM2-E3-ligas som ubikvitinylerar p53 och riktar det för nedbrytning. 40 Det var således nödvändigt att avgränsa om hämning av MDM2-funktion på glukosdeprivation resulterar i förhöjd p53-stabilitet. Två konstruktioner som visas i figur 1j användes, en skulle endast producera p53 när andra ATG muterades (pGFP-hp-p53-5'UTR- (A252G / T253C / G254T) -cDNA eller 14A-M1-plasmid), medan den andra skulle producera endast Δ40p53 eftersom den första ATG muterades (pGFP-hp-p53-5'UTR (A135T) -cDNA eller 14A-M2-plasmid), båda plasmiderna skulle använda hela (1–251) IRES för att styra syntesen av proteinet. När celler berövades glukos under 8 eller 30 timmar ökade nivåerna p53 och även of40p53 (figur 1j). Eftersom Δ40p53-isoform saknar TAD-I och inte kan binda MDM2, uppträder ökning i dess nivåer uppenbarligen utesluter eventuellt fysiskt deltagande av MDM2 i att höja stabilitetsnivåer av p53-isoformer vid glukosberövning. Detta antyder också att bortsett från varje ökning i proteinstabilitet som kan tillskrivas glukos-svältinducerad p53-nivåer i full längd, är translation av p53- mRNA (som är IRES-medierad i detta experiment) också nödvändig för sådan induktion.

SMAR1-knockdown hämmar p53 IRES-funktion

För att bestämma om SMAR1 deltar i IRES-medierad translation av p53 mRNA på ett mer direkt sätt, bedömdes effekten av SMAR1-knockdown på det IRES-medierade uttrycket av p53-isoformer från pGFP-hp-p53-5'UTR cDNA. En siRNA-medierad dosberoende minskning sågs i nivåerna av p53 och Δ40p53 (figur 2a) men inte i cap-beroende ß- galaktosidasuttryck (figur 2a insatt), vilket tyder på att slå ner SMAR1 specifikt påverkade den IRES-beroende syntesen av p53-isoformer. Liknande siRNA-medierade knockdown-experiment med pRp53 (1–251) F bicistronic konstruktion, som representerar båda modulerna för p53 IRES behövs för fullständig IRES-funktionalitet i Δ40p53-syntes, 3, 8 minskade IRES-aktiviteten med nästan 30% (figur 2b och kompletterande tabell S7 ) och SMAR1-knockdown kontrollerades genom immunblotting (figur 2b, insättning). HCT116-p53 + / + kolonkarcinomceller (som A549 icke-småcelliga lungkarcinomceller som används) har också endogena nivåer av p53 och Δ40p53, i vilket uttryck av den kortare isoformen är helt IRES-beroende. siRNA-medierad knockdown av SMAR1 kan nedreglera Δ40p53-nivåer i dessa celler (kompletterande figur S8A). I dessa celler fanns det också en dosberoende minskning av IRES-aktivitet från pRp53 (1-25) F bicistronic konstruktion också (kompletterande figur S8B och kompletterande tabell S8C). För att validera RNA-interferensresultaten upprättades två stabila cellinjer genom puromycinselektion. H1299-S3-celler uttryckte stabilt shRNA för SMAR1, medan H1299-NS-celler uttryckte ett icke-målriktande shRNA; IRES-medierat uttryck av p53 och A40p53 var mindre i H1299-S3-celler (figur 2c). Vi kontrollerade också p53- och Δ40p53-nivåer vid överuttryckning av pcDNA-p53-däggdjursvektorn (5'UTR + cDNA; kompletterande figur S9A) och 14A (kompletterande figur S9B) i H1299-NS och H1299-S3-celler, i närvaro och frånvaro av DNA- skadligt medel doxorubicin; resultat tyder på att nivåer för stabilitet i båda isoformerna beror på SMAR1-nivåer. Intressant nog inducerades SMAR1-nivåer också på DNA-skador. Det bör emellertid noteras att SMAR1 kan interagera med full längd p53 i sin TAD1 och positivt reglera dess stabilitet 37 och följaktligen kommer nivåerna för fullängdsisoformen att bero på både översättning och stabilitet.

Image

SMAR1-knockdown hämmar p53 IRES-funktion. ( a ) Western blot av H1299-cellextrakt samtransfekterade med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmid (14A, visat schematiskt), pSV40- p- galaktosidasplasmid (transfektion och lockberoende translationskontroll) och icke-målriktning (Nsp) eller SMAR1 siRNA. Insats visar vikförändring i ß- galaktosidasaktivitet i vart och ett av de experimentella förhållandena (1–6), n = 3. ( b ) Analys med dubbel-luciferasreporter för relativ IRES-aktivitet från pRp53 (1-25) F-plasmid, representerad av Fluc / Rluc-förhållandet, på SMAR1-knockdown i H1299-celler, n = 9. Immunoblot inset visar knockdown av SMAR1 i samma lysat. ( c ) Puromycin-utvalda H1299-celler med stabil icke-målriktande (NS) eller SMAR1 (S3) shRNA-expression transfekterades med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmid. Western blot genomfördes 48 timmar efter transfektion. ( d ) Caspase 3/7 aktiveringsanalys i H1299-celler efter SMAR1-knockdown i närvaro av pGFP hp-p53-5'UTR cDNA (14A-plasmid). Puro, puromycin (2 μg / ml, 24 timmar) används som positiv kontroll för kaspasinduktion och apoptos. Experimentet utfördes 48 timmar efter transfektion, n = 3. ( e ) Δ40p53 mål 14-3-3σ mRNA-nivåer mätt med qRT-PCR i H1299-NS och H1299-S3-celler transfekterade med pGFP-hp-p53-5'UTR (A135T) -cDNA (14A-M2) plasmid, n = 9. ( f ) Western blot av H1299-NS- och H1299-S3-cellextrakt som transfekterades med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA (14A) eller pGFP-hp-p53-5'UTR (A135T) -cDNA (14A-M2) plasmid. Proteasomal nedbrytningshämmare MG132 (10 μM ) tillsattes 1 timme före skörd. Western blot gjordes på samma gel och membran; resultaten visas vid samma exponering

Bild i full storlek

Caspase 3/7-aktivering minskades även i närvaro av p53 och Δ40p53 om SMAR1 slogs ner under 48 timmar (figur 2d). Minskningen av Δ40p53-uttrycket på grund av SMAR1-knockdown försämrade också dess förmåga att inducera transkription av målgener nedströms. 14-3-3σ rapporterades nyligen som en preferensiell gene40p53 målgen. 5, 14 Uttryckning av p40p53 från 14A-M2-plasmiden resulterade i en 70% ökning av 14-3-3σ mRNA i H1299-NS-celler (figur 2e). SMAR1-knockdown kompromitterade emellertid induktionen av 14-3-3σ mRNA med endast cirka 17% ökning av H1299-S3-cellerna, vilket antydde att SMAR1 krävs för Δ40p53-medierad transaktivering (figur 2e).

Vi ställde frågan att om proteasomal nedbrytning hämmas genom MG132-behandling (60 min) i H1299-S3-celler, kommer det att lindra SMAR1-knockdown-medierad förtryck av p53 och Δ40p53-uttryck. Vi använde två konstruktioner för denna studie (figur 2f): en som skulle uttrycka båda isoformerna (14A), medan en annan som bara skulle uttrycka Δ40p53 (14A-M2). I båda fallen skulle uttryck av p53-isoformer enbart IRES-medieras. Vid MG132-behandling efter SMAR1-knockdown fanns det ingen de-repression i uttrycket av p53-isoformer från någon av konstruktionerna, vilket antydde att SMAR1: s roll inte är i nivå med proteinnedbrytning (figur 2f). SMAR1 är känt för att binda till p53 i full längd vid 14–16 aminosyror som ligger inom TAD-I. 37 Eftersom SMAR1-knockdown minskade p53 såväl som Δ40p53-nivåer uttryckta från olika konstruktioner och Δ40p53 saknar TAD-I, verkar SMAR1 ha funktioner som är oberoende av TAD-I-interaktion också. En trolig förklaring är att SMAR1 verkligen är väsentlig för IRES-beroende översättning av p53 och Δ40p53.

p53-MDM2-proteininteraktion är väl dokumenterad i den vetenskapliga litteraturen. Ett annat protein SMAR1 visade sig bilda ett ternärt komplex med p53-MDM2. 37 Som ett bevis på att SMAR1-homologer kan binda p53 RNA, renades 6X-His-taggade mus SMAR1 (BANP) (kompletterande figur S10A) och visade sig interagera med p53 (1–251) IRES RNA i såväl direkt som konkurrens RNA-protein UV-tvärbindningsanalys (kompletterande figurer S10B och D), under nativa förhållanden i RNA-EMSA (kompletterande figur S10E) och även med 1–134 och 135–251 regioner av p53 IRES RNA i filterbindande analyser (kompletterande Figur S10F).

Intracellulär omfördelning av SMAR1 på glukosdeprivation

Överraskande sågs SMAR1 distribueras i H1299-celler på glukosdeprivation i immunofluorescensförsök. H1299-celler svaldes av glukos under 4, 8 och 30 timmar, samma punkter i tid när relativa IRES-aktiviteter av p53 mRNA ökar. Efter 8 timmar tappades den nukleära SMAR1 anmärkningsvärt med ökningen i cytoplasmatiska nivåer jämfört med kontrollcellerna vid denna tidpunkt (figur 3a). Emellertid hade kontrollceller och glukos-svaltade celler vid 30 timmar nästan samma mängder kärn-SMAR1 men det fanns mer SMAR1 i cytoplasma för den senare (figur 3a). SMAR1 är ett övervägande kärnprotein och genomgår cytoplasmisk till nukleär relokalisering under genotoxisk stress. 41 FACS-studier visade att glukosdeprivationsdriven intracellulär omfördelning av SMAR1 i cytoplasma inträffade utan några ledtrådar från cellcykelförändringar, eftersom cellcykelprofilerna vid 4, 8 och 30 timmar för kontroll och experimentella monolagskulturer var nästan identiska, asynkron och saknar cellcykelstopp (kompletterande figur S11). PTB är en mycket väletablerad ITAF för p53 IRES och under experimentella förhållanden misslyckades den med att visa kärncytoplasmisk omlokalisering som SMAR1 under glukosdeprivation (figur 3b).

Image

Lokalisering av SMAR1 och PTB efter glukosberövning ( a ) Intracellulär omfördelning av SMAR1 på glukosberövning. Anti-SMAR1-antikropp användes i indirekt immunofluorescensanalys på asynkrona H1299-celler svälta av glukos under 4, 8 och 30 timmar och jämfördes med ostärkta celler vid samma tidpunkter. Streckade och fasta pilar indikerar cytoplasmatisk respektive nukleär lokalisering av SMAR1. Fluorescerande märkt sekundär antikropp användes och visualiserades med Zeiss LSM-mikroskop vid x60-mål. SMAR1 visas i grönt och DAPI (kärna) i rött, medan SMAR1 och DAPI sammanfogas visas i gult. ( b ) PTB omlokaliserar inte till cytoplasma vid glukosberövning. Anti-PTB-antikropp användes i indirekt immunofluorescensanalys på asynkrona H1299-celler svälta av glukos under de angivna tidspunkterna. Fluorescerande märkt sekundär antikropp användes och visualiserades med Zeiss LSM-mikroskop vid x60-mål. PTB visas i grönt och DAPI (kärnan) i blått, medan PTB och DAPI-sammanslagning visas i cyan

Bild i full storlek

Ökat uttryck av p53 och Δ40p53 under glukosdeprivation behöver SMAR1

H1299-NS och H1299-S3-celler transfekterades med 14A-plasmid och dessa celler glukos-svält i 8 timmar. Som väntat var IRES-beroende uttryck av p53 och -40p53 mindre i H1299-S3-celler jämfört med H1299-NS-celler (figur 4a). Intressant nog upphävdes glukos-svältmedierad induktion av isoformnivåerna anmärkningsvärt i H1299-S3-cellerna, vilket indikerar att SMAR1 är väsentlig för en sådan translationell induktion. För att studera effekten av glukosberövande på enbart Δ40p53 utfördes ett liknande experiment med 14A-M2-plasmid och resultaten bekräftade väsentligheten hos SMAR1 för glukos-svältmedierad induktion i syntesen av Δ40p53 (figur 4b). För att bekräfta vår hypotes fanns det ingen minskning av Δ40p53-nivåer på SMAR1-knockdown eller induktion vid glukosberövning när denna isoform enbart uttrycktes på ett mössberoende sätt utan någon IRES (ΔIRES-Δ40p53-plasmid; figur 4c). På liknande sätt bekräftade dual-luciferas-experiment med bicistroniska plasmider som bär den första (1–134) eller den andra (135–251) IRES eller med (1–251) IRES i den intercistroniska regionen att SMAR1 är nödvändig för induktion av IRES-aktivitet när celler är svält av glukos (figur 4d – f; tilläggstabell S12). Uttrycket av VEGF IRES ökade relativt vid glukosberövning, men uttrycket från VEGF (kompletterande figur S15) och HIF1 a IRES (kompletterande figur S16) sågs emellertid vara oberoende av SMAR1-knockdown. Stabila mRNA-nivåer av tre p53-transkriptionsmål, p21, Mdm2 och TIGAR, kontrollerades i NS- och S3-cellerna under glukosdeprivation (figur 4g). Det fanns en induktion av alla tre mRNA i NS-celler men inte i S3-celler, med undantag för p21 vid 30 timmar av svält i den senare. Immunoblots för samtidiga p53-, Δ40p53- och SMAR1-nivåer visas också (figur 4g).

Image

Ökat IRES-beroende uttryck av p53 och Δ40p53 och nedströms aktivering av mål-mRNA under glukosdeprivation är SMAR1-beroende. ( a - c ) Western blot-analys av H1299-NS- och H1299-S3-cell-extrakt transfekterade med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmid (14A i schematisk; a ), pGFP-hp-p53-5 ' UTR (A135T) -cDNA-plasmid (14A-M2 i schematisk; b ) eller ΔIRES-Δ40p53-plasmid ( c ) som var glukos-svält (-G) under 8 timmar före skörd, jämfört med ostärkta (+ G) celler. ( d - f ) Analys med dubbel-luciferasreporter för pRp53 (1–134) F (IRES1, d ), pRp53 (135–251) F (IRES2, e ) och pRp53 (1–251) F (IRES1 + 2, f ) bicistroniska konstruktioner transfekterade i H1299-NS- och H1299-S3-celler som var glukos-svält (-G) under 8 timmar före skörd, jämfört med ostärkta (+ G) -celler. Vik förändring i IRES-aktivitet (Fluc / Rluc) som visas med denna förhållandenhet normaliserad för ostärkta H1299-NS-celler, n = 6. ( g ) Kvantitativ PCR för nivåer av p53-mål-mRNA: er p21 / Cip1 (CDK-interagerande protein 1), Mdm2 (murin dubbel minut 2) och TIGAR (TP53-inducerad glykolys- och apoptosregulator), analyserad efter 0, 8 och 30 timmar av glukosberövande av H1299-NS och H1299-S3-celler transfekterade med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA (14A) -plasmid, n = 3. Representativa immunoblots som visar SMAR1, p53 och Δ40p53 nivåer visas

Bild i full storlek

I A549-celler återspeglar förändringar i -40p53-nivåer cap-oberoende-IRES-medierad översättning av denna isoform. 3, 14 På grund av glukosdeprivation fanns det en ökning i -40p53-nivåer vid 30 timmar och detta bekräftades med två olika antikroppar (figur 5a). p53- mRNA-nivåer förändras inte signifikant under denna tidsperiod (kompletterande figur S17A). I A549 (figur 5b) och HCT116-celler (figur 5c) ökar mRNA-nivåerna av p21 (ett föredraget p53-mål) och SFN (ett föredraget -40p53-mål) signifikant efter 30 timmars glukosutarmning. I A549 såväl som i hepatiska HepG2-celler befanns stabiliteten i SMAR1-proteinet öka vid glukosdeprivation (figur 5d). Men när SMAR1 tappades med användning av siRNA, upphävdes Δ40p53-uttryck nästan vid glukos-svält (figur 5e). Detta indikerar att SMAR1 är nödvändig för Δ40p53-uttryck under sådana förhållanden. Interaktionen ex vivo för p53 IRES adresserades genom kvantitativa immunutfällningsförsök. Från A549-celler immunutfälldes RNA-proteinkomplex med anti-SMARl-antikropp. ITAF PTB, som visade sig binda p53 IRES, 3 tjänade som en positiv kontroll (figur 5f, anti-PTB-staplar). RT-qPCR-analys av SMAR1-immunutfällningsassocierat RNA visade närvaron av RNA motsvarande 1–251 IRES, utöver det från RNA-proteinkomplex som immunutfällts av IgG-isotyp-antikroppen, i icke-svältade celler (figur 5f). Det var en uppenbar ökning i mängden RNA som drogs ned av anti-SMAR1-antikropp från glukos-svältade A549-celler (figur 5f). Ett liknande experiment utfördes i p53-null H1299-celler, som transfekterades med GFP-hp-5'UTR- p53-bicistronic RNA (figur 5g). Det var en tydlig ökning av IRES-RNA som drogs ner med SMAR1 under förhållanden med glukosdeprivation jämfört med normal glukos (figur 5g, anti-SMAR1-staplar). Tillsammans visar dessa resultat att SMAR1 kan interagera med IRS p53 (1–251) i celler och en sådan förening ökar uppenbarligen vid glukosdeprivation. Vi undersökte nästa cellcykelprogression (figur 5h) efter dubbel-tymidinblock i NS- eller S3-celler transfekterade med pEGFP (uttrycker endast EGFP) -, 14A (konstruktion uttrycker GFP, p53a och Δ40p53 a ) - eller 14A-M2 (konstruktion uttrycker GFP och -40p53 a ) och följs upp med glukos-svält. Våra resultat antyder att efter 8 timmars glukosdeprivation i pEGFP-transfekterade celler finns det en uppenbar ökning i 4 n (och den mellanliggande 2 n – 4 n ) populationen efter 8 timmar och omvänt vid 24 timmar, oavsett om SMAR1 slås ner eller inte. Intressant nog är denna förändring vid 8-timmars deprivation frånvarande i Δ40p53 α -transfekterade H1299-S3-celler i glukosdeprivation, vilket antyder preliminärt en korrelation av Δ40p53 α och S-fasvaraktighet i glukosdeprivation som är beroende av SMAR1-nivåer.

Image

Image

Fysiologisk relevans av glukosdeprivation vid SMAR1-p53 IRES-associering. ( a ) Western blot av A549-cellextrakt efter indikerad varaktighet av glukos svält, blottad med CM1 (vänster panel) eller Pab240 antikropp (höger panel). ( b, c ) Kvantitativ PCR för p21- , mdm2- och SFN- mRNA-nivåer normaliserade till GAPDH i A549-celler ( b ) och HCT116-celler ( c ) efter 0, 8 och 30 timmars glukosberövning. ( d ) Western blot av A549- och HepG2-cellextrakt som visar expressionsmönstret för SMAR1 på ett tidsberoende sätt efter glukosdeprivation. Glukos berövades den angivna tiden i timmar och cellerna skördades vid de givna tidpunkterna. ( e ) Western blot-analys av A549-cellextrakt transfekterade med icke-targetterande (Nsp) eller SMAR1 siRNA under 96 timmar, följt av glukos svält i 30 timmar. Δ40p53 nivåer indikeras med en pil. ( f ) Omvänd transkriptas-kvantitativ PCR-analys av RNA extraherat från ribonukleoproteinkomplex immunutfällt från icke-svält eller 8-timmars glukos-svält A549-celler med användning av anti-SMAR1, anti-PTB antikroppar eller IgG-isotypkontroll. Primrar motsvarande 1–251 region av p53-RNA användes. Resultat representerade som vikningsändring utöver RNA-immunutfällning från icke-svältade celler med IgG-kontrollantikropp. ( g ) Omvänd transkriptas-kvantitativ PCR-analys av RNA extraherat från ribonukleoproteinkomplex immunutfällt från icke-svält eller 8-timmars glukos-svält H1299-celler transfekterade med GFP-hp-5'UTR- p53-bicistronic mRNA med användning av anti-SMAR1, anti- PTB-antikroppar eller IgG-isotypkontroll. Primrar motsvarande 1–251 region av p53-RNA användes. Resultat representerade som vikningsändring utöver RNA-immunutfällning från icke-svältade celler med IgG-kontrollantikropp. ( h ) FACS-analys av cellpopulationer i G1-, S- eller G2-M-faser i H1299-NS och H1299-S3-celler. Cellerna transfekterades med 14A (övre raden), 14A-M2 (mellersta raden) eller pEGFP (nedre raden). Cellcykeln arresterades genom dubbel-tymidinbehandling, varefter cellerna glukos svaltade under 0, 4, 8, 12, 24 och 30 timmar och skördades vid dessa tidpunkter med motsvarande ostärkta kontrollceller. ( i ) Glukospåfyllning (räddning) under 12 och 24 timmar efter 8 timmars glukosdeprivation i H1299-celler transfekterade med pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmid. Western blots depict SMAR1, p53, Δ40p53 and actin levels. Graphs represent lane-wise densitometric analysis. ( j ) Glucose replenishment (rescue) for 12 and 24 h following 8 h of glucose deprivation in A549 cells. Western blots depict endogenous p53 and Δ40p53 (shown by an arrow) as well as SMAR1 and actin levels. Graphs represent lane-wise densitometric values. ( k ) Quantitative PCR for levels of p53-target mRNAs p21/Cip1 (CDK-interacting protein1), SFN (stratifin alias 14-3-3 σ ), Bax (Bcl-2 associated X), TIGAR (TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator), PIDD (P53-induced DNA damage) and Mdm2 (murine double minute 2) in H1299 cells transfected with pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA plasmid, starved of glucose for 8 h ( 8 h ) and then rescued by glucose replenishment for 12 h ( 8 h/12 h ) and 24 h ( 8 h/24 h ). Results represented as fold change in mRNA levels compared to non-starved, transfected cells, n =3

Bild i full storlek

Next, we investigated whether deprivation-induced induction of p53 and Δ40p53 levels is reversible. After 8 h of glucose deprivation, H1299 (Figure 5i) and A549 cells (Figure 5i) were replenished with a medium containing glucose. In H1299 cells, IRES-driven expression of p53 isoforms from 14A plasmid returned to normal after 24 h of rescue with replenished glucose (Figure 5i). In A549 cells, endogenous levels of Δ40p53 (IRES driven) and SMAR1 increased on deprivation and returned to basal levels on 24 h of rescue (Figure 5j). The steady-state-mRNA levels of six p53 transcription targets were checked in H1299 cells transfected with pGFP-hp-p53-5'UTR cDNA (Figure 5k). There was an increase in levels of all the mRNAs, except Mdm2 on 8 h of glucose deprivation. However, on rescue, levels of p21 and SFN (cell-cycle arrest) as well as Bax and PIDD (pro-apoptotic) decreased; whereas TIGAR (glycolysis and apoptosis regulator) remained high after 8 h of rescue and decreased only after 24 h of rescue. Interestingly, Mdm2 levels were not affected significantly until 24 h of rescue, when it decreased significantly compared to non-starvation (Figure 5k).

The effect of starvation on p53 and Δ40p53 was investigated in vivo . Wild-type as well as SMAR1 transgenic mice were starved for 0, 12 and 24 h. In the liver, there was a marked increase in SMAR1 levels 24 h post deprivation (Figure 6a, lanes 5 and 6) that corresponded to an increase in the levels of p44 protein (mouse Δ40p53). This was also evident in the thymus (Figure 6b, lanes 5 and 6). In the liver from SMAR1 transgenic mice, the increase in SMAR1 was more evident 12 h post deprivation with a corresponding increase in Δ40p53 at this time point (Figure 6a, lanes 9 and 10). The results, however, were more heterogeneous in the thymus from these SMAR1 transgenic mice (Figure 6b, lanes 7–12). A rescue experiment was performed in WT mice, wherein after 24 h of starvation, these were fed ad libitum for a further 12 and 24 h. Liver lysates from 12 and 24 h 'rescued' mice showed decrease in the levels of SMAR1, p53 and, to a lesser extent, p44 (mouse Δ40p53) protein levels compared to starved mice. The mRNAs of p53 targets, p21 and Mdm2 displayed corroborating changes in their levels, returning to normal (non-starved) levels after 24 h of rescue. Blood glucose levels in both the wild-type and SMAR1 transgenic mice drop by about 20 and 40% after 12 and 24 h of starvation, respectively and are restored to normal levels after 12 h of feeding (Supplementary Figure S18).

Image

Starvation induces levels of SMAR1, p53 and Δ40p53 in vivo and this effect is reversible on withdrawal of starvation. Western blot of tissue extracts of liver ( a ) or thymus ( b ) from wild-type and SMAR1 transgenic mice at 0, 12 and 24 h of starvation, in duplicates, probed for SMAR1 (upper panel), p53 and Δ40p53 (middle panel) and actin (lower panel). Graphs show lane-wise densitometric analysis of SMAR1, p53 and Δ40p53 levels normalized to actin, n =4. '*' represents non-specific band. ( c ) Rescue experiment on starvation withdrawal for 12 and 24 h following 24 h of dietary starvation. Western blot of tissue extracts of the liver from wild-type mice probed for SMAR1 (upper panel), p53 and Δ40p53 (middle panel) and actin (lower panel). Graphs show lane-wise densitometric analysis of SMAR1, p53 and Δ40p53 levels normalized to actin, n =3. '*' represents non-specific band. ( d ) Quantitative PCR for levels of p53-target mRNAs p21/Cip1 (CDK-interacting protein1), SFN (stratifin alias 14-3-3 σ ) and Mdm2 (murine double minute 2) in wild-type mice liver, starved of glucose for 12 h ( 12 h ) and then rescued by starvation withdrawal for 12 h ( 12 h/12 h ) and 24 h ( 12 h/24 h ). Results represented as fold change in mRNA levels compared to liver from non-starved mice, n =3. mmu: Mus musculus

Bild i full storlek

Diskussion

During translational control of p53 mRNA, levels of full-length p53 are predominantly regulated by cap-dependent translation initiation and IRES functions more as a back-up in stress, when cap-dependent translation declines. However, for Δ40p53 such regulation is solely IRES dependent. We report here that glucose deprivation in cultured mammalian cells induces p53 IRES activities. Earlier studies have shown that glucose starvation induces p53 protein levels in an AMP-activated protein kinase-dependent manner. 42, 43 In addition, it was shown that PPAR gamma coactivator 1 alpha (PGC-1 α ) binds to p53 and modulates its transactivation function on glucose starvation. 44 p53 IRESs are known to be inducible by ER and genotoxic stress, oncogene overexpression and G2-M arrest. The current study is the first to report that p53 IRESs are sensitive to any form of nutrient depletion. Both the IRES modules of p53 mRNA were seen to be induced on glucose starvation and higher steady-state levels of p53 and Δ40p53 could be abrogated on treatment with translation-blocker cycloheximide even in glucose depletion, further confirming the role of IRES-mediated translation in p53 mRNA under such stress. There is also a greater turnover of p53 isoforms on glucose deprivation, evident on cycloheximide treatment also. The striking feature was a complete abrogation of induced p53 isoform levels on glucose deprivation because of arrested translation with cycloheximide treatment, hence for the current study we focussed on IRES-mediated enhancement of translation of p53 isoforms on glucose deprivation. Glucose starvation has been observed as a form of ER stress because similar to this stress, depleting glucose in a medium of cultured cells results in increased eIF2 α phosphorylation. 39 p53-MDM2 protein interactions are well documented in the scientific literature. 40, 45 MDM2 protein also binds to the coding region of p53 IRES RNA and promotes translation of the full-length p53 and the alternatively translated product Δ40p53. 12, 35 p53 is also known to have RNA re-annealing properties, binding to the 5′UTR of its own mRNA, 34 as well as of Cdk4 46 and FGF2. 47, 48 Recent reports showed that SMAR1 forms a ternary complex with p53-MDM2, in which MDM2 binds to residues 17–26 of p53 and SMAR1 binds to residues 14–16 of p53, with a simultaneous interaction of SMAR1 and MDM2. 37

We report that SMAR1 is able to bind to p53 (1–251) IRES directly and specifically in the in vitro studies; ex vivo immunoprecipitation experiments serve in confirming this association. SMAR1 was identified as a novel DNA-binding protein from murine thymocyte expression library screen that was associated with matrix attachment region on enhancer regions for genes encoding T-cell receptor β chain in murine CD4 + CD8 + double-positive thymocytes. 49 SMAR1 has been implicated in maintaining cellular homeostasis and is a global regulator/modulator of gene expression. 37, 38, 50, 51, 52, 53, 54 Our recent study showed that SMAR1 is directly linked to translation of both p53 and Δ40p53 in normal as well as glucose-deprived conditions. 14-3-3σ was demonstrated as a preferential transcriptional target of Δ40p53. 5, 14 The downstream effects of Δ40p53 induction on target gene activation, and the resulting biological outcome, have been previously explored. 55, 56, 57 In the current study, using Δ40p53-mediated transactivation as a model, we showed that SMAR1 is important for IRES-dependent Δ40p53 induction, as well as for the consequent elevation of 14-3-3σ mRNA (Figure 2e). Therefore, activation of p53 IRES by SMAR1 is likely to contribute to Δ40p53 function, probably more than full-length p53, as translational induction of the shorter isoform has to be through IRES and hence ITAF mediated. Also, p53-mediated transactivation was found to be lesser in case of SMAR1-knockdown cells, largely in both non-starved and starved conditions (Figure 2e). Nuclear-cytoplasmic relocalization of ITAFs is essential for cellular IRES function. 58, 59, 60 We report in the current study a glucose-dependent relocalization of SMAR1, but not PTB, in cultured cells, highlighting the novelty of SMAR1-mediated control in stress. In addition, rescue experiments both ex vivo and in vivo show that the induction of p53 isoform levels on nutrient deprivation is reversible, with these returning to basal levels on nutrient replenishment. The changes in p53 transactivation target mRNAs also largely corroborate this finding.

Deregulations in translational control contribute to each step of cellular transformation and tumor progression, nutrient starvation being a very common stress for the cells located inside non-vascularized tumors. 61 Activation of p53 IRESs on glucose deprivation provides a new regulatory aspect to the field of translational control of p53 mRNA, suggesting critical function of the p53 isoforms in these conditions in terms of cell survival and stress tolerance.

Material och metoder

Plasmidkonstruktioner

Dual-luciferase constructs of the p53 (1–251) IRES, first (1–134) IRES, second (135–251) IRESs, 3, 8 VEGF and HIF1 α IRESs (kind gifts from Professor Greg Goodall, Centre of Cancer Biology, Australia and Professor Annapoorni Rangarajan, MRDG, IISc) and HCV IRES 62 were used in quantitative bicistronic assays. WWP luciferase (a kind gift from Professor Kumaravel Somasundaram, IISc) was used for measuring p53-dependent transactivation, CMV- Renilla -luciferase (Promega, Madison, WI, USA) constructs were used to normalize transfection efficiency. GFP-p53-bicistronic constructs used were pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-containing initiator ATGs for both p53 and Δ40p53 (a kind gift from Professor Robin Fahraeus, INSERM, France), pGFP-hp-p53-5'UTR-(A252G/T253C/G254T) cDNA with a functional initiator ATG for p53 only, and pGFP-hp-p53-5'UTR(A135T) cDNA with a functional initiator ATG for Δ40p53 only. pSV40- β -galactosidase (Promega, Madison, WI, USA) was used as a control for transfection efficiency as well as cap-dependent translation. shRNA-mediated knockdown of SMAR1 was through pGIPZ-shSMAR1(S3) construct, pGIPZ-NS construct expressed non-targeting shRNA. ΔIRES-Δ40p53 construct was used for cap-dependent expression of Δ40p53 (a kind gift from Professor Robin Fahraeus, INSERM, France and Professor Adi Kimchi, Weizmann Institute of Science, Israel). pCMV-3XFLAG-SMAR1 was used as described earlier. 53

Cell lines, transfections, glucose deprivation and drug treatment

H1299, HCT116-p53 +/+, A549 and HepG2 cells were maintained in DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 10% fetal bovine serum (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). For luciferase assays or western blots, 70% confluent monolayer of H1299 or A549 were transfected with various bicistronic luciferase constructs or cDNA plasmids using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in Opti-MEM (Invitrogen). Four hours later, the medium was replaced with DMEM (with antibiotic) and 10% FBS. At the desired time point, the cells were harvested and processed as required. For glucose deprivation, cells were washed twice in DMEM-minus glucose and maintained in the same medium for the desired duration. For establishing cell populations with stable expression of SMAR1 or non-targeting shRNA, corresponding pGIPZ DNA constructs were transfected into H1299 cells. After 24 h, 2- μ g/ml puromycin was added in the medium and this concentration was maintained for the next 48 h. Then the pooled-puromycin-resistant cells were passaged two times in 1- μ g/ml puromycin and SMAR1 knockdown validated by immunoblotting. For all subsequent experiments, pooled-antibiotic-resistant H1299-NS and H1299-S3 cells were maintained in 1- μ g/ml puromycin. For DNA-damage induction, H1299-NS and S3 cells were treated with 2- μ M doxorubicin for 16 h.

siRNA-transfektion

The employed siRNA sequence against SMAR1 was 5′-UAACCCUGAGAUGCGGGUA-3′. As a control for silencing, a siCONTROL non-targeting siRNA #5 (Dharmacon, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) was used in the experiments in a similar manner. Co-transfection of siRNA with various plasmid constructs was performed in monolayer H1299, HCT116-p53 +/+ or A549 cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfection reagent in Opti-MEM (Invitrogen). Forty-eight or 96 h post-transfection the cells were harvested and the extracts were used for dual-luciferase assays or for western blot analysis.

Western blot-analys

Proteinkoncentrationer av extrakten analyserades av Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) och lika stora mängder cellextrakt upplöstes i SDS-PAGE, 12% och överfördes till nitrocelluosemembran (Sigma-Aldrich). Prover analyserades sedan med western blotting med användning av kaninupphöjt CM-1-antikropp (vänlig present från professor Robin Fahraeus, INSERM), anti-SMAR1-antikropp (Abcam, Cambridge, UK), musuppvuxen DO1- och Pab240-antikroppar (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) eller kaninupphöjd anti-GFP-antikropp (IMG5127, Imgenex, Bhubaneswar, Odisha, Indien) följt av sekundär antikropp (pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-kanin IgG; Sigma-Aldrich). Mus-monoklonal anti- / -aktinantikropp (Sigma-Aldrich) användes som en kontroll för lika belastning av totala cellextrakt. Antikroppskomplex detekterades med användning av Immobilon Western-systemen (EMD Millipore, Billerica, MA, USA).

Dual-luciferas-analys

Renilla - och eldfluciferasaktiviteter mättes med användning av dual-luciferasreporteranalyssystemet (Promega), enligt tillverkarens protokoll, med TD20 / 20 Luminometer (Turner BioSystems, Promega).

Beta-galaktosidasanalys

RIPA-lysat från pSV40- p- galaktosidas-transfekterade celler användes för den kolorimetriska analysen. Till 0, 1-M natriumfosfatbuffert (82% 0, 1-M Na2HP04 och 18% 0, 1-M NaH2P04) sattes totalprotein-normaliserade volymer RIPA-lysat tillsammans med 0, 1-M MgCl2, 4, 5-M p- merkaptoetanol och 4 mg / ml o- nitrofenyl- p , d-galaktopyranosidsubstrat; reaktionerna inkuberades i 37 ° C under 30 minuter. Efter släckning med 1-M natriumkarbonatlösning mättes en 420 nm i en spektrofotometer.

Caspase-analys

Åtta tusen H1299-celler ympades per brunn i plattor med 96 brunnar 16 timmar före transfektion. Dessa transfekterades med totalt 15 ng DNA per brunn och mediet byttes efter 6 timmar. Efter 48 timmar tillsattes 50 μl caspase 3/7 Glo-reagens (Promega) per brunn, inkuberades vid rumstemperatur under 3 timmar och därefter mättes luminescens i Turner BioSystems plattläsare med motsvarande protokoll.

RNA-isolering och PCR i realtid

Totalt RNA isolerades från H1299, A549 eller HCT116-celler med användning av TRI-reagens (Sigma-Aldrich) enligt tillverkarens protokoll, behandlades med 10 enheter DNas per prov och extraherades med fenol-kloroform-metod. För RNA-isolering från mösslever, suspenderades en del av organet i TRI-reagens (Sigma-Aldrich) och 200 μg / ml glykogen, homogeniserades med handhållen Downs homogenisator (Sigma-Aldrich) med 50 slag på is och sedan tillverkarens protokoll följdes som vanligt. För PCR i realtid syntetiserades första-sträng cDNA med användning av oligo- (dT) 18- primer (Thermo Scientific) med användning av RevertAid RT-enzym (Thermo Scientific) från 2- μg RNA. Reaktionen sattes upp med 2 μl av 1: 5 utspädd cDNA med användning av DyNAmo qPCR-kit (Thermo Scientific) som använder SYBR grön kemi enligt tillverkarens instruktioner om ABI Prism 7900HT-maskin (Applied Biosystems, Life Technologies) eller ABI ViiA7-maskin (Applied Biosystems, Life Technologies). Data analyserades med hjälp av SDSv2.3-mjukvara (Applied Biosystems, Life Technologies) eller ViiA7 RUO-programvara (Applied Biosystems, Life Technologies). Resultaten beräknades med den jämförande Ct-metoden. Primersekvenserna är som följer:

p53 Framåt: 5′-TGGGCTTCTTGCATTCTGG-3 ′, p53 bakåt: 5′-GCTGTGACTGCTTGTAGATGGC-3 ′; p21 framåt: 5′-CCTCAAATCGTCCAGCGACCTT-3 ′; p21 omvänd: 5′-CATTGTGGGAGGAGCTGTGAAA-3 ′; BAX framåt: 5′-GCCCTTTTGCTT CAGGGTTT-3 ′; BAX-omvänd: 5′-TCCAATGTCCAGCCCATGAT-3 ′; PIDD framåt: 5′-CGAGCCCTCTGACACGGT-3 ′; PIDD-omvänd: 5′-AGAAGGACACCTGGCCCC-3 ′; SFN framåt (14-3-3 σ ): 5'-TGAGAACTGGACAGTGGCAG-3 '; SFN (14-3-3 a ) Omvänd: 5'-GAGGAAACATGGTCACACCC-3 '; MDM2 framåt: 5′-ATCTTGGCCAGTATATT ATG-3 ′; MDM2 omvänd: 5′-GTTCCTGTAGATCATGGTAT-3 ′; TIGAR framåt: 5′-CTGACTGAAACTCGCTAAGG-3 ′; TIGAR omvänd: 5′-CAGAACTAGCAGAGGA GAGA-3 ′; aktin framåt: 5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ′; aktinomvänd: 5′-TGAGGTAGTCAGTCAGGTCCC-3 ′; mmu-p21 framåt: 5′-CGGTGGAACTTTGACTTCGT-3 ′; mmu-p21 omvänd: 5′-GAGTGCAAGACAGCGACAAG-3 ′; mmu-Mdm2 framåt: 5′-AGATTCCAGCTTCGGAACAA-3 ′; mmu-Mdm2 omvänd: 5′-ACACAATGTGCTGCTGCTTC-3 ′; mmu-SFN framåt: 5′-GAAACCTGCTTTCCGTAGCTTA-3 ′; mmu-SFN omvänd: 5′-TCTGAGCTCGGTCTCTACCTTC-3 ′; mmu-Actin framåt: 5′-CGGTTCCGATGCCCTGAGGCTCTT-3 ′; mmu-aktin omvänd: 5′-CGTCACACTTCATGATGGAATTGA-3 ′.

Immunofluorescensfärgning

För immunfluorescensfärgning odlades H1299-celler på täckglas under 14 timmar följt av glukosberövning under 4, 8, 17 och 30 timmar. Vid varje tidpunkt tvättades cellerna på täckglas två gånger med 1x PBS och fixerades med 4% formaldehyd vid rumstemperatur under 20 minuter. Efter permeabilisering med 0, 1% Triton X-100 under 2 minuter vid rumstemperatur inkuberades cellerna med 4% BSA vid 37 ° C under 1 timme följt av inkubering med kaninhöjd anti-SMAR1 (Abcam) antikropp eller musupphöjd anti- PTB-antikropp (Calbiochem, White House Station, NJ, USA) under 16 timmar vid 4 ° C och detekterades sedan av Alexa-488-konjugerad anti-kanin eller Alexa-633-konjugerad anti-mus-sekundär antikropp under 30 minuter (Invitrogen). Bilder förvärvades med hjälp av Zeiss konfokala mikroskop och bildanalys gjordes med LSM Image browser (Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

FACS-analys

För FACS-analys trypsiniserades den asynkrona monolagen av H1299-celler, tvättades med 1x PBS och fixerades i 70% etanol vid 4 ° C. Fasta celler behandlades med 50 ug RNas A (Thermo Scientific) vid 37 ° C under 60 minuter och färgades sedan med 20-ng / ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich) vid 37 ° C under 30 minuter. Färgade celler analyserades i FACSCantoII (BD Biosciences) cellanalysator med användning av FACS Diva 2.0-programvara (BD Biosciences).

Immunutfällning av RNP-komplex in vivo

GFP-hp-5'UTR- p53-bicistronic mRNA syntetiserades från Xhol- lineariserad pGFP-hp-p53-5'UTR-cDNA-plasmid med användning av RiboMax-kit (Promega) enligt tillverkarens instruktioner. H1299-celler vid 85–90% sammanflytning 16 timmar efter sådd transfekterades med dessa RNA. Efter 4 timmar tillsattes ingen glukos-DMEM med 10% FBS till den experimentella uppsättningen med celler. Efter ytterligare 8 timmar lyserades cellerna med polysomlysbuffert (100-mM KCl, 5-mM MgCl2, 10-mM HEPES vid pH 7, 0, 0, 05% NP-40, 1-mM DTT, 100-U / ml RNasin och 1% proteasinhibitorcocktail). På liknande sätt togs icke-transfekterade A549-celler glukos under 8 timmar, ingen berövning användes för kontroll A549-celler och efter 8 timmar lyserades celler med polysomal lysbuffert. Supernatanter förklarades med Fast-Flow protein-G-sepharose-pärlor (Sigma-Aldrich) under 30 minuter vid rumstemperatur. Förklädda lysat innehållande lika totalt protein (500 μg ) inkuberades med anti-SMAR1, anti-PTB- (Calbiochem) eller kanin IgG (Sigma-Aldrich) mättat protein-G-sepharose-pärlor över natten vid 4 ° C. RNP-komplex konjugerade till antikroppsbundna pärlor snurrades ned vid 8000 varv per minut under 2 minuter, tvättades fyra gånger i iskall polysomal lysbuffert och spinnades på liknande sätt. RNP-komplex fälldes ut följt av proteinas-K (Promega) -behandling under 30 minuter vid 55 ° C. RNA extraherades med användning av TRI-reagens (Sigma-Aldrich) enligt tillverkarens protokoll och behandlades med DNase-I (Promega) vid 37 ° C under 20 minuter. Slutligen, med fenol-kloroform-utfällt RNA, utfördes RT-PCR med användning av IRES-specifik omvänd primer och RevertAid omvänt transkriptas (Thermo Scientific). cDNA användes för kvantitativ PCR med användning av IRES-specifika primrar och PCR-produkter upplöst i 2% agarosgel. Primersekvenserna är följande: p53-10-27-F-IP: 5'-ACCGTCCAGGGAGCAGGT-3 ', p53-238-251-R-IP: 5'-TGCTTGGGACGGCA -3'. Ingången normaliserades med användning av värden som erhölls i RNA isolerat från 10% inmatat lysat.

In vivo- experiment i möss

Totalt använde 24 åtta veckor gamla kvinnliga C57BL / 6-möss (12 WT och 12 transgena; för SMAR1) 63 i experimentet. Tre tidspunkter användes, till exempel, 0 timmar (kontroll), 12 timmar (med svält) och 24 timmar (svält). Vid varje tidpunkt dödades fyra möss per experimentell uppsättning och de erforderliga vävnaderna (lever och tymus) isolerades. För räddningsförsöket användes totalt 12 WT-möss, tre vardera för kontroll, 24-timmars svält, 24-timmars svält / 12-timmars räddning och 24-timmars svält / 24-timmars räddningsgrupper. Vävnaderna tvättades först i iskall 1x PBS och finhakades med en sax och pincett på is. Totalt suspenderades 30 mg av det hackade vävnadsprovet i 1x RIPA-buffert och utsattes för sonikering (15 s / 15 s; puls / paus) vid hög intensitet under en total tid på 15 minuter i en sonikationsmaskin (Bioruptor, Diagenode, Denvile, NJ, USA). Proverna centrifugerades sedan vid 12 000 rpm under 30 minuter. Supernatanten uppsamlades och behandlades för immunblotting. För bestämning av blodsockernivå användes vildtyp (C57BL / 6) och SMAR1 transgena (SMAR1Tg) -möss för att sätta upp experimentet. Blod samlades upp genom hjärtpunktion och serumet isolerades. Serumglukosnivåerna mättes med GOD-POD-metoden med användning av ett kit (Spinreact, Girona, Spanien). Absorbansen mättes vid 505 nm i en ELISA-plattläsare. Nivåerna beräknades sedan med hänvisning till standardprovet. Grafen representerar data från fyra oberoende experiment.

In vitro transkription

För mSMAR1-bindande analys av p53 (1–251) IRES, respektive bikistronisk plasmid-DNA amplifierades PCR med användning av T7-promotorsekvensmärkt p53 fram-primer och specifik omvänd primer. Amplifierat DNA renades med PCR-reningskit (Qiagen, Venlo, Nederländerna) enligt tillverkarens instruktioner. Enligt tillverkarens instruktioner syntetiserades den a - 32 P-UTP-märkta RNA-sonden med 1–251 IRES RNA med T7 RNA-polymeras och 10 μ Ci / μl av a - 32 P-UTP (NEN, Perkin Elmer, Waltham, MA Och används för UV-tvärbindningsanalyser. Dessutom inkluderades 40 enheter RNase-hämmare (Promega) i varje reaktion för att hämma aktiviteten hos kontaminerande nukleaser.

Proteinrening

Uttrycket av rekombinant mus SMAR1 inducerades med 1-M IPTG under 16 timmar i Escherichia coli (BL21 DE3) celler transformerade med pET28b-SMAR1. Hans-märkta protein renades med användning av Ni2 + -nitrilotriättiksyra-agaros (Qiagen) under icke-denaturerande betingelser och eluerades med 500 mM imidazol.

UV-inducerad tvärbindning av proteiner och RNA

UV-inducerad tvärbindning utfördes såsom beskrivits på annat håll. 3 Kortfattat fick a - 32 P-UTP-märkt 1–251 IRES RNA-sond bilda komplex med rekombinant mSMAR1 vid 30 ° C i 25 minuter i 1x RNA-bindande buffert och bestrålades sedan med en handhållen UV-lampa i 20 minuter. Blandningen behandlades med 30 μg RNas A (Sigma-Aldrich) vid 37 ° C under 30 minuter. Protein-nukleotidylkomplexen elektroforesades på SDS-PAGE, 10% och analyserades genom fosforimaging.

Elektroforetisk mobilitetsskiftanalys

Villkor för EMSA har tidigare beskrivits. 64 a 32 P-UTP-märkt p53 1-251 IRES (25 fmol) inkuberades med 300 och 600 ng His-SMARl-protein vid 30 ° C under 30 minuter. Ladningsfärgämne tillsattes och protein-nukleotidylkomplexet upplöstes på en 4% (60: 1) polyakrylamidgel vid 4 ° C.

Filterbindande analys

De a - 32P-märkta motsvarande p53-RNA: erna (1–251 eller 1–134 eller 135–251 regioner av p53 IRES) inkuberades med ökande koncentrationer av renad mSMAR1 vid 30 ° C under 20 minuter i RNA-bindande buffert (5- mM HEPES vid pH 7, 6, 2- mM KCl, 2-mM MgCl2, 3, 8% glycerol, 2-mM DTT och 0, 1 mM EDTA) och laddades på nitrocellulosafilter jämviktade igen med RNA-bindande buffert. Filtren tvättades fyra gånger, torkades och de kvarvarande räkningarna mättes i en scintillationsräknare. Grafen ritades med proteinkoncentration (mikromolära koncentrationer) på x -ax och procent av RNA bundet som procenttalet räknat kvar på y -ax.

Statistisk analys

Uppgifterna uttrycktes som medelvärde ± SD Statistisk betydelse bestämdes med användning av dubbelsidig studentens t- test. Kriteriet för statistisk signifikans var P <0, 05 (*) eller P < 0, 005 (**).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

Ordlista

IRES

intern ribosominträdesplats

ER

endoplasmatiska retiklet

ITAFs

IRES transaktiva faktorer

R-Luc

Renilla luciferas

F-Luc

firefly luciferas

CHX

cykloheximid

TAD jag

transaktiveringsdomän

14A

pGFP-hk-p53-5'UTR-cDNA

14A-M1 plasmid

pGFP-hk-p53-5'UTR- (A252G / T253C / G254T) -cDNA

14A-M2-plasmid

pGFP-hk-p53-5'UTR (A135T) -cDNA

mSMAR1

mus SMAR1

SMAR1Tg

SMAR1 transgen

EMSA

elektroforetisk mobilitetsskiftanalys

Doxo

doxorubicin

Kompletterande information åtföljer detta dokument på Cell Death and Differentiation-webbplatsen (//www.nature.com/cdd)