Svar: 18-talet är en lämplig hushållningsgen för in vitro-hypoxi-experiment | brittisk journal för cancer

Svar: 18-talet är en lämplig hushållningsgen för in vitro-hypoxi-experiment | brittisk journal för cancer

Anonim

ämnen

  • cancer
  • Genexpression
  • hypoxi

Den här artikeln har uppdaterats

Herr,

Vi har läst med stor uppmärksamhet det brev som skickats av Nagelkerke et al. Detta team har tidigare publicerat en av de mest intressanta artiklarna om variationer i hushållningsgen (HKG) (de Kok et al, 2005). På grundval av sin egen tidigare laboratorieerfaring och specifika data erhållna om hypoxi-experiment (Mujcic et al., 2009) rapporterade de att om 18S rRNA inte var tillräckligt stabilt för att kunna användas för att normalisera resultat i mänskliga vävnader, verkade det vara ett bra HKG i cellinjer för att kompensera inmatning, omvänd transkription och PCR-effektivitet. Eftersom 18S rRNA inte var en av våra utvalda HKG: er i vår studie, föreslog de med rätta att studera dess uttryck på vår hypoxiska cDNA-bank. För detta ändamål använde vi samma 18S-primrar som de använde i sina försök (18S_W: F-agtccctgccctttgtacaca och R-gatccgagggcctcactaaac) och utförde kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR), såsom beskrivits tidigare (Caradec et al, 2010), på fyra prostata (PNT2 och LNCaP), njur (HEK) och bröst (MCF-7) cellinjer behandlade med fyra syrekoncentrationer (1, 5, 10 och 20%).

Resultaten visar först att 18S-amplifiering konstant detekteras vid cirka 15 PCR-tröskelvärden ( Ct ). När det gäller cellvariabilitet verkar uttrycket r18S vara relativt stabilt (variationskoefficient ( Ct CV%) <3%) i tre cellinjer, förutom i LNCaP-prostatumörcellcellinje där Ct CV% är över 6%. Dessa resultat har bekräftats med användning av en nyutformad uppsättning 18S-specifika primrar (18S_C: F-catggccgttcttagttggt och R-cgctgagccagtcagtgtag) (figur 1). När 18S-resultat jämfördes med de som vi redan erhållit med andra HKG (Caradec et al, 2010), fann vi att 18S verkar vara den bästa i HEK-cellinjen och den näst bästa i PNT2-cellinjer (tabell 1). Men det är troligtvis en av de värsta i LNCaP och MCF-7.

r18S-variationer i PNT2-, MCF-7-, LNCaP- och HEK-cellinjer odlade under olika hypoxiska förhållanden (1, 5, 10 och 20% syre). Rutplott representerar cykeltröskelvariationer ( Ct ), mätt med olika primrar (svart ruta: 18S_W, vit ruta: 18S_C, värde som representerar Ct CV% anges under motsvarande ruta plot). r18S-uttryck kvantifierades med qRT-PCR i duplikat i tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Våra studieresultat bekräftar eller motsäger inte slutsatserna som Nagelkerke et al. De rapporterade r18S som det bästa HKG för att normalisera resultat i hypoxiaxperiment, och vi fann att det kan vara en bra av två av de fyra cellinjer som vi studerade under hypoxi-tillstånd. Medan r18S kan vara ett bra och rimligt val för vissa cellinjer, skulle det inte vara det rätta för andra. Som angivits av Nagelkerke et al gäller detta även för in vivo- system eftersom kompensationssystemet som är bekvämt för en dedikerad in vitro- modell inte nödvändigtvis rekommenderas när vävnader måste studeras. Det är därför vi fortsätter med att hävda att varje HKG måste testas före experiment för att välja det bästa: detta nödvändiga steg bestämmer resultatets tillförlitlighet och bör utföras för varje ny studiedesign. När vi testade r18S måste en viktig fråga diskuteras här om dess användning som en dedicerad kompensation för effekt, RT och PCR. Faktum är att de flesta målutskrifter av intresse uttrycks på en i stort sett lägre nivå än r18s (vanligtvis över 25 upp till 35–36 ° C - över denna gräns är resultaten sannolikt otolkbara). Eftersom en skillnad på 10–15 Ct motsvarar en skillnad på 10 - till 10 5- gånger i expressionsnivå, återstår det att fastställa om en starkt uttryckt gen kan tjäna till att normalisera svagt uttryckta transkript. Det finns inga tydliga bevis på att transkript som finns i ett stort antal kopior extraheras på samma avkastningsnivå som skarpare. Dessutom kan det också vara detsamma för cDNA-produktion eftersom det är frestande att spekulera att omvänt transkriptas kan vara mer effektivt när stor mängd substrat är närvarande än för små representerade mål som har en stokastisk sannolikhet att behandlas på liknande sätt.

Eftersom RNA-extraktionsprotokoll, såväl som RT- eller PCR-effektivitet förblev starkt laboratoriereagens, protokoll och instrumentberoende, är globalisering av dessa tekniker fortfarande starkt obligatoriskt. Eftersom dessa standarder inte är tillgängliga ännu, förblir användning av HKG ett intressant alternativ som förutsätter att HKG: er har testats och kontrollerats noggrant i det experimentella systemet som de måste användas.

Förändra historien