Reaktion – diffusionsteori förklarar hypoxi och heterogen tillväxt inom mikrobiella biofilmer förknippade med kroniska infektioner | npj biofilmer och mikrobiom

Reaktion – diffusionsteori förklarar hypoxi och heterogen tillväxt inom mikrobiella biofilmer förknippade med kroniska infektioner | npj biofilmer och mikrobiom

Anonim

ämnen

  • biofilmer
  • Sjukvård

Abstrakt

Reaktionsdiffusionsmodeller användes för att få insikt i aspekterna av biofilminfektion och uthållighet genom att jämföra matematiska simuleringar med experimentella data från olika bakteriella biofilmer. Dessa jämförelser, inklusive tre in vitro- system och två kliniska undersökningar av exemplar som undersöktes ex vivo , underströk den centrala betydelsen av koncentrationsgradienter av metaboliska substrat och den resulterande fysiologiska heterogeniteten hos mikroorganismerna. Relativt enkla endimensionella och tvådimensionella (2D) modeller fångade: (1) experimentellt bestämd fördelning av specifika tillväxthastigheter uppmätta i Pseudomonas aeruginosa- celler i sputum från patienter med cystisk fibros; (2) mönster av relativ tillväxthastighet inom aggregat av streptokock biofilm som ligger i en endokarditvegetation; (3) ofullständig penetration av syre i en Pseudomonas aeruginosa- biofilm under exponeringsförhållanden för omgivande luft och även rent syre; (4) lokalisering av anabolisk aktivitet kring periferin av P. aeruginosa -cellkluster bildade i en flödescell och tillskrivning av detta mönster till järnbegränsning; (5) mycket låga specifika tillväxthastigheter, så små som 0, 025 h1, i det inre av cellkluster inom en Klebsiella pneumoniae- biofilm i en komplex 2D-domän med variabel celldensitet.

Introduktion

Listan över kroniska infektioner som härrör från biofilmer fortsätter att växa, liksom medvetenheten om den ekonomiska och mänskliga vägtull som uppstår genom dessa försvagande infektioner. Reaktion – diffusionsteori har framgångsrikt använts i årtionden för att förstå mikroskala kemiska gradienter, ekologiska nischer och substratflöden i avloppsrening och biofilmer i miljön. Det finns mycket färre exempel på anpassning av denna teori till system av medicinsk relevans. Här illustreras den allmänna användbarheten för denna klass av modeller, som härrör från de första principerna för samordnad Fickian diffusion och metabolisk reaktion, med fallstudier som inbegriper begränsning för syre, glukos och järn. Återkommande teman för hypoxi, fysiologisk heterogenitet i den mikrobiella populationen och antibiotikatolerans till följd av celler som inte växer upp. Sammantaget visar dessa exempel att reaktion-diffusionsteori kan tillämpas för att belysa den kemiska och fysiologiska heterogeniteten som sannolikt bidrar till patogenesen och persistensen av biofilminfektioner.

Matematisk modellering av biofilmer har bidragit till att förstå hur dessa aggregerade mikrobiella samhällen fungerar sedan semriartikeln av Enrique Lamotta 1976. 1 Hundratals biofilmmodeller har publicerats därefter, av vilka vi endast citerar några av landmärkeexemplen. . 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Nästan alla dessa studier var motiverade av tillämpningar inom vatten- och avloppsrening. De behandlar driften av system som trickling-filter, anaerob slamgörare och dricksvattenfördelningsrör.

Eftersom medvetenheten om biofilmbildningens roll i många ihållande infektioner expanderar, 10, 11, 12, 13 finns det en möjlighet att öka förståelsen för infektionsbara biofilms bildning, aktivitet och ekologi genom att anpassa samma typer av matematiska modeller som har varit så framgångsrika inom anläggningsteknik till system av medicinskt och tandligt intresse. Denna möjlighet förblir relativt outforskad och underutvecklad. Det finns några banbrytande exempel på biofilmmodellering som används på medicinska system. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Dessa modeller har bidragit med viktig insikt i sådana ämnen som mekanismen för tandkärl, 15, 23 penetrering av antibiotika i biofilmer, 14, 17 induktion av kvorumavkänning i en biofilm 19 och probiotisk kontroll av en patogen biofilm. 22

Syftet med det arbete som rapporteras i denna artikel är att visa den allmänna användbarheten av reaktionsdiffusionsteori för biofilmproblem av medicinsk relevans. Vi fokuserar särskilt på förmågan hos denna teoretiska metod att förutsäga gradienter i koncentrationen av metaboliska substrat och, som en konsekvens, mönster av mikrobiell tillväxt som är rumsligt heterogena.

Resultat

Fall 1 - förutsägelse av den rumsliga fördelningen av syre i en biofilm och hur det beror på koncentrationen av syre som appliceras på biofilmens yta

Eftersom syre är sparsamt lösligt och snabbt andas av aeroba mikroorganismer, är syrekoncentrationsgradienter ett vanligt särdrag i biofilmsystem. Syreprofilen uppmätt i en enkel in vitro P. aeruginosa biofilm beskriver en kurva vars form passar ganska bra av den paraboliska lösningen till reaktionsdiffusionsproblemet med noll ordning (figur 1a). I det här exemplet tillhandahåller ett värde på Thiele-modulen på O = 2, 82 en acceptabel beskrivning av data (figur Ib). De experimentella mätningarna som visas i figur 1 är från en biofilm med en koloni som först profilerades i luft och sedan översvämmades med ren syrgas och åter profilerades i denna syreberikade miljö. Mätningarna utfördes på samma exakta plana placering i biofilmen. Således var de fixerade fysikaliska ( Lf , ρ , D e ) och inneboende biologiska parametrarna ( μ o, Y xs ) som utgör ϕ o identiska. Den enda skillnaden mellan luft- och syrebetingelserna berodde på förändringen i syrehalten vid gränsen ( C o ). Vi förutspår därför att förhållandet mellan O- värden mellan dessa två fall borde vara numeriskt lika med kvadratroten av förhållandet mellan bulk-syrekoncentrationerna (se Ekvation (4)), vilket är (28, 5 / 6) 1/2 eller 2, 18 . Det faktiska förhållandet mellan de två monterade värdena på O var 4, 78 / 2, 82 eller 1, 70. Thiele-modulvärdena bestämda i luft och syre var statistiskt signifikant olika ( P <10 −4 ).

Experimentella och teoretiska syrekoncentrationsprofiler i en biofilm av P. aeruginosa koloni. ( a ) Teoretiska koncentrationsprofiler (fasta kurvor) för ett metaboliskt substrat som upplever reaktionskinetik med noll ordning för olika värden på Thiele-modulen, ϕ o . ( b ) Experimentella syrekoncentrationsprofiler i en enda P. aeruginosa- kolonibiofilm exponerad för antingen luft (grå cirklar) eller syreberikad gas (öppna cirklar). De heldragna linjerna är teoretiska kurvor som passar de två datauppsättningarna.

Bild i full storlek

Fall 2 - beräkning av sannolikhetsfördelningen för specifika tillväxthastigheter i en biofilm

Med tanke på att biofilmer har gradienter i koncentrationen av det tillväxtbegränsande substratet kommer det också att motsvara förändringar i den lokala cellspecifika tillväxthastigheten. För fallet med reaktionskinetik från första ordningen leder detta till variation i tillväxthastigheten i rymden som fångas i de fördelningar som visas i figur 2a. När diffusion endast är något begränsande ( ϕ 1 = 0, 5) är tillväxthastigheterna snabba och nära tillväxthastigheten som skulle förväntas med bulkvätskekoncentrationen av substrat (~ 1 h −1 ). När diffusionsbegränsningen ökar ( ϕ 1 gradvis större) blir distributionen bredare och inkluderar fler lägre tillväxthastigheter.

Förutsedd distribution av bakterietillväxthastigheter i en biofilm. ( a ) Tillväxthastighetsfördelningar för en biofilm med platt platta styrd av första ordningens reaktionskinetik för olika värden på Thiele-modulen, ϕ 1 . ( b ) Jämförelse av uppmätt tillväxthastighetsfördelning av P. aeruginosa i de explanterade lungorna hos tre CF-patienter 25 (svarta staplar) med fördelningen förutsagd för ϕ 1 = 5 (grå staplar).

Bild i full storlek

Kragh et al. 25 rapporterade nyligen encellsmätningar av specifik tillväxthastighet för P. aeruginosa i sputum hos tre patienter med cystisk fibros. Vi samlade dessa 63 mätningar och skapade en quadripartite-distribution. Den teoretiska fördelningen för ett värde av ϕ 1 = 5 matchar detta experimentella resultat väl (figur 2b).

Fall 3 - visualisering och kvantifiering av en tillväxthastighetsgradient inom en biofilm och identifiering av det tillväxtbegränsande substratet som järn

Ett sätt att visualisera gradienter i anabol aktivitet inom en biofilm är att använda en bakteriestam som innehåller ett inducerbart fluorescerande protein. En videosekvens för ett förflutet mikroskopi av ett sådant experiment kan ses i den kompletterande filmen S1. I detta experiment odlades en P. aeruginosa- biofilm innehållande en isopropyltio-P-D-galaktosidinducerbart grönt fluorescerande protein (GFP) under 5 dagar i frånvaro av induceraren. Biofilmen var mörk på denna punkt. Det inducerande medlet tillsattes sedan till mediet i oavbrutet kontinuerligt flöde. Under de närmaste timmarna utvecklades grön färg i cellklustret motsvarande det lokala uttrycket av GFP. Mer GFP uttrycktes vid periferin av klustret än vid klustercentret. Denna gradient återspeglar den relativa tillväxthastigheten för bakterierna i olika regioner i klustret.

Processen för att kvantifiera tillväxtmönstret i ett experiment som det som beskrivits ovan illustreras i figur 3. Ett biofilmkluster avbildat i överföringsläge var ~ 126 um i diameter (figur 3a). Efter induktionen av GFP och försänkning med ett rött färgämne observerades ett mönster av GFP-uttryck liknande det som beskrivits ovan: ljusare grönt nära klusterens kanter och dimmergrönt mot mitten (figur 3b). Den röda fläcken avslöjar fördelningen av biomassa oberoende av metabolisk aktivitet. Beräknade koncentrationsprofiler (ekvation (18)) av ett reagerande substrat i ett halvkuliskt kluster ges i figur 3c för flera värden i Thiele-modulen, ϕ 1 . Observera att eftersom tillväxthastigheten i detta fall är direkt proportionell mot den lokala substratkoncentrationen, förväntas de rumsliga mönstren som beräknas i figur 3c tillämpas på den mikrobiella specifika tillväxthastigheten såväl som själva substratkoncentrationen. Bildanalys av den gröna fluorescensintensiteten i ett biofilm-kluster kan jämföras med de teoretiska mönstren som de i figur 3c för att extrahera en kvantitativ uppskattning av Thiele-modulen. Ett exempel på en sådan anpassning visas i figur 3d.

Relativa tillväxttaktmönster i runda kluster av P. aeruginosa biofilm. ( a ) Sändningsbild av ett cellkluster. ( b ) Mönster för GFP-induktion (grönt) och biomassavlägsnande (rött) i samma cellkluster. a och b avbildades genom glasfästytan i planet för underlagsskalstavarna är 50 mikron. ( c ), Teoretiska substratkoncentrationsprofiler i ett halvsfäriskt kluster som är föremål för första ordningens reaktionskinetik för olika värden på Thiele-modulen, ϕ 1 . ( d ) Teoretisk kurva ( ϕ 1 = 4.5) anpassad till en experimentell GFP-fluorescensintensitet erhållen genom bildanalys från ett experiment som det som visas i b . ( e ) Thiele-modul bestämd genom anpassning till experimentell data planerad kontra klusterradie (symboler). Linjen är en minsta kvadratregression vars sluttning har värdet ( k 1 / D e ) 1/2 ; se Ekvation (17).

Bild i full storlek

När denna bildanalysprocess tillämpades på flera biofilm-kluster ( n = 22) från flera experiment bestämdes ett intervall av värden på 1 (figur 3e). Den uppskattade Thiele-modulen ökade med den uppmätta radien för cellklustret (figur 3e). Detta linjära beroende förväntas från definitionen av Thiele-modulen. Lutningen på linjen som är anpassad till data i figur 3e ger åtkomst till en kvantitativ uppskattning av värdet på den första ordningens reaktionshastighetskoefficient, k 1 .

Denna diskussion har hittills inte behandlat identiteten hos det tillväxtbegränsande substratet. I själva verket ger observationen av en aktivitetsgradient i en biofilm inte i sig någon ledtråd om begränsningens natur. Den troliga identiteten för det tillväxtbegränsande substratet kan nås genom att jämföra värden på k1 härrörande från experiment (dvs. figur 3e) och beräkna a priori från oberoende uppskattningar av beståndsdelparametrarna Dessa jämförelser sammanfattas i tabell 1. Alla teoretiska uppskattningar använde samma värde på bakteriens tillväxthastighet under bulkvätskeförhållanden ( μ o ). Tillväxthastigheten vid 23 ° C för denna P. aeruginosa- stam i det minimala använda mediet uppmättes i batchkultur till 0, 16 h −1 . De teoretiska uppskattningarna använde också samma konstantvärde för celltätheten i biofilmen ( ρ ) på 10 4 mg l −1 . Utbyteskoefficienter ( Yxs ) uppskattades baserat på den typiska sammansättningen av biomassa och referens till uppmätta värden. 26 Bulkvätskekoncentrationen för det begränsande substratet ( CO ) bestämdes av medelkompositionen för kol och kväve och av lösligheten av syre i vatten vid det typiska barometriska trycket i Bozeman, Montana. Järnkoncentration uppskattades som löslighetsgränsen för järn (III) fosfat. 27 Diffusionskoefficienter i biofilmen uppskattades som beskrivits på annat håll. 28, 29 Jämförelse av experimentvärdena för k 1 med de beräknade teoretiska värdena avslöjar en skillnad för kol, kväve och syre med två storleksordning eller mer. Endast för järn finns det en rimlig korrespondens. Järn är således det troliga tillväxtbegränsande substratet i detta fall.

Full storlek bord

Fall 4A - beräkning av rumslig variation i tillväxthastighet inom en heterogen biofilm in vitro

Wentland et al. 30 rapporterade en experimentell visualisering av den relativa tillväxthastigheten inom en K. pneumoniae- biofilm odlad in vitro i en kontinuerlig flödesreaktor. Detta resultat återges i figur 4a. Biofilmen varierade i tjocklek och lokal celltäthet. Det fanns ett band med aktiv tillväxt (indikerat med orange eller röd färg) som spårade biofilm-bulkvätskegränssnittet. Då biofilmen var tunnare och mindre tät, växte hela biofilmtjockleken snabbt, vilket indikeras av de varmare färgerna. Då biofilmen var lokalt tjockare föreslog klusterens inre lägre tillväxthastigheter, vilket indikeras av de kallare färgerna i gult och grönt.

Simulerade rumsliga mönster med specifik tillväxthastighet i en 2D heterogen biofilmstruktur jämfört med ett in vitro- resultat. ( a ) Akridinorangefärgad fryst sektion som visar områden med relativt snabb (röd / orange) och långsam (grön / gul) tillväxt (omtryckt med tillstånd från ref. 30). ( b ) Beräknat glukoskoncentration (mg l −1 ) för en vätskeformig glukoskoncentration på 30 mg l −1 . ( c - e ) Den förutspådda specifika tillväxthastigheten (h −1 ) för glukoskoncentrationer i bulk med 10 mg l −1, ( c ); 25 mg l −1, ( d ); och 40 mg l −1, ( e ). Bar = 100 um.

Bild i full storlek

Vi simulerade fördelningen av det tillväxtbegränsande substratet, glukos, inom en tvådimensionell representation av biofilmen med hjälp av parametervärden sammanfattade i tilläggstabell S2. Ett exempel på den förutsagda glukoskoncentrationen visas i figur 4b. Denna simulering visar att glukoskoncentrationerna minskas inom de tre större biofilmklusteren. Då bulkflukoskoncentrationen varierades (detta var den parametern för vilken en oberoende experimentell uppskattning inte var tillgänglig), förändrades det förutsagda tillväxthastigheten inom biofilmen. Vid en relativt låg bulkkoncentration på 10 mg l1 var tillväxthastigheterna i biofilmen också relativt långsam, vilket indikerades av en övervägande av gröna och gula nyanser (figur 4c). Vid den simulerade högsta bulkglukoskoncentrationen, 40 mg l1, tillväxthastigheterna var högre och mycket av biofilmen förutsågs växa snabbt (figur 4e). Eftersom reaktorns inflytande koncentration av glukos var 40 mg l-1 utgör detta en övre gräns till den faktiska koncentrationen som biofilmen upplever. Simuleringen vid en vätskeförsedd glukoskoncentration på 25 mg l-1 (figur 4d) liknar det experimentella mönstret (figur 4a). Förutsagda tillväxthastigheter manifesteras som en tydlig rumslig gradient inom biofilmen som sträcker sig från 0, 71 h −1 (84% av den maximala tillväxthastigheten) till bara 0, 025 h −1 (3% av det maximala).

Fall 4B - beräkning av rumslig variation i tillväxthastighet inom en heterogen biofilm ex vivo

Vi analyserar här aktivitetsmönstret som finns i en fluorescens in situ hybridisering (FISH) -probed infektiös biofilm som återvunnits från hjärtventilvegetationen hos en endokarditpatient (figur 5a). Mikroorganismen bestämdes vara Streptococcus equinus med användning av 16S rRNA (ribosomal RNA) -gen sekvensering. Det relativa ribosominnehållet, vilket avslöjades av fluorescenssignalintensiteten associerad med mängden hybridiserad FISH-sond (röd färg) indikerade lokal aktivitet associerad med biofilmens vänstra och övre gränser. Rumsliga mönster av bakterietillväxt inom denna struktur simulerades med användning av parametervärden sammanfattade i tilläggstabell S3. Simuleringar som endast modellerade tillhandahållande av glukos från vänster- eller toppgränserna ensam (figurerna 5b, c, respektive) kunde inte producera kvalitativt exakta representationer av det observerade aktivitetsmönstret. Snarare var det nödvändigt att modellera tillhandahållandet av det tillväxtbegränsande näringsämnet, glukos, från både vänster och övre gränser (figur 5d – f).

Simulerade rumsliga mönster med specifik tillväxthastighet i en 2D heterogen biofilmstruktur jämfört med ett ex vivo- resultat. ( a ) FISK-undersökt humant kliniskt endokarditprov som visar celler med relativt snabb (röd), mellanliggande (magenta) eller långsam eller ingen aktivitet (blå), vilket indikeras av relativt ribosominnehåll. ( b - f ) Den förutsagda specifika tillväxthastigheten (h −1 ) för glukoskoncentrationer i bulk med 100 mg l −1, ( b, c, e ); 500 mg l −1, ( d ); och 50 mg l −1, ( f ). Glukos tillhandahölls vid den vänstra gränsen ( b ), övre gränsen ( c ) eller på både vänster- och övre gränsen ( d - f ).

Bild i full storlek

En utgångspunkt för att ställa glukoskoncentrationen vid gränserna var glukoskoncentrationen i humant plasma, ~ 900 mg l −1 (ref. 31). När höga koncentrationer av glukos antogs längs vänstra och övre gränserna för aggregatet, förutsades snabb mikrobiell tillväxt i hela biofilmen (figur 5d). Först när gränsvillkorets glukoskoncentration minskades till ~ 100 mg l1 eller mindre (figurerna 5e och f), överensstämde de förutsagda mönstren med det observerade mönstret. Detta resultat visar att detta biofilmaggregat sannolikt utsattes för lägre koncentrationer av näringsämnen än vad som är tillgängligt i plasma, troligen till följd av yttre massöverföringsbegränsningar.

Diskussion

Reaktion – diffusionsteori kan tillämpas för att belysa den kemiska och fysiologiska heterogeniteten som sannolikt bidrar till patogenesen och persistensen av biofilminfektioner. Här har vi analyserat elementära problem som illustrerar benägenheten för hypoxi i närheten av en biofilm, potentialen för begränsning av olika substrat från syre till glukos till järn och verkligheten för distribuerade tillväxtstillstånd i den mikrobiella populationen som sträcker sig från snabbt växande till vilande.

Jämförelsen rapporterad i figur Ib kan betraktas som ett test av potentialen för hyperbar syreterapi för att förbättra penetrationen av syre till en biofilm. Genomträngningsdjupet för syre förutsägs öka när kvadratroten av den applicerade syrekoncentrationen. Exempelvis fördubblar syrespänningen fyrdubblar bara penetrationsdjupet för syre. Detta resultat belyser en möjlig begränsning av effektiviteten av att leverera syre till en infektiös biofilm med hyperbar syreterapi. 32 Denna begränsning kanske inte är allmänt erkänd inom det medicinska området även om koncentrationsberoendet av substratgenomträngning har varit känt i decennier i samband med reningsprocessen för biofilm. 33

Hypoxia är ett återkommande tema i biofilminfektioner. 34, 35, 36 Det påverkar läkning, den oxidativa sprängningen av neutrofiler och bakteriell antibiotikatolerans. 37 Reaktions – diffusionsmodeller är ett lämpligt tillvägagångssätt för analys av hypoxi, även om de kommer att behöva gå längre än de enkla modellerna som presenteras här för att införliva syretransport i kärlsjukdom och syreförbrukning av värdvävnad och leukocyter.

Kvantitativa resultat härrörande från en reaktionsdiffusionsanalys tillät oss att diagnostisera ett exempel på järnbegränsning (figur 3). Järn har inte tidigare identifierats som ett begränsande underlag för biofilmtillväxt enligt vår kunskap. Järnbegränsning är emellertid ganska plausibel in vivo , där det mesta järnet är sekvesterat. 38 Det mycket enkla minimala mediet som användes i detta experiment, till skillnad från många laboratoriemedier, innehöll inga spårelement. Det enda närvarande järnet tränade troligen in som en förorening av de bestående salterna. På grund av den relativt höga koncentrationen av fosfat skulle järn ha fallit ut som ett järnfosfat. Utfällt järn som finns kvar i suspension kommer att vara tillgängligt för planktoniska celler, men i biofilmen skulle bara det upplösta järnet kunna komma åt det inre av ett cellkluster genom diffusion.

Våra beräkningar visar att mikroskala biologisk heterogenitet i specifik tillväxthastighet kan förutsägas från de första principerna för reaktion och diffusion (figurerna 2, 4 och 5). Denna heterogenitet är uppenbar i variationen i tillväxthastighet mellan enskilda celler i en population (figur 2) och i rumsliga mönster över multicellulära aggregat av bakterier (figur 4 och 5). I dessa tre exempel - cystisk fibros sputum, en in vitro Enterobacterial biofilm och en bakteriellt koloniserad endokarditvegetation - har biofilmen inte bara hamnar på växande bakterieceller utan också celler som växer långsamt eller inte alls. Detta resultat kan hjälpa till att förstå antibiotikatolerans som härrör från biofilmer som innehåller en betydande andel icke-växande bakterier. 39

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film S1