Rationella kombinationer av sirnas riktade mot plk1 med läkemedel mot bröstcancer | onkogen

Rationella kombinationer av sirnas riktade mot plk1 med läkemedel mot bröstcancer | onkogen

Anonim

Abstrakt

Vanliga läkemedel som används för behandling av patienter med bröstcancer som paklitaxel och Herceptin visar ofta allvarliga biverkningar eller inducerar resistens i kliniska miljöer. Således analyserade vi en kombination av Plk1 (polo-liknande kinas 1) -specifika små störande RNA (siRNA), ett kraftfullt verktyg för att inducera 'mitotisk katastrof' i cancerceller, tillsammans med dessa läkemedel för att identifiera villkor för förbättrad läkemedelskänslighet. Efter transfektion tillsattes de antineoplastiska medlen och cellproliferation, apoptos och cellcykeldistribution i bröstcancerceller (MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435 och BT-474) och i primära humana epitelceller fast besluten. Nedreglering av cellulära Plkl-nivåer ledde till en förhöjd procentandel celler i G2 / M-fas. Procentandelen apoptotiska kärnor i MCF-7, MDA-MB-435, SK-BR-3 och BT-474-celler ökades tydligt efter inkubering med Plkl-specifika siRNA och paklitaxel. Intressant nog aktiverades kaspasvägen efter behandling med Plkl-specifika siRNA och paklitaxel eller Herceptin. Behandling av bröstcancerceller med siRNA som är inriktade på Plk1 förbättrade känsligheten gentemot paklitaxel och Herceptin på ett synergistiskt sätt. I alla experiment var mycket låga koncentrationer över ett brett spektrum av kliniskt relevanta koncentrationer tillräckliga för att inducera en antiproliferativ effekt. Kombinationen av Plk1-specifika siRNA med moderna bröstcancerläkemedel verkar representera rationella kombinationer som ska testas i prekliniska studier.

Introduktion

Ökad kunskap om den genetiska kontrollen av cellproliferation utgör grunden för specifika terapeutiska strategier för att bekämpa proliferativa störningar som cancer. Nyckelregulatorer för mitos i däggdjursceller är de polo-liknande kinaser (Plks), som är en grupp av mycket konserverade serin / treoninkinaser (Barr et al., 2004). Plk1-aktivitet är förhöjd i alla cancerceller som hittills analyserats (Strebhardt och Ullrich, 2006). Betydelsen av Plk1 för aggressiviteten hos en tumör och för att förutsäga resultat hos cancerpatienter (Strebhardt, 2001) är resultatet av dess bidrag till onkogen transformation (Smith et al., 1997, 2000; Ando et al., 2004). Inhiberingen av Plk1 med antikroppar, antisense-oligonukleotider (ASO), små störande RNA (siRNA) eller dominerande negativa mutanter leder till 'mitotisk katastrof', ökad apoptos och tumörinhibering (Lane och Nigg, 1996; Cogswell et al., 2000; Spankuch-Schmitt et al., 2002a, 2002b; Liu och Erikson, 2003; Ahmad, 2004; Spankuch et al., 2004; Liu et al., 2006). I stället för att träffa ett enda lovande mål som Plk1, är en kombinationsterapi mycket skräddarsydd för maximal effekt mot enskilda tumörer mycket ofta det bästa alternativet för cancerbehandling. Dessutom uppvisar många karcinom resistens mot antineoplastiska läkemedel, vilket är en viktig begränsning för kemoterapi av avancerade cancerformer. Även om antineoplastiska medel som paklitaxel och den monoklonala antikroppen Herceptin redan har uppvisat lovande resultat i kliniska prövningar, har flera fall med låg känslighet för dessa läkemedel gjort behandlingsbeslut av kliniker svåra (Crown and Pegram, 2003; Nahta och Esteva, 2006b). Av dessa skäl är det nödvändigt att förbättra terapeutiska regimer.

Nya framsteg inom området för nukleinsyrakemi erbjuder attraktiva alternativ för att tystna genprodukter som är viktiga för tumörprogression och behandlingsresistens. Ett fascinerande tillvägagångssätt är användningen av siRNA som är riktade mot viktiga element i spridningsrelevanta signaltransduktionsvägar, som kan förhindra tumörutveckling i djurmodeller. Terapeutisk applicering av siRNA beror till stor del på utvecklingen av en leveransfordon som kan transportera syntetisk siRNA till målceller. Kationiska liposomer eller konjugering till kolesterol representerar några av de få exemplen som kan uppfylla dessa krav (Templeton, 2002; Soutschek et al., 2004) och har till och med använts för behandling av primater (Zimmermann et al., 2006).

Syftet med den aktuella studien var att kombinera Plk1-specifika siRNA med paklitaxel och med den monoklonala antikroppen Herceptin för att testa förhållanden för förbättrad läkemedelskänslighet i bröstcancerceller jämfört med primära humana epitelceller (HMEC). Intressant nog gjorde behandlingen av cancerceller med Plk1-specifika siRNA celler mer mottagliga för paklitaxel respektive Herceptin på ett synergistiskt sätt. I primära celler förstärktes inte effekterna inducerade av paklitaxel genom tillsats av Plkl-specifika siRNA.

Resultat

Reduktion av Plk1-mRNA och proteinuttryck i bröstcancerceller efter behandling med Plk1-specifika siRNA

Under det senaste decenniet har 'RNA-interferens' uppstått som en naturlig och mycket effektiv mekanism för gendämpning. siRNA4, som tidigare visat sig tystna Plk1-uttryck i olika cancercellinjer (Spankuch-Schmitt et al., 2002a), testades med avseende på dess förmåga att nedreglera Plk1 mRNA-nivåer i olika bröstcancercellinjer i mycket låga koncentrationer jämfört med tidigare studier. Således analyserade vi den dosberoende reduktionen av endogent Plkl-mRNA (efter 24 timmar) och protein (efter 48 timmar) med Plkl-specifika siRNA i MCF-7, MDA-MB-435, SK-BR-3 och BT-474 celler. I MCF-7-celler reducerade 0, 56 och 5, 6 n M siRNA4 Plkl mRNA signifikant till 76 och 47% ( P <0, 01, figur la). I SK-BR-3-celler minskade alla tre siRNA4-koncentrationer Plk1 mRNA statistiskt signifikant (figur Ib): 0, 056 n M till 67% ( P <0, 01), 0, 56 n M till 39% ( P <0, 0001) och 5, 6 n M till 52% ( P <0, 01). I MDA-MB-435-celler reducerade 0, 056 n M siRNA4 Plkl mRNA statistiskt signifikant till 32% ( P <0, 01; figur 1c), 0, 56 n M till 39% ( P <0, 05) och 5, 6 n M till 16% ( P < 0, 01). I BT-474-celler minskade 0, 056–5, 6 n M siRNA4 inte Plk1 mRNA statistiskt signifikant jämfört med kontrollceller ( P > 0, 05 för alla koncentrationer; figur 1d). I alla cellinjer förändrade transfektion med siRNA4S, en förvrängd version av siRNA4, inte Plk1 mRNA-uttrycket signifikant.

RT – PCR-analys av MCF-7 ( a ), SK-BR-3 ( b ), MDA-MB-435 ( c ) och BT-474-celler ( d ) 24 timmar efter transfektion med siRNA. Varje representativ gel visar Plkl cDNA (överst) och GAPDH cDNA för standardisering (botten). Procentandel av Plkl-cDNA-uttryck ges som procent av GAPDH-standardiserat Plkl-cDNA-uttryck i kontrollceller. Stapeldiagram representerar medel för tre oberoende experiment och 95% konfidensintervall (CI).

Bild i full storlek

Därefter analyserade vi huruvida denna reduktion av Plk1-mRNA åtföljdes av en reduktion av Plkl-protein i MCF-7-celler (figur 2a): 0, 056 n M siRNA4 reducerade signifikant nivåerna för Plk1-proteinuttryck till 39% ( P <0, 001), 0, 56 nM till 19% ( P <0, 0001) och 5, 6 nM till 21% ( P <0, 01). I SK-BR-3-celler reducerade 0, 056 n M siRNA4 Plkl-protein signifikant till 49% ( P <0, 0001; figur 2b), 0, 56 n M till 27% ( P <0, 001) och 5, 6 n M till 35% ( P <0, 0001) ). I MDA-MB-435-celler reducerades Plk1-proteinuttrycket signifikant till 18% med 0, 056 n M siRNA4 ( P <0, 0001; figur 2c), 0, 56 n M till 31% ( P <0, 05) och 5, 6 n M till 2% ( P <0, 0001). I BT-474-celler reducerade 0, 056 n M siRNA4 uttryckt Plkl-protein signifikant till 7%, 0, 56 n M till 3% och 5, 6 n M till 2% (figur 2d, P <0, 0001 för alla koncentrationer). Samma koncentrationer av siRNA4S förändrade inte Plk1-proteinuttrycket i alla testade cellinjer.

Western blot-analys av MCF-7 ( a ), SK-BR-3 ( b ), MDA-MB-435 ( c ) och BT-474-celler ( d ) 48 timmar efter transfektion med siRNA. Varje representativ Western blot visar Plkl (övre) och p- aktinprotein (botten) för standardisering. Procentandel av Plk1-proteinuttryck ges som procent av p- aktin-standardiserade Plkl-nivåer i kontrollceller. Stapeldiagram representerar medlen för tre oberoende experiment och 95% CI.

Bild i full storlek

Reduktion av Plk1-protein uppmätt med Western blot-analys kan bekräftas med indirekt immunofluorescens: 0, 056 n M siRNA4 reducerade Plkl-protein tydligt i MCF-7 (figur 3a), SK-BR-3 (figur 3b), MDA-MB-435 (figur 3c) och BT-474-celler (figur 3d) jämfört med celler behandlade med 0, 056 n M siRNA4S. I alla cellinjer avslöjade 2- (4-amidinofenyl) -6-indolekarbamidindihydroklorid (DAPI) färgning ett förhöjt antal apoptotiska kärnor efter siRNA4-behandling.

Immunofluorescensanalys av MCF-7 ( a ), SK-BR-3 ( b ), MDA-MB-435 ( c ) och BT-474-celler ( d ) 48 timmar efter transfektion med siRNA4 eller siRNA4S (kontroll). Celler analyserades med avseende på DNA genom DAPI-färgning (blå), a- tubulin (röd) och Plkl (grön).

Bild i full storlek

I våra tidigare siRNA-studier kunde vi visa att primära HMEC: er inte var lätt transfekterbara, därför var vi tvungna att använda upp till 2 μM för att uppnå liknande transfektionseffektivitet jämfört med MCF-7-celler, men med denna koncentration kunde vi minska Plk1 mRNA och Plk1 proteinuttryck signifikant med siRNA4 riktade mot Plk1 (Spankuch-Schmitt et al., 2002a).

Minskning av HER2-uttrycket efter behandling med Herceptin och synergistisk aktivering av p27 kip1 i bröstcancercellinjer

En utökad förståelse av biologin för bröstcancer har lett till identifiering av HER2-receptorn som en viktig parameter förknippad med ett aggressivt biologiskt beteende och dåligt kliniskt resultat (Nahta och Esteva, 2006b). För att bestämma receptorstatusen för de fyra bröstcancercellinjerna och för HMEC: er genomförde vi en Western blot-analys mot HER2 och ß- aktin. Som tidigare demonstrerats (Chen et al., 2000) visar BT-474 och SK-BR-3-celler starkt HER2-uttryck, medan nivån av HER2 var under detektionsgränsen i MCF-7 och MDA-MB-435-celler ( Figur 4a). HMEC: er visar inget HER2-uttryck jämfört med den starka HER2-uttryckande cellinjen SK-BR-3 (figur 4b). Dessutom behandlade vi BT-474 och SK-BR-3-celler med den humaniserade monoklonala antikroppen Herceptin och analyserade cellinnehållet i HER2-proteinet. Stigande koncentrationer av Herceptin (0, 1–10, 0 μg / ml) ledde till reducerat HER2-proteinuttryck 6 dagar efter administrering i BT-474 (figur 4c) och SK-BR-3-celler (figur 4d) jämfört med kontrollceller.

Uttryck av HER2 i olika bröstcancercellinjer och av HMEC i kultur. Western blot-analyser utfördes med användning av anti-HER2-antikroppar. För att kontrollera för belastningens variabilitet inkuberades membran tillsammans med p- aktinantikroppar. Uttrycket av HER2 i MDA-MB-435, MCF-7, BT-474 och SK-BR-3-celler avbildas (spår 1–4) ( a ) och uttrycket av HER2 i HMECs och SK-BR-3-celler är avbildad (spår 1 och 2) ( b ). HER2-uttryck av BT-474-celler ( c ) och SK-BR-3-celler ( d ) 6 dagar efter behandling med ökande koncentrationer av Herceptin (0, 01–10, 0 μg / ml). Membraner inkuberades med antikroppar mot HER2 och p- aktin för standardisering. p27 kip1- uttryck i SK-BR-3-celler efter behandling med Herceptin enbart ( e ) eller med siRNA4 tillsammans med Herceptin ( f ). Membraner inkuberades med antikroppar mot HER2, p27 kip1 och p- aktin för standardisering.

Bild i full storlek

Som tidigare beskrivits medierar p27 kip1 G 0 / G1-arrestering och antiproliferativa effekter i BT-474 och SK-BR-3-celler inducerade av Herceptin (Marches och Uhr, 2004). Här tog vi upp frågan om den kombinerande behandlingen med Herceptin och Plk1-specifik siRNA förbättrar uttrycket av p27 kip1 signifikant jämfört med appliceringen av enstaka medel. I våra experiment inducerade behandling med Herceptin ensam måttliga ökningar i p27 kip1- uttryck (figur 4e, P <0, 05 för 10, 0 μg / ml). Efter kombinatorisk behandling med Herceptin och 0, 056 n M siRNA4 kunde signifikanta ökningar av uttrycket p27 kip1 observeras (figur 4f, P <0, 05 för 0, 01, 0, 1 och 10, 0 μg / ml; P <0, 01 för 0, 005 μg / ml; och P = 0, 1 för 1, 0 μg / ml).

Bestämning av cellproliferation efter enstaka behandling

Därefter transfekterade vi bröstcancerceller med Plk1-specifika siRNA, eller vi behandlade dessa cellinjer och primära HMEC med anti-neoplastiska medel 1 dag efter subkultivering för att övervaka deras påverkan på cellproliferation.

siRNA-transfektion

Medan i MCF-7-celler minskade 0, 056 n M siRNA4 cellantal till 39% och 0, 56 n M till 44% ( P > 0, 05), ledde 5, 6 n M till en signifikant reduktion av cellantal till 11% efter 96 timmar jämfört med kontroll celler (figur 5a, övre; P <0, 05). SK-BR-3-celler visade starkare minskningar i cellproliferation än MCF-7-celler efter transfektion med 0, 056–5, 6 n M siRNA4 jämfört med kontrollceller: 0, 056 n M reduktion till 33% ( P <0, 05), 0, 56 n M till 38% ( P <0, 05) och 5, 6 nM till 9% ( P <0, 01; figur 5a, sekund). I MDA-MB-435-celler korrelerade reduktionen av cellproliferation till koncentrationen av siRNA4: 0, 056 n M reducerade proliferation till 67% ( P <0, 01), 0, 56 n M till 57% ( P <0, 01) och 5, 6 n M till 8% ( P <0, 0001) jämfört med kontrollceller (figur 5a, tredje). Den mest uttalade hämmande effekten observerades i BT-474-celler med 1–25% jämfört med kontrollceller (figur 5a, lägre; P <0, 01 för alla koncentrationer efter 96 timmar).

Effekt av enstaka administrering av Plk1-specifika siRNA och antineoplastiska medel på spridningen av bröstcancercellinjer och på HMEC. ( a ) Transfektion av MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435 och BT-474-celler med siRNA4S. Administration av paklitaxel ( b ) och Herceptin ( c ) till MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435, BT-474-celler och till HMEC-celler. Procentandel överlevande celler anges i procent av antalet kontrollceller efter 72 eller 96 timmar eller efter 8 dagars inkubation. Stapeldiagram representerar medel för tre olika experiment med övre 95% CI.

Bild i full storlek

Som jämförelse minskade inte transfektion av HMEC med stigande doser av siRNA4 (566 n M till 2 μM ) proliferation jämfört med obehandlade kontrollceller, vilket indikerar en differentiell effekt mellan bröstcancerceller och primära HMEC: er (Spankuch-Schmitt et al., 2002a).

Herceptin

Vidare testade vi påverkan av Herceptin på spridningen av HER2-positiva och -negativa celler. Under perioden 24–96 timmar observerade vi inte en minskning av cellproliferation efter behandling med Herceptin jämfört med obehandlade celler (data visas inte). Därefter analyserade vi cellproliferation 2, 6 och 8 dagar efter behandlingen. I HER2-negativa MCF-7-celler påverkade Herceptin inte cellproliferation efter 2-8 dagar (figur 5b, övre). Åtta dagar efter behandling av HER2-positiva SK-BR-3-celler reducerades proliferationen signifikant för alla Herceptin-koncentrationer (figur 5b, sekund): 0, 01 μg / ml till 50% ( P <0, 05), 0, 1 μg / ml till 39% ( P <0, 01), 1, 0 μg / ml till 22% ( P <0, 0001) och 10, 0 μg / ml till 15% ( P <0, 001). I HER2-negativa MDA-MB-435-celler reducerade endast den högsta Herceptin-koncentrationen (10, 0 μg / ml) cellproliferation till nivåer om 13% troliga på grund av cytotoxiska effekter (figur 5b, tredje). I BT-474-celler reducerade 0, 01 μg / ml Herceptin cellproliferation efter 8 dagar till 72% ( P = 0, 1), 0, 1 μg / ml till 45% ( P <0, 01), 1, 0 μg / ml till 26% ( P <0, 001) och 10, 0 μg / ml till 22% ( P <0, 001; figur 5b, fjärde). I HER2-negativa HMEC: er påverkade inte 0, 01–10 μg / ml Herceptin cellproliferation jämfört med obehandlade kontrollceller. Fortfarande, endast den mycket höga dosen på 100 μg / ml Herceptin inducerade cytotoxisk celldöd i HMEC till nivåer av 54% jämfört med obehandlade kontrollceller (figur 5b, lägre).

paclitaxel

Därefter behandlade vi bröstcancercellinjer med stigande koncentrationer av paklitaxel. I MCF-7-celler minskade 0, 01–10, 0 μg / ml paklitaxel cellproliferation statistiskt signifikant till 55–4% jämfört med kontroller (figur 5c, övre; P <0, 01 för alla koncentrationer). I SK-BR-3-celler reducerade 0, 01–10, 0 μg / ml paklitaxel cellproliferation till 8–2% (figur 5c, sekund; P <0, 001 för alla koncentrationer), i MDA-MB-435 celler till 46–1% (Figur 5c, tredje; P <0, 001 för alla koncentrationer) och i BT-474 celler till 3–0% (figur 5c, fjärde; P <0, 001 för alla koncentrationer). I HMEC minskade 0, 01–100, 0 μg / ml paklitaxel cellproliferation till nivåer av 9–0% jämfört med kontroller (figur 5c, lägre; P <0, 01 för alla koncentrationer).

Bestämning av cellproliferation efter kombinatorisk behandling

Kombinatorisk läkemedelsapplikation som behandlingsparadigm är mycket effektiv i cancerterapi. Således testade vi de antineoplastiska läkemedlen paklitaxel och Herceptin i kombination med Plk1-specifika siRNA för att identifiera fördelaktiga kombinationer som inducerar starka antiproliferativa effekter vid låga läkemedelskoncentrationer. Dessutom analyserade vi inverkan av läkemedelskombinationer på spridningen av primära celler.

siRNA4 och paklitaxel

Först analyserade vi effekten av en låg siRNA4-koncentration (0, 056 n M) tillsammans med paklitaxel i koncentrationer från 0, 005 till 1, 0 μg / ml på spridningen av MCF-7-celler (figur 6a, övre). siRNA4 (0, 056 n M) enbart inducerade en liten reduktion i proliferation till 70% ( P <0, 01) efter 96 timmar jämfört med kontrollceller. I kombination med 0, 005–1, 0 μg / ml paklitaxel reducerades proliferationen till 9–4% ( P <0, 001 för alla koncentrationer). I SK-BR-3-celler inducerade 0, 056 n M siRNA4 en liten reduktion i proliferation till 90% jämfört med kontrollceller efter 96 timmar ( P = 0, 05; figur 6a, sekund). I kombination med 0, 005–1, 0 μg / ml paklitaxel reducerades proliferationen signifikant till 10–3% ( P <0, 001 för alla koncentrationer). I MDA-MB-435-celler inducerade 0, 056 n M siRNA4 en signifikant reduktion i proliferation till 60% jämfört med kontrollceller efter 96 timmar ( P <0, 01; figur 6a, tredje). I kombination med 0, 005 μg / ml paklitaxel reducerades proliferationen signifikant till 67% ( P <0, 05), med 0, 01 μg / ml till 10% ( P <0, 001), med 0, 1 μg / ml till 3% ( P < 0, 0001) och med 1, 0 μg / ml till 1% ( P <0, 0001). I BT-474-celler inducerade 0, 056 n M siRNA4 enbart en signifikant reduktion i proliferation till 22% jämfört med kontrollceller 96 tim efter transfektion ( P <0, 05; figur 6a, fjärde). I kombination med 0, 005–1, 0 μg / ml paklitaxel reducerades proliferationen signifikant till 4–0% ( P <0, 05 för alla koncentrationer). Sammantaget, även om kombinationen av 0, 056 n M siRNA4 med paklitaxel inducerade synergistiska hämmande effekter (kombinationsindex (ci) <1) på spridningen av MDA-MB-435 celler, i MCF-7 visade kombinationen en tillsatseffekt (ci = 1).

Effekt av kombinationen av Plk1-specifika siRNA med antineoplastiska medel på spridningen av bröstcancercellinjer och av HMEC. Kombination av siRNA4 med paklitaxel ( a ) i MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435, BT-474-celler och i HMEC-celler och med Herceptin i SK-BR-3 och BT-474-celler ( b ). Procentandel överlevande celler anges i procent av antalet kontrollceller efter 72 eller 96 timmar eller efter 8 dagars inkubation. Stapeldiagram representerar medel för tre olika experiment med övre 95% CI.

Bild i full storlek

I HMEC reducerade 1 μM siRNA4 enbart cellproliferation till 48% ( P <0, 05) och 1 μM siRNA4 tillsammans med 0, 005–10, 0 μg / ml paklitaxel reducerade cellproliferationen till 8–0% ( P <0, 01 för alla koncentrationer ; Figur 6, nedre). siRNA4S (1 μM ) påverkade inte cellproliferation jämfört med kontrollceller. Dessa data indikerar att tillsatsen av siRNA4 till HMEC inte förstärkte den cytotoxiska effekten av paklitaxel ensam. Sammantaget, i HMEC, hade kombinationen av 1 μM siRNA4 med paklitaxel inget starkare inflytande på spridningen än paclitaxel enbart som indikerar en antagonistisk effekt (ci> 1).

siRNA4 och Herceptin

För analys av kombinationen av siRNA4 med Herceptin valde vi de HER2-positiva cellinjerna SK-BR-3 och BT-474. I SK-BR-3-celler inducerade 0, 056 n M siRNA4 enbart en liten minskning av cancercellsproliferation jämfört med kontrollceller efter 2, 6 respektive 8 dagar (figur 6b, övre). Herceptin (0, 01 μg / ml) enbart reducerade inte cellproliferationen efter 2 dagar signifikant ( P = 0, 5). Kombinationen av 0, 056 n M siRNA4 med 0, 005–1, 0 μg / ml Herceptin ledde till en tidigare minskning av cancercellproliferation jämfört med en enda administration av Herceptin; vi observerade en signifikant reduktion av cellproliferation med användning av 0, 01 μg / ml Herceptin tillsammans med 0, 056 n M siRNA4 efter 2 dagar i SK-BR-3-celler ( P <0, 05). I BT-474-celler inducerade 0, 056 n M siRNA4 enbart en minskning av cancercellsproliferation till nivåer av 3–15% jämfört med kontrollceller efter 2, 6 respektive 8 dagar (figur 6b, lägre). Herceptin enbart inducerade en fullständig blockad av cellproliferation i en koncentration av 10, 0 μg / ml efter 8 dagar, men inte en minskning i cellantalet. Kombinationen av 0, 056 n M siRNA4 med 0, 005–1, 0 μg / ml Herceptin ledde till en tidigare och ännu starkare minskning av cancercellproliferation jämfört med en enda administrering av Herceptin efter 8 dagar. Här observerade vi en signifikant minskad proliferation med 0, 005 μg / ml Herceptin tillsammans med 0, 056 n M siRNA4 redan efter 2 dagar till 4% ( P <0, 001) jämfört med kontrollceller. I båda HER2-positiva cellinjerna var denna kombination synergistisk efter 2 och 6 dagar (ci <1).

Cellcykelfördelning av bröstcancerceller efter behandling med Plk1-specifika siRNA och paklitaxel

MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435, BT-474-celler och HMEC behandlades med siRNA och paklitaxel enbart och i kombinationer, och cellcykeldistributionen övervakades med användning av FACScan-analys. Ökande koncentrationer av siRNA4 inducerade en mer uttalad G2 / M-arrest i alla bröstcancercelltyper jämfört med kontrollceller: från 9–16% i kontrollceller till 15–42% med 0, 056 n M, till 23–34% med 0, 56 n M och till 25–59% med 5, 6 n M siRNA4 (figur 7a – d). Samma koncentrationer av siRNA4S förändrade inte G2 / M-innehållet signifikant. Procentandelen celler i G2 / M korrelerade med graden av apoptos (figur 8j – n) som bekräftar en tidigare observation av Nishii et al. (1996). Behandling med paklitaxel ledde till stark G2 / M-arrest i alla cancercellinjer: 0, 005 μg / ml till 27–49%, 0, 01 μg / ml till 39–62%, 0, 1 μg / ml till 33–75%, 1, 0 μg / ml till 31–75% och 10, 0 μg / ml till 21–60%. I alla fyra bröstcancercellinjer ledde kombinationen av 0, 056 n M siRNA4 med 0, 005–10, 0 μg / ml paklitaxel till en signifikant och synergistisk G2 / M-arrest till nivåer av 35–84% (figur 7a – d). Detta G 2 / M-arrest är ett annat bevis för apoptotiska förändringar efter en enda eller kombinatorisk behandling med siRNA4 och / eller paklitaxel. Vi fortsatte denna fråga genom att analysera aktiveringen av kaspasvägen med Western blot-analyser (figur 8). I HMEC ökade inte ens den mycket höga dosen av siRNA4 (1 μM ) cellantalet i G2 / M-fasen jämfört med kontrollceller (figur 7e). Ökande koncentrationer av paklitaxel (0, 01–10, 0 μg / ml) inducerade en stark G2 / M-grip i HMEC: er; men kombinationen av 1 μM siRNA4, som ensam inte påverkade cellcykeldistributionen med ökande koncentrationer av paklitaxel, ledde till en svagare G2 / M-arrest än samma koncentrationer av paklitaxel ensam. I primära celler framkallade därför inte kombinationen av Plk1-specifika siRNA tillsammans med paklitaxel synergistiska effekter.

Effekt av behandling med paklitaxel och siRNA4 på cellcykeldistribution av bröstcancerceller och primära HMEC. FACScan-analys av MCF-7 ( a ), SK-BR-3 ( b ), MDA-MB-435 ( c ), BT-474 celler ( d ) och HMECs ( e ) 48 timmar efter respektive enskild eller kombinatorisk behandling. Kontroller inkuberades endast med Opti-MEM I. Fluorescensintensiteten (proportionell mot DNA-innehållet) ges på x- axeln, och antalet fluorescerande celler anges på y- axeln. Grafiska sammanfattningar representerar cellcykelfördelningen av tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Effekt av behandling med paklitaxel, Herceptin och siRNA4 på apoptos av bröstcancerceller. Kontroller inkuberades endast med Opti-MEM I. En Western blot-analys mot caspas 9 utfördes efter behandling av MCF-7-celler med paklitaxel ( a ) och efter behandling av MCF-7-celler med siRNA4 och paklitaxel tillsammans ( b ). En Western blot-analys mot caspaser 3 och 9 utfördes 48 timmar efter behandling av SK-BR-3-celler med paklitaxel ( c ), siRNA4 och siRNA4S ( d ), 6 dagar efter behandling med Herceptin ( e ) och 6 dagar efter behandling med siRNA4 kombinerat med Herceptin ( f ). En Western blot-analys mot caspaser 3 och 9 utfördes efter behandling av BT-474-celler med paklitaxel ( g ) och efter behandling med siRNA4 kombinerad med paklitaxel ( h ). En Western blot-analys mot kaspas 3 och 9 utfördes 48 timmar efter kombinatorisk behandling av MDA-MB-435-celler med siRNA4 och paklitaxel ( i ). I alla Western blotting färgades P -actin eller p38 för att bekräfta lika belastning. DAPI-färgning utfördes för att detektera apoptotiska kärnor i MCF-7 ( j ), SK-BR-3 ( k ), MDA-MB-435 ( l ) och BT-474 celler ( m ) och i HMECs ( n ) efter behandling med siRNA4, paklitaxel eller en kombination av båda medlen.

Bild i full storlek

Induktion av apoptos i bröstcancerceller efter en enda eller kombinatorisk behandling med paklitaxel, Herceptin och siRNA4

Vi utförde Western-blots för att bestämma om den minskade cellproliferationen och G2 / M-arresteringen korrelerar med induktionen av apoptos. Plk1-specifika siRNA enbart och enbart paklitaxel kan inducera apoptos, varför vi testade om kombinationen av båda medlen leder till en starkare apoptotisk reaktion än varje enskilt medel. Av denna anledning utförde vi Western blots mot kaspas 9 och 3. I de första experimenten behandlade vi MCF-7-celler med ökande koncentrationer av paklitaxel enbart som inducerade klyvning av caspase 9 (figur 8a). Efter den kombinatoriska behandlingen av MCF-7-celler med 0, 056 n M siRNA4 och paklitaxel var klyvningen av kaspas 9 jämförbar (figur 8b). Sedan behandlade vi SK-BR-3-celler med stigande doser av paklitaxel enbart (0, 01–10, 0 μg / ml) och utförde anti-caspas 3 och caspase 9 Western-blot-analyser. Caspase 3, exekveraren caspase i apoptos och caspase 9 aktiverades tydligt, såsom visas av klyvningen av protein i full längd (figur 8c). Vidare transfekterade vi SK-BR-3-celler med siRNA4 och siRNA4S och observerade en dosberoende kaspas 9-klyvning efter siRNA4-behandling (figur 8d). Eftersom Herceptin enbart är känt för att inducera apoptos endast i höga koncentrationer, analyserade vi kaspaserna efter behandling av HER2-positiva SK-BR-3-celler med Herceptin. Behandling av SK-BR-3-celler med enbart Herceptin inducerade inte starka kaspaser 3 eller 9-klyvning (figur 8e), men kombinationen av 0, 056 n M siRNA4 med ökande Herceptin-koncentrationer ledde till aktivering av caspas 3 och 9 jämfört med kontrollceller (Figur 8f). I BT-474-celler inducerade behandling med stigande doser av paklitaxel (0, 005–10 μg / ml) kaspas 3 och 9-klyvning (figur 8g), vilket förbättrades efter den kombinerande behandlingen av BT-474-celler med 0, 056 n M siRNA4 och paklitaxel (figur 8h).

I tidigare studier observerade vi en aktivering av kaspas 3 och 9 i MDA-MB-435 celler efter behandling med enbart paklitaxel (Spankuch et al., 2006). Kombinatorisk behandling av MDA-MB-435-celler med Plk1-specifik siRNA och paklitaxel ledde till en förbättrad aktivering av kaspas 3 och 9 jämfört med en enda behandling med samma siRNA4-koncentration (figur 8i).

Förutom kaspasspjälkning observerade vi ett förhöjt antal apoptotiska kärnor såsom visas med DAPI-färgning efter kombination av 0, 056 n M siRNA4 med paklitaxel i MCF-7 (figur 8j), SK-BR-3 (figur 8k), MDA-MB -435 (figur 8l) och BT-474-celler (figur 8m) jämfört med enstaka behandling med siRNA4 eller enbart paklitaxel. I HMEC observerade vi inte apoptotiska kärnor efter transfektion med 2 μM siRNA4. Efter behandling med paklitaxel observerade vi ett förhöjt antal apoptotiska kärnor, och efter kombinationen av båda medlen var antalet apoptotiska kärnor jämförbart med en enda administrering av paklitaxel (figur 8n).

Diskussion

Kemoresistens är en av de främsta orsakerna till behandlingsbrister i avancerade cancerformer, där lokala behandlingar är otillräckliga. Endast ett fåtal typer av cancer kan botas med antineoplastiska medel, för de mest distribuerade typerna av karcinom hos vuxna är kemoterapiens effektivitet otillräcklig. Vid bröstcancer är överuttryck av HER2 associerat med resistens mot kemoterapi och förutsäger ett dåligt resultat (Xia et al., 2006). Därför behövs nya terapier för att besegra resistens mot antineoplastiska medel. En möjlig metod är användningen av nukleinsyrabaserade medel ensam eller i kombination med antineoplastiska medel (Spankuch-Schmitt et al., 2002b; Spankuch et al., 2006). Användningen av ASO: er korrelerar ofta med allvarliga toxiska biverkningar enligt kliniska studier som genomförts under de senaste två decennierna (Gleave och Monia, 2005). Sedan upptäckten av RNAi hos däggdjur (Elbashir et al., 2001) har den prekliniska utvecklingen av siRNA som riktar sig till olika cancerrelaterade gener gått mycket snabbt. Många tillvägagångssätt har visat övertygande in vitro- reduktion av målgenuttryck och hämning av cancercellproliferation. Några in vivo- studier har framgångsrikt genomförts hittills, till exempel tystnad av apolipoprotein B av siRNA i primater (Zimmermann et al., 2006) eller siRNA som är riktade mot makuladegeneration hos människor (Check, 2005).

En möjlig målgen för cancerterapi är Plk1, som har flera funktioner under cellcykeln. Efter uttömning av Plk1 i cancerceller av siRNA, avslöjade våra studier en stark ökning av G2 / M, ett förhöjat antal apoptotiska kärnor, defekter i centrosomal mognad och tumörinhibering (Spankuch-Schmitt et al., 2002a). Olika studier betonade vikten av Plk1 som främsta målkandidat för läkemedelsutveckling vid proliferativa sjukdomar såsom cancer (Eckerdt et al., 2005; Gumireddy et al., 2005; Spankuch och Strebhardt, 2005). Således testade vi inverkan av Plk1-specifika siRNA ensam eller i kombination med olika antineoplastiska medel på tillväxten av bröstcancerceller för att söka efter effektiva och säkra anticancerregimer.

Fortfarande är leveransen av siRNA: er ett problem som måste lösas för terapeutisk applicering av siRNA. Hittills är det svårt att leverera syntetiska siRNA i djur eller människor till specifika organ eftersom rena siRNA har en halveringstid på cirka 15 minuter i humant blod (opublicerad data). Nyligen genomförda studier handlar om leverans av syntetiska siRNA till djur, även i primater, med användning av katjoniska liposomer eller konjugation till kolesterol (Templeton, 2002; Soutschek et al., 2004; Nogawa et al., 2005; Zimmermann et al., 2006) . Enligt vår egen metod testades den systemiska leveransen av plasmider för expression av shRNA mot Plkl i nakna möss (Spankuch et al., 2004), vilket avslöjade en betydande antitumoreffekt in vivo . Effektiv leverans av RNAi-baserade läkemedel kommer att vara en utmaning för framtida forskning.

Först analyserade vi effekterna av Herceptin tillsammans med Plk1-specifika siRNA. The mechanism of Herceptin is cytostatic by blocking and downmodulation of the HER2-receptor, by antibody-dependent cellular cytotoxicity as major mechanism of antibody action (Clynes et al., 2000; Therasse, 2002; Dubska et al., 2005; Mimura et al., 2005; Xia et al., 2006; Nahta and Esteva, 2006b). Herceptin evokes response rates of 15–40% in metastatic HER2-overexpressing breast cancers as single agent (Vogel et al., 2002; Nahta and Esteva, 2006a). However, the majority of patients with initial response to Herceptin generally acquires resistance within 1 year (Slamon et al., 2001; Nahta and Esteva, 2006b). Combined with chemotherapeutic drugs like doxorubicin or paclitaxel, it prolongs survival as first-line therapy (Slamon et al., 2001). Paclitaxel that disrupts microtubule dynamics is known to invoke the mitotic checkpoint. The combination of docetaxel, another member of the taxane family, and Herceptin has been evaluated in clinical phase II studies (Esteva et al., 2002). The results are encouraging in that the combination of docetaxel and Herceptin demonstrated high levels of activity when used as first- and second-line treatment of HER2-positive metastatic breast cancer cells. Because inhibitors of Plk1 have also been demonstrated to activate the mitotic checkpoint, a cooperative effect with Herceptin could be expected. Our combinatorial studies using siRNAs targeting Plk1 and Herceptin provide the first evidence for synergistic activities in SK-BR-3 and BT-474 cells. Although the treatment of HER2-positive cells with Herceptin alone does not induce apoptosis (Xia et al., 2006), the combination with Plk1-specific siRNAs showed apoptosis based on cleavage of caspases 3 and 9. In addition, after pre-treatment of SK-BR-3 cells with Plk1-specific siRNAs, we observed an induction of p27 kip1 which mediates the G 0 /G 1 arrest and the antiproliferative effect of Herceptin (Lane et al., 2000; Marches and Uhr, 2004; Dubska et al., 2005). One experimental approach to overcome Herceptin resistance is the transfection of p27 kip1 which restores Herceptin sensitivity to resistant cell lines (Nahta et al., 2004). This is in line with our observations in which Plk1-specific siRNAs induced p27 kip1 expression and enhanced the effects of Herceptin in SK-BR-3 cells. Interestingly, silencing of Plk1 seems to sensitize HER2-overexpressing cells to Herceptin, resulting in the induction of apoptosis after treatment with Herceptin.

Because decreased expression of p27 kip1, which is an inhibitor of cyclin-dependent kinase, is often associated with cancer aggressiveness (Blain et al., 2003), the significant upregulation of p27 kip1 levels following combinatorial treatment in our studies might suggest a mechanism for improved sensitivity of breast cancer cells. Still, signalling events in breast cancer cells behind this unique interaction between Plk1-specific siRNA at very low concentrations and Herceptin need to be the subject of future investigations.

Next, we tested one family member of the taxanes (paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere)), which are used for the treatment of many cancers. They target microtubule dynamics and bind to a subunit of the tubulin heterodimer that form cellular microtubules thereby accelerating the polymerization of tubulin, efficiently stabilizing and inhibiting the depolymerization of the microtubules (Schiff and Horwitz, 1980; Jordan and Wilson, 2004). Cells show tetraploidy, a transient arrest in mitosis and a multinucleated interphase state, followed by apoptosis (Blajeski et al., 2001). In our studies, Plk1-specific siRNAs and paclitaxel, two mitotic spindle targeting drugs, exerted synergistic effects together in MDA-MB-435 cells, additive effects in MCF-7 cells and an elevated number of apoptotic nuclei in MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435 and BT-474 cells. In HMECs, higher concentrations of siRNAs are necessary to achieve similar transfection efficiencies (Spankuch-Schmitt et al., 2002a), hence we combined a higher dose of Plk1-specific siRNA with paclitaxel, but the observed reduction of proliferation, G 2 /M arrest or the number of apoptotic nuclei was not increased compared with either agent alone.

The traditional approach for the introduction of new agents into cancer therapy has been to add a new drug to accepted or established treatment regimens. Synergistic actions of paclitaxel and Herceptin with siRNAs targeting Plk1 across a wide range of clinical relevant concentrations in HER2-overexpressing breast cancer cells indicate that these are rational combinations to test in preclinical trials. Two additional advantages of these combinations are that they might help reduce the risk of cardio- and neurotoxicity observed with Herceptin and paclitaxel, and that they might reduce general side effects because the concentrations necessary to achieve synergistic actions in breast cancer cells did not affect primary HMECs more than paclitaxel alone.