Rab8a interagerar direkt med pi3kγ för att modulera tlr4-driven pi3k och mtor signalering | naturkommunikation

Rab8a interagerar direkt med pi3kγ för att modulera tlr4-driven pi3k och mtor signalering | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Cell signalering
  • Inflammation
  • Avgiftsliknande receptorer

Abstrakt

Avgiftliknande receptor 4 (TLR4) aktiveras av bakteriell lipopolysackarid (LPS) för att uppnå medfödda immunsvar. Den TLR4-inducerade frisättningen av pro- och antiinflammatoriska cytokiner genererar robusta inflammatoriska svar, som sedan måste begränsas för att undvika sjukdom. Nya mekanismer för kritisk reglering av TLR-inducerade cytokinrespons dyker fortfarande upp. Här hittar vi TLR4-komplex som är lokaliserade i LPS-inducerade ryggflodar på ytan av makrofager. Vi upptäcker att det lilla GTPas Rab8a berikas i dessa rufsar och rekryterar fosfatidylinositol 3-kinas (PI3Ky) som en effektor genom att interagera direkt genom dess Ras-bindande domän. Rab8a och PI3Kγ fungerar för att reglera Akt-signalering genererad av ytan TLR4. Rab8a och PI3Ky påverkar inte TLR4-endocytos, utan reglerar istället däggdjurens mål för rapamycinsignalering som en mekanism för att förspänna cytokinprofilen för att begränsa inflammation i medfödd immunitet.

Introduktion

Makrofager är nyckelfaktorer i det medfödda immunsystemet, som har till uppgift att upptäcka och svara på patogener. Följaktligen är makrofagcellytan beväpnad med olika membranutskjutningar, servas av flera endocytiska och exocytiska vägar och har en hög hastighet av plasmamembranomsättningen för att rymma miljöprovtagning och patogenavkänning 1 . Medlemmar i Rab-familjen med små GTPaser reglerar flera steg i membranhandel 2 och i makrofager är Rabs associerade med cellytan och endocytiska vägar unikt beredda att påverka patogenigenkänning och internalisering 3, 4, 5 . Flera Rabs är involverade i fagocytos av patogener 6, 7 och i handel och utsöndring av cytokiner i patogenaktiverade celler 1 . Flera Rabs 3, 4, 5 har också varit inblandade i att reglera handeln med Toll-liknande receptor 4 (TLR4), en medlem av TLR-familjen av mönsterigenkänningsreceptorer som initierar cellulära svar på patogener och faresignaler 8 .

TLR4 känner igen lipopolysackarid (LPS) -komponenten av gramnegativa bakterier och aktiverar makrofager för att initiera svar inklusive frisättning av inflammatoriska cytokiner och kemokiner, produktion av reaktiva syresorter och modulering av cellöverlevnad och proliferation 9 . Den spatiotemporala regleringen av TLR4 och dess signalering från antingen cellytan eller endosomalkomplex reglerar nettoutfallet av dessa svar 10, 11, 12 . Vid cellytan dimeriseras LPS-bunden TLR4 för den fosfoinositidberoende rekryteringen av dess adaptrar, Mal (TIRAP) och MyD88 (ref. 13) 13, vilket resulterar i aktivering av transkriptionsfaktorer, såsom NFKB och AP-1, för produktion av inflammatoriska cytokiner 14, 15 . Ytaktivering av TLR4 åberopar också fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) / Akt-väg 16 . Inhiberar PI3Ks förspänningar TLR-inducerade cytokinresponser mot en pro-inflammatorisk inställning. Rapporter har föreslagit två mekanismer för att förklara denna effekt: regleringen av TLR4-endocytos 10 och regleringen av nedströms TSC / däggdjursmål för rapamycin (mTOR) signalering 16 . mTOR, ett serin / treoninproteinkinas, är den katalytiska underenheten för både mTORC1- och mTORC2-komplexen 17 . Rapamycin riktar sig mot mTORC1-komplexet nedströms för Akt, och under TLR4-signalering ökar det selektivt produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner 16 . Sammantaget reglerar dessa komplexa signalvägar det inflammatoriska svaret, vars programmering är avgörande för korrekt reaktion på olika patogener och för att avgränsa inflammation. Dysregulerad eller överdriven cytokinsekretion har allvarliga eller till och med dödliga konsekvenser vid akuta tillstånd som sepsis och vid kroniska inflammatoriska eller autoimmuna sjukdomar 18 . Det är viktigt att det finns flera regulatoriska kontrollpunkter som utövar kontroll över TLR4-signaleringens svar; emellertid är den fulla omfattningen och arten av de mekanismer som ligger till grund för denna kontroll fortfarande oklar.

Första kontakten med patogener som bakterier initieras vid cellytan, så vi försöker karakterisera några av de relevanta membrandomänerna och cellulära maskiner involverade i makrofagaktivering med LPS. Dorsala ruffles är slående upprätt, och ofta böjda eller cirkulära utsprång som följer patogenkontakt och föregår makropinocytos och fagocytos i aktiverade makrofager 19, 20 . I andra celltyper ryser dorsal tillväxtfaktorreceptorer och är platser för att initiera tillväxtfaktorinducerad signalering 21, 22 . Dorsala ruffles har emellertid fått lite tidigare uppmärksamhet med avseende på LPS-aktivering av TLR4 (ref. 19, 20). Screening av Rab GTPases för ruffle-lokalisering i makrofager drog vår uppmärksamhet till Rab8a, en multi-tasking Rab som tidigare lokaliserats till ledande kanter på cellytan och endo / exocytiska vägar i flera celltyper 23 . Här visar vi att Rab8a och komponenterna i TLR4-komplexet är berikade i dorsala ruffles där de bidrar till LPS-initierad signalering. Genom masspektrometri och biokemisk analys identifierade vi den p110y katalytiska underenheten av PI3K som en ny effektor för Rab8a och presenterar således för första gången ett Rab GTPas som binder direkt till en klass IB PI3K. Dessutom visar vi en funktion för detta komplex i medfödd immunsignalering. Under TLR4-receptoraktivering krävs Rab8a och PI3Ky tillsammans för att fullständigt aktivera Akt / mTOR-vägen och förspänna cytokinsvaret från en hyperinflammatorisk miljö genom att minska produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner och öka produktionen av antiinflammatoriska cytokiner. Rab8a och PI3Ky presenteras häri som nya regulatorer för signalering i TLR4-vägen.

Resultat

TLR4 och Rab8a i dorsala ruffles av aktiverade makrofager

I makrofager sker perifera Rac-1 och fosfatidinsyraberoende ruffling konstitutivt 24 och förbättras vanligtvis av tillväxtfaktorer som kolonistimulerande faktor-1 (ref. 25) 25 . Här visar vi att LPS också ökar dorsal ruffling på makrofager, vilket avslöjar detta som ett akut makrofagsvar på kontakt med gramnegativa bakterier. F-aktinrika dorsala ruffles som sticker ut från LPS-aktiverade celler ökas två gånger över de i obehandlade celler (fig. La och kompletterande fig. 1a). Detta speglar iakttagelsen att det inte bildas fläckar efter knock-up av TLR4 (ref. 19) 19 . Ytterligare undersökning av rufsar i transfekterade celler avslöjade att både Citrin-märkt TLR4 och dess cellytadapter, Mal (som Cerulean-märkt Mal), är anrikade i dorsala ruffles (Fig. 1b), vilket betecknar dessa domäner som en ny plats för patogenen igenkänningsreceptorkomplex av TLR4 / Mal / MyD88. Kolokalisering med Mal placerar Rab8a i samma rufsar som TLR4-komplexet (fig. 1c). Under dessa förhållanden rekryteras Rab8a dessutom aktivt till rufflesna, snarare än att vara närvarande genom en passiv membranbindning ensam. Denna rekrytering kan demonstreras genom ratiometrisk avbildning, som belyser den dramatiska berikningen av Rab8a-protein i full längd i ryggflodar i rygg, jämfört med den laddningsberoende membranbindningen av den polybasiska Rab8a-svansen (fig. 1d och kompletterande fig. Ib). Som etablerade platser för receptorsignalering anrikas dorsala ruffles i signalering av fosfoinositider, PI (3, 4, 5) P3 och PI (3, 4) P2, som kan märkas i levande celler med PH (pleckstrin homology) domänen från Akt (GFP-Akt-PH) 26 . Våra LPS-aktiverade celler visar stark Akt-PH-märkning av Rab8a-innehållande dorsala ruffles, med båda molekylerna berikade två till tre gånger, jämfört med deras märkning i andra plasmamembrandomäner (Fig. 1e). Denna membranlokalisering av Rab8a är konsekvent, även vid mycket låga uttrycksnivåer (kompletterande figur 2). Baserat på att Rab8a berikades i LPS-inducerade ryggfläckar undersökte vi därefter en möjlig roll för Rab8a i TLR4-signalering.

( a ) Kvantifiering av dorsal ruffling på obehandlade och LPS-behandlade RAW 264.7 makrofager. Bilder av ruffling och parametrar för kvantifiering av ruffle visas i tilläggsfiguren. 1. Uppgifterna analyseras med studentens t- test. ( n = 13–20 per grupp) *** P <0, 001. ( b ) En enda stapelbild från levande, LPS-behandlade (15 min) RAW 264.7-celler som uttrycker TLR4-Citrin och Mal – Cerulean visar kolokalisering vid perifera ruffles. Låg TLR4-citrin-märkning har förbättrats i z- segmentvyn för att visualisera cellytan TLR4. Original 16-bitarsnivåer (532–18722) förbättrade nivåer (1728–10652). ( c ) En bild av en z- stapel (0, 19 um skiva) från levande celler transfekterade med Mal – Cerulean och tdTomato-Rab8a. Övre panelen visar de första tre skivorna från basen av cellen där Rab8a och Mal kolokaliserar vid cellperiferin; den nedre panelen visar de tre bästa skivorna i cellen där det finns kolokalisering i dorsala ruffles. ( d ) RAW 264.7-celler som samuttryckte full längd tdTomato-Rab8a och GFP-svansdomänen i Rab8a användes för att generera ratiometriska bilder för att bedöma Rab8a-anrikning vid ryggslingor. Insatsen visar steg om 0, 6 mikrometer z- segment. ( e ) Enkel z- skiva visad i basal- och ryggvyer där td-tomat Rab8a och GFP-Akt-PH kolokaliserar i ruffles efter 15 min LPS-behandling. Kvantifiering av Rab8a och Akt-PH-sonden ( n = 5) i ruffles och andra membrandomäner mättes genom envägsanalys av varians, ** P < 0, 01 och; **** P <0, 0001, respektive. Eftertest av Dunnetts flera jämförelser. Alla bilder skalfält, 10 μm.

Bild i full storlek

Rab8a reglerar TLR4-signalering och cytokinsekretion

För att undersöka dess funktion tappades Rab8a av små hårnål-RNA (shRNA) i RAW 264, 7-makrofager (till <30% av kontrollnivåerna) och celler behandlades med LPS för att undersöka nedströms signalrespons (fig. 2). Rab8a-utarmade celler visar en blygsam ökning av fosforylering av MAPK-proteinet, p38, men ingen förändring i ERK1 / 2-fosforylering eller nedbrytning av det NFKB-hämmande proteinet, IB. Noterbart emellertid är Akt-fosforylering markant reducerad (med> 60% vid 30 minuter) efter utarmning av Rab8a (fig. 2a). För att bekräfta att det förändrade Akt-svaret kunde tillskrivas Rab8a, undersökte vi också LPS-signalering i cellinjer som stabilt överuttryckte Rab8a (med ungefär tre till fyra gånger) och fann en ~ 2, 5-faldig ökning i Akt-fosforylering 30 och 60 min efter LPS (Kompletterande bild 3a). Dessa resultat tjänar till att implicera Rab8a i TLR4-signalering och antyder att Rab8a krävs för maximal PI3K / Akt-aktivering.

( a ) Representativ immunoblotanalys av LPS-tidskurs för kontroll (förvrängd shRNA) och Rab8a-shRNA-stabila RAW 264, 7-cellinjer. Fosforylering av Akt, ERK1 / 2 och p38 analyserades 30 minuter efter LPS med densitometri. Alla immunoblott beskurades för presentation; fullängdsflottar tillhandahålls i kompletterande fig. 5. ( b ) Kontroll (krypterat shRNA) och Rab8a-shRNA-stabila RAW 264.7-cellinjer analyserades med kvantitativt omvänt transkriptas-PCR (qRT – PCR) för transkriptionellt svar och med enzymbundet immunosorbent analys för utsöndring av cytokinerna IL-6 och IL-10. Grafer representerar medelvärde ± sem ( n = 3 vardera). Tidskursprofiler analyserades genom tvåvägsvariansanalys (ANOVA). För qRT – PCR; **** P <0, 0001 för både IL-6 och IL-10. För cytokinsekretion **** P <0, 0001 för IL-6 och *** P <0, 001 för IL-10. Tvåvägs ANOVA analyserades med Sidaks posttest för flera jämförelser.

Bild i full storlek

För att testa den biologiska betydelsen av utarmning av Rab8a, mätte vi syntesen och utsöndringen av inflammatoriska cytokiner, som initieras nedströms LPS-aktiverade TLR4. Under en 8-timmars tidskurs produceras signifikant mer pro-inflammatorisk interleukin-6 (IL-6) vid både transkriptions- och utsöndrade nivåer i Rab8a-utarmade celler jämfört med kontroller (Fig. 2b). Omvänt visar de Rab8a-utarmade cellerna minskad syntes och utsöndring av det regulatoriska cytokinet, IL-10 (Fig. 2b). Således fungerar Rab8a i Akt / PI3K-signalering för att producera ett selektivt eller partiskt cytokinsvar på TLR4-aktivering. Detta är en helt ny roll för Rab8a i TLR4-signalering, och en som inte lätt förklaras av de kända Rab8a-effektorerna 27 . Vi försöker alltså identifiera de relevanta effektorerna eller bindande partnerna för Rab8a som förmedlar dess engagemang i TLR4-signalering.

PI3Kγ är en direkt bindande partner och effektor för Rab8a

För att identifiera bindningspartners för Rab8a i makrofager utförde vi GST-Rab8a neddragningsförsök med LPS-aktiverade cellextrakt (Fig. 3a). Masspektrometri-analys avslöjade ett antal kända och nya Rab8a-bindande partners (kompletterande tabell 1a). Bland dem framkom en framträdande men oväntad bindningspartner som ett band vid 120 kDa, vilket identifierades övertygande av fem oberoende trypsin-digererade peptider, var och en med 95% förtroende (Fig. 3a, b), som den p110y katalytiska underenheten för PI3K ( Kompletterande tabeller 1a, b). Expression av klass 1B PI3Ky är till stor del begränsad till immunceller där det har studerats i samband med GPCR-beroende neutrofil och T-cellmigration 28, även om det högsta uttrycket har rapporterats i myeloida celler, varav huvuddelen är makrofager 29 . För att bekräfta uttrycket av PI3Ky i makrofager jämfört med de andra klass I PI3K: er, p och 6, jämfördes messenger-RNA-nivåer med kvantitativt omvänt transkriptas PCR, och faktiskt är PI3Ky både immunspecifik och är den vanligaste isoformen i makrofager (kompletterande figur 3b). Traditionellt för klass 1B PI3K interagerar den katalytiska underenheten p110y med de regulatoriska underenheterna p87 eller p101 och med de lilla GTPas Ras för rekrytering till GPCR 30, 31 . Den oväntade bindningen av PI3Ky av Rab8a avviker från denna modell, vilket kräver en mer detaljerad undersökning för att belysa arten av denna interaktion.

( a ) GST-Rab8a kopplad till GSH-Sepharose användes för neddragningar från LPS-aktiverade RAW 264.7 cellextrakt. Bundna proteiner separerades med SDS – PAGE. Skurna band identifierades genom vätskekromatografi / masspektrometri eller masspektrometri. Ett huvudband vid 120 kDa, frånvarande från GST-kontrollen, identifierades som PI3Ky. ( b ) Sekvensstäckningen av identifierade peptider i PI3Ky. Masspektrometri-analys identifierade fem trypsin-digererade peptider från PI3Ky med 99% konfidens, inklusive många peptider som inte hittades i andra PI3K-isoformer. ( c ) Samutfällning av His-PI3Ky genom renad GST-Rab8a. ( d ) Samimmunutfällning av PI3Ky med GFP-Rab8a i närvaro av GTPyS från LPS-behandlat (15 min) RAW 264, 7 celllysat. Kvantifiering utfördes genom densitometrisk analys av westernblots relativt maximal nederbörd. ( e ) Nukleotidutbyte av GST-Rab8a med GTP eller BNP följt av neddragning av PI3Ky från RAW 264, 7 celllysat. Alla immunoblott beskurades för presentation; fullängdsfläckar finns i tilläggsfiguren 5.

Bild i full storlek

Renade proteiner producerade i bakterie- och insektsceller användes sedan för in vitro- bindande analyser för att bekräfta att Rab8a binder direkt till PI3Ky (fig. 3c), men inte till andra klass I PI3K-isoformer (kompletterande fig. 3c). Vidare, andra Rabs som är kända för att fungera i TLR4-vägen, såsom Rab10 (ref. 3) 3 och 11a 5, co-immunoprecipiterar inte PI3Ky (kompletterande fig. 3d). Denna direkta interaktion förbättras när Rab8a är i sin GTP-bundna, aktiva form, såsom visas av både GTP-belastning av GST-Rab8a och samimmunutfällning av PI3Ky av GFP-Rab8a i närvaro av ökande koncentrationer av en icke-hydrolyserbar GTP analog, GTPyS (fig. 3d, e). Dessa egenskaper överensstämmer med PI3Ky som interagerar med GTP-Rab8a som en ny klass av Rab-effektor.

Rekryteringen av PI3Ky till membran är tillräcklig för att initiera dess kinasaktivitet, till skillnad från andra klass IA PI3K-isoformer 32 . I andra signalvägar medieras denna rekrytering genom att Ras binder direkt till den Ras-bindande domänen (RBD) för PI3Ky 30 . För att testa om RBD är på liknande sätt ansvarig för Rab8a-bindning utförde vi neddragningsförsök med användning av det isolerade rekombinanta RBD från PI3Ky. RBD kunde framgångsrikt ersätta protein i full längd under neddragningsbetingelserna och bekräfta att det är nödvändigt och tillräckligt för bindning till Rab8a (fig. 4a). Vi använde sedan de kända kristallstrukturerna av GTP-bunden Rab8a 33 och samkristallstrukturen för PI3Ky med Ras 34 för att producera en homologimodell av Rab8a / PI3Ky (fig. 4b). Denna modell visar en livskraftig inriktning av PI3Ky RBD med den effektorbindande domänen av Rab8a och förutsäger de kritiska bindningsresterna på båda sidor av den samverkande ytan. Mutation av antingen F221 eller T232 i RBD eller I41-resterna i den effektorbindande domänen till Rab8a är tillräcklig för att reducera interaktion mellan de två proteinerna i neddragningsförsök (fig. 4c). Dessa resultat ger detaljerade bevis på en direkt interaktion mellan Rab8a och PI3Ky. Rab8a binder till samma RBD som Ras och använder dessutom samma kritiska rester i RBD 34 för sin interaktion med PI3Ky. PI3Ky binder normalt till Ras under sin rekrytering till aktiverade receptor (GPRC eller RTK) komplex. Att söka bevis för en sådan receptorinteraktion med TLR4 avslöjade att PI3Ky inte co-immunutfälls med TLR4 (kompletterande figur 3e). Sammantaget innebär substitutionen av Ras med Rab8a och rekryteringen av PI3Ky oberoende av TLR4 ett nytt sätt för rekrytering av PI3Ky i TLR4-vägen.

( a ) Bakteriellt uttryckt GST-PI3Ky RBD (aminosyror 1–356) och insektscelluttryckta GST-PI3Ky i full längd användes för att dra ner Rab8a från RAW 264, 7-celllysat. ( b ) PI3Ky-domänstruktur och homologimodell för Rab8a / PI3Ky-komplexet. Homologimodellen genererades med användning av kristallstrukturen hos GTP-bunden Rab8a (PDB: 3QBT) och samkristallen av PI3Ky och Ras (PDB: 1HE8). ( c ) Parvis GST-neddragningsförsök med antingen mutantformerna av PI3Ky med vildtyp Rab8a eller muterad Rab8a med vildtyp PI3Ky. Alla Rab8-fusionsproteiner var GTP-laddade. Den kinasinaktiva mutanten (R947P) användes som en negativ kontroll. ( d ) LPS-behandlade (15 min) RAW 264, 7 makrofager som transporterats med GFP-Rab8a och mCherry-PI3Ky visar kolokalisering i ruffles. Skala bar, 10 μm. Alla immunoblott beskurades för presentation; fullängdsfläckar finns i tilläggsfiguren 5.

Bild i full storlek

Vi försökte sedan bestämma membranlokaliseringen av Rab8a och PI3Ky. Kotransfekterade makrofager visar diffus cytoplasmisk märkning av mCherry-PI3Ky, typiskt för PI3K-isoformer. I LPS-aktiverade celler rekryteras PI3Ky till makrofagfläckar där den kolokaliserar med GFP-Rab8a (fig. 4d). Liksom alla PI3K-isoformer i klass, konverterar PI3Ky PI (4, 5) P2 till PI (3, 4, 5) P3, en funktion som överensstämmer med fosfoinositidmiljön i de Rab8-positiva rufsarna (visas i fig. 1e) . Således introducerar vi klass IB PI3Kγ som en ny effektor för GTP-Rab8a på ruffle membran. Därefter undersökte vi ytterligare denna stridighet genom att testa om PI3Ky, som Rab8a, fungerar i TLR4-signalering.

PI3Ky-utarmningseffekter på TLR4-signalering och inflammation

Som den första av tre tillvägagångssätt för att utforska PI3Ky-funktionen använde vi oberoende små störande RNA som riktade sig till PI3Ky (Fig. 5a). För alla små störande RNA fanns en minskning i fosforyleringen av Akt efter LPS-behandling som korrelerade med utarmningsnivån för PI3Ky (Fig. 5a). Som ett andra tillvägagångssätt behandlades makrofager med en PI3Ky-isoform-specifik hämmare, AS605240 (ref. 35) 35, vilket resulterade i reducerad fosforylering av Akt på ett dosberoende sätt (fig. 5b). Eftersom PI3Ky-hämmare kan ha effekter utanför målet vid högre koncentrationer, använde vi också genetisk ablation av PI3Ky i knockout-möss för att bedöma dess funktion. Målriktad knockout av p110y-subenheten (PI3Kγ - / - ) i C57BL / 6-musbakgrund påverkar inte uttrycket av andra p110-isoformer (a, β och δ) 28 . Primära benmärgs-härledda makrofager (BMM) från PI3Ky - / - och vildtypsmöss utmanades med LPS, vilket resulterade i> 50% minskad fosforylering av Akt i PI3Ky-nollceller (fig. 5c). Sammantaget indikerar dessa fynd att förlust av PI3Ky i LPS-behandlade makrofager signifikant reducerar Akt-signalering. Denna effekt efterliknar knockdownen av Rab8a (se fig. 2a, b) och överensstämmer med uppfattningen att PI3Ky fungerar som Rab8a-effektoren under TLR4-signalering. Vi drar därför slutsatsen att de fysiologiska rollerna för både Rab8a och PI3Ky är att förbättra TLR4-medierad PI3K / Akt-signalering.

( a ) RAW 264.7 makrofager behandlade med antingen kontroll (icke-målriktning) eller en av tre oberoende PI3Ky-målriktade små interfererande RNA inkuberades med LPS under 30 minuter. Kvantifiering av västra blott utfördes med användning av densitometri. ( b ) RAW 264, 7 celler behandlades under 30 minuter med antingen vehikel (DMSO), 0, 1, 1 eller 10 um AS605240 före tillsats av LPS under 30 minuter. Cellextrakt analyserades med avseende på Akt-fosforylering. ( c ) BMM härrörande från vildtyp (WT) och PI3Ky - / - djur utsattes för en 60-minuters tidsförlopp av LPS. Cellextrakt analyserades med avseende på Akt, ERK1 / 2 och p38 fosforylering. Kvantifiering av fosforylering sker endast vid 30 minuters tidpunkt och gelén är representativ ( n = 3 vardera). Alla immunoblott beskurades för presentation; fullängdsfläckar tillhandahålls i kompletterande figur 6.

Bild i full storlek

Vi undersökte också nedströms cytokinsvar på LPS i PI3Ky - / - BMM, där produktion av proinflammatoriska cytokiner, IL-6 och IL-12p40, förbättras signifikant som svar på LPS, jämfört med BMM från kontrolldjur (fig 6a, b). I motsats härtill undertrycks syntesen och frisättningen av IL-10 och den antivirala interferon av typ I, IFN-p, signifikant i PI3Ky - / - BMM. Följaktligen påverkar PI3Ky inte bara signalering utan också de medfödda immunsvaren aktiverade av TLR4 i makrofager. I enlighet med signalprofilerna och med rollen som Rab8a tjänar PI3Ky till att förspänna det inflammatoriska svaret genom att begränsa produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner.

( a ) Kvantitativ PCR-tidskurs för omvänd transkriptas efter LPS-behandling i WT och PI3Ky - / - BMM. Datapunkter är medelvärdet ± sem ( n = 3) av cytokinprofiler och jämfördes med tvåvägsvariansanalys (ANOVA). ( b ) Cytokiner utsöndrade i BMM-mediet uppmättes genom enzymbunden immunosorbentanalys, efter LPS-behandling, med undantag av IFN-p, som mättes vid 24 timmar. Varje datapunkt är medelvärdet ± sem ( n = 3 med tre replikat). Betydelsen mättes med tvåvägs ANOVA med Sidaks posttest för flera jämförelser (** P < 0, 01, **** P <0, 0001). IFN-p uppmättes med Students t- test.

Bild i full storlek

PI3Kγ reglerar inte endocytos av TLR4

Internaliseringen av TLR4 (ref. 12) 12 genom att effektivt ta bort den från ytadaptern, Mal och MyD88, är en möjlig mekanism för att begränsa pro-inflammatorisk signalering 10 . Eftersom klass I PI3K är vanligtvis involverade i endocytiska vägar 36 och Rabs också är vanliga endocytiska regulatorer 37, skulle en trolig mekanism för verkningarna av Rab8a / PI3Ky till synes vara att reglera endocytos av TLR4. Testning av kända endocytiska vägar i PI3Ky - / - BMM avslöjade emellertid inget krav på PI3Ky för direkt reglering av FcyR-medierad fagocytos, klathrinmedierad transferrinreceptorendocytos eller dextran-märkt makropinocytos (kompletterande fig. 4a – c). Vanliga endocytiska vägar i PI3Ky-noll-möss verkar således fungera effektivt. Internaliseringen av själva TLR4 mättes sedan genom ytimmunolabelling och flödescytometri under en tidsförlopp för LPS-aktivering. TLR4 internaliseras framgångsrikt i PI3Ky - / - BMM med samma hastighet som i kontrollceller (fig 7a, b). Följaktligen krävs inte PI3Ky för att reglera endocytos av TLR4 i detta sammanhang.

( a ) Obehandlad eller LPS-behandlad (100 ng ml-1 för de angivna tiderna) WT och PI3Ky - / - BMM användes för att undersöka ytnivåerna av endogen TLR4 genom immunfärgning och flödescytometri. ( b ) Kvantifiering av TLR4-internalisering över tid. Procentandelen yt TLR4 beräknades med den genomsnittliga fluorescerande intensiteten för TLR4-receptorfärgning vid varje tidpunkt över MFI hos obehandlade celler ( n = 3 med tre replikat).

Bild i full storlek

PI3Kγ förmedlar cytokinförspänning genom mTOR

En andra mekanistisk förklaring till cytokinförspänningen som observerats i Rab8a- och PI3Ky-utarmade celler involverar mTORC1-komplexet, som verkar nedströms PI3K i TLR4-vägar. Inom detta komplex har serin / treoninproteinkinas mTOR implicerats i transkriptionell och post-translationell reglering av cytokinproduktion och förspänning 38 . I våra vildtyp-BMM förbättrar hämning av mTORC1 med rapamycin effektivt produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner, IL-6 och IL-12p40, samtidigt som nivåerna av IL-10 minskas (Fig. 8a). Detta överensstämmer runda med effekterna av Rab8a och PI3Ky på cytokinutgångar i våra experiment och med fynd som rör mTOR-funktion i litteraturen 16, 39 . För att undersöka om PI3Kγ reglerar mTOR nedströms TLR4, analyserade vi fosforylering av Akt och mTOR i LPS-behandlade vildtyp och PI3Ky - / - BMM (fig. 8b). Kvantifiering avslöjade en signifikant minskning av både Akt och mTOR-fosforylering i frånvaro av PI3Ky (fig. 8b). För att undersöka betydelsen av minskad mTOR-fosforylering testade vi två kanoniska mTORC1-substrat, 4E-BP1 och p70S6K, kända mål under LPS-stimulering 16 . I PI3Ky - / - celler efter LPS-behandling reducerades fosforylering av p70S6K till under detekterbara nivåer, medan fosforylering av 4E-BP1 reducerades för isoform med högre molekylvikt. Tillsammans bekräftar dessa resultat en defekt i PI3K / Akt / mTOR-vägen (Fig. 8c). Således krävs PI3Ky för effektiv aktivering av mTOR som svar på patogenigenkänning med TLR4. Sammantaget föreslår våra data en ny roll för PI3Ky under TLR4-signalering och en som är oberoende av receptorendocytos. Rekryteringen av Rab8a och PI3Ky under TLR4-aktiveringsfunktioner för att förbättra mTOR-signalvägen, effektivt polarisera cytokinsvaret och begränsa inflammation.

( a ) Cytokiner utsöndrade i mediet av obehandlad och mTOR-hämmare (rapamycin) -behandlade BMM uppmättes genom enzymbunden immunosorbentanalys, efter LPS-behandling vid 8 timmar. Datapunkter är medelvärdet ± sem ( n = 5 med tre replikat). Betydelsen mättes Studentens t- test (* P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001, **** P <0, 0001) ( b ) BMM härrörande från WT och PI3Ky - / - djur utsattes för en 60-minuters tidskurs av LPS. Cellextrakt analyserades med avseende på Akt och mTOR-fosforylering. Densitometrisk kvantifiering av fosforylering är endast vid 30 minuters tidpunkt och gelén är representativ ( n = 3 vardera). ( c ) BMM härrörande från WT och PI3Ky - / - djur behandlades med LPS (30 min) och cellextrakt analyserades med avseende på fosforylering av mTOR-substraten, p70S6K och 4E-BP1. Pilthuvuden indikerar den hyperfosforylerade formen av 4E-BP1, som har en rörelseskift. Alla immunoblott beskurades för presentation; fullängdsfläckar tillhandahålls i kompletterande figur 6.

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie beskriver vi en ny reglerande enhet bestående av Rab8a med PI3Ky som dess effektor. I detta sammanhang spelar Rab8a en ny roll i signalering med den nya PI3Ky-funktionen i TLR4-vägen. Denna ytterligare roll för PI3Ky utökar dess räckvidd utöver kända GPCR: er och RTK: er. I makrofager exponerade för LPS rekryteras Rab8a och PI3Ky till dorsala ruffles tillsammans med komponenter i TLR4 / Mal / MyD88-komplexet. Rab8a och PI3Kγ är två nyinförda partners som krävs för effektiv Akt / mTOR-signalering under TLR4-aktivering. PI3Ky tjänar till att förbättra mTOR-fosforylering och signalering via denna arm av TLR4-svaret, varvid nedströmsproteiner både kan begränsa inflammatoriska svar genom att begränsa produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner och bias svaret till förmån för reglerande eller antiinflammatoriska cytokiner 38 . Våra fynd avslöjar således Rab8a / PI3Ky-komplexet som en viktig och ytterligare mekanism för att kontrollera PI3K-signalering i inflammation.

Rab8a är en allestädes närvarande Rab, som fungerar i flera återvinningsvägar genom olika effektorer 27, 40, 41 . Den Rab8a-lokaliseringen som vi visar i aktiverade makrofager är i stort sett jämställd med sin tidigare lokalisering på cellytor, vid framkanter och på membranblåsor och rör som rör sig till och från ytan 23, 40 . Inom denna distribution visar vi en specifik och dramatisk rekrytering av Rab8a till dorsala ruffles på ytan av LPS-aktiverade makrofager, tillsammans med komponenter i yt-TLR4-komplexet. Vår studie tjänar till att lyfta fram makrofag dorsala ruffles som en tidigare oheralderad plats för kluster av TLR4-receptorn och tillhörande molekyler. Funktionerna vi visar, nämligen rekryteringen av PI3Ky, generering av signalering fosfoinositid PI (3, 4, 5) P3 och efterföljande aktivering av Akt, betecknar dessa ryggflodar som en funktionell plats för TLR4-signalering. Anrikning av Rab8a i rufsarna är slående och återspeglar kluster av Rabs vid funktionella membrandomäner, mestadels på begäran av deras guanin nukleotidutbytesfaktorer och effektorer. Identiteten för sådana Rab8a-rekryteringsfaktorer i detta landskap är ännu inte känd, även om GTPase Arf6 är en kandidatspelare på grund av dess roller i ruffleformation 42, dess deaktivering av Rab8a i epitelceller 43 och en föreslagen roll i TLR4-aktivering i makrofager 13 . Medan Rab8a reglerar signalering från ytan TLR4-komplexet, påverkar ytterligare Rabs TLR4 vid andra punkter längs endocytiska och återvinningsvägar via mer traditionella människohandel mekanismer. Rab11a reglerar återvinning av endosomförmedlad leverans av TLR4 till fagosomer, ett alternativt ställe som föreslås för LPS-aktivering av TLR4 varvid TLR4-signaler via TRIF / TRAM-adaptrar för att producera IFN-p5. Notera är det faktum att fagosomer kan genereras från dorsala ruffles, vilket antyder en annan väg för spatiotemporal reglering av TLR4. Dessutom fungerar Rab10 (ref. 3) 3 och Rab7 (ref. 4) 4 vid återvinning av TLR4 till ytan respektive för nedbrytning; emellertid förblir Rab-effektorer som är relevanta för TLR4 vid alla dessa andra steg inte definierade. Vi omarbetar nu Rab8a med en ny effektor och en helt annan roll genom dess direkta engagemang i PI3K-signalering i TLR4-vägen.

PI3Ky avslöjades häri som en oväntad bindningspartner för Rab8a och den första instansen av klass 1B PI3Ks som direkt interagerar med en Rab. Rab5 var tidigare implicerad som en effektor för klass IA PI3Kβ 44, även om arten av denna interaktion inte kännetecknades. At a molecular level, the PI3K catalytic subunit p110γ is traditionally recruited by binding directly to Ras, along with a class IB regulatory subunit, and the Gβγ subunit of an activated GPCR complex 45 . We now confirm that Rab8a and PI3Kγ bind directly to each other, using homology modelling and mutagenesis of critical residues. Rab8a binds to two residues in the RBD of PI3Kγ that are critical and necessary for Ras binding to PI3Kγ 34 . Recently, Rho family GTPases, Rac1 and CDC42, but not Ras, were also shown to directly interact with class IA PI3Kβ through the kinase's RBD 46 . Our findings now show that the PI3K RBD also supports interactions with a Rab GTPase, in addition to Ras and Rho family GTPases 46 . These G protein families thus offer a variety of modalities for the recruitment and regulation of PI3Ks in signalling pathways.

In the context of LPS signalling, it remains unclear precisely how PI3Kγ is recruited and activated by TLR4, particularly because PI3Kγ does not bind directly to TLR4. Our findings suggest that Rab8a provides a parallel means of recruiting a PI3K to augment LPS signalling, with Rab8a/PI3Kγ acting as an auxiliary unit in its own right or in the context of another receptor. Such crosstalk for amplifying PI3K-mediated signalling has precedents, including the Fc?RI receptor in mast cells, where this receptor has no direct link to GPCRs, yet degranulation is dependent on PI3Kγ 47 . Indeed, a seminal study of tumour-associated macrophages expanded the field of PI3Kγ's influence by showing that it regulates signalling not only from GPCRs, but also from RTKs and the TLR/IL1 receptor 29 . In the complex ligand environment of tumour inflammation, the loss of PI3Kγ was found to limit tumour progression 29, in line with the current interest in PI3Kγ inhibitors for treating cancer. By adding the pathogen recognition receptor, TLR4, to the classes of receptors employing PI3Kγ, we raise questions for the future about even more receptors that may activate Rab8a/PI3Kγ, including other members of the TLR family and their arrays of pathogen-derived ligands. Further studies are also needed to establish whether Rab8a, rather than Ras, is involved in recruiting PI3Kγ to other receptor families.

Previous studies have focused on TLR4 internalization as a mechanism by which macrophages can terminate the production of pro-inflammatory cytokines 10, 11, 12 . The class IA PI3Kδ is recruited to the TLR4 complex, where it reportedly regulates internalization of the receptor by an unknown pathway 10 . This results in a switch from cell surface MyD88/Mal signalling, which generates pro-inflammatory cytokines, to the endosomal adaptors TRIF/TRAM, which induce production of type I interferons 10 . We saw no general effects on endocytosis or the internalization of TLR4 itself after loss of PI3Kγ. Therefore, Rab8a/PI3Kγ operates via another mechanism to control TLR4 signalling and cytokine production. The effects we demonstrate here for PI3Kγ are similar to those reported for PI3Kδ in enhancing Akt signalling and in limiting pro-inflammatory cytokines. Therefore, it is likely that both PI3Ks act in concert to augment the same effect, possibly reflecting the need for multiple mechanisms to stimulate and fine-tune the production of inflammatory cytokines.

Mechanistically, we found that Rab8a and PI3Kγ exert their control over cytokine production by signalling through the multi-functional serine/threonine protein kinase mTOR, which acts as a hub downstream of TLR4 to strategically bias cytokine responses 48 . In this context, mTOR signalling inhibits the function of NFκB and the transcription of pro-inflammatory cytokines, IL-6 and IL-12p40, while enhancing the function of STAT3 and the transcription of an anti-inflammatory or regulatory cytokine, IL-10 (refs 16, 49). The importance of mTOR in this regulatory role emerged with a recent study showing that the intracellular pathogen Legionella pneumophila subverts the immune response with bacterial effectors that target mTOR to disengage its cytokine biasing role 39 . The regulation of mTOR downstream of TLR4 by PI3Kγ results in the polarized inflammatory response towards an anti-inflammatory setting. This effect has been demonstrated elsewhere, through the pharmacological inhibition of mTORC1 with rapamycin and by the genetic perturbation of TSC2—another kinase in the pathway 16 . Our findings represent the first example of mTOR regulation by a Rab GTPase through PI3Kγ. Given that mTOR controls many cellular functions, Rab8a and PI3Kγ may have broader physiological effects beyond cytokine production.

PI3Kγ has become an attractive drug target in cancer and other diseases 50 . PI3Kγ −/− mice show reduced inflammation in a number of disease models, including diabetes 51 and cardiovascular disease 52, primarily related to roles for this kinase in GPCR-dependent cell migration of immune cells and activation of the respiratory burst 28 . On this basis, PI3Kγ inhibitors are also viewed as potential anti-inflammatory drugs 47 . However, at least in the context of bacterial infection, our preliminary results suggest that PI3Kγ inhibition might acutely skew signalling towards pro-inflammatory cytokines, enhancing bactericidal responses, but exacerbating inflammation. Further studies are now needed to dissect the role of PI3Kγ and the clinical consequences of its inhibition over the course of bacterial infection and in disease. As a pharmacologically tractable target operating at a critical point to regulate cytokine outputs from TLR4 activation, understanding how PI3Kγ influences infection and inflammatory disease is vital.

metoder

Antibodies and reagents

Primary antibodies recognizing PI3Kα, β, γ, δ (sampler kit-9655), phospho-mTOR, phospho-4E-BP, phospho-p70 S6 kinase (sampler kit-9862), Akt (9272), phospho-Akt (Ser 473 ) (4962), phospho-p38 MAPK (Thr 180 /Tyr 182 ) (4511), IκBα (9242), phospho-ERK1/2 (4370) were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Mouse anti-Rab8 (610845) was purchased from BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA). GST antibody (71-7500) was purchased from Invitrogen, Sydney, Australia. Anti-TLR4 for western blotting was from Abcam (ab22048). For fluorescent-activated cell sorting (FACS) analysis, the anti-TLR4 SA15-21 clone was biotinylated using the EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (Thermo Scientific, CA, USA). Streptavidin–APC (Biolegend, CA, USA) was used to detect biotinylated anti-TLR4. Mouse anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (2275-PC-1) was purchased from Trevigen (Gaithersburg, MD, USA). Alexa Fluor 488/594- (A21208) and 647- (A31573) conjugated secondary antibodies, Alexa Fluor 488- and 647-dextran and wheat germ agglutinin (WGA)-Texas Red were purchased from Molecular Probes (Invitrogen, OR, USA). Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse and rabbit antibodies (81–6520) were obtained from Zymed (San Francisco, CA, USA). Bacterial lipopolysaccharide (LPS), purified from Salmonella enterica serotype Minnesota Re 595, was purchased from Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). AS605240 (IC 50 =0.008 μM) was purchased from Sigma-Aldrich and IC87114 (IC 50 =0.07 μM) was from Scientifix, Australia. For phagocytosis, human IgG (Invitrogen) was conjugated to 3 μm latex beads (Sigma). All other chemicals and reagents were from Sigma-Aldrich.

Plasmid and constructs

The mouse PI3Kγ cDNA was obtained from the Facility for Life Science Automation at the Institute for Molecular Bioscience. GST-PI3Kγ-FL and His-PI3Kγ-FL were expressed in Sf9 insect cells using baculovirus expression vector systems according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). Rab8a was subcloned into pEGFP-C1, pm-Cherry-C1 and ptd-Tomato-C1 that had been generated from pCMV-tdTomato (Clontech). The pEGFP-Rab8aCAAX domain (Rab8a tail) was generated by PCR to contain the last 29 amino acids of the Rab8a C terminus with a modification of the CAAX motif to CMIV to allow for prenylation of the fusion protein 53, 54 . Rab8a was also subcloned into pGEX6P-1 and expressed in E. coli 55 . Phosphoinositide probes and pEGFP-C1-Akt-PH were kindly provided by Frederic Meunier, and the lentiviral vector PLL5.0 was obtained from Alpha Yap (both of The University of Queensland, QLD, Australia). Mal–Cerulean and TLR4-Citrine plasmids were gifts from Nicholas J. Gay, University of Cambridge, UK.

Expression and purification of recombinant proteins

Recombinant GST-tagged proteins were produced in an E. coli BL21(DE3) strain transformed with the plasmid DNA of interest. Expression of the recombinant protein was induced with the addition of 0.5 mM IPTG for 18 h at 25 °C with shaking. The bacterial cells were then pelleted by centrifugation at 5, 000 g . The pellets were resuspended in ice-cold lysis buffer (Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet (Roche Applied Science), 1 mM DTT and 1 mM PMSF). The bacterial lysates were lysed using a Constant Systems cell disruptor according to the manufacturer's instructions (Thermo Scientific, Australia) and then cleared by centrifugation at 48, 254 g at 4 °C. The recombinant proteins were affinity purified by incubating the cleared lysate with Glutathione Sepharose (GE Healthcare Life Science, Australia) for 1 h at 4 °C. The beads were washed extensively with 1 M NaCl in 20 mM Tris pH 7.4. GST-fusion proteins on the beads were stored at −20 °C in 20 mM Tris pH 7.4 containing 20% glycerol.

Mouse model

Knockout of the p110γ subunit in PI3Kγ −/− mice (pik3cg2/2) on a C57BL/6 background has been previously described 28 . Age (16–20 weeks) and sex-matched C57BL/6 mice were used as controls. Mice were housed and used for experiments in accordance with approved animal ethics protocols at AMREP (Alfred Medical Research and Education Precinct) AEC, Alfred Hospital Melbourne, Victoria. (E/1089/2011/M). Experiments utilized samples or cells from three or more mice per group per time point to generate statistical significance. Animals within groups were randomized for treatments. Primary BMMs were obtained by ex vivo differentiation of bone marrow cells collected from mouse femurs or tibias. Cells were differentiated for 7 days in complete RPMI medium supplemented with 20 U ml −1 penicillin, 20 μg ml −1 streptomycin and 100 ng ml −1 purified recombinant macrophage colony-stimulating factor-1 (refs 56, 57).

Cell culture and siRNA

The mouse RAW 264.7 macrophage cell line was sourced from ATCC. PI3Kγ was silenced using Stealth siRNA primer sets from Life Technologies, Australia (catalogue number 1320003). RAW 264.7 macrophages were cultured in RPMI 1640 medium (Lonza) supplemented with 10% heat-inactivated FCS (Thermo Trace) and 2 mM L-glutamine (Invitrogen) in humidified 5% CO 2 at 37 °C (ref. 58). Cells were screened monthly for mycoplasmal contamination. For transient expression of cDNA, cells at 50% confluence were transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were typically used for experiments 18 h after transfection. Non-targeting siRNA was used as a control. For Rab8a depletion, an 18 nucleotide shRNA was designed and cloned into the lentivirus expression vector LentiLox pLL5.0 (refs 59, 60, 61), using forward primer 5′-tGCCTTCAACTCCAC ATTCAttcaagagaTGAATGTGGAGTTGAAGGCttttttg-3′, and reverse primer 5′-TCGACAAAAAAGCCTTCAACTCCACATTCATCTCTTGAATGAATGTGGATTGAAGGCA-3′. The shRNA was cloned downstream of the U6 promoter (HpaI and XhoI) into a lentivirus expression vector pLL5.0 (backbone pLL3.7) carrying a soluble mCherry gene as a fluorescent reporter. The pLL5.0 shRNA and packaging vectors were transfected into HEK-293T cells by Lipofectamine 2000 precipitation. Virus-like particles were collected from the supernatant 48–72 h after transfection, and virus was concentrated using polyethylene glycol 6000 (ref. 62) 62 . Aliquots of virus were subsequently used for titration or stored at −80 °C. Titres were determined by infecting HEK-293T cells with serial dilutions of concentrated lentivirus. RAW 264.7 macrophages were infected with lentiviral particles at a multiplicity of infection of 10 per cell. Cells were incubated at 37 °C with lentivirus in RPMI complete medium and collected 48 h post infection. Single-cell suspensions were sorted by flow cytometry according to moderate to high levels of reporter gene expression.

Fixed cell ruffle quantification and analysis

RAW 264.7 macrophages were grown on coverslips overnight at a low confluency. Cells were either treated with exogenous LPS 100 ng ml −1 (stimulated) or not treated (unstimulated) for 30 min before fixation. Cytoskeletal F-actin was labelled with Alexa Fluor 488 phalloidin (Life Technologies) for 60 min; in addition, nuclei were labelled with 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) concurrently. Three-dimensional z -stacks were acquired using a DeltaVision devolution microscope (GE Healthcare) and were analysed using Fiji image software. The mid-point of cellular nuclei (DAPI) was selected and labelled as the new base slice. Slices from the mid-point until the top of the cell were flattened using maximum projection. Background subtraction and median filters were applied to the flattened image for smoothing purposes for further analysis. The image was then duplicated, whereby a threshold mask was constructed (equally for all images) and all regions collected from the phalloidin threshold image were selected as the region of interest (ROI). The fluorescence intensity for the generated ROI in the phalloidin channel was then measured and quantified using GraphPad Prism.

Phagocytic assay and procedures

Wild-type and PI3Kγ −/− BMMs ( n =3 each) were grown on coverslips before phagocytosis experiments. Latex beads (3 μm diameter) from Sigma-Aldrich (LB30-2ML) were diluted 1 × 10 −1 in dH2O and washed with phosphate-buffered saline (PBS) three times by centrifugation. Beads were resuspended in 2 μg ml −1 human immunoglobulin G (IgG) (Invitrogen, 02-7102) in PBS. IgG was left to bind by passive adsorption for 2 h at room temperature on a rotating mixer. The suspension was then washed three times and resuspended in PBS and sodium azide (0.2%). For phagocytosis, 1 μl of this suspension was added to macrophages on coverslips in 1 ml of cold complete RPMI medium, and spun onto the cells at 1, 00 g for 2 min at 4 °C. Cells are then transferred back to 37 °C for 5–20 min. Cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 30 min and then permeabilized, if required, with 0.1% Triton X-100/PBS for 5 min. Washing, blocking and antibody incubation steps were done using blocking buffer (0.5% BSA/PBS). Human IgG on beads was detected using Cy3 goat anti-human antibody (1:200, Jackson Labs 109-165-003). Cells were labelled with Alexa350/488 phalloidin (1:50/1:500, Molecular Probes, 22281, 12379), to outline cells and show actin-enrichment at sites of phagocytosis. Coverslips were mounted in Prolong Gold (Invitrogen, P10144) for imaging. Olympus BX-51 upright microscope fitted with an Olympus DP-71 12Mp Colour Camera. Images were captured using a × 40/1.35 U Apo Oil lens with the Olympus DP controller version 2.1 capture software at an image size of 2040 × 1536 pixels. Each bead was classified as either phagocytosed (Cy3<5%), in-between (5% 63 . ( n >200 beads per animal).

TLR4 internalization assay

Wild-type and PI3Kγ −/− BMMs ( n =3 each) were grown on non-adherent tissue culture plates. In FACS tubes, 0.5 × 10 6 cells ml −1 for each animal in triplicate were treated with or without LPS (100 ng ml −1 ) for indicated times at 37 °C before being placed on ice to halt all internalization. Cells were washed twice with ice-cold FACS buffer (PBS, 1% FCS, 5 mM EDTA) and blocked with 24G2 for 20 min on ice. Cell surface TLR4 was stained with biotinylated anti-TLR4 (clone SA15-21 Biolegend 145402) at 0.5 μg ml −1 . Cells were washed three times in FACS buffer before labelling with Streptavidin–APC (Biolegend 405207) at 0.5 μg ml −1 . Cells were washed extensively in FACS buffer at 4 °C before acquisition on a Canto II cytometer (Becton Dickinson). Cellular profiles were analysed using FlowJo software (TreeStar). The percentage internalization=(MFI X −MFI TLR4−/− )/(MFI WT untreated −MFI TLR4−/− ) × 100 for each data point.

Transferrin uptake assay

Wild-type and PI3Kγ −/− BMMs ( n =3 each) grown on coverslips were serum starved for 30 min and treated with Alexa Fluor 546-labelled mouse transferrin (Life Technologies) for 10 min at 37 °C. Cells were then washed and chased for 20 min at 37 °C in complete medium to allow trafficking of transferrin from early endosomes to recycling endosomes. Flattened three-dimensional images were captured for each treatment using identical conditions. The background intensity ROI was selected from a region not containing cells. Background intensity was removed from the entire field of view before individual cells were selected, and total cell transferrin intensity was then measured for analysis ( n >30 cells per animal).

Dextran uptake assay

RAW 264.7 macrophages were incubated with or without LPS pre-priming for 30 min. Alexa Fluor 488-conjugated dextran (10, 000 MW) was added to the cells at a final concentration of 50 μg ml −1 in complete medium and left on cells for 10 min. Macropinocytosis was stopped by washing cells in 4 °C PBS before exchanging for 4 °C complete medium. Cells were kept on ice until imaging live using the Personal DeltaVision deconvolution microscope. Macropinocytosis was then analysed using ImageJ software. Cells were segmented using WGA as a cell mask. Macropinosomes were segmented and filtered by size >0.2 μm. Final segmentation of individual macropinosomes was performed manually before counting and size measurements were taken in an automated fashion.

Ruffle enrichment analysis

Recruitment analysis was performed by comparing the fluorescence intensity of a transfected protein at multiple locations in a given cell. The peak fluorescence intensity of each channel across an ROI line was divided by the fluorescent intensity of WGA as a measure of total membrane. The mean fluorescence of each channel/WGA at the filopodia was set to 1 and the measurements in ruffles compared with identify recruitment of tdTomato-Rab8a and GFP-Akt-PH. By standardizing all measurements to the WGA intensity at the filopodia, measurements among cells could be compared even though the total intensity per cell was not equal.

Mikroskopi

For live cell experiments, RAW 264.7 macrophages were cultured on glass-bottom 35-mm dishes (MatTek). Live and fixed cell imaging were additionally performed using a Personal DeltaVision Olympus IX71 inverted wide-field deconvolution microscope equipped with Olympus U-Apochromat 40 × /1.35 oil DIC, Plan-Apochromat 60 × /1.42 oil DIC and UPLS-Apochromat 100 × /1.40 oil DIC, and a 120 W xenon arc lamp. Images were captured using a Roper Coolsnap HQ2 monochrome camera. Live cell three-dimensional z -stack imaging for ruffle analysis using temporal colour coding was acquired using the Zeiss Axiovert 200 Yokogawa spinning disk confocal microscope. Each stack was acquired every 30 s and full stacks represented as sum-intensity projections. Temporal colour coding of each slice was performed using ImageJ and the spectrum lookup table. Immunofluorescence staining is described in 'phagocytic assay and procedures' 63, 64 .

Scanning electron microscopy

RAW 264.7 macrophage cells were incubated with human IgG-opsonized latex beads (3 μm, Sigma-Aldrich) for 30 min and fixed with 2.5% glutaraldehyde in sodium cacodylate buffer, post-fixed in 2% osmium tetroxide, dehydrated through ethanol, and dried using HMDS (Sigma-Aldrich). Coverslips were coated in platinum and viewed on a JEOL JSM-6300F scanning electron microscope.

Immunoblot

For immunoblot analysis 65, cells were lysed in lysis buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-40 (Sigma) with addition of 1 mM PMSF, 1 mM DTT, cOmplete protease inhibitors (Roche Applied Science) and phospho-Stop tablets (Roche Applied Science). The proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (BioTrace, NZ), blocked with 5% skim milk in PBS-0.1% Tween-20 buffer (TBS-T) and incubated overnight at 4 °C with primary antibodies. After washing of the membrane, a secondary antibody was incubated for 1 hour. The membrane was developed with a chemiluminescence reagent (ECL, Detection Reagents, Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions.

Quantitative real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay

Total RNA was prepared using RNeasy mini-kits (Qiagen, Valencia, CA) and cDNA reverse transcribed using 1 μg of total RNA and Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Gene expression was quantitated using SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems) 66, using an ABI Prism 7000 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA). All primers used in this study are listed in Supplementary Table 2. Data are presented as relative change compared with control cells ( n =3) and represents the average±sem

Rab8a GTP loading for GST pull-down and mass spectrometry analysis

GTP-loaded GST-Rab8a sepharose beads were incubated with LPS-activated cell lysate for 1 h at 4 °C with agitation. MicroSpin columns (#27– 3565–01; GE Healthcare) were used for all of the pull-downs. Beads were washed with ice-cold wash buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, pH 7.4). Elution was achieved conventionally by boiling in 3 × SDS–PAGE sample buffer for 5 min (ref 67). LC MS/MS was performed at the IMB Mass Spectrometry Facility, The University of Queensland. LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage extracts were lysed in ice-cold lysis buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40 (Sigma), 1 mM PMSF, 1 mM DTT, cOmplete protease inhibitors (Roche Applied Science), and PhosStop tablet (Roche Applied Science). The lysate was centrifuged at 75, 600 g for 15 min at 4 °C. The supernatant was pre-cleared by the addition of GSH-Sepharose beads for 1 h, pelleted at 50 g for 5 min at 4 °C, and the supernatant collected. Various GST-tagged recombinant proteins were then incubated with an equal amount of tissue lysate at 4 °C for 1 h. Beads were washed extensively with ice-cold 20 mM Tris pH 7.4 containing 150 mM NaCl, 1 mM DTT, and 1 mM PMSF, eluted in 2 × SDS–PAGE sample buffer, resolved on 10% SDS–PAGE gels, and stained with Coomassie blue G250. GTP loading of Rab8 was performed by nucleotide exchange as described earlier 68 .

Samples were analysed by LC MS/MS on a Shimadzu Prominence Nano HPLC (Japan) coupled to a Triple TOF 5600 mass spectrometer (ABSCIEX, Canada) equipped with a nano electrospray ion source. Six microliters of each extract was injected onto a 50 mm × 300 μm C18 trap column (Agilent Technologies, Australia) at 30 μl min −1 . The samples were de-salted on the trap column for 5 min using 0.1% formic acid at 30 μl min −1 . The trap column was then placed in-line with the analytical nano HPLC column, a 150 mm × 75 μm 300SBC18, 3.5 μm (Agilent Technologies, Australia) for mass spectrometry analysis. Linear gradients of 1–40% solvent B over 35 min at 300 nl min −1 flow rate, followed by a steeper gradient from 40 to 80% solvent B in 5 min were used for peptide elution. Solvent B was held at 80% for 5 min for washing the column, and then returned to 1% solvent B for equilibration before the next sample injection. Solvent A consisted of 0.1% formic acid and solvent B contained 90/10 acetonitrile/0.1% formic acid. The ion spray voltage was set to 2400 V, declustering potential (DP) 100 V, curtain gas flow 25, nebuliser gas 1 (GS1) 12, and interface heater at 150 °C. The mass spectrometer acquired 500 ms full scan TOF-MS data followed by 20 by 50 ms full scan product ion data in an information dependent acquisition (IDA) mode. Full scan TOF-MS data were acquired over the mass range 350–1400 and for product ion ms/ms 80–1400. Ions observed in the TOF-MS scan exceeding a threshold of 100 counts and a charge state of +2 to +5 were set to trigger the acquisition of product ion, ms/ms spectra of the resultant 20 most intense ions. The data were acquired and processed using Analyst TF 1.6.1 software (ABSCIEX, Canada). Proteins were identified by database searching usingProteinPilot v4.5 (ABSCIEX, Canada) against the UniProt_Sprot_20130205 database (~106, 000 entries of all species searched, FDR of 1%). Search parameters were defined as a thorough search using trypsin digestion, iodoacetamide cysteine alkylation and all entries in the database. Proteins were considered identified if there was at least one peptide identified with 99% confidence.

Image analysis software

All images were analyzed using either ImageJ (version 1.43; National Institutes of Health, Maryland, USA) or Imaris (version 7.3.6, Bitplane Scientific Software). Adobe Photoshop CS6 was used to crop regions of interest or to extract single channels.

Statistik

If not stated otherwise, data are presented as arithmetic means±sem For direct comparison of one experimental variation, Student's t -test was used for data with normal distribution (assessed by Shapiro–Wilk test). Post-test analysis of one-way analysis of variance was corrected for multiple comparisons by Dunett's method and corrected for multiple comparisons in two-way analysis of variance using Sidak's method. All analysed experiments used biological replicates to compute statistical significance. In all statistical analysis, a P- value<0.05 was considered statistically significant. Statistics were calculated using GraphPad Prism version 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Ytterligare information

How to cite this article : Luo, L. et al. Rab8a interacts directly with PI3Kγ to modulate TLR4-driven PI3K and mTOR signalling. Nat. Commun. 5:4407 doi: 10.1038/ncomms5407 (2014).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-6 and Supplementary Tables 1-2

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.