Proteinkinas cα undertrycker bildning av kras-medierad lungtumör genom aktivering av en p38 mapk-tgfp-signalaxel | onkogen

Proteinkinas cα undertrycker bildning av kras-medierad lungtumör genom aktivering av en p38 mapk-tgfp-signalaxel | onkogen

Anonim

ämnen

  • Cell signalering
  • Icke-småcellig lungcancer

Abstrakt

Proteinkinas C alfa (PKCa) kan aktivera både pro- och antitumorigen signalering beroende på cellulär kontext. Här undersökte vi rollen för PKCa i lungtumörigenesen in vivo . Genuttrycksdatauppsättningar avslöjade att primära humana icke-små lungcancer (NSCLC) uttrycker signifikant minskade PKCa-nivåer, vilket indikerar att förlust av PKCa-uttryck är en återkommande händelse i NSCLC. Vi utvärderade den funktionella relevansen av PKCa-förlust under lungtumorigenesen i tre murina lungadenokarcinommodeller ( LSL-Kras , LA2-Kras och uretanexponering). Genetisk borttagning av PKCa resulterade i en signifikant ökning av antalet lungtumörer, storlek, belastning och grad, förbikoppling av onkogeninducerad senescens, progression från adenom till karcinom och en signifikant minskning av överlevnad in vivo . Den tumörfrämjande effekten av PKCa-förlust återspeglades i förbättrad Kras- medierad expansion av bronkioalveolära stamceller (BASC: er), förmodade tumörinitierande celler, både in vitro och in vivo . LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisade en minskning i fosfo-p38 MAPK i BASC in vitro och tumörer in vivo , och behandling av LSL-Kras BASC med en p38-hämmare resulterade i ökad kolonistorlek som inte kan skiljas från vad som observerades i LSL- Kras / Prkca - / - BASC. Dessutom uppvisade LSL-Kras / Prkca - / - BASCs en blygsam men reproducerbar ökning av TGFp1 mRNA, och tillsats av exogent TGFp1 till LSL-Kras BASC resulterar i förbättrad tillväxt liknande obehandlade BASC från LSL-Kras / Prkca - / - möss . Omvänt reverserade en TGFpR1-hämmare effekterna av PKCa-förlust i LSL-Kras / Prkca - / - BASC. Slutligen identifierade vi hämmare av DNA-bindande (Id) Id1-3 och Wilms tumör 1 som potentiella nedströmsmål för PKCa-beroende tumörsuppressoraktivitet in vitro och in vivo . Vi drar slutsatsen att PKCα undertrycker tumörinitiering och -progression, åtminstone delvis, genom en PKCα-p38MAPK-TGFp-signalaxel som reglerar tumörcellproliferation och Kras- inducerad senescens. Våra resultat ger det första direkta beviset på att PKCa uppvisar tumörsuppressoraktivitet i lungan in vivo .

Introduktion

Lungcancer är den ledande orsaken till cancerdöd i USA med uppskattningsvis 160 340 dödsfall årligen. 1 Icke-småcellig lungcancer (NSCLC), som står för ∼ 85% av diagnoserna i lungcancer, uppvisar en 5-årig överlevnad på endast 16%, 1 understryker vikten av att förstå både tumörfrämjande och tumörundertryckande signalvägar som driver NSCLC för att identifiera potentiella terapeutiska mål för bättre behandlingsstrategier.

Proteinkinas C (PKC) representerar en familj av tio strukturellt relaterade lipidberoende serin / treoninkinaser involverade i cellproliferation, differentiering och överlevnad. Identifieringen av PKC-enzymer som intracellulära receptorer för tumörfrämjande phorbolestrar 2, 3 gav en suggestiv orsakssamband mellan PKC: er och cellulär transformation. Förhållandet mellan specifika PKC-isozymer och cancer är emellertid komplex. 4 Enskilda PKC-isozymer uppvisar celltypspecifika uttrycksmönster och komplexa signalrespons genom olika subcellulära lokaliseringar, substratval och kofaktorkrav. Som ett resultat har nära besläktade PKC-isozymer ofta distinkta, ibland motsatta roller i cancer. 4 Exempelvis främjar PKC epsilon (PKCɛ) cellproliferation och överlevnad, 5 och överuttryck av PKCK ökar förankringsoberoende celltillväxt och tumörgenicitet hos NIH 3T3-celler. 6 Däremot främjar det nära besläktade isozymet, PKC delta (PKCδ) apoptos och hämmar NIH 3T3-celltillväxt. 6 De motsatta rollerna för PKC3 och PKCδ observeras också in vivo . Transgen överuttryck av PKC ^ i överhuden främjar karcinogen-inducerad tumörbildning, medan överuttryck av PKC 5 är skyddande. 7, 8

En liknande dikotomi av funktionen ses i de två atypiska PKC-isozymerna PKCι och PKCζ. 9, 10 Vi har visat att atypisk PKCι är en onkogen i NSCLC. 11 PKCι är överuttryckt i primära humana NSCLC-tumörer som ett resultat av återkommande tumörspecifik genamplifiering, och PKCι krävs för förankringsoberoende tillväxt och tumörgenes av humana NSCLC-celler in vivo . 11, 12 Dessutom krävs PKCι för initiering av Kras- medierad lungtumör i LSL-Kras- modellen. 13 PKCι har också en tumörfrämjande roll i kolon, 14 äggstocks, 15, 16 leukemi, 17, 18 bukspottkörteln 19, 20 och alveolär rabdomyosarkom 21 cancer. Med tanke på det direkta engagemanget av PKCι i tumorigenes utvecklade vi en ny terapeutisk behandling som selektivt riktar sig till onkogen PKCι-signalering, 9, 22, 23 som för närvarande utvärderas i kliniken. Däremot uppvisar det mycket besläktade atypiska PKC3-isozymet tumörsuppressoraktivitet i flera vävnader, inklusive äggstocken 24 och lungorna. 25

PKC-alfa (PKCa) är särskilt intressant eftersom den uppvisar både tumörfrämjande och tumörundertrycksaktivitet beroende på cellulärt sammanhang. I hepatocellulära karcinomceller minskar PKCa-knockdown celltillväxt, migration och invasion, vilket indikerar en tumörfrämjande roll. 26 Däremot inducerar aktivering av PKCa i LNCaP-prostatacancerceller ökad apoptos vilket antyder en tumörundertryckande aktivitet. 27 På samma sätt ökade genetisk deletion av PKCa-genen Prkca i APC min / + -möss tumörstorleken och minskade överlevnaden, vilket stödde en tumörundertryckande roll i tjocktarmen. 28 PKCa: s roll i lungcancer är osäker. Å ena sidan resulterar selektiv aktivering av PKCa i NSCLC-celler under S-fasen i cellulär senescens genom G2 / M-cellcykelstopp, 29 medan hämning av PKCa under G-fasen inte påverkar celltillväxt. 30 Därför kvarstår frågan fortfarande om PKCa är tumörfrämjande eller tumörundertryckande i lungan, och inga studier har bedömt rollen för PKCa i lungtumörigenesen in vivo . För att ta itu med denna fråga bedömer vi rollen för PKCa i tre oberoende transgena musmodeller av Kras- driven lungtumorigenes. Vi observerade en signifikant ökning i tumörantal, börda och grad som ett resultat av PKCa-förlust. Denna effekt återspeglas i förbättrad expansion av bronkioalveolära stamceller (BASC), tumörinitierande celler i dessa modeller, i frånvaro av PKCa. PKCa-medierad tumörsuppression involverar aktivering av en p38 MAPK-TGFp-signalaxel som inducerar cellulär tillväxtstopp in vitro och verkställer onkogeninducerad senescens (OIS) in vivo .

Resultat

PKCa-uttrycket minskar ofta i humana lungtumörer

Vi analyserade först PKCa-uttryck i humana NSCLC-genuttryckningsuppsättningar. NextBio-databasen avslöjade att PKCa är signifikant nedreglerat i adenokarcinom, skivepitelcancer och stora cellkarcinom, de tre huvudsakliga NSCLC-subtyperna (figur 1a). Intressant nog ökade PKCa-förlusten med tumörstadiet vilket tyder på en roll i tumörprogression. Immunohistokemi bekräftade förlust av PKCa i primära lungadenokarcinomceller jämfört med det omgivande stroma (figur 1b). Förlust av PKCa observerades också i lungadenom från LSL-Kras- möss (figur 1c). I LSL-Kras- tumörer var PKCa-förlusten större i vissa områden av tumören än andra. Dessa resultat överensstämmer med progressiv PKCa-förlust med avancerat tumörstadium eftersom LSL-Kras lungtumörer är adenom i tidigt stadium. Således uppstår PKCa-förlust i både primära humana NSCLC-tumörer och LSL-Kras- adenom.

Förlust av PKCa är en frekvent händelse vid icke-småcellig lungcancer. ( a ) Analys av offentligt tillgängliga datasätt för genuttryck med användning av NextBio avslöjade nedreglering av PKCa i de tre huvudformerna av NSCLC (lungadenokarcinom, skivepitelcancer och stora cellkarcinom), som är progressivt med avancerat tumörstadium. ( b ) Immunohistokemisk färgning för PKCa i humant lungadenokarcinom och intilliggande normal lung avslöjade förlust av PKCa-uttryck i tumörvävnad. Fotomikrografi är representativt för tre analyserade primära lungadenokarcinom. ( c ) Förlust av PKCa observeras i lungadenom hos LSL-Kras- möss. Fotomikrografi är representativt för tumörer från 15 tumörbärande LSL-Kras- möss. En lista över genuttryckningsuppsättningar analyserade i ( a ) kan hittas i material och metoder.

Bild i full storlek

PKCa hämmar Kras-beroende tumörinitiering

Därefter bedömde vi rollen för PKCa-förlust i Kras- medierad lungtumörigenes med användning av möss som innehöll konstitutiv radering av Prkca ( Prkca - / - möss). 59 Funktionell förlust av PKCa bekräftades genom kvantitativ PCR (figur 2a) och immunblotanalys (figur 2a, insättning) av lungvävnad från icke-transgena (Ntg), heterozygota Prkca +/− och homozygota Prkca - / - möss. Homozygota Prkca - / - möss korsades med LSL-Kras- möss för att generera bitransgena LSL-Kras / Prkca - / - möss. Onkogent Kras- uttryck och lungtumorigenes initierades genom intratrakeal instillation av rekombinant adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas såsom beskrivits tidigare. 31 LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisade en signifikant minskning av medianöverlevnad (196 dagar) jämfört med LSL-Kras- möss (251 dagar; P <0, 0001) (figur 2b). Minskad överlevnad korrelerade med en signifikant ökning i tumörantal, storlek och börda hos LSL-Kras / Prkca - / - möss (figur 2c). För att bedöma generaliteten av dessa resultat bedömde vi tumörbildning i Ntg- eller Prkca - / - -möss efter exponering för lungkarcinogen uretan (figur 2d) och i Kras LA2 / + -möss (figur 2e), där onkogena Kras är spontant aktiveras genom homolog rekombination. 32 I båda modellerna resulterade PKCa-brist i en signifikant ökning av tumörantal och börda. Lungetumorigenes var strikt beroende av karcinogen exponering och / eller onkogen Kras- aktivering eftersom inga tumörer observerades i Ntg eller Prkca - / - möss i frånvaro av tumörinitiatorer (data visas inte).

Genetisk förlust av PKCa stimulerar Kras- medierad lungtumörigenes. ( a ) Lungor från LSL-Kras , LSL-Kras / Prkca +/− och LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar progressiv förlust av PKCa mRNA. Data representerar de genomsnittliga mRNA-värdena från två möss i varje genotyp Insats: Immunoblot-analys av lungextrakt från dessa LSL-Kras , LSL-Kras / Prkca +/− och LSL-Kras / Prkca - / - möss som visar förlust av PKCa-proteinuttryck. Actin fungerade som en lastkontroll. ( b ) LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar minskad överlevnad jämfört med LSL-Kras efter tumörinduktion. * P <0, 001; N = 20 / genotyp. ( c ) Bruttopatologi för representativa lungor från LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss visar en förbättrad tumörgen fenotyp förknippad med PKCa-förlust. Kvantitativ analys av tumörantal, tumörstorlek och tumörbörda visar en statistiskt signifikant ökning av dessa parametrar i LSL-Kras / Prkca - / - möss jämfört med LSL-Kras- möss. * P <0, 001; N = 20 möss / genotyp. ( d ) PKCa-förlust stimulerar uretaninducerad lungtumörantal och börda; * P <0, 001; N = 20 i varje behandlingsgrupp. ( e ) PKCa-förlust stimulerar onkogent Kras LA2- inducerat lungtumörantal och börda. * P <0, 03; N = 15.

Bild i full storlek

Förlust av PKCa inducerar tumörprogression och bypass av OIS

Patologisk undersökning avslöjade en signifikant ökning av tumörprogression i LSL-Kras / Prkca - / - tumörer jämfört med LSL-Kras tumörer. LSL-Kras / Prkca - / - möss tumörer uppvisade kärnkraft trängsel, ökade mitotiska siffror, nukleär svullnad och mycket varierande kärnmorfologier (figur 3a, höger panel), alla egenskaper hos progression från adenom till karcinom i denna modell. 33 Däremot uppvisade de flesta LSL-Kras- tumörer inte dessa egenskaper och klassificerades som adenom (figur 3a, vänster panel). Kvantitativ analys avslöjade framsteg till karcinom hos alla LSL-Kras / Prkca - / - möss (14/14) men i endast 20% (3/15) LSL-Kras- möss ( P = 0.00001; Fishers exakta test). Hos LSL-Kras- möss undertrycks progression till karcinom på grund av OIS i närvaro av onkogena Kras . 34 OIS kännetecknas av utbrett uttryck av tumörundertryckande cellcykelinhibitor p16 Ink4A . 35 Som förväntat uppvisade LSL-Kras- tumörer utbredd OIS vilket framgår av positiv färgning för p16 och relativt låg Ki67-färgning (figur 3c). Intressant visade LSL-Kras- tumörer regioner som färgade positivt för både PKCa och p16, medan andra områden uttryckte låg PKCa- och p16-färgning. Däremot uppvisade LSL-Kras / Prkca - / - tumörer enhetligt lågt p16-uttryck och ökad Ki67-färgning i överensstämmelse med OIS-förbikoppling, ökad tumörtillväxt och tumörprogression (figur 3c).

PKCa-förlust leder till tumörprogression och bypass av OIS in vivo . ( a ) Histologisk analys av representativa tumörer från LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss som visar att tumörer från LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar karakteristiska egenskaper hos progression från adenom till karcinom, medan de flesta tumörer från LSL -Kras- möss klassificeras som adenom. Pil: stora svullna kärnor med avvikande kärnmorfologi; pilspetsar: kärnkraftsföring och onormal kromatinkondensation. Immunohistokemisk färgning av tumörer från LSL-Kras ( b ) och LSL-Kras / Prkca - / - ( c ) möss för PKCa, p16 och Ki67. LSL-Kras- tumörer uttrycker rikligt med p16 i områden av tumören där PKCa-uttryck bibehålls, medan tumörer från LSL-Kras / Prkca - / - möss uttrycker ingen PKCa, liten eller ingen p16 och ökade Ki67.

Bild i full storlek

Förlust av PKCa stimulerar Kras-medierad BASC-expansion

Eftersom PKCa hämmar initiering av Kras- drevna lungtumörer, antog vi att PKCa kan hämma expansion av BASC: er, antagande tumörinitierande celler i denna modell. 36 Därför kvantifierade vi BASC: er i de terminala bronkiolerna (TB) hos LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss in vivo som beskrivits tidigare. 13, 36 Som förväntat innehöll de flesta TB från Ntg-möss antingen inga BASC eller en enda BASC (figur 4a). Intressant visade Prkca - / - möss ingen förändring i BASC-nummer, vilket indikerar att PKCa inte är en viktig faktor som reglerar basala BASC-nummer. Däremot uppvisade både LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss en statistiskt signifikant ökning av BASC: er (mer TB visade två eller flera BASC: er) jämfört med Ntg-möss. Analys av BASC-mångfald visade att LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar en betydligt större utvidgning av BASC: er än LSL-Kras- möss (fler bronkioler med högre BASC-mångfald) (figur 4b). För att bedöma om denna skillnad beror på en direkt effekt av PKCa-förlust på BASC: er, bedömde vi tillväxten av isolerade BASC-kulturer ex vivo . BASC isolerade och renade från Ntg, Prkca - / - , LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss som beskrivits tidigare, 36 behandlades med adenoviral Cre för att inducera onkogena Kras och pläterades i tredimensionell Matrigelkultur såsom beskrivits tidigare . 13 Kvantitativ analys av BASC-kolonier odlade ex vivo under 7 dagar visar att förlust av PKCa hade liten effekt på BASC-kolonistorleken i frånvaro av Kras , medan onkogent Kras- uttryck resulterade i en signifikant ökning i BASC-kolonistorlek, vilket ytterligare förbättrades genom borttagning av PKCa (figur 4c). En liknande ökning i kolonistorlek observerades i BASC från LSL-Kras- möss behandlade med den selektiva PKCa / p-hämmaren Gö6976 (figur 4d), vilket indikerar att effekten av PKCa på den transformerade tillväxten av BASC: er är beroende av akut PKCa-kinasaktivitet. Således reglerar PKCa direkt BASC-tillväxt i närvaro av onkogena Kras .

PKCa-förlust leder till expansion av Kras- transformerade BASC in vivo och förbättrad BASC-tillväxt ex vivo . ( a ) Kvantitativ analys av BASC-nummer in vivo . TB värderades för BASC: er som beskrivits i material och metoder och resultat planerade som fraktionen av TB med antingen 0 eller 1 BASC: er eller 2 eller fler BASC: er. Både LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar en ökning av BASC-antal jämfört med Ntg eller Prkca - / - möss. * P <0, 05, ** P <0, 004. ( b ) BASC-multiplikationsanalys visar att LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar en signifikant större ökning av BASC-expansion än LSL-Kras-möss . P <0, 04. ( c ) Morfologi och kvantitativ analys av koloniediametern för BASC från Ntg, Prkca - / - , LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss som odlats i tredimensionell Matrigelkultur under 7 dagar. * P <0, 01 jämfört med Ntg; ** P <0, 0001 jämfört med LSL-Kras . ( d ) Effekt av den selektiva PKCa-hämmaren Go6976 på BASC-kolonitillväxt. BASC: er från Ntg och LSL-Kras- möss odlades i tredimensionskultur i Matrigel i närvaro av Go6976 (10 n M) eller utspädningsmedel (DMSO) under 7 dagar. Representativa mikrofotografier och kvantitativ analys av BASC-kolonistorlek visas. * P <0, 0001 jämfört med Ntg; ** P <0, 0001 jämfört med LSL-Kras behandlade med DMSO.

Bild i full storlek

p38 MAPK är en nedströms effektor av PKCa vid Kras-inducerad tumorigenes

p38 MAPK har en nyckelroll i onkogen Ras- inducerad senescens och p16 Ink4A- induktion. 37, 38 p38 MAPK fosforyleras och aktiveras nedströms PKCa och fungerar i tumörfrämjande och undertryckande effekter av PKCa. 26, 27 Dessutom är den förbättrade lungtumorigenesen som observerades i LSL-Kras / Prkca - / - möss lik den som ses i p38 MAPK-bristfälliga möss på LSL-Kras- bakgrunden. 39 Därför bedömde vi om p38 MAPK-aktivering moduleras av PKCa i BASC: er och LSL-Kras- inducerade lungtumörer. Immunoblot-analys avslöjade minskad fosfo-p38 MAPK i BASC från LSL-Kras / Prkca - / - möss jämfört med LSL-Kras- möss (figur 5a). Effekten av PKCa-förlust var selektiv för fosfo-p38 MAPK eftersom vi observerade liten eller ingen förändring i varken total p38 MAPK, eller total eller fosfo-Erk1 / 2 (figur 5a). Tillsats av den selektiva p38 MAPK-hämmaren SB203580 inducerade förbättrad tillväxt av BASC från LSL-Kras- möss, vilket resulterade i kolonier som är jämförbara med de från LSL-Kras / Prkca - / - möss medan de inte hade någon effekt på BASC från Ntg eller LSL-Kras / Prkca - / - möss (figur 5b). Vidare uppvisade LSL-Kras / Prkca - / - tumörer reducerad fosfor-p38 MAPK-färgning jämfört med LSL-Kras- tumörer, vilket indikerar att p38 MAPK-aktivitet regleras av PKCa in vivo (figur 5c). Således aktiveras p38 MAPK selektivt nedströms PKCa under LSL-Kras- inducerad lungtumorigenes, och är troligtvis involverad i PKCa-medierad hämning av tumörtillväxt och progression.

p38 MAPK är en nedströms effektor av PKCa i Kras- medierad BASC-expansion. ( a ) Immunoblot-analys av totala celllysat av BASC: er från LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss för fosfo-p38 MAPK, totalt p38 MAPK, fosfo-Erk 1, 2 och totalt Erk 1, 2. ( b ) Farmakologisk hämning av p38 MAPK efterliknar PKCa-förlust på BASC-kolonitillväxt. BASC: er från Ntg, LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss odlades i tredimensionell Matrigel-kultur i närvaro av utspädningsmedel (DMSO) eller den p38 MAPK-selektiva hämmaren SB203580 (1 μM). SB203580 stimulerar tillväxten av LSL-Kras BASC medan den inte har någon signifikant effekt på Ntg eller LSL-Kras / Prkca - / - BASC. * P <0, 001; ** P <0, 02; *** P <0, 003. ( c ) Immunohistokemisk färgning av tumörer och normal intilliggande lunga från LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - möss för fosfo-p38 MAPK. LSL-Kras / Prkca - / - tumörer uppvisar förlust av fosfor-p38 MAPK jämfört med LSL-Kras tumörer. Normalt lungepitel visar lågfosfor-p38 MAPK-färgning som inte påverkas av genotyp.

Bild i full storlek

TGFp1 förmedlar effekterna av PKCa-förlust på BASC-expansion

TGFp-vägen är normalt tumörundertryckande, men i närvaro av onkogena Ras kan bli pro-onkogena. 40 Intressant nog är TGFp1-uttryck förhöjda i p38 MAPK-bristande möss som uttrycker onkogena Kras , 39 vilket antyder att en PKCa-p38 MAPK-signalaxel kan reglera lungtumorigenes genom TGFp-signalering. I överensstämmelse med denna möjlighet demonstrerade kvantitativ PCR-analys en liten men signifikant ökning av TGFp1-mRNA-uttryck i LSL-Kras / Prkca - / - BASC jämfört med LSL-Kras BASC: er (Figur 6a) och tillsats av exogent TGFp1 ledde till en signifikant ökning i tillväxt av LSL-Kras BASC, medan de inte hade någon signifikant effekt på Ntg eller LSL-Kras / Prkca - / - BASC: er (figur 6b). Dessutom blockerade behandling med den selektiva TGFpR1-hämmaren SB431542 tillväxt av LSL-Kras / Prkca - / - BASCs medan den inte hade någon signifikant effekt på tillväxten av Ntg eller LSL-Kras BASC: er (figur 6c). Sammantaget visar dessa data att TGFp-signalering kan förmedla PKCa-reglerad transformerad tillväxt och indikerar att PKCa hämmar tillväxt av lungtumörceller, åtminstone delvis, genom att undertrycka TGFp-signalering.

TGFp1 är en kritisk förmedlare av de hämmande effekterna av PKCa på BASC-tillväxt. ( a ) TGFp1-uttryck induceras blygsamt men signifikant i LSL-Kras / Prkca - / - BASC: er jämfört med LSL-Kras BASC. N = 4; * P <0, 004. ( b ) TGFp1 efterliknar effekterna av PKCa-förlust på BASC-kolonitillväxt. Tillsats av exogent TGFp1 stimulerar tillväxten av LSL-Kras BASC-kolonier medan den inte har någon signifikant effekt på Ntg eller LSL-Kras / Prkca - / - BASC. * P <0, 001; ** P <0, 001. Alla andra jämförelser var inte signifikanta. ( c ) Den selektiva TGFp-receptorantagonisten SB431542 hämmar den förbättrade tillväxten av LSL-Kras / Prkca - / - BASCs medan den inte har någon signifikant effekt på tillväxten av Ntg eller LSL-Kras BASC. * P <0, 001 jämfört med Ntg DMSO; ** P <0, 001 jämfört med LSL-Kras DMSO; *** P <0, 001 jämfört med LSL-Kras / Prkca - / - DMSO. Alla andra jämförelser var inte signifikanta.

Bild i full storlek

PKCa reglerar expression av hämmare av DNA-bindande (Id) proteinfamilj

Våra resultat i LSL-Kras / Prkca - / - möss överensstämmer med tumörundertryckande effekten av PKCa i tjocktarmen. 41, 42 Vid koloncancer hämmar PKCa cellcykeln genom att negativt reglera uttryck av Id-familjen av proteiner, Id1-4. 41, 42 LSL-Kras / Prkca - / - BASC: er uttrycker betydligt mer Id1-3 men inte Id4 jämfört med LSL-Kras BASC: er (figur 7a). PKCa-beroende Id-genuttryck kräver p38 MAPK-aktivitet då Id1-3 mRNA ökas i LSL-Kras BASC: er behandlade med p38 MAPK-hämmaren SB203580 (figur 7b). Vidare minskade Id1-3-uttrycket signifikant i LSL-Kras / Prkca - / - BASC: er behandlade med TGFPR1-hämmaren SB431542 (figur 7c). Således undertrycker PKCa expression av Id-familjemedlemmar genom en p38 MAPK-TGFp1 signalväg, vilket antyder att Id-proteiner kan vara centrala spelare i den PKCa-medierade regleringen av lungtumörtillväxt.

PKCa-förlust inducerar p38 MAPK-, TGFp-beroende expression av hämmare av DNA-bindning 1, 2 och 3 (Id1-3). ( a ) PKCa-förlust leder till induktion av Id1, Id2 och Id3 mRNA. Kvantitativ PCR för Id1-4 i LSL-Kras och LSL-Kras / Prkca - / - BASC. N = 3; * P <0, 0001. ( b ) P38 MAPK-hämmaren SB203580 inducerar Id1-3-uttryck i LSL-Kras men inte LSL-Kras / Prkca - / - BASC. N = 3; * P <0, 01 jämfört med DMSO-kontroll. ( c ) TGFpR1-hämmaren SB431542 vänder Id1-3 mRNA-induktion i LSL-Kras / Prkca - / - BASC. N = 3; * P <0, 001 jämfört med DMSO-kontroll.

Bild i full storlek

Radering av PKCa inducerar Wilms tumör 1 (WT1) under Kras-inducerad lungtumorigenes

Våra data visar att förlust av PKCa leder till förbikoppling av OIS och tumörprogression (figur 3). Denna fenotyp liknar påfallande den som ses hos transgena möss som överuttrycker WT1-genen på LSL-Kras- bakgrunden. 43 LSL-Kras / Tg WT1- möss uppvisar förbättrad tumorigenes och tumörprogression som ett resultat av OIS-bypass. 43 WT1-mRNA förhöjdes i LSL-Kras / Prkca - / - BASC: er jämfört med LSL-Kras BASC: er (figur 8b). Dessutom avslöjade immunhistokemi att WT1 är förhöjd i LSL-Kras / Prkca - / - jämfört med LSL-Kras- tumörer (figur 8b) och behandling av LSL-Kras BASC med p38 MAPK-hämmare SB203580 ledde till induktion av WT1 (figur 8c) . Slutligen reducerades WT1-uttrycket i LSL-Kras / Prkca - / - BASC efter behandling med TGFpR-hämmaren SB431542 (figur 8d). Dessa data överensstämmer med en roll för WT1 i att underlätta OIS-förbikoppling nedströms PKCa-förlusten i lungtumorigenes.

PKCa-förlust inducerar p38 MAPK-TGFp-beroende uttryck av WT1. ( a ) WT1-mRNA induceras i LSL-Kras / Prkca - / - BASC jämfört med LSL-Kras BASC. N = 3; * P <0, 0001. ( b ) Immunohistokemisk färgning för WT1. WT1-protein är förhöjt i LSL-Kras / Prkca - / - tumörer jämfört med LSL-Kras tumörer. ( c ) P38 MAPK-hämmaren SB203580 inducerar företrädesvis WT1-uttryck i LSL-Kras BASC. N = 3; * P <0, 001 jämfört med LSL-Kras DMSO. ( d ) TGFpR1-hämmaren SB431542 hämmar företrädesvis WT1-uttryck i LSL-Kras / Prkca - / - BASC. N = 3; * P <0, 0001 jämfört med LSL-Kras / Prkca - / - DMSO.

Bild i full storlek

Diskussion

PKC-familjemedlemmar har varit inblandade i tumörfrämjande och undertryckande (för granskning se Fields och Murray 4 och Fields och Gustafson 44 ) Det finns motstridiga rapporter om PKC: s roll i allmänhet, och PKCa specifikt, i tumörgenes och progression. Dessa olika resultat kan bero på skillnader i cell- och tumörtypsfunktion, resultat erhållna i cellinjer in vitro jämfört med transgena djurmodeller in vivo och specificiteten för reagens som används för att identifiera PKCa-funktion. Här demonstrerar vi att PKCa är en tumörsuppressor in vivo med användning av tre modeller av Kras- medierad lungcancer. Genetisk förlust av PKCa i murin lunga resulterar i förbättrad tumörtillväxt och progression till karcinom efter aktivering av onkogena Kras . Dessa resultat överensstämmer med den progressiva förlusten av PKCa i primära humana NSCLC-tumörer med framskridande tumörstadium. Eftersom PKC: er är kapabla att fosforylera Kras, vilket leder till dess associering med mitokondriell BCL-XL och induktion av cellulär apoptos, 45 kommer det att vara av intresse att bedöma om en sådan mekanism också bidrar till tumörsuppressoreffekter som observeras här. Medan våra studier fokuserade på Kras- medierad lungadenokarcinom, indikerar humana genuttrycksdata att PKCa ofta går förlorat i andra huvudformer av NSCLC, inklusive lungpitelös cellkarcinom, som inte innehåller ofta Kras- mutationer. Likaså har PKCa en tumörundertryckande roll i APC min intestinal tumörgenes, 28 vilket indikerar att tumörundertryckande roll för PKCa sträcker sig utöver Kras- drevna tumörer. Huruvida signalmekanismerna som är involverade i PKCa-medierad tumörsuppression skiljer sig beroende på onkogena förare är ett viktigt område för framtida undersökning.

Förutom en roll i tumörprogression avslöjar våra djurstudier en ytterligare, oväntad roll för PKCa vid tumörstart. LSL-Kras / Prkca - / - möss uppvisar förbättrad expansion av tumörinitierande BASC: er, en effekt som verkar bero, åtminstone delvis, på en direkt effekt av PKCa-förlust på tillväxten av Kras- transformerade BASC. Eftersom Prkca - / - möss har konstitutiv, organismbredd förlust av PKCa, kan vi inte utesluta ett ytterligare bidrag av PKCa uttryckt i tumörassocierat stroma och immunceller i tumörundertryckning in vivo . En sådan analys kommer att kräva mer komplexa djurmodeller, i vilka PKCa-uttryck kan kontrolleras på ett vävnads- och tidspecifikt sätt.

Mekaniskt indikerar våra uppgifter att PKCa har en nyckelroll för att upprätthålla OIS in vivo . LSL-Kras / Prkca - / - tumörer uppvisar reducerat p16 Ink4A- uttryck, en ökning av Ki67-färgning och progression till adenokarcinom, i överensstämmelse med OIS-bypass. Intressant sett observerade vi regionalt samuttryck av PKCa och p16 Ink4A i LSL-Kras- tumörer, vilket tyder på att PKCa-förlust under Kras- medierad tumörgen kan representera en inneboende mekanism genom vilken dessa tumörer övervinner OIS. Våra resultat med PKCa-förlust liknar en slående likhet med de som observerats med genetisk förlust av p38 MAPK, 39 vilket tyder på en funktionell koppling mellan dessa gener. I själva verket avslöjar våra mekanistiska studier att p38 MAPK är en nyckelmekanisator för PKCa nedströms som reglerar tumörinitiering, åtminstone delvis, genom kontroll av Kras- medierad transformation av tumörinitierande BASC. Våra data överensstämmer med publicerade rapporter som visar en nyckelroll för p38 MAPK i OIS 37, 38 och ger den första demonstrationen att en PKCa-p38 MAPK signalaxel har en roll i OIS i Kras- medierad lungtumorigenes in vivo . Dessa resultat överensstämmer också med upptäckten att PKCa kan reglera senescens i lungcancercellinjer in vitro . 29

Våra resultat ger övertygande bevis för en PKCa-p38 MAPK-TGFp-signalaxel som driver tumörundertryckande effekter av PKCa. Intressant nog resulterade genetisk förlust av PKCa i Kras- transformerade BASC: er i en liten men mycket reproducerbar ökning av TGFp1-uttrycket. Denna effekt, även om den är blygsam, är funktionellt relevant eftersom exogen TGFp1 kan härma PKCa-förlust, och hämning av TGFp-signalering vänder effekten av PKCa-förlust på BASC-tillväxt. Därför är undertryckning av TGFp-signalering en nyckelmekanism genom vilken PKCa hämmar initiering och progression av lungcancer. Med tanke på den blygsamma förändringen i TGFp1-mRNA-överflöd, reglerar PKCa sannolikt också andra aspekter av TGFp-signalering i lungan. I detta avseende underlättar PKCa internalisering av TGFpR från cellytan i podocyter, 46 och PKCa inducerar expression av både TGFp1 och TGFpR1 i vaskulära glatta muskelceller. 47 Våra data tyder på involvering av TGFβR1 i TGFβ-signaleringaktivering medierad av PKCa-förlust, eftersom behandling med den selektiva TGFβR1 / ALK5-hämmaren SB431542 hämmar den förbättrade tillväxten av LSL-Kras / Prkca - / - BASC.

TGFp, som PKCa, kan antingen vara tumörfrämjande eller tumörundertryckande beroende på cellulärt sammanhang. Id-familjen av gener regleras negativt av PKCa i koloncancer 41, 42 där PKCa-förlust resulterar i ökat uttryck av Id1-4, vilket i sin tur reglerar cyklin D1 och cellcykelprogression. 41 I överensstämmelse med dessa fynd visar vi att PKCa negativt reglerar Id1-3 i BASC. Effekten av PKCa på Id-uttryck kräver den nya PKCa-p38 MAPK-TGFp1 signalaxeln som kännetecknas i denna rapport. Vi antar att PKCa fungerar som en tumörsuppressor i lungan, åtminstone delvis genom hämning av expression av Id-gener, som i sin tur medierar PKCa-inducerad hämning av BASC och lungtumörtillväxt.

Effekten av PKCa-förlust på Kras- inducerad lungtumorigenes påminner om fenotypen som observerats i WT1-överuttryckande möss i närvaro av onkogena Kras . 43 Medan WT1-överuttryckande möss uppvisar förbättrad Kras- driven tumorigenes uppvisar möss som saknar WT1 förbättrad OIS. 43 PKCa-förlust leder till ökat WT1-uttryck genom en p38 MAPK-TGFp-beroende väg, i överensstämmelse med upptäckten att WT1-uttryck regleras av TGFp-signalering. 48 Våra data antyder att WT1 är ett relevant nedströmsmål som är involverat i att förmedla OIS-förbikoppling i LSL-Kras / Prkca - / - möss. Analys av genuttryckningsuppsättningar avslöjade ett signifikant omvänt samband mellan PKCa och både WT1- och Id1-uttryck i primära humana NSCLC-tumörer ( P <0, 02 för Id1; P <0, 0002 för WT1), vilket indikerar relevansen av tumör PKCa-förlust vid induktion av WT1 och Id1-uttryck i primär human NSCLC.

Slutligen har våra resultat viktiga konsekvenser för terapeutiska interventionsstrategier riktade mot PKCa. Den första isozym-selektiva PKC-hämmaren för att komma in i klinisk användning var en 20-basig antisense-oligonukleotid riktad till PKCa (LY900003 / Aprinocarsen). Aprinocarsen inhiberade PKCa-uttryck och uppvisade anti-tumöraktivitet i naken musxenograftmodeller. 49, 50 Emellertid observerades ingen klinisk fördel i kliniska fas II-studier av Aprinocarsen som ett enda medel vid äggstockscancer 51 eller högklassig gliom. 52 På samma sätt misslyckades en stor fas III-klinisk studie av Aprinocarsen i kombination med gemcitabin och cisplatin i avancerad NSCLC inte visa någon överlevnadsfördel eller skillnad i respons. 53 Trots att uppmuntra prekliniska data har PKCα därför inte varit ett framgångsrikt mål för cancerbehandling. Vår nuvarande studie, och andra citerade häri, indikerar att PKCa undertrycker snarare främjar tumörgenes i tjocktarmen och lungan, vilket ifrågasätter skälen för PKCa-hämmare vid cancerterapi, åtminstone i dessa tumörtyper.

anslutningar

Genuttryck Omnibus

  • GSE18842
  • GSE19188
  • GSE1987
  • GSE2109
  • GSE27556
  • GSE3398