Proinflammatorisk tlr-signalering regleras av en traf2-beroende proteolysmekanism i makrofager | naturkommunikation

Proinflammatorisk tlr-signalering regleras av en traf2-beroende proteolysmekanism i makrofager | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Inflammation
  • Monocyter och makrofager
  • Signaltransduktion
  • Avgiftsliknande receptorer

Abstrakt

Signalöverföring från avgiftsliknande receptorer (TLR) är viktigt för medfödd immunitet mot infektioner, men avreglerad TLR-signalering bidrar till inflammatoriska störningar. Här visar vi att myeloida cellspecifik ablation av TRAF2 i hög grad främjar TLR-stimulerad proinflammatorisk cytokinuttryck i makrofager och förvärrar kolit i en djurmodell av inflammatorisk tarmsjukdom. TRAF2-brist ökar inte uppströms signalhändelser, men den orsakar ansamling av två transkriptionsfaktorer, c-Rel och IRF5, känd för att mediera proinflammatorisk cytokininduktion. Intressant nog kontrollerar TRAF2 ödet för c-Rel och IRF5 via en proteasomberoende mekanism som också kräver TRAF3 och E3 ubiquitin ligas cIAP. Vi visar vidare att TRAF2 också reglerar inflammatorisk cytokinproduktion i tumörassocierade makrofager och underlättar tumörtillväxt. Dessa fynd visar en oväntad antiinflammatorisk funktion av TRAF2 och antyder en proteasomberoende mekanism som begränsar den proinflammatoriska TLR-signaleringen.

Introduktion

Makrofager bildar en viktig typ av medfödda immunceller som förmedlar värdförsvar mot infektioner och inflammatoriska svar 1 . Vid aktivering producerar makrofager olika proinflammatoriska cytokiner och andra faktorer som reglerar inflammation och den tidiga fasen av ett immunsvar. Makrofagernas aktivering och funktion är beroende av medfödda immunreceptorer, särskilt mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som detekterar olika molekylära mönster associerade med de invaderande patogenerna 2 En huvudsaklig familj av PRR är de avgiftsliknande receptorerna (TLR), som fungerar på cellytan eller de intracellulära facken 3 . Stimulering av TLR: er med specifika ligander initierar kaskader av signalhändelser genom MyD88- och TRIF-beroende vägar, vilket leder till aktivering av tre huvudfamiljer av MAP-kinaser (MAPK), ERK, JNK och p38, liksom IKB-kinaset (IKK) ). MAPK: erna medierar aktivering av transkriptionsfaktorerna AP-1 och CEBP: er, och IKK deltar i aktivering av transkriptionsfaktorn NF-KB (ref. 2).

NF-kB-familjen av transkriptionsfaktorer spelar en avgörande roll i transaktiverande gener som kodar proinflammatoriska cytokiner 4, 5 . I synnerhet krävs NF-KB-medlemmet c-Rel specifikt för TLR-stimulerad expression av IL-12 och IL-23 (refs 6, 7, 8). Förutom de traditionella transkriptionsfaktorerna krävs interferon-responsiv faktor 5 (IRF5) för TLR-stimulerad proinflammatorisk cytokininduktion 9, 10 . IRF5 förmedlar induktion av multipla proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-6, IL-12, IL-23 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-a), och hämmar induktion av det antiinflammatoriska cytokinet IL-10 (ref 9 10). Både IRF5 och c-Rel har associerats med humana inflammatoriska sjukdomar 11, 12, 13, 14, men hur dessa proinflammatoriska mediatorer är negativt reglerade under makrofagdifferentiering och aktivering förblir okänd.

TNFR-associerade faktorer (TRAF) är viktiga mediatorer för medfödd immunreceptorsignalering 15 . TRAF6 är väsentlig för TLR-stimulerad aktivering av MAPK: er och IKK och induktion av proinflammatoriska cytokiner 16, men rollen för de andra TRAF-familjemedlemmarna i att reglera TLR-signalering är mindre tydlig. TRAF2 är känd som en adapter som är involverad i aktivering av MAPK: er och IKK av TNF-receptorer (TNFR), såsom TNFR1 och CD40 (refs 17, 18). TRAF2: s roll i regleringen av TLR-signalering i medfödda immunceller och inflammation har emellertid varit svårfångad. Noterbart är förhöjd expression av TRAF2, såväl som dess homolog TRAF3, associerad med mänsklig inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 19, 20, 21 . Högre TRAF2-uttryck är också en prediktor för återfall hos patienter med ulcerös kolit (UC) 20, även om hur TRAF2 reglerar koloninflammation är oklart. I den aktuella studien behandlade vi denna fråga genom att generera myeloida cellkonditionerade knockout-möss. Vi fann att myeloida cellspecifik ablation av TRAF2 i hög grad främjar TLR-stimulerad proinflammatorisk cytokinuttryck i makrofager och förvärrar kolit i en djurmodell av IBD. Vi erhöll genetiska och biokemiska bevis på att TRAF2 förmedlar proteasomberoende nedbrytning av de proinflammatoriska transkriptionsfaktorerna IRF5 och c-Rel i en mekanism som också kräver TRAF3 och E3 ubiquitin ligas cIAP (cIAP1 eller cIAP2). Vi visar vidare att TRAF2 reglerar makrofagpolarisering i tumörens mikromiljö och spelar en roll för att kontrollera tumörtillväxt. Dessa fynd avslöjar en oväntad antiinflammatorisk funktion av TRAF2 i makrofager och belyser en ny mekanism som begränsar den proinflammatoriska TLR-signaleringen.

Resultat

Myeloida cellspecifik TRAF2-ablation främjar kolit

TRAF2-överuttryck är associerat med humant IBD- och IBD-återfall, även om det har förblivit oklart om TRAF2 spelar en roll i medfödda immunceller för att främja eller hämma koloninflammation 19, 20, 21 . För att ta itu med denna fråga använde vi en allmänt använd djurmodell av IBD, dextrannatriumsulfat (DSS) -inducerad kolit 22 . Intressant nog var nivån av TRAF2 såväl som dess homolog TRAF3 väsentligt högre i kolonmakrofagerna, jämfört med nivån i spleniska och peritoneala makrofager (fig. La). Eftersom detta resultat sågs i både obehandlade och DSS-behandlade möss, kan den högre nivån av TRAF2 och TRAF3 bero på de homeostatiska förhållandena i tjocktarmen, där immunceller har en dynamisk interaktion med kommensala mikrober. För att undersöka TRAF2: s funktion vid reglering av koloninflammation genererade vi myeloida cellkonditionerade TRAF2-knockout ( Traf2- MKO) -möss genom att korsa Traf2- flussmössen med Lyz2- Cre-möss. Traf2- MKO-mössen visade inte märkbara förändringar i frekvensen av makrofager eller neutrofiler (kompletterande figur la).

Image

WT- och Traf2- MKO (T2-MKO) -möss behandlades med 3% ( a, c - h ) eller 3, 5% ( b ) DSS (i dricksvatten) under 6 dagar och levererades sedan med normalt dricksvatten. ( a ) IB-analys av TRAF2 och TRAF3 i den FACS-sorterade mjälten (SM), peritoneal (PM) och kolon (CM) -makrofager (CD11b + F4 / 80 + ) från naiv (H20 behandlad) och dag 8 DSS- behandlade WT-möss. ( b, c ) Överlevnadshastighet ( b ) och kroppsviktförlust ( c ) för DSS-behandlade Traf2- MKO- och WT-möss. ( d, e ) Kolonlängd ( d ) och H&E-histologfärgning ( e ) från dag 8 DSS-behandlade Traf2- MKO- och WT-möss. (Skalstång, 100 μm) ( f, g ) FACS-analys av de totala immuncellerna (CD45 + ) och de angivna delmängderna, presenterade som ett representativt diagram ( f ) och medelvärden ± sd-värden för flera möss ( n = 3 möss / genotyp) ( g ). ( h ) qRT-PCR-analys av de indikerade generna (presenterade som vikning relativt Actin mRNA-nivå) med användning av FACS-sorterade kolonmakrofager (CD11b + F4 / 80 + ) från dag 8 DSS-behandlade WT- och Traf2- MKO-möss. Data som visas är representativa för minst tre oberoende experiment. Felstegen representerar standardavvikelse (sd). Skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes med studentens t- test. För djuröverlevnadsanalys antogs Kaplan-Meier-metoden för att generera grafer, och överlevnadskurvorna analyserades med log-rank-analys. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Vi undersökte sedan den myeloida cellspecifika rollen för TRAF2 vid regleringen av koloninflammation med användning av den DSS-inducerade kolitmodellen. När de matades med dricksvatten innehållande 3, 5% DSS, så överlevde så högt som 70% av vildtypen (WT) mössen behandlingen upp till 16 dagar (fig. 1b). I skarp kontrast dog 100% av Traf2- MKO-mössen inom 14 dagar efter DSS-behandling (Fig. 1b). För att studera fenotyperna på koloninflammation behandlade vi mössen med en lägre dos av DSS för att förhindra tidig död. Jämfört med WT-mössen hade Traf2- MKO-mössen signifikant minskat kroppsvikt och förkortat kolon, typiska kännetecken för kolit (fig. 1c, d). Konsekvent avslöjade histologianalyser förvärrad inflammation i den distala kolon hos TRAF2-bristande möss, kännetecknad av förbättrad leukocytinfiltrering och allvarligare slemhinneskada (Fig. 1e). Flödescytometri upptäckte också ökad frekvens och antal koloninfiltrerande immunceller (CD45 + ) (fig. 1f, g). Även om de grindade CD45 + -cellerna från WT- och Traf2- MKO-möss inte skiljer sig väsentligt i frekvensen av myeloidcellsuppsättningar (fig. 1f) ökades frekvensen för dessa celler inom de totala koloncellerna betydligt i Traf2- MKO-kolon på grund av till den väsentliga förhöjningen i den totala populationen av de infiltrerande CD45 + -immuncellerna (Fig. 1 g, vänster panel). Det absoluta antalet makrofager och neutrofiler var också signifikant förhöjd i Traf2- MKO-kolon (fig. 1g, höger panel). Vidare avslöjade kvantitativa RT-PCR-analyser (qRT-PCR) i realtid förhöjd expression av ett antal proinflammatoriska cytokina gener i kolonmakrofagerna från Traf2- MKO-mössen (fig. 1h). Däremot orsakade förlusten av TRAF2 en måttlig minskning av uttrycket av den antiinflammatoriska cytokingenen IllO (Fig. 1h). Dessa resultat etablerar TRAF2 som en negativ regulator av kolit som fungerar i medfödda immunceller.

TRAF2 hämmar proinflammatorisk cytokininduktion

För att undersöka mekanismen genom vilken TRAF2 reglerar kolit, analyserade vi effekten av TRAF2-brist på geninduktion i makrofager med TLR4-liganden LPS. Det är anmärkningsvärt att de TRAF2-bristfälliga makrofagerna från benmärgen (BMDM) var hyperresponsiva mot LPS vid induktionen av ett antal proinflammatoriska cytokingener och iNOS-genen ( Nos2 ) (Fig. 2a). Omvänt försvagades TRAF2-bristen induktionen av den antiinflammatoriska cytokingenen Il10 . Liknande resultat erhölls med användning av peritoneala makrofager isolerade från Traf2- MKO- eller WT-kontrollmöss (fig. 2b). Det LPS-stimulerade avvikande uttrycket av proinflammatoriska cytokiner i Traf2- MKO-makrofager inträffade också på proteinnivån, vilket avslöjades av ELISA (fig. 2c).

Image

( a, b ) qRT-PCR-analys av de indikerade generna med användning av BMDM: er ( a ) eller peritoneala makrofager ( b ) härledda från WT- eller Traf2- MKO-möss vid 0, 2 och 6 timmar efter LPS-stimulering. Data presenteras i veck i förhållande till Actin mRNA-nivå. ( c ) ELISA av de indikerade cytokinerna i supernatanterna i WT och Traf2- MKO BMDM, som antingen inte behandlades (0) eller stimulerades med LPS under 24 timmar. Data presenteras som medelvärden ± sem-värden och är representativa för minst tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes med Student's t- test. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

För att undersöka om TRAF2 också reglerar geninduktion med andra immunstimulanser, stimulerade vi WT- och TRAF2-bristfälliga BMDM: er och peritoneala makrofager med TLR3-agonistpoly (I: C). Liksom LPS, stimulerade poly (I: C) hyperuttryck av flera proinflammatoriska cytokina gener och reducerade expression av Il10 i TRAF2-bristfälliga BMDM och peritoneala makrofager (kompletterande figur 1b, c). Liknande resultat erhölls också när makrofagerna stimulerades med IL-1p, vilket är känt för att inducera signalering via MyD88-vägen (kompletterande figur 1d). Sammantaget visade dessa resultat en oväntad antiinflammatorisk funktion av TRAF2 i TLR-vägen, vilket ger mekanistisk insikt i den colitreglerande rollen för TRAF2.

TRAF2s antiinflammatoriska funktion är oberoende av NIK

TRAF2 är känd som en negativ regulator för den icke-kanoniska NF-KB-banan 23, 24 . Faktum är att TRAF2-bristen i makrofager orsakade ackumulering av NIK och samtidig behandling av p100 för att generera p52 (fig. 3a). Som tidigare rapporterats 25 förbättrade NIK-ackumuleringen också några av de kanoniska NF-KB-signalhändelserna, inklusive fosforylering av NF-KB-hämmaren IBBa och det kanoniska NF-KB-elementet p65 vid serin 529 (Fig. 3a). Dessa signalhändelser var till stor del, även om de inte helt, beroende av NIK, eftersom de minskade i NIK-null genetisk bakgrund (Fig. 3a). Det är för närvarande oklart hur förlusten av TRAF2 orsakade den resterande basnivån fosforylering av IKBa och p65 i NIK-bristfällig bakgrund. Liknande resultat erhölls med Traf3- MKO-makrofager (data visas inte).

Image

( a ) IB-analys av de angivna fosforylerade (P-) och totala proteinerna i helcellslosaten av LPS-stimulerade BMDM härrörande från WT- eller Traf2- MKO (MKO) -möss korsade till NIK + / + eller NIK - / - bakgrund . ( b ) qRT-PCR-analys av de indikerade mRNA: erna i LPS-stimulerade BMDM: er härledda från WT- och Traf2- MKO-mössen korsade till NIK + / + eller NIK - / - bakgrund. MRNA-nivån beräknades som vikning relativt en intern kontroll, Actb . Data är medelvärde ± sem baserat på flera prover och representerar tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes av studentens t- test. * P <0, 05.

Bild i full storlek

För att undersöka den funktionella betydelsen av icke-kanonisk NF-KB aktivering vid induktion av proinflammatoriska cytokina gener, beredde vi BMDM från WT och Traf2- MKO möss, antingen i NIK + / + eller NIK - / - (NIK-KO) bakgrund. Som förväntat orsakade TRAF2-bristen i NIK + / + bakgrund hyper-induktion av flera proinflammatoriska cytokina gener och nedreglering av den antiinflammatoriska IllO- genen (Fig. 3b). Det är viktigt att en sådan abnormal geninduceringsfenotyp korrigerades inte vid ablering av NIK, med undantag av Il23a som delvis nedreglerades i NIK-null-bakgrunden (Fig. 3b). Dessa resultat antyder att den icke-kanoniska NF-KB-vägen inte spelar en viktig roll i regleringen av TLR-stimulerad proinflammatorisk geninduktion i makrofager.

TRAF2 förmedlar nedbrytning av c-Rel och IRF5

Induktion av proinflammatoriska cytokiner genom LPS involverar aktivering av MAP-kinas-kinas-kinas (MAP3K) TAK1 och dess nedströms IKK och MAPK: er (p38 och JNK). TRAF2-bristen främjade inte, utan ganska måttligt inhiberade, LPS-stimulerad aktivering av det typiska IKK-komplexet, vilket avslöjades genom en in vitro -kinasanalys (fig. 4a). Detta resultat var något överraskande, eftersom de TRAF2-bristfälliga makrofagerna hade högre basfosforylering av IBBa och p65 (fig. 3a). Även om exakt hur TRAF2-bristförstärkt basalnivå av fosforylering av IBB / p65 är oklart, verkade det som om detta åtminstone delvis medieras av NIK-vägen, eftersom dessa fosforyleringshändelser väsentligen, men inte helt, inhiberades på NIK-ablation (Fig. 3a) . Vi fann också att LPS-stimulerad aktivering av TAK1 och dess mål p38 och JNK var jämförbar mellan WT- och Traf2- MKO-makrofagerna (Fig. 4b).

Image

( a ) IKK-kinasanalys (KA) och IB-analyser med användning av helcellslysat av LPS-stimulerade BMDM: er härledda från WT- och Traf2- MKO-möss. ( b, c ) IB-analys av de indikerade fosforylerade (P-) och totala proteinerna i helcellslosat av WT och Traf2- MKO BMDM stimulerade med LPS. ( d ) Immunoblotanalys av de indikerade proteinerna i cytoplasmatiska (CE) och nukleära (NE) extrakt av WT och Traf2- MKO BMDM antingen inte behandlade (0) eller stimuleras med LPS under 3 timmar. ( e ) ChIP-analys av c-Rel och IRF5 vid promotorn för de indikerade generna med användning av WT eller Traf2- MKO BMDM som antingen inte behandlades (0) eller stimulerades under 3 timmar med LPS. Data presenteras i veck i förhållande till det totala inmatade DNA och representerar tre eller flera oberoende experiment. * P <0, 05. ( f ) IRF5 och c-Rel isolerades genom IP (under denatureringsbetingelser) från helcellslosat av DMSO eller MG132-behandlade WT och Traf2- MKO BMDM och utsattes för IB-analyser med användning av anti-ubiquitin (toppaneler) eller anti- K48-länkade antikroppar från ubiquitin (mellanpaneler). Proteinlysat utsattes också för direkt IB (bottenpaneler). Data är representativa för minst tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes av studentens t- test. * P <0, 05.

Bild i full storlek

Vi analyserade nästa nedströms transkriptionsfaktorer kända för att medla den proinflammatoriska TLR-signaleringen. Intressant nog hade de TRAF2-bristfälliga makrofagerna en markant förhöjd stabil nivå av c-Rel och IRF5 (fig. 4c), två huvudsakliga transkriptionsfaktorer som medierade proinflammatorisk cytokininduktion 6, 7, 8, 9, 10 . TRAF2-bristen påverkade inte expressionsnivån för flera andra transkriptionsfaktorer, inklusive p65 och C / EBPp (Fig. 4c). Konsekvent var kärnnivån för c-Rel och IRF5, men inte C / EBPp, drastiskt högre i de LPS-stimulerade TRAF2-bristmakrofagerna än i de LPS-stimulerade WT-makrofagerna (Fig. 4d). Vi fann att kärnnivån för p65 också var högre i TRAF2-bristfälliga makrofager, men detta berodde uppenbarligen på dess förbättrade kärntranslokation eftersom den cytoplasmiska nivån för p65 inte var högre i dessa mutanta celler (fig. 4d). Detta fynd stämde överens med den förbättrade p65-fosforyleringen delvis på grund av avvikande aktivering av NIK (fig. 3a). För att undersöka den funktionella betydelsen av hyperaktivering av c-Rel / IRF5 analyserade vi deras bindning till promotorerna av målgener. Som förväntat avslöjade ChIP-analyser bindning av c-Rel till KB-förstärkningsregionen för två väldefinierade c-Rel-målgener, Il12a och Il12b , vid LPS-stimulering (Fig. 4e). Dessutom förbättrades denna DNA-bindande aktivitet hos c-Rel signifikant i de TRAF2-bristfälliga makrofagerna (fig. 4e). En ny studie tyder på att IRF5 och kanonisk NF-kB kooperativt reglerar många proinflammatoriska gener, inklusive Illb och Il6 , genom att binda till promotorregioner som innehåller KB-förstärkaren 26 . Konsekvent hittade vi att IRF5 band till kB-regionen för Ill- och Il6- generna i LPS-stimulerade makrofager, vilket kraftigt förbättrades av TRAF2-bristen (fig. 4e). Således reglerar TRAF2 ödet och funktionen för två viktiga proinflammatoriska transkriptionsfaktorer i makrofager.

En tidigare studie antyder att IRF5-expression induceras av M-CSF tillsammans med makrofagdifferentiering 27 . Vi undersökte således om TRAF2 reglerade uttrycket av IRF5 tillsammans med M-CSF-inducerad makrofagdifferentiering. Vi fann att nivån för både IRF5 och c-Rel var extremt låg i benmärgsceller (Kompletterande Fig. 2a). I överensstämmelse med den tidigare studien var M-CSF-inducerad makrofag-differentiering associerad med uppreglering av IRF5 (kompletterande fig. 2a). Intressant nog inducerades c-Rel också med makrofag-differentieringen (kompletterande figur 2a). Dessutom förbättrade TRAF2-bristen uttrycket av c-Rel och IRF-5 vid proteinnivån (kompletterande fig. 2a) men inte den för mRNA (kompletterande fig. 2b), vilket antyder en post-translationell mekanism för reglering. Vid inkubering av makrofager med en proteasominhibit, MG132, återställdes faktiskt nivån av c-Rel och IRF5 i Traf2-MKO- cellerna till en nivå liknande den för WT-cellerna (fig. 4f). TRAF2-brist dämpade kraftigt den totala och K48-länkade ubikvitineringen av c-Rel och IRF5 (fig. 4f). Dessa resultat antyder att c-Rel och IRF5 aktivt genomgår ubiquitinberoende nedbrytning i en TRAF2-beroende mekanism. Nedbrytningen av c-Rel och IRF5 tycktes inträffa i cytoplasma, eftersom de ackumulerades i cytoplasma vid inkubering av celler med proteasominhibitorn MG132 (kompletterande fig. 2c). Dessutom ackumulerades c-Rel och IRF5 också i cytoplasma av TRAF2-bristfälliga makrofager och flyttades till kärnan endast med LPS-stimulering (fig. 4d).

TRAF3 reglerar också negativt c-Rel och IRF5

Den TRAF2-medierade c-Rel / IRF5-nedbrytningen är anmärkningsvärt lik nedbrytningen av NIK 28, 29 . Eftersom den TRAF2-medierade NIK-nedbrytningen också kräver TRAF3, frågade vi om TRAF3 också kan ha en roll i att förmedla nedbrytning av c-Rel och IRF5 i makrofager. Vi beredde BMDM från benmärgen hos TRAF3 fl / fl Cre ER eller kontrollera TRAF3 + / + Cre ER- möss och inducerade TRAF3-ablering in vitro genom att odla cellerna i närvaro av Cre ER- inducerande tamoxifen. Liksom TRAF2-bristfälliga makrofager visade de TRAF3-bristfälliga makrofager inte uppenbara förändringar i LPS-stimulerad aktivering av p38 eller JNK (kompletterande figur 3). Intressant nog resulterade TRAF3-ablationen i markant ansamling av c-Rel och IRF5 i BMDM (fig. 5a). TRAF3-bristen förbättrade också nivån på c-Rel och IRF5 tillsammans med M-CSF-inducerad makrofagdifferentiering (fig. 5b). Konsekvent visade de TRAF3-bristfälliga makrofagerna hyper-induktion av flera proinflammatoriska cytokina gener och hämmade induktionen av Il10- genen av både LPS och poly (I: C) (fig. 5c och kompletterande fig. 4b).

Image

( a ) IB-analys av de indikerade proteinerna i helcellslosat av LPS-stimulerade Traf3 fl / fl Cre ER eller kontroll Traf3 + / + Cre ER BMDM-differentierade i närvaro av Cre-inducerande tamoxifen. ( b ) IB-analys med användning av hela celllysat av M-CSF-behandlade benmärgsceller från tamoxifen-injicerade Traf3 fl / fl Cre ER eller kontroll Traf3 + / + Cre ER- möss. ( c ) qRT-PCR-analys av de indikerade mRNA: erna i LPS- eller poly (I: C) -stimulerad Traf3 + / + Cre ER och Traf3 fl / fl Cre ER BMDM: er differentierade i närvaro av Cre-inducerande tamoxifen. ( d - h ) Traf3- MKO och WT-kontrollmöss utmanades med 3, 5% ( d ) eller 3% (EH) DSS (i dricksvatten) under 6 dagar. Mössen övervakades med avseende på överlevnad ( d ) och beräkning av viktminskning ( e ) eller dödades på dag 8 för H&E-histologianalys (skala, 100 μm) ( f ), kolonlängdmätning ( g ) eller flödescytometri-analys av kolonmakrofager ( h ). Data är representativa för minst tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes av studentens t- test. För djuröverlevnadsanalys antogs Kaplan-Meier-metoden för att generera grafer, och överlevnadskurvorna analyserades med log-rank-analys. * P <0, 05.

Bild i full storlek

Precis som TRAF2, är TRAF3 uppreglerad i kolonmakrofager (fig. 1a) och TRAF3-uppreglering har associerats med human IBD 21 . För att undersöka TRAF3: s roll i reglering av koloninflammation genererade vi myeloida cellkonditionerade TRAF3-knockout ( Traf3- MKO) -möss för att avbryta dess funktion i medfödd immunmiljö. Traf3- MKO-mössen hade en normal frekvens av makrofager och en något högre frekvens av neutrofiler i benmärgen (kompletterande figur 4a). Intressant nog, som Traf2- MKO-möss, hade Traf3- MKO-mössen förvärrat koloninflammation i den DSS-inducerade kolitmodellen, vilket visades genom minskad överlevnad, försämrad kroppsviktförlust, samt mer allvarliga slemhinneskador och kolonförkortning (Fig. 5d-g). Dessutom uttryckte kolonmakrofager från de DSS-behandlade TRAF3-bristande mössen signifikant högre nivå av proinflammatoriska cytokiner än den för WT-kontrollmöss (fig. 5h). Såsom TRAF2 medierar TRAF3 således nedbrytning av c-Rel och IRF5 och fungerar som en antiinflammatorisk faktor i medfödda immunceller.

cIAP är involverat i nedbrytning av IRF5 och c-Rel

Nya studier tyder på att TRAF2 och TRAF3 associerar sig med E3 ubiquitin ligas cIAP1 eller cIAP2 för att bilda ett komplex som förmedlar ubiquitinering och nedbrytning av NIK 23, 28, 29 . Man tror allmänt att TRAF3 och TRAF2 binder till respektive NIK och cIAP och rekryterar NIK till cIAP genom TRAF2-TRAF3-dimerisering 28, 29 . Således stör genetiska brister i antingen TRAF2 eller TRAF3 cIAP / NIK-föreningen och NIK-ubikitinering. Hittills har det varit okänt om detta E3 ubiquitin-ligaskomplex också förmedlar ubikvitering och nedbrytning av ytterligare substratproteiner. Vårt konstaterande att ablation av antingen TRAF2 eller TRAF3 i makrofager blockerar ubiquitinering och nedbrytning av c-Rel och IRF5 väckte frågan om cIAP är involverat i den ubiquitinberoende nedbrytningen av dessa transkriptionsfaktorer. Vi testade denna möjlighet med hjälp av en specifik cIAP-hämmare, Smac mimetic (SM). Intressant nog ledde inkubering av WT-makrofagerna med SM verkligen till ackumulering av både c-Rel och IRF5, men hade ingen effekt på TRAF2 eller TRAF3 (Fig. 6a). Dessutom hade SM liten eller ingen effekt på proteinnivån för c-Rel och IRF5 i TRAF2-bristfälliga makrofager. Liknande resultat erhölls med TRAF3-bristfälliga makrofager (data visas inte).

Image

( a ) IB-analys av de indikerade proteinerna i helcellslosaten av WT och Traf2- MKO BMDM, behandlade under 12 timmar med en Smac-efterliknande (SM) -förening eller lösningsmedelskontroll DMSO (DM). ( b, c ) BMDM: er från WT- och Traf2- MKO-möss ( b ) eller tamoxifen-behandlade TRAF3 + / + Cre ER och TRAF3 fl / fl Cre ER- möss ( c ) förbehandlades med MG132. Helcellslysat utsattes för IP med användning av antikroppar för IRF5 eller c-Rel eller en kontrollkanin IgG (Ig), följt av detektering av den utfällda IRF5, c-Rel och deras tillhörande cIAP2 med IB. Celllysat utsattes också för direkta IB: er (bottenpaneler). ( d ) qRT-PCR-analys av de indikerade mRNA: erna i WT och Traf2- MKO BMDM, förbehandlade i 12 timmar med en Smac-efterlikning (SM) eller DMSO och stimulerades sedan med LPS. Data är medelvärde ± sem av tre replikatprover och representerande för tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes av studentens t- test. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi den fysiska föreningen av cIAP med c-Rel eller IRF5. Vi inkuberade makrofagerna med MG132 för att motsvara nivån på IRF5 och c-Rel i WT och TRAF2, 3-bristfälliga makrofager. Intressant nog detekterade co-immunoprecipitation (co-IP) analyser den fysiska föreningen av cIAP2 med IRF5 och c-Rel i WT-cellerna, men dessa molekylära interaktioner detekterades inte i TRAF2- och TRAF3-bristmakrofagerna (Fig. 6b, c). Dessa resultat, tillsammans med de som beskrivits ovan, antydde att cIAP kan rikta in sig på IRF5 och c-Rel på ett TRAF2- och TRAF3-beroende sätt. För att ytterligare utvärdera denna möjlighet utförde vi co-IP-analyser för att undersöka om TRAF2 eller TRAF3 fysiskt kunde interagera med IRF5 och c-Rel. När uttryckt i HEK293-celler interagerade TRAF3, men inte TRAF2, starkt med IRF5 och c-Rel (kompletterande figur 5). Intressant är dock att samuttryck av TRAF2 och TRAF3 tillät TRAF2 att interagera med c-Rel och IRF5, vilket antydde att TRAF3 kan tjäna som det primära interagerande proteinet av c-Rel och IRF5 och rekrytera dessa proteiner till TRAF2 (kompletterande fig. 5) .

För att undersöka funktionellt engagemang av cIAP i proinflammatorisk cytokininduktion behandlade vi WT- och TRAF2-bristfälliga BMDM: er med SM, vilket är känt för att inducera nedbrytning av cIAP1 och cIAP2 (ref. 30). SM-förbehandlingen främjade LPS-stimulerad expression av ett antal proinflammatoriska cytokiner och undertryckte IlIO- induktion i WT BMDM, men SM hade ingen effekt på geninduktion i TRAF2-bristfälliga BMDM (fig. 6d). Detta konstaterande överensstämde med kravet från TRAF2 för associering av cIAP med c-Rel och IRF5, vilket antydde ytterligare involvering av TRAF3-TRAF2-cIAP E3 ubiquitin ligas i kontrollen av proinflammatorisk TLR-signalering i makrofager.

TRAF2-bristande makrofager reglerar tumörtillväxt in vivo

Makrofager är en av huvudpopulationerna av tumörinfiltrerande immunceller och spelar viktiga roller i tumörtillväxt och metastas 31 . Beroende på deras polarisationsfenotyper kan makrofager ha anti- eller pro-tumörfunktioner. Klassiskt aktiverade (M1) makrofager producerar inflammatoriska cytokiner och kväveoxid (NO) som främjar antitumörimmunrespons genom att öka antigenpresentationskapaciteten och inducera Th1-immuniteten 32, 33, medan alternativt aktiverade (M2) eller M2-liknande makrofager producerar IL- 10 och undertrycker tumörimmunitet och stimulerar tumörprogression 34 . Eftersom TRAF2 undertrycker proinflammatorisk cytokininduktion i makrofager, antog vi att TRAF2 kan spela en roll i att reglera tumörfrämjande funktion hos tumörassocierade makrofager (TAM). Vi undersökte denna hypotes genom att använda en murin melanomodell som involverade inokulering av B16 melanomceller i WT- eller Traf2- MKO-möss. Medan B16-tumörerna växte kraftigt i WT-mössen bildades väsentligt mindre tumörer i Traf2- MKO-mössen (fig. 7a, b). Traf2- MKO-mössen hade också högre överlevnadshastighet än WT-mössen (Fig. 7c). Konsekvent hade de B16- cellutmanade Traf2- MKO-mössen ökad frekvens av tumörinfiltrerande immunceller (CD45 + ) -celler (fig. 7d). Bland CD45 + -cellerna som infiltrerade i tumörerna hos Traf2- MKO-möss var det en avsevärd ökning av frekvensen och antalet CD4 + och CD8 + effektor T-celler, medan frekvensen och antalet makrofager (CD11b + F4 / 80 + ) och myeloid-härledda suppressorceller (MDSC, CD11b + Gr-1 + ) reducerades antingen eller ändrades inte (fig. 7d, e och kompletterande fig. 6). CD4 + och CD8 + T-cellerna härledda från Traf2-MKO- mustumörer innehöll mycket högre frekvens av IFNy + effektorceller än de härledda från WT-mustumörerna (fig. 7f, g). Dessa resultat gav förklaring till den starkare tumöravstötningsförmågan hos Traf2- MKO-mössen.

Image

WT eller Traf2- MKO injicerades med 2 x 105 ( a, b och d - h ) eller 5 x 105 ( c ) B16 melanomceller. ( a - c ) Tumörtillväxtkurva ( a ), en representativ bild av tumörer dag 18 ( b ) och överlevnadskurva ( c ). ( d ) Flödescytometrisk analys av immunceller (CD45 + ) infiltrerade till dag 18-tumörer och frekvensen av CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, makrofager (CD11b + F4 / 80 + ) och myeloid-härledda suppressorceller (MDSC) (CD11b + Gr-1 + ) inom CD45 + -cellpopulationen. ( e ) Sammanfattning av flödescytometri-data för d baserat på flera djur och visar frekvensen för de indikerade cellpopulationerna inom totala tumörceller. ( f, g ) ICS och flödescytometrisk analys av IFNy + CD4 + och CD8 + T-celler, presenterade som ett representativt diagram ( f ) och en sammanfattande graf baserad på flera djur med tumörer dag 18 ( g ). ( h ) qRT-PCR-analys av de indikerade mRNA: erna i TAM härrörande från tumörer från dag 18 av WT- eller Traf2- MKO (MKO) -möss. Data är medelvärde ± sem-värde för flera djur (varje cirkel eller kvadrat representerar en mus) och representerar tre oberoende experiment. Felstegen representerar sd, och skillnader mellan experimentella och kontrollgrupper bestämdes av studentens t- test. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

För att ytterligare undersöka mekanismen genom vilken TRAF2 reglerar tumörimmunitet, analyserade vi cytokinproduktion i TAM. TAM: erna isolerade från tumörer av Traf2- MKO-möss uttryckte högre nivåer av proinflammatoriska cytokina gener och Nos2 och lägre nivåer av IllO (Fig. 7h). Dessa data överensstämmer med de erhållna med in vitro- makrofagaktiveringsexperiment (fig. 2) och antyder att förlust av TRAF2 kan främja M1-liknande antitumörfunktion hos makrofager. Således, förutom att reglera kolit, spelar TRAF2 sålunda en roll i makrofagfunktion i tumormikromiljö.

Diskussion

Uppgifterna som presenterades i detta dokument visade en oväntad mekanism som begränsade den proinflammatoriska axeln för TLR-signalering i makrofager, som involverade proteasomal nedbrytning av två huvudsakliga proinflammatoriska transkriptionsfaktorer, c-Rel och IRF5. Denna mekanism förlitade sig på två TRAF-medlemmar, TRAF2 och TRAF3, som tycktes fungera i samarbete med E3 ubiquitin ligas cIAP för att inducera ubiquitination av c-Rel och IRF5. Således stabiliserade myeloid cellspecifik ablation av antingen TRAF2 eller TRAF3 c-Rel och IRF5 och drastiskt deras stabila expressionsnivå, vilket gör makrofager hyperresponsiva för TLR-ligander och IL-1p vid induktion av proinflammatoriska cytokiner. Dessa fynd ger ett nytt exempel för hur ubiquitin-proteasome systemet reglerar TLR-signalering och makrofagfunktion.

TRAF2 är känd som en adaptermolekyl som förmedlar signalering från TNFR-familjemedlemmar, såsom TNFR1 och CD40. Trots de omfattande in vitro- studierna av TRAF2 har dess in vivo- roll i regleringen av medfödd immunitet och inflammation dåligt förståts, delvis på grund av den postnatala dödligheten hos de konventionella Traf2- KO-mössen 35 . Speciellt hur TRAF2 fungerar i myeloida celler för att reglera TLR-signalering och inflammation har inte undersökts med in vivo- modeller. Intressant nog har uppreglerat uttryck av TRAF2, liksom dess homolog TRAF3, associerats med human IBD 19, 20, 21 . Vi upptäckte också en betydligt högre nivå av TRAF2 och TRAF3 i kolonmakrofager, jämfört med mjälten och peritoneala makrofager, hos kolitinducerade möss. Våra data avslöjade att TRAF2, såväl som TRAF3, negativt reglerade inflammation i DSS-inducerad kolit, vilket således antyder att dessa faktorer är involverade i en mekanism för negativ återkoppling som begränsar inflammation. En tidigare studie antyder att TRAF2 förhindrar spontan kolit genom att förmedla överlevnaden av kolonepitelceller 36 . Medan denna funktion överensstämmer med den positiva rollen för TRAF2 i att förmedla TNF-receptorinducerade överlevnadssignaler i epitelceller, visade vår nuvarande studie en ny antiinflammatorisk funktion av TRAF2 som involverar negativ reglering av TLR-signalering i myeloida celler. Förutom att reglera inflammation hade TRAF2 en roll i att modulera tumörimmunitet. Myeloid cellspecifik deletion av TRAF2 ökade kraftigt frekvensen av tumörinfiltrerande T-celler, särskilt CD8 T-celler, och främjade tumöravstötning. TRAF2-bristfälliga TAM producerade förhöjda nivåer av proinflammatoriska cytokiner och iNOS, vilket tyder på en M1-liknande fenotyp som är känd för att främja antitumör T-cell-svar 34 .

I TNFR-vägarna tjänar TRAF2 som en positiv signalmedlare för aktivering av IKK och JNK och deras nedströms transkriptionsfaktorer, NF-KB och AP1, respektive 37, 38 . Vi fann att TRAF2-brist i makrofager inte hade någon effekt på LPS-stimulerad JNK-aktivering och endast delvis hämmade IKK-aktivering. Intressant nog, trots den måttligt försvagade IKK-aktiveringen, var TRAF2-bristfälliga makrofager högkänsliga för LPS för proinflammatorisk cytokininduktion. Våra data antyder att TRAF2 negativt reglerar den proinflammatoriska axeln för TLR-signalering genom att förmedla nedbrytning av c-Rel och IRF5, viktiga transkriptionsfaktorer för proinflammatorisk cytokingen induktion. I överensstämmelse med tidigare rapporter 39, 40, 41 fann vi att TRAF3 också negativt reglerade LPS-stimulerad proinflammatorisk cytokinproduktion. Det har föreslagits att TRAF3 kan hämma aktiveringen av JNK och p38 genom att reglera den cytoplasmiska translokationen av MyD88-signalkomplexet 15 . TRAF3-knockout eller knockdown höjer emellertid inte väsentligt LPS-stimulerad fosforylering av JNK eller p38 (refs 39, 40, 41). Med användning av BMDM härrörande från både Traf3- MKO och de inducerbara Traf3 fl / fl Cre ER- mössen, visade vi vidare att TRAF3-brist inte hade någon större effekt på p38 / JNK-aktivering. Dessutom var TRAF3: s roll i TLR-reglering inte begränsad till MyD88-vägen, eftersom TRAF3-brist också främjade proinflammatorisk geninduktion genom den TRIF-beroende TLR-ligandpoly (I: C). Våra data antyder att TRAF3, liksom TRAF2, fungerar för att medla nedbrytning av c-Rel och IRF5.

TRAF2 och TRAF3 är kända för att bilda ett komplex med E3 ubiquitin ligas cIAP (cIAP1 eller cIAP2) som förmedlar nedbrytning av NIK 28, 29 . Hittills har man tänkt att detta E3-komplex specifikt förmedlar nedbrytning av NIK. Vår nuvarande studie avslöjade att alla tre komponenterna i detta E3-komplex krävdes för c-Rel / IRF5-nedbrytning i makrofager, vilket tyder på att TRAF3-TRAF2-cIAP-komplexet också kan fungera som en E3 av c-Rel och IRF5 (kompletterande fig. 7 ). Våra resultat överensstämmer med de senaste rapporterna att cIAP-antagonisten SM har proinflammatoriska åtgärder i myeloida celler och makrofager 42, 43 . Vi visade vidare att SM kraftigt främjade LPS-stimulerat uttryck av proinflammatoriska cytokiner i BMDM. Våra resultat kastar nytt ljus på SM: s proinflammatoriska och immunostimulerande roller in vivo .

Våra data antydde att den avreglerade NIK-aktiveringen i TRAF2-bristande makrofager bara spelade en mindre roll i att förmedla hyper-induktion av proinflammatoriska cytokiner av LPS, vilket ytterligare betonade rollen för IRF5 och c-Rel i denna proinflammatoriska åtgärd. Emellertid orsakade den avreglerade NIK-aktiveringen viss nivå av aktivering av den kanoniska NF-kB-signaleringen, vilket föreslogs av den förbättrade fosforyleringen och kärntranslokationen av p65. Vår senaste studie visar att den NIK-inducerade icke-kanoniska NF-kB-vägen negativt reglerar induktionen av typ I-interferoner 44 . Därför är det troligt att TRAF3-TRAF2-cIAP-komplexet kan reglera både NIK-beroende och IRF5 / c-Rel-beroende signalhändelser involverade i induktion av proinflammatoriska cytokiner och typ I-interferoner (kompletterande fig. 7).

metoder

Möss

Traf2- fllox- och Traf3- flussmöss tillhandahölls av Dr Robert Brink (Garvan Institute of Medical Research) 45 . Dessa möss korsades med lysozym 2-Cre ( Lyz2- Cre) möss (Jackson Lab) 46 för att producera åldersmatchade Traf2 fl / fl lyz2 Cre / + (benämnd Traf2- MKO) och Traf2 fl / fl - lyz 2 + / + (benämnd WT) möss eller Traf3 fl / fl lyz2 Cre / + (benämnd Traf3 -MKO) och Traf3 fl / fl - lyz2 + / + (benämnd WT) möss. NIK-KO-mössen tillhandahölls av Amgen 47 . I vissa experiment korsades Traf2- MKO-möss vidare med NIK-KO-möss för att generera dubbel-KO-möss. The NIK-KO mice had a 129SvEv background, and all other mouse strains had a B6;129 mixed background. The mice were maintained in specific pathogen-free facility of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, and all animal experiments were conducted in accordance with protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.

Antikroppar och reagens

Antibodies for RelB (C-19, 1:1, 000), Lamin B (C-20, 1:1, 000), NIK (H248, 1:1, 000), TRAF2 (C-20, 1:1, 000), TRAF3 (H-122, 1:1, 000), cIAP2 (H85, 1:1, 000), ERK (K-23, 1:5, 000), phospho-ERK (E-4, 1:3, 000), JNK1 (C-17, 1:1, 000), p38 (H-147, 1:1, 000), phospho-p65 (Ser529, 1:1, 000), IKKα (H744, 1:1, 000), IKKβ (H-4, 1:1, 000), IKKγ (FL-419, 1:1, 000), ubiquitin (P4D1, 1:1, 000) and c-Rel (sc71, 1:3, 000), as well as a control rabbit IgG (sc-2027, 1:1, 000), were from Santa Cruz Biotechnology. Antibodies for phosho-TAK1 (Thr187, 1:1, 000), phospho-IκBα (Ser32, 1:1, 000), phospho-JNK (Thr180/Tyr185, 1:1, 000), phospho-p38 (Thr180/Tyr182, 1:1, 000) and IRF5 (4950S, 1:1, 000) were purchased from Cell Signaling Technology. Anti-Actin (C-4, 1:10, 000) was from Sigma, and anti-TAK1 (1:1, 000) was provided by Dr Jun Ninomiya-Tsuji (North Carolina State University). Antibody for p100/p52 (TB4, 1:8, 000) was from National Cancer Institute Preclinical Repository. Other antibodies were described previously 48 . Fluorescence-labelled antibodies are listed in the section of flow cytometry and cell sorting.

LPS (derived from Escherichia coli strain 0127:B8) and CpG (2216) were from Sigma-Aldrich. Poly (I:C) was from Amersham, dextran sulfate sodium salt (DSS) was from MP Biomedicals, and recombinant murine M-CSF and IL-1β were from Peprotech. Smac mimic was kindly provided by Dr Xiaodong Wang (National Institute of Biological Sciences, Beijing).

Flow cytometry, cell sorting and intracellular cytokine staining (ICS)

Single-cell suspensions of colon tissue, B16 melanoma, or bone marrow were subjected to flow cytometry using FACSAria (BD Bioscience) and the following.fluorescence-labelled antibodies from eBioscience: PB-conjugated anti-IFNγ, anti-CD4 and anti-CD11c; PE-conjugated anti-F4/80 and anti-CD45; PerCP5.5-conjugated anti-Gr-1 (Ly6G) and anti-CD45; APC-conjugated anti-CD11b; and APC-CY7-conjugated anti-CD8. The macrophages in colon tissue and B16 melanoma were stained with APC-conjugated anti-CD11b and PE-conjugated anti-F4/80 and sorted by flow cytometry using FACSAriaII (BD Bioscience). For ICS, the tumour-infiltrating T cells were stimulated for 4 h with PMA plus ionomycin in the presence of monensin and then subjected to intracellular IFN-γ staining and flow cytometry.

ELISA and Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

Supernatants of in vitro cell cultures were analysed by ELISA using a commercial assay system (eBioScience). For qRT-PCR, total RNA was isolated using TRI reagent (Molecular Research Center) and subjected to cDNA synthesis using RNase H-reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo (dT) primers. qRT-PCR was performed in triplicates, using iCycler Sequence Detection System (Bio-Rad) and iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad). The expression of individual genes was calculated by a standard curve method and normalized to the expression of Actb . The gene-specific PCR primers (all for mouse genes) are shown in Supplementary Table 1.

Immunoblot (IB), IP and kinase assays

Whole-cell lysates or subcellular extracts were prepared and subjected to IB and IP assays as described 49 . The samples were resolved by 8.25% SDS–PAGE. After electrophoresis, separated proteins were transferred onto polyvinylidene difluoride membrane (Millipore). For IB assays, the polyvinylidene difluoride membrane was blocked with 5% non-fat milk. After incubation with a specific primary antibody, horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody was applied. The positive immune reactive signal was detected by ECL (Amersham Biosciences). For kinase assays, the IKK complex was isolated from WT and Traf2 -MKO BMDMs by IP (using anti-IKKγ) and subjected to IKK kinase assay (KA) using GST-IκBα (1–54) (1 μg) as a substrate as previously described 50 . Full-size images are presented in Supplementary Figs 8–11.

Ubiquitination assays

Cells were pretreated with MG132 for 2 h and then lysed with a Nonidet P-40 lysis buffer (50 mM Tris–HCl, pH7.5, 120 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) containing 6 M urea and protease inhibitors. c-Rel and IRF5 were isolated by IP with antibodies for c-Rel (sc-71) and IRF5 (4950S), respectively, and the ubiquitinated c-Rel or IRF5 was detected by IB using an anti-ubiquitin (P4D1). For transfection models, expression vectors encoding c-Rel or HA-IRF5 was transfected into HEK293 cells along with HA-ubiquitin and other indicated vectors. The cells were pretreated with MG132 for 2 h and then lysed for IP followed by detecting ubiquitination by IB using anti-ubiquitin.

Kromatinimmunutfällningsanalyser (ChIP)

BMDMs (6 × 10 7 ) were stimulated for 3 h with LPS, fixed in 1% formaldehyde and then sonicated as previously described 51 . Lysates (from 2 × 10 7 cells in 3 ml) were subjected to IP with the indicated antibodies, and the precipitated DNA was then purified by Qiaquick columns (Qiagen) and quantified by QPCR using primers listed in Supplementary Table 1 to amplify NF-κB-binding region of the different gene promoters. The precipitated DNA is presented as percentage of the total input DNA ( y -axis).

DSS-induced colitis

For lethality analysis, mice were supplied with 3.5% DSS in drinking water (MP Biomedicals) for 6 days and replaced with normal drinking water for the rest of experimental time. The treated mice were monitored every other day, and moribund mice were killed based on protocols approved by the IACUC of the University of Texas MD Anderson Cancer Center. For inflammation studies, mice were treated with a lower dose (3%) of DSS to prevent early lethality. Body weight was measured every other day for up to 8 days, and the mice were then killed for measuring colon length, histology analysis and immune cell isolation from the mucosa.

For isolating colon macrophages, the colon was cut and digested with 0.25 mg ml −1 collagenase A (Sigma-Aldrich) and 25 U ml −1 DNase (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) for 20 min at 37 °C. Cells were harvested by passing the suspension through a cell strainer (BD Biosciences, San Diego, CA), followed by centrifugation. Colonic macrophages were isolated from colonic cells by FACS sorting using CD11b and F4/80 markers (double positive). Inflammation cytokine gene expression was analysed by qRT-PCR.

Macrophage preparation and stimulation

BMDMs were prepared essentially as previously described 48 . In brief, bone marrows were isolated from the femurs of young adult mice and cultured for 5 days in a DMEM medium supplemented with M-CSF conditional medium. For inducible ablation of TRAF3 in BMDMs, the bone marrows of Traf3 +/+ Cre ER or Traf3 fl/fl Cre ER mice were differentiated in the M-CSF medium in the presence of tamoxifen (1 μg ml −1 ). For inducible ablation of TRAF3 in bone marrow cells, the Traf3 +/+ Cre ER and Traf3 fl/fl Cre ER mice were injected ip with tamoxifen (5 mg per mouse) every other day for three times and killed after 7 days for bone marrow cell preparation. For peritoneal macrophage isolation, WT and Traf2 -MKO mice were killed, and the peritoneal cavity was lavaged with 8 ml of RPMI 1640 medium. The medium recovered from three mice was pooled, and cells were collected by centrifugation and plated onto 12-well plates in a density of 1 × 10 6 cells ml −1 . Macrophages were allowed to adhere for 2 h (37 °C, 5% CO2), washed with fresh medium to remove unattached cells and incubated overnight.

BMDMs and peritoneal macrophages were starved overnight in medium supplemented with 0.5% FCS before being stimulated with LPS (1 μg ml −1 for IB experiments and 100 ng ml −1 for cytokine induction experiments), poly(I:C) (20 μg ml −1 ), CpG (2216, 5 μM) and murine recombinant IL-1β (20 ng ml −1 ). Total and subcellular extracts were prepared for IB assays, and total RNA was prepared for qRT-PCR assays. The B16-infiltrating macrophages were isolated by FACS sorting with CD11b and F4/80 marker (double positive) and used for qRT-PCR and IB assays.

B16 model of melanoma

WT and Traf2 -MKO mice were injected sc with 5 × 10 5 B16 melanoma cells. The injected mice were monitored for tumour growth every other day, and lethality was defined when mice had a tumour size reaching 225 mm 2 based on protocols approved by the IACUC of University of Texas MD Anderson Cancer Center. For analyses of tumour growth rate and tumour-infiltrating immune cells, a lower number (2 × 10 5 ) of B16 cells were injected to prevent lethality during the course of the experiment. To minimize individual variations, littermate WT and Traf2 -MKO mice were used. Mice were randomly selected for tumour injection, and analysis of tumour size was done in a blinded manner. To analyse tumour-infiltrating immune cells, tumour tissues were treated with 0.25 mg ml −1 collagenase A (Sigma-Aldrich) and 25 U ml −1 DNase (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) for 20 min at 37 °C, and the cells were passed through a plastic mesh. The resulting dissociated cells were collected by centrifugation, resuspended in Red Blood Cell Lysis Buffer for 3 min and washed twice in PBS. The cells were subjected to flow cytometry analysis, and TAMs were isolated by cell sorting based on CD11b + F4/80 + surface markers.

Statistisk analys

Prism software was used for two-tailed unpaired t -tests. P values<0.05 and 0.01 are considered significant and very significant, respectively.

Ytterligare information

How to cite this article : Jin, J. et al . Proinflammatory TLR signalling is regulated by a TRAF2-dependent proteolysis mechanism in macrophages. Nat. Commun. 6:5930 doi: 10.1038/ncomms6930 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-11 and Supplementary Table 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.