Prelimbisk signalering av bdnf och trkb reglerar konsolidering av både aptitligt och aversivt emotionellt lärande | translationell psykiatri

Prelimbisk signalering av bdnf och trkb reglerar konsolidering av både aptitligt och aversivt emotionellt lärande | translationell psykiatri

Anonim

ämnen

  • Cell signalering
  • Känsla
  • Lärande och minne
  • Prefrontal cortex

Abstrakt

Det mediala prefrontala cortex (mPFC) är känt för att reglera verkställande beslut och uttryck för känslomässiga minnen. Mer specifikt är den prelimbiska cortex (PL) för mPFC implicerad för att driva emotionella svar via nedströmsmål inklusive nucleus accumbens och amygdala, men mekanismer är ännu inte att förstå. Därför undersökte vi huruvida prelimbisk kortikal hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) som signalerar genom den höga affiniteten tyrosinkinasreceptor B (TrkB) -receptorn kan fungera som en molekylär mekanism som ligger bakom emotionellt minne kodande. Här använde vi viral-medierad inducerbar bdnf- borttagning i PL, liksom TrkB F616A- mutanta möss, varvid TrkB-receptorpunktmutation resulterar i att den är mycket känslig för hämning av små PP1-derivatmolekyler, och tjänar som en specifik TrkB-hämmare. Den platsspecifika TrkB-antagonismen och viral-medierad bdnf- borttagning inom PL resulterade i underskott i både kokainberoende associerande lärande och rädslauttryck. Brister räddades av den nya TrkB-agonisten 7, 8-dihydroxyflavon, vilket indikerar att PL BDNF-uttryck och nedströms signalering genom TrkB-receptorn krävs för minnesbildning på både aptitliga och aversiva domäner.

Introduktion

Bildandet av aversivt och aptitvärderade minnen är avgörande för normalt beteende. Sådana minnen kan dock bli skadliga för hälsan om de utvecklas till okontrollerad rädsla, ångest eller belöningssökande. Den mediala prefrontala cortex (mPFC) är starkt inblandad i både aversiv och aptitlig inlärning. 1 Av särskilt intresse är den prelimbiska kortikala subregionen (PL), som skickar robusta utskjutningar till den basolaterala kärnan i amygdala och nucleus accumbens, 2 som ger tydlig anslutning till rädsla och belöningsvägar. Ett fastare grepp om PL: s neurobiologi är avgörande för att förstå mekanismerna för normalt lärande och utvecklingen av rädsla och ångeststörningar som post-traumatisk stressstörning, liksom drogberoende och co-morbiditeter.

Aktivering av PL krävs för uttryck av tidigare lärt rädsla. 1 Dessutom genomgår PL-neuroner plasticitet efter rädsla-konditionering under den presumtiva konsolideringsperioden. 3, 4, 5 Omvänt minskar PL-inaktivering frysbeteendet hos rädsla-konditionerade råttor, 6 vilket antyder att PL är nödvändigt för uttrycket av tidigare lärt rädsla. De molekylära mekanismerna som reglerar rädslauttryck, konsolidering och utrotning är dock fortfarande olösta.

En lovande mekanism är hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) och dess högaffinitetsreceptor tyrosinkinasreceptor B (TrkB). Betydande bevis tyder på att BDNF har en viktig roll i att reglera aptitligt och aversivt lärande, 7, 8 särskilt i den prefrontala cortex. 9, 10, 11 Det återstår emellertid mer att avgöra om BDNF- och TrkB-signaleringens roll i PL, särskilt med avseende på känslomässigt minne. Här belyser vi en molekylär mekanism som involverar BDNF-signalering genom TrkB i PL, som reglerar uttrycket av både aptitliga och aversiva emotionella minnen, vilket ger övertygande bevis på att BDNF är en "masterregulator" av emotionellt minne i denna prefrontala kortikala region.

Material och metoder

djur

Villkorliga mutantmöss

Lentivirus-experiment använde homozygota bdnf- flussade möss (ursprungligen erhållna från Jackson Labs, Bdnf tm3Jae / J (B6 / 129S4 / BALB / C bakgrund) och uppfödda inom vår djurfacilitet). Dessa möss uttrycker loxP-platser både uppströms och nedströms från exon 5 av BDNF- genen. 12 TrkB F616A- mutanta möss (129J / C57Bl / 6 hybridbakgrund): TrkB KI-mössen har en enpunktsmutation i ATP-bindande ficka i kinasunddomän V i TrkB-receptor, vilket resulterar i känslighet för hämning av litet PP1-derivat molekyler inklusive 1-NM-PP1. 13

Alla experiment utfördes med vuxna (2-4 månader gamla) hanmöss, som grupperades i ett temperaturkontrollerat vivarium, med ad libitum tillgång till mat och vatten. De bibehölls under en 12 timmars ljus / mörk cykel, med alla beteendemetoder som utfördes under ljuscykeln. Alla förfaranden som användes godkändes av Institutory Animal Care and Use Committee vid Emory University och i överensstämmelse med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur.

Farmakologiska läkemedel

TrkB F616A- mutanta möss implanterades ensidigt med ledningskanyler riktade mot PL (interna kanylspetskoordinater från Bregma: AP +2.0, ML ± 0.4, DV −2.0) ( n = 12 per grupp) med användning av stereotaxisk operation under ketamin (75 mg / kg ) / sovsal (1 mg / kg) anestesi. TrkB KI-möss infunderades bilateralt med 0, 1 nmol 1-NM-PP1 (TrkB-hämmare) (0, 2 mM i 4% dimetylsulfoxid, 2% Tween-20) eller vehikel under 1 minut omedelbart efter rädsla. 7, 8-dihydroxflavon (7, 8-DHF) doserades systemiskt intraperitonealt (ip) vid en 5 mg / kg dos i 17% dimetylsulfoxid i fosfatbuffrad saltlösning som tidigare beskrivits. 10, 14, 15 Injektionsvolymen var 1 ml / 100 g.

Cre-rekombinas lentivirusinfektion

Cre-rekombinasuttrycksvektor (LV-Cre) eller ett greenfluorescerande protein (GFP) -uttryckande kontrollvektor (LV-GFP), delta8.9 och VSV-g samtransfekterades i HEK293T-producentceller för att producera replikationsinkompetenta men mycket infektiva virus. Det förpackade viruset koncentrerades genom ett antal ultracentrifugeringssteg såsom beskrivits tidigare 16, 17, 18 Virus titrerades för att nå minst 1 x 109 smittsamma partiklar per ml. Grönt fluorescerande proteinuttryckande kontrollvektor ( n = 12) eller cre-rekombinasuttrycksvektor ( n = 12) virus injicerades bilateralt med en 26-gauge Hamilton-spruta (förbelagd med 10 mg / ml bovint serumalbumin) på en mikroinjektionspump ( 0, 25 ul / 15 min) in i PL (koordinater från Bregma: AP +2, 0, ML ± 0, 3, DV −2, 0) av homozygota flytande BDNF-möss med stereotaxisk kirurgi under ketamin (75 mg / kg) / sovsal (1 mg / kg) anestesi. Lentivirala infektioner bekräftades genom GFP-fluorescens och hybridisering in situ för Cre-rekombinas och BDNF-mRNA (se nedan). Möss där infektionsspridningen lokaliserades bilateralt, i PL, och med begränsad till ingen spridning i angränsande kortikala subregioner inkluderades i denna studie ( n = 7 per grupp).

Cue-beroende rädsla

Alla möss utsattes för tre gånger i förrådskamrarna (San Diego Instruments, San Diego, CA, USA) under 10 minuters vana, 3 dagar före träning (14 dagar efter operationer för lentivirusinfekterade möss). Under cued fear training, fick möss fem parade konditionerade stimulanston (30 s, 6 kHz, 90 db) eller (30 s, 12 kHz, 80 db) som avslutades med obekonditionerade stimulanschock (500 ms, 1, 0 mA) försök med en 5 min inter-testintervall i startboxarna. Upprörande svar på chockerna och procent av tiden för att frysa till tonerna mättes med SR-LAB-programvara (San Diego Instruments).

Cued skräck uttrycktest

Uttrycket av rädselminne testades 24 timmar efter rädsla-konditionering i ett nytt sammanhang (förändring av golv med mattor / sandpapper, lampor mot ljus av och / eller fyrkantiga mot cirkulära väggar) (modulära testkamrar; MedAssociates, St Albans, VT, USA). Möss exponerades för 15 konditionerade stimulanstoner med 1, 5-minuters intervall mellan försöken och frysning under tonpresentationerna mättes med FreezeView-programvaran (Coulbourn Instruments, Allentown, PA, USA).

Rädsla utrotningstest och retentionstester

Utrotningsträning inträffade 24 timmar efter konditionering, och utrotningsretentionstest inträffade 24 timmar efter utrotningsträning på liknande sätt i de modulära testkamrarna förutom att mössen utsattes för 30 konditionerade stimulanstoner med ett 30-sekunders intervall för varje testsamling.

Kokainkonditionerade platspreferenser

Apparater med konditionerat ställe (CPP), (MedAssociates) bestod vardera av två konditioneringskamrar (svart med stånggolv och vitt med nätgolv) anslutna med en central kammare med vertikala skjutbara manuella dörrar. De kammarjusterbara ljusnivåerna var optimerade för balanserad preferens mellan svarta och vita konditioneringskamrar. Femton fotobjälkar spelade in tiden i varje fack. Mössen fick ett försträckningstest för individuell platspreferens genom att placera musen i det neutrala facket och möjliggöra 20 min fri tillgång till alla tre kamrarna. Dagen efter prövningen genomfördes CPP-träning under 3 dagar i följd, under vilken varje dag djur fick en kokainparad session (10 mg per kg kokain-hydroklorid ip (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) upplöst i saltlösning ) i den vita kammaren (minst föredragna kammaren under förprovning), och en saltlösning av parning av fordonsparametrar i den svarta kammaren (distribuerad och omväxlande i sessionerna 0900–1100 och 1400–1600 timmar) i 30 minuter. Dagen efter avslutad CPP-träning fick alla möss efterträningstest (identiskt med förtränningstestet), där djur fick fritt utforska alla tre kamrarna i 20 minuter. Kokainassocierade platspreferensdata beräknades som procent av tiden som använts för kokainparade kammare under den totala tiden som användes i de två konditioneringskamrarna.

Öppet fält, lokomotorisk känslighetstest

Det öppna fältet var en öppen låda (27, 9 cm × 27, 9 cm) gjord av plexiglas. Mössen placerades i apparaten för att utforska i 10 minuter och återvände sedan till hemburarna. Aktivitetsdata erhölls och analyserades med hjälp av Activity Software (Med Associates.).

Lokomotorisk känslighet för administrering av psykostimulant testades också med användning av liknande metoder. Möss placerades i kundanpassade Med-Associates-lokomotorkamrar utrustade med 16 fotstrålar, som bröts när djuret rörde sig genom buren. Möss invåndes ursprungligen i kammaren under 1 timme. Följande dag fick möss igen undersöka kammaren under 1 timme, varefter metylfenidat (5 mg / kg, ip, Sigma-Aldrich) injicerades. Dosen valdes för att matcha dosen kokain för effektivitet hos dopamintransportören. Amulering och upprepad avbrott av samma fotobalk, vilket tyder på stereotypi, övervakades under ytterligare en timme; fotstrålarna brutna efter injektion normaliserades till en förprovningens baslinje för att redovisa individuella skillnader mellan möss.

Vävnadsförberedelse

Möss dödades av halshövning, och hjärnorna samlades och snabbfrystes på torris och lagrades vid -80 ° C tills de sektionerades på en kryostat i sex parallella serier av hjärnsektioner på mikroskopglas (16 μM / sektion). Hjärnpartier lagrades vid -80 ° C tills de användes för hybridisering in situ .

Hybridisering in situ

Regionspecifikt Cre-genuttryck och bdnf- deletion bekräftades med hybridisering in situ . I korthet inkluderade förbehandling av vävnadsglas, fixering i 4% paraformaldehyd, proteinas K-matsmältning och acetylering, som vi tidigare gjort. 19 Sliderna hybridiserades med 35 S-UTP-märkta cRNA-riboprober, framställda från linjäriserade konstruktioner för antisens-sekvenser av BDNF (exon 5), med användning av T7 RNA-polymeras och Cre-rekombinas med SP6 RNA-polymeras vid 50 ° C över natt. Posthybridisering inkluderade RNase A-behandling, sträng SSC-tvätt och dehydrering. Slides exponerades för på Biomax MR autoradiografi-film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA, under 1 dag (Cre), under 14 dagar (BDNF). Utvecklade filmbilder skannades in i högupplösta bildfiler. Webbplats och spridning av virusinfektion lokaliserades av Cre mRNA eller med GFP. Möss med infektionsställen utanför prelimbic cortex avlägsnades från alla statistiska analyser.

Statistiska analyser

Rädsla förvärv, uttryck och utrotning data samt kokain preferens data analyserades genom tvåvägs analys av varians med upprepade åtgärder. Alla andra beteendestest analyserades genom envägsanalys av varians. Statistiskt signifikanta huvudeffekter eller interaktioner följdes av skillnader i test efter minsta kvadrater efter multipla jämförelser. Data presenteras som medelvärde ± sem, och statistisk signifikans sattes till P <0, 05. Tester för homogenitet av varians utfördes och vid behov användes kvadratrottransformationer. Detektering av utskott utfördes, och vid behov avlägsnades från analyser, och data återanalyserades efter tidigare borttagning och / eller transformation.

Resultat

Vi använde villkorade mutanta homozygota BDNF-floxade möss 12 och lentivirusuttryckande Cre-rekombinas för att slå ned bdnf bilateralt i PL (figur 1a – c). Två veckor efter operationen blev mössen rädslighetskonditionerade till fem försök med konditionerad stimulanston (30 s, 6 kHz, 90 db) som avslutades med okonditionerat stimulanschock (500 ms, 1, 0 mA) (figur 2a). Följande dag hade möss med platsspecifika borttagningar kraftigt försvagat uttrycket av inlärd rädsla för cue (F 1, 48 = 3, 79; P <0, 05) (figur 2b). Dessa möss var sedan rädd för utrotning utbildade tills det inte fanns några skillnader i frysning till köet. De omskolades därefter med en ny signal (12 kHz ton) (med särskilt inga skillnader i frysning under omskolning (data visas inte)), omedelbart följt av en systemisk infusion av en potent TrkB-agonist, 7, 8-DHF (5 mg / kg). 10, 15, 20 En dag efter omskolning till den nya cue följt av TrkB-agonist som administrerades under räddkonsolideringsperioden, uttryckte PL bdnf knockdown-möss nu rädsla på samma sätt som kontrollmöss, P > 0, 05 (figur 2c), vilket indikerar att körning av TrkB-signalering är tillräckligt för att rädda rädsla inlärningsunderskott hos bdnf knockdown-möss.

Representativa bilder av platsspecifik inducerbar PL- bdnf- knockdown. ( a ) Cre-rekombinas mRNA-expression på infektionsstället. ( b ) Selektiv deletion av bdnf mRNA i den intilliggande halvklotet. Observera att den infralimbiska cortex till stor del är skonad. ( c ) Representativ spridning av infektion i dessa experiment, med grått som indikerar den största spridningen och svart den minsta.

Bild i full storlek

Site-specifika PL bdnf knockdown försvagningar cued rädsla: Räddning av en TrkB agonist. ( a ) PL bdnf knockdown-möss har normalt förvärv av rädsla. ( b ) PL bdnf- knockdown-möss har minskat känsligheten för rädsla-konditioneringen, vilket indikeras av mindre frysning efter angivna rädsla-konditionering. ( c ) Systemisk TrkB-agonist 7, 8-DHF räddade rädselsassocierat lärande, eftersom det inte fanns några skillnader i frysning mellan grupper. * P <0, 05. "LV-Cre" avser knockdown-möss.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi om bdnf knockdown har sina beteendeeffekter via minskad signalering genom PL TrkB. Vi använde TrkB F616A- mutanta möss (TrkB KI), som har en enpunktsmutation, vilket resulterade i känslig hämning av små PP1-derivatmolekyler inklusive 1-NM-PP1. 13 TrkB KI-möss kanylerades, fick utbildad rädsla-konditionsträning och följde omedelbart infusion med TrkB-hämmaren 1-NM-PP1 (0, 1 nmol) eller vehikel inom PL (figur 3a). Endast TrkB KI-möss som erhöll 1-NM-PP1 hade försvagat frysning till köet ( F 1, 13 = 14, 03, P < 0, 05) (figur 3b). Efter utrotningsträning och omskolning till en ny ledning i frånvaro av hämmaren uttryckte samma möss rädsla lika bra, P > 0, 05 (figur 3c).

Platsspecifik PL TrkB-hämmare försvagar orsakade rädsla. ( a ) Representativa interna kanylplaceringar riktade till PL. ( b ) TrkB-hämmare (1-NM-PP1 i F616-möss) dämpade också konsolideringen av cued rädsla. ( c ) Att återgå till en ny ledning i frånvaro av hämmaren avslöjade inga skillnader mellan grupper. * P <0, 05. "LV-Cre" avser knockdown-möss.

Bild i full storlek

För att ta itu med PL BDNFs roll i aptitlärande lärande utbildade vi PL-specifika bdnf knockdown-möss i ett kokain-CPP-paradigm. Efter träning hade mössen med PL- bdnf- borttagningar försvagat preferensen för den kokainassocierade kammaren ( t (22) = 23, 90; P <0, 05) (figur 4a). Möss ombildades med användning av nya sammanhang, varvid 7, 8-DHF administrerades omedelbart efter träning. Precis som i aversiva domäner räddade TrkB-aktivering kokainassocierad platspreferens ( P > 0, 05) (figur 4b).

PL bdnf knockdown trubbig psykostimulantkänslighet. ( a ) Kokain-CPP minskas i knockdown-möss. ( b ) Administration av en TrkB-agonist räddar kokainberoende associerande lärande. ( c ) Lokomotorisk känslighet för metylfenidat avstängdes också i bdnf- knockdown-möss, så att både ambulerande och stereotypliknande antal minskades. * P <0, 05. "LV-Cre" avser knockdown-möss.

Bild i full storlek

I det relativt begränsade utrymmet för CPP-kamrarna såg vi inga skillnader i lokomotorisk aktivitet vid baslinjen eller som svar på kokain ( P > 0, 05, inte visat). Vi testade emellertid även lokomotorisk känslighet för metyfenidat i en dos matchad med kokain för effekt hos dopamintransportören (5 mg / kg). I stora lokomotorkamrar som möjliggjorde avsevärd rörelse minskade bdnf-knockdown både metyfenidat-framkallad ambulation och stereotypliknande räkningar ( F 1, 28 = 5, 6, P < 0, 05), vilket ger bevis på att bdnf- knockdown interfererar med dopamin- och norepinefrinberoende mekanismer av psykostimulant handling. Liksom i våra CPP-kamrar fanns det emellertid inga gruppskillnader i baslinjeläget ( P > 0, 05, ej visat).

Diskussion

Raderingen av PL bdnf- gen här resulterade i försvagade rädselsvar efter rädsla-konditionering, överensstämmer med det tidigare arbetet, vilket tyder på att PL BDNF krävs för att konsolidera den lärda rädsla. 10 I dessa bdnf- knockdown-möss fanns det inte heller några effekter av bdnf- tystnad på förvärvet av rädsla under rädsla-konditionering, och det fanns inga skillnader i utrotning av rädsla (data visas inte), vilket antyder att PL BDNF är avgörande för konsolidering av lärde rädsla, men inte utrotning av rädsla. Dessutom räddades detta rädselförlust genom systemadministrering av TrkB-agonisten 7, 8-DHF, vilket indikerar att TrkB-aktivering under konsolideringsperioden (efter konditionering) är tillräcklig för att rädda de knockdown-inducerade bristerna. Våra rädselsvar (% frysning) var inte tillräckligt höga för att antyda en takeffekt, och TrkB-agonisten höjde inte rädslauttryck i kontroller, vilket tyder på att normativ rädslauttryck inte kan förbättras ytterligare med TrkB-agonisten. Det är emellertid anmärkningsvärt att vi tidigare har rapporterat att samma TrkB-agonist förstärker rädselskonsolidering i vildtypsmöss, 15 men detta kan bero på spänningsskillnader mellan C57 vildtypsmöss och bdnf- flussmöss, som föds upp på en blandad 129S4 / BALB / C-bakgrund.

Mot att bestämma huruvida BDNF verkade specifikt på TrkB-receptorer i PL, fann vi att TrkB-hämning i PL omedelbart efter konditionering (det vill säga under rädskkonsolideringsperioden) resulterade i liknande underskott i lärt rädselssvar. Dessa fynd indikerar att TrkB-signalering i PL krävs för konsolidering av rädselminnet, och att PL-kretsar behåller potentialen för ny plasticitet efter övergående TrkB-hämning. Dessa fynd utesluter dock inte möjligheten att anterograde eller retrograd PL BDNF-transport också har en roll i uttrycket av känslomässigt värderade minnen. 21, 22 Särskilt Peters et al. 23 visade på ett parallellt sätt att BDNF-infusioner i det infralimbiska cortexet i det mediala prefrontala cortexet kunde släcka rädsla, och att hippocampal BDNF är avgörande för att tillhandahålla och reglera den prefrontala kortikala TrkB-aktiviteten.

Vi fann också att PL- bdnf- borttagningar var effektiva för att trubba kokain-CPP efter CPP-utbildning, vilket ger bevis på att PL BDNF är avgörande för konsolidering av stimuli-resultat-associativa förhållanden i både aversiva och aptitliga domäner. Dessa bdnf knockdown-möss hade inga skillnader i utrotningen av kokainassocierad platspreferens i frånvaro av kokain (data inte visade), liknar rädslautrotningen, vilket tyder på att PL BDNF inte är kritiskt för utrotning av pavloviska läkemedels- eller rädsla- relaterade föreningar. Intressant, PL BDNF är emellertid väsentligt för utrotningen av operanten som svarar på matresultat, 11 som antyder att inflytandet från PL BDNF skiljer sig efter associativa - det vill säga Pavlovian vs operant - sammanhang.

Här var TrkB-agonisten 7, 8-DHF tillräcklig för att rädda underskottet i aptitlärande lärande i PL bdnf knockdown-möss, vilket indikerar specificiteten hos BDNF och TrkB vid modulering av kokainberoende associerande lärande. Däremot undertrycker BDNF-överuttryck i den dorsalt belägna främre cingulatbarken kokain som söker efter modeller av återfall. 9 Samma sak gäller infusioner i NAc 24 och VTA. 25 Tillsammans indikerar dessa data att BDNF TrkB-signalering har kritiska roller i emotionellt lärande, men att dessa är mycket region- eller kretsspecifika.

Det har tidigare rapporterats att PL- bdnf- knockdown inte påverkar baslinjens lokomotoriska aktivitet, 10 och vi replikerade detta fynd under mötena hos våra möss till våra CPP-testkamrar (data visas inte). Därför anser vi att PL bdnf knockdown-beteendefynd inte förvirras av skillnader i rörelse under frysning eller kokain-CPP-test, och att knockdown därför specifikt påverkar konsolideringen av emotionella minnen.

Som våra fynd med lokal hämning av TrkB antyder kan BDNF verka direkt via TrkB-receptorer inom PL, men det är också troligt att BDNF projicerar till terminaler i nedströmsregioner som amygdala, nucleus accumbens eller ventral tegmental område. 22, 26 BDNF-effekter via sin TrkB-receptor är troligen anatomiskt selektiva, eftersom BDNF-infusioner både dorsal och ventral till PL har olika konsekvenser 9, 23 troligtvis på grund av den unika anatomin hos PL-projektioner. 2

Sammantaget ger våra data tvingande bevis på att PL BDNF är en huvudregulator för minnesbildning i flera biologiska sammanhang. PL är av avgörande betydelse, eftersom den är positionerad för att integrera information om aptitliga och aversiva minnen, och att därefter modulera svar på känslomässiga stimuli via inriktning, till exempel, nucleus accumbens och basolaterala amygdala, som båda är viktiga nedströmsmål. Ett mer fullständigt perspektiv på neurotrofinhandlingar i det mediala prefrontala cortexen kommer att klargöra de terapeutiska metoderna för affektiva sjukdomstillstånd som kännetecknas av försvagande rädsla, ångest och drogmissbruk.