Platina pyrition inducerar apoptos i kroniska myeloida leukemiceller resistenta mot imatinib via dub-hämningsberoende kaspasaktivering och bcr-abl nedreglering | celldöd och sjukdom

Platina pyrition inducerar apoptos i kroniska myeloida leukemiceller resistenta mot imatinib via dub-hämningsberoende kaspasaktivering och bcr-abl nedreglering | celldöd och sjukdom

Anonim

ämnen

  • apoptos
  • Cell signalering
  • Kemoterapi
  • Kronisk myeloid leukemi

Abstrakt

Kronisk myelogen leukemi (CML) kännetecknas av det chimära tyrosinkinaset Bcr-Abl. T315I Bcr-Abl är den mest ökända punktmutationen för att framkalla förvärvat resistens mot imatinib (IM), vilket leder till dålig prognos. Därför är det angeläget att söka efter ytterligare tillvägagångssätt och inriktningsstrategier för att övervinna IM-motstånd. Vi rapporterade nyligen att platinapyrition (PtPT) potentiellt hämmar ubiquitin-proteasome-systemet (UPS) genom att rikta in sig på 26 S-proteasomassocierade deubiquitinaser (DUB), utan att påverka 20 S-proteasomen. Här rapporterar vi vidare att (i) PtPT inducerar apoptos i Bcr-Abl vildtyps- och Bcr-Abl-T315I-mutationsceller inklusive de primära mononukleära cellerna från CML-patienter som är kliniskt resistenta mot IM, samt hämmar tillväxten av IM-resistenta Bcr -Abl-T315I xenografts in vivo ; (ii) PtPT nedreglerar Bcr-Abl-nivån genom att begränsa Bcr-Abl-transkription och minska Bcr-Abl-proteinet medierat av DUB: s hämningsinducerad kaspasaktivering; (iii) UPS-hämning krävs för PtPT-inducerad kaspasaktivering och celloptoptos. Dessa fynd stöder att PtPT övervinner IM-resistens genom både Bcr-Abl-beroende och oberoende mekanismer. Vi drar slutsatsen att PtPT kan vara en blyförening för ytterligare läkemedelsutveckling för att övervinna imatinibresistens hos CML-patienter.

Huvudsaklig

Kronisk myelogen leukemi (CML) är en myeloproliferativ hematologisk neoplasma förknippad med vid (9; 22) kromosomal translokation som ger upphov till Philadelphia (Ph) kromosom och fusionen Bcr-Abl- genen, som kodar för ett Bcr-Abl-protein med förbättrad tyrosinkinas aktivitet. 1, 2 Bcr-Abl kan aktivera ett brett spektrum av mitogena signalvägar såsom MAPK / ERK-kaskad, PI3K / Akt / mTOR och STATs-vägar. 3, 4, 5 Aktiveringen av dessa vägar i Bcr-Abl-uttryckande celler resulterar i ökad aktivering och / eller expression av en serie anti-apoptotiska proteiner, såsom Bcl-2and XIAP, och ger därmed cellöverlevnadsfördel. 6, 7, 8 Imatinib är en väletablerad liten molekyltyrosinkinasinhibitor (TKI) som specifikt riktar sig till ATP-bindningsstället för Bcr-Abl och därmed förhindrar Bcr-Abl autofosforylering; andit har visat signifikant effekt vid klinisk behandling av CML genom att inducera cytogenetisk och molekylär remission. 9, 10, 11 Trots den specifika och anmärkningsvärda effekten av imatinib dyker upp ett ökande antal CML-patienter som är resistenta mot imatinib i kliniken. 12, 13 Den frekventa orsaken till imatinibresistensen är Bcr-Abl-amplifiering och punktmutationer i de Bcr-Abl-relevanta domänerna. 14, 15, 16, 17 Det finns mer än 100 rapporterade mutationer, varav 18 de flesta kan erövras av andra generationens tyrosinkinashämmare (t.ex. nilotinib, dasatinib och bosutinib), 19, 20, 21 med undantag för T315I-mutation, den mest envisa punktmutationen, som står för cirka 20% av mutationer inom Abl-kinasdomänen. 18 Ponatinib, som en tredje generation av tyrosinkinasinhibitor, har visat aktivitet mot eldfast CML inklusive de som har T315I Bcr-Abl. 22 Responsen hos avancerade patienter är emellertid begränsad eftersom successiv användning av TKI leder till utvecklingen av sammansatta Bcr-Abl-kinasdomänmutationer som visar resistens även mot ponatinib. 23 Dessutom måste den långsiktiga nyttan av ponatinib balanseras mot risken för skadliga biverkningar hos dessa patienter. Därför kvarstår utmaningen att övervinna resistens mot IM-terapi i hanteringen av CML.

Med den växande förståelsen för cancercellernas beroende av ett fungerande ubiquitin-proteasome system (UPS), och framgången i klinisk användning av proteasomhämmare (t.ex. bortezomib, carfilzomib) för att behandla multipelt myelom och mantelcelllymfom, har UPS bevisat att vara ett attraktivt mål för utveckling av läkemedel för cancerterapi. 24, 25 Deubikvitinerande enzymer (DUB), en kritisk komponent i UPS, ansvarar för avlägsnande av ubiquitinmonomerer och -kedjor före proteasomal nedbrytning och har varit inblandade i patogenesen av cancer. 26, 27 medlemmar av DUB-familjen har visat sig uttryckas differentiellt och aktiveras i ett antal cancerinställningar, inklusive CML, med deras avvikande aktivitet kopplad till cancerprognos och kliniskt resultat. 282930 Studier har tidigare visat att hämning av proteasomala cystein-DUB-enzymer (t.ex. USP14 och UCHL5) kan förutsägas vara särskilt cytotoxisk för tumörceller eftersom det leder till blockering av proteasomfunktion och ackumulering av proteasomala substrat. 31, 32 Även om proteasominhibitorer såsom bortezomib och gamboginsyra har rapporterats nedreglera Bcr-Abl-uttryck och inducera apoptos i CML-celler, är det också berättigat att undersöka effekten av DUB-hämmare på Bcr-Abl-hematopoietiska maligniteter.

Först nyligen har vi definierat att en ny platinabaserad antitumörmedel platinapyrition (PtPT), platinjon och PT-kelaterande produkt har hämmande aktivitet av 26 S proteasomassocierade DUB och därmed utövar säkrare och potenta antitumöreffekter. 35 I den aktuella studien undersökte vi de antineoplastiska effekterna av PtPT på Bcr-Abl vildtyp och Bcr-Abl-T315I mutantcellinjer, primära celler från CML-patienter och mus-IM-resistenta xenograftmodeller. Här visar vi att PtPT-inducerad UPS-hämning leder till kaspas-3-medierad start av apoptos i både IM-resistenta och IM-känsliga CML-celler och att både UPS-hämning och kaspasaktivering krävs för PtPT att inducera Bcr-Abl-nedreglering.

Resultat

PtPT inducerar proteasominhibering i CML-celler

Det är väl etablerat att hämning av proteasomen eller DUB: erna orsakar ansamling av ubiquitinerade proteiner. 36 Liksom vad vi tidigare rapporterade med andra cancerceller, 35 PtPT-dos- och tidsberoende inducerade markanta ökningar av både ubiquitinerade proteiner (Ubs) och proteasome substratprotein p27 i alla CML-cellinjer som vi testade (figur1a). För att ytterligare utvärdera de proteasominhiberande effekterna av PtPT, behandlades benmärgsceller från 10 patienter med CML (3 patienter är IM-resistenta) ex vivo med eskalerande doser av PtPT. PtPT-behandling inducerade markant ackumulering av ubiquitinerade proteiner och proteasomsubstratprotein I B- α (figur Ib). I likhet med DUB-hämmaren b-AP15 orsakade PtPT-behandling ingen minskning av proteasom-peptidasaktiviteter (chymotrypsin-liknande, caspas-liknande och trypsin-liknande aktivitet) i KBM5- och KBM5R-celler, medan proteasominhibitorn bortezomib väsentligen hämmade den proteasome chymotrypsin-liknande och kaspasliknande aktivitet som förväntat (figur 1c). Dessa resultat antyder att som DUB-hämmare blockerar PtPT inte direkt 20 S proteasom-peptidasaktivitet i CML-celler, i överensstämmelse med vår tidigare rapport. Vidare reducerades fosforyleringen av USP14 (S241) väsentligt i PtPT-behandlade CML-celler (figur 1d), vilket också indikerar undertryckande av DUB-aktiviteten för USP14 genom PtPT-behandling. 37

Image

PtPT hämmar proteasomfunktion i CML-celler. ( a ) PtPT inducerar ackumulering av polyubiquitinerade proteiner i CML-celler. Cellerna behandlades med den indikerade dosen av PtPT under 6 timmar; proteinnivåerna av ubiquitinerade proteiner (Ubs) och p27 detekterades med användning av westernblots. ( b ) PtPT ackumulerar ubiquitinerade proteiner och I-B- α i CML-cancerceller. Cancerceller från tre CML-patienter behandlades med PtPT under 9 timmar. De indikerade proteinerna analyserades med användning av westernblots (nr 3, 5: imatinib-känsliga patienter; # 8: imatinib-resistent patient). ( c ) PtPT hämmar inte 20 S proteasom-peptidasaktiviteter i KBM5- och KBM5R-celler. Celllysat behandlades med PtPT, och sedan registrerades den chymotrypsin-liknande, caspasliknande och trypsin-liknande aktiviteten vid olika tidpunkter med användning av det fluorogena Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC och Boc-LRR-AMC-substratet . PS341 (Ps) användes som en positiv kontroll och b-Ap15 (b-AP) användes som en DUB-hämmarkontroll. De visade resultaten är medelvärdet av ett representativt experiment utfört i tre exemplar. *** P <0, 001, jämfört med kontrollgruppen (0 μM PtPT). ( d ) PtPT hämmar fosforylering av USP14. KBM5- och KBM5R-celler behandlades med 2, 0 mikrometer PtPT under den angivna varaktigheten. Fosforylerad (p-USP14) och total USP14 detekterades med Western blot

Bild i full storlek

PtPT nedreglerar Bcr-Abl-protein och inhiberar dess signalering nedströms

Därefter bestämde vi om PtPT kan hämma Bcr-Abl i CML-celler. Mot detta syfte utsattes både Bcr-Abl-WT- och Bcr-Abl-T315I-celler för ökande koncentrationer av PtPT under olika tidsperioder, Bcr-Abl och dess nedströmsmål upptäcktes. Vårt resultat indikerade att PtPT nedreglerade halterna av de totala och fosforylerade Bcr-Abl-proteinerna i både Bcr-Abl-WT- och Bcr-Abl-T315I-celler på ett dos- och tidsberoende sätt (figurerna 2a och b). Ytterligare undersökning visade att PtPT påverkade uttrycket av Bcr-Abl nedströms målproteiner. Fosforyleringen av STAT5 och Akt minskade också signifikant på ett dos- och tidsberoende sätt. Intressant nog stimulerade PtPT-behandling också fosforylering av ERK, vilket kan vara förknippat med den katalytiska processen för autofagi i CML-celler, liknande funktionen för PS341 som rapporterats tidigare. 38

Image

PtPT-behandling reglerar Bcr-Abl och dess nedströms signalproteiner. ( a och b ) PtPT sänker proteinnivåerna för Bcr-Abl och dess nedströmsmål på ett dos- och tidsberoende sätt. CML-celler behandlades med PtPT som angivet, och samlades sedan in för Western blot-analyser för de indikerade proteinerna. ( c ) PtPT minskar mRNA-expressionen av Bcr-Abl. KBM5- och KBM5R-celler exponerades för 1, 0 μM PtPT under 9 eller 12 timmar. Bcr-Abl-mRNA-nivån bestämdes med användning av RT2-PCR och dess expressionsnivå relativt kontrollen beräknades. Medel ± SD ( n = 3). ** P <0, 01, *** P <0, 001, kontra kontrollgrupp. ( d ) PtPT inhiberar cellaktivitet av RNA pol II. KBM5- och KBM5R-celler behandlades med PtPT (1 mikrometer ) under den angivna varaktigheten, de fosforylerade (p-Rpb) och totala proteinnivåer av RNA pol II (Rpb) analyserades med western blot

Bild i full storlek

Bcr-Abl-nedreglering resulterar från minskat genuttryck

För att utforska mekanismen för PtPT-medierad minskning i Bcr-Abl upptäcker vi först transkriptionen av Bcr-Abl med RT 2 -PCR. KBM5- och KBM5R-celler behandlades med 1, 0 mikrometer PtPT under 9 och 12 timmar, och mRNA-nivån för Bcr-Abl minskades till viss utsträckning i båda cellerna (figur 2c). För att ytterligare ta itu med detta problem analyserades fosforyleringen av RNA-polymeras II. Såsom visas i figur 2d leder PtPT till hämning av RNA-polymeras oavsett mutationsstatus för Bcr-Abl- genen. Även om graden av mRNA-reduktion uppenbarligen är mindre än reduktionen av motsvarande proteinnivåer, bidrar nedregleringen av mRNA med PtPT sannolikt till minskningen av Bcr-Abl-proteinerna.

PtPT hämmar tillväxt av både IM-känsliga och IM-resistenta CML-celler

Vi analyserade först effekten av PtPT på tillväxt i IM-känsliga och IM-resistenta CML-celler. Både Bcr-Abl vildtyp IM-känsliga cellinjer (KBM5, K562 och BaF3-p210-WT) och Bcr-Abl-T315I muterade IM-resistenta cellinjer (KBM5R och BaF3-p210-T315I) behandlades med eskalerande koncentrationer av PtPT under 48 timmar, och därefter bedömdes cellviabilitet genom MTS-analysen. PtPT kunde hämma tillväxten av alla cellinjer (figur 3a). Effekten av föreningen på cellviabilitet undersöktes vidare i CML-cellinjer genom Trypan-blå uteslutningsfärgningsanalys. Som visas i figur 3b observerades en tids- och dosberoende hämning av cellviabilitet, vilket återspeglade dess anti-leukemi-aktivitet. Som visas i figur 3c minskade PtPT cellviabiliteten för primära monocyter från CML-patienter med IC50-värden från 0, 22 μM till 1, 10 μM (0, 68 ± 0, 3 μM ), medan för mononukleära celler från sex friska frivilliga, IC 50 värden var mer än 4, 4 μM som vi rapporterade nyligen, ungefär 6, 5 gånger högre än för primära monocyter erhållna från CML-patienter. 27

Image

PtPT hämmar cellviabilitet i CML-cellinjer. ( a och b ) PtPT minskar cellviabiliteten för både IM-känsliga och IM-resistenta CML-cellinjer. KBM5, KBM5R, K562, BaF3-p210-WT och BaF3-p210-T315I-celler behandlades med de angivna koncentrationerna av PtPT under 48 timmar och utsattes sedan för MTS-analyser ( a ). Cellviabilitet undersöktes också med trypanblått uteslutande färgningsanalys. Efter behandling med angivna koncentrationer av PtPT analyserades CML-celler med Trypan-blåfärgning för förändringar i livskraft ( b ). Grafer representerar data från tre upprepningar. Medel ± SD ( n = 3). * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, kontra kontrollgrupp. ( c ) PtPT minskar cellviabiliteten hos CML-patientcancerceller. CML-celler från 10 CML-patienter behandlades med PtPT i de indikerade doserna under 48 timmar, och cellviabilitet detekterades med MTS-analysen. Medel ± SD ( n = 3). ( d och e ) PtPT inducerar cellapoptos i CML-celler. Celler (inklusive mononukleära celler från CML-patienter) exponerades för den indikerade dosen av PtPT under 24 timmar, och cellapoptos observerades genom registrering av Annexin V-FITC / PI-positiva celler under ett inverterat fluorescensmikroskop ( d ) (en av doserna med PtPT visades, respektive) eller detekterades genom Annexin V-FITC / PI dubbelfärgning med flödescytometri ( e ). Medel ± SD ( n = 3). Representativa bilder visades. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, kontra kontrollgrupp

Bild i full storlek

PtPT inducerar apoptos i både IM-känsliga och IM-resistenta CML-celler

En dosberoende proapoptotisk effekt av PtPT bekräftades genom att registrera antalet Annexin V / PI-positiva celler under ett inverterat fluorescensmikroskop och flödescytometri-analys efter dubbelfärgning av Annexin V-FITC / PI i båda Bcr-Abl vildtypen och T315I-mutanta cellinjer (figurerna 3d och e, till vänster). Dessutom fann vi att PtPT-behandling i doser från 0, 5 till 3, 0 μM under 36 timmar resulterade i betydande apoptos i alla primära monocyter från de 10 CML-patienterna som detekterades med Annexin V / PI dubbelfärgning (figur 3e, till höger).

Därefter resonerade vi att uttrycket av PARP, såväl som caspase-3, -8 och -9 kan påverkas av inkubering med PtPT. I själva verket inducerade PtPT en dos- och tidsberoende specifik klyvning av PARP och caspase-3, -8 och -9, alla kännetecken för apoptos (figur 4a).

Image

PtPT inducerar kaspasberoende cellapoptos. ( a ) PtPT-behandling aktiverar caspase. KBM5, KBM5R, K562, BaF3-p210-WT och BaF3-p210-T315I celler exponerades för PtPT vid den indikerade dosen och under den angivna varaktigheten, följt av detektion av klyvningen av PARP, caspase-3, -8 och 9. ( b ) PtPT reducerar mitokondriell membranpotential i CML-celler. Cellerna behandlades med olika doser av PtPT under 24 timmar och därefter utvärderades mitokondriell membranpotential med rodod-123 färgning kopplad flödescytometri. Medel ± SD ( n = 3). * P <0, 05, ** P <0, 01, kontra kontrollgrupp. ( c ) PtPT inducerar frisättningen av cytokrom C och AIF i CML-celler. KBM5- och KBM5R-celler exponerades för 2, 0 mikrometer PtPT under 1, 3 och 6 timmar, de cytosoliska proteinnivåerna av cytokrom c och AIF analyserades med immunblotting. ( d ) PtPT nedreglerar anti-apoptotiska proteiner i CML-celler. KBM5- och KBM5R-celler behandlades med de angivna doserna av PtPT under den angivna varaktigheten; celllysat immunoblottades sedan för att bedöma förändringarna av XIAP, Bcl-2, Bax, Bid och Survivin. GAPDH användes som en lastkontroll

Bild i full storlek

Det är ett allmänt accepterat begrepp att mitokondrion är det reglerande centrumet för apoptos. Vårt resultat visade att integriteten hos mitokondriella membran minskade i alla CML-cellinjer behandlade med PtPT (figur 4b). Frisättningen av cytokrom c och apoptosinducerande faktor (AIF) från mitokondrier till cytoplasma har erkänts som de tidiga tecknen på apoptos. 39 För att klargöra involveringen av apoptosvägen som utlöses av PtPT, behandlade vi KBM5- och KBM5R-celler under olika varaktigheter och bestämde sedan cytokrom c och AIF i de cytosoliska fraktionerna. Såsom visas i figur 4c, frigöres cytokrom c och AIF vid tidigare tidpunkter, vilket indikerar att PtPT inducerade mitokondriell väg för apoptos i CML-celler. Samtidigt reducerade PtPT-behandlingen signifikant halterna av pro-caspase-3 och inducerade PARP-klyvning i de primära monocyterna (figur 4d).

För att ytterligare undersöka mekanismen för apoptos inducerad av PtPT undersökte vi uttrycket av andra apoptosrelaterade proteiner. Resultaten visade att det fanns en minskning av anti-apoptotiska proteiner XIAP och survivin, och av Bid, en förmedlare av mitokondriell skada inducerad av caspase-8 (figur 4d).

PtPT utlöser det endoplasmatiska retikulumstresvaret i CML-celler

UPS-hämning inducerar utfoldat proteinsvar (UPR) och apoptos. 40 Undersökning av effekten av PtPT på endoplasmatisk retikulum (ER) -starsrespons visade att behandling av både KBM5- och KBM5R-celler med PtPT aktiverar PERK-medierad ER-stresignalering, bevisat av signifikant induktion av p-eIF2a. Dessutom utlöste PtPT-behandling induktion av CHOP och Bip (figur 5a). Tillsammans antyder dessa resultat att PtPT-medierad proteasominhibering har en viktig roll i PtPT-inducerad ER-stressrespons i CML-celler.

Image

PtPT-behandling inducerar Bcr-Abl-nedreglering via hämning av proteasomaktivitet i CML-cellinjer. ( a ) PtPT-behandling inducerar ER-stressrespons i KBM5- och KBM5R-celler. Cellerna behandlades med 2, 0 μM PtPT under den angivna varaktigheten, sedan immunlysades celllysat för att bedöma förändringarna av PARP, Bip, CHOP, PERK, p-eIF2a och eIF2a. ( b ) Proteasominhibitionsmedierad caspasaktivering inducerar Bcr-Abl-nedreglering. KBM5- och KBM5R-celler behandlades med 2, 0 mikrometer PtPT under de angivna varaktigheterna. Ubs, PARP, klyvda-caspase-3 och Bcr-Abl analyserades med western blot. Representativa bilder visas. ( c ) PtPT minskar Bcr-Abl och de nedströms signalproteinerna på ett kaspasberoende sätt. KBM5R-celler behandlades med 1, 0 mikrometer PtPT under 12 timmar i frånvaro eller närvaro av 30 mikrometer pan-kaspasinhibitor z-VAD-fmk. Den totala och fosforylerade Bcr-Abl, Ubs, PARP, caspase-3, klyvda-caspase-3, XIAP och Survivin analyserades med användning av western-blotting. Representativa bilder visas. ( d ) Effekt av EDTA på PtPT-inducerad proteasominhibering, apoptos och Bcr-Abl-nedreglering. KBM5R-celler inkuberades med 1, 0 μM PtPT i frånvaro eller närvaro av 100 μM EDTA under 12 timmar, och sedan detekterades Ubs, p-Bcr-Abl, Bcr-Abl, PARP, p-USP14 och USP14-proteiner med användning av Western blot . GAPDH användes som en lastkontroll

Bild i full storlek

Bcr-Abl-nedreglering resulterar från kaspasberoende klyvning

Vi och andra har rapporterat att kaspasaktiveringsvägen är involverad i nedbrytningen av Bcr-Abl. 34, 41 Vi antog alltså att kaspasaktiveringen kan vara involverad i den PtPT-inducerade Bcr-Abl-nedgången. För att testa denna hypotese inkuberades KBM5R-celler med PtPT i frånvaro eller närvaro av pan-kaspasinhibitorn z-VAD-fmk, och Bcr-Abl-proteiner bedömdes. Specifikt observerade vi att z-VAD-fmk mestadels blockerade PtPT från att inducera celldöd och från att minska Bcr-Abl-proteiner till en viss grad men visade ingen effekt på ubiquitinerad proteinansamling (figurerna 5b och c). Dessa resultat visar att kaspasaktivering som utlöses av PtPT-inducerad proteasominhibering bidrar till nedregleringen av Bcr-Abl.

Proteasominhibering är en kritisk mediator för PtPT-inducerad apoptos

Ackumulering av ubiquitinerade proteiner såväl som minskningen av fosforylerad USP14 observerades så tidigt som 6 timmar under behandlingsförloppet (figur la och d). Det är viktigt att uppenbar apoptosspecifik PARP-klyvning inte observerades förrän 9 timmar av PtPT-behandlingen (figurerna 4a och 5b). Dessa resultat visar att apoptosen inducerad av PtPT inträffar efter proteasominhiberingen. För att ytterligare ta itu med detta problem testade vi effekten av etylendiamintetraättiksyra (EDTA), ett kelatbildande medel för metalljoner såsom Pt 2+, på PtPT-induktionen av proteasominhibering och cellapoptos. Resultatet visar att PtPT uppvisade minskad reaktivitet efter att ha blivit bunden av EDTA. Som förväntat reverserade EDTA delvis PtPT-inducerad ubiquitinerad proteinansamling och fosforylerad USP14-nedreglering; PARP-klyvningen avskaffades följaktligen; och minskningarna av Bcr-Abl-proteiner utvanns uppenbarligen i KBM5R-celler (figur 5d). Därför krävs proteasominhibering för induktion av cellapoptos genom PtPT.

PtPT hämmar tumörutvecklingen från de xenograftade Bcr-Abl-WT- och -T315I-mutanta cellerna i nakna möss

Vi utvärderade vidare in vivo- effekten av PtPT på Bcr-Abl-WT och Bcr-Abl-T315I-celler med användning av naken musxenograftmodell. KBM5- och KMB5R-celler ympades subkutant i nakna möss. När tumörstorleken nådde ~ 50 mm3 (3 dagar efter ympningen) randomiserades mössen för att få behandling med vehikel eller PtPT (7 mg / kg / dag) under 11–14 dagar. En markant mindre tumörstorlek noterades i PtPT-behandlade möss kontra möss som fick enbart vehikel (figur 6a och b) medan kroppsvikt förblev relativt stabil i varje grupp (figur 6c). Motorisk aktivitet och matningsbeteende var alla normala (data visas inte). Immunoblotting av xenograftvävnader från möss visade att PtPT potentiellt inhiberade Bcr-Abl och dess nedströmsvägar (figur 6d). Immunohistokemisk analys avslöjade att de ubiquitinerade proteinerna och proteasomsubstraten p27 var mycket ackumulerade i PtPT-behandlade tumörvävnader gentemot de fordonsbehandlade modellerna (figur 6e), vilket indikerar att PtPT hämmar proteasomfunktion i både IM-känsliga och resistenta xenografter. Proteinbiomarkören relaterad till cellproliferation, Ki-67, reglerades också av PtPT-behandlingen i både KBM5 och KBM5R-modeller (figur 6e). Tillsammans visar dessa data in vivo antitumoraktiviteten för PtPT mot CML-celler oavsett dess Bcr-Abl-T315I-mutationsstatus.

Image

In vivo- effekt av PtPT på KBM5- och KBM5R-celler härledde musxenograftmodeller. Nakenmöss som bär vildtyp och T315I-mutant Bcr-Abl xenograft-tumörer behandlades med antingen vehikel eller PtPT (7 mg / kg / dag) under 11-14 dagar efter ympning av KBM5- och KBM5R-celler. ( a ) PtPT hämmar tumörtillväxt i n vivo . Tumörtillväxtkurvor registrerades varje dag i två uppsättningar experiment. Medel ± SD ( n = 6). * P <0, 05, ** P <0, 01, mot PtPT-behandlad grupp. ( b ) På dag 11 eller dag 14 efter ympningen dödades mössen och tumörvävnaderna vägdes och avbildades. ** P <0, 01, jämfört med kontrollgruppen. ( c ) Mössvikterna registrerades varje dag efter PtPT-behandling. Medel ± SD ( d och e ) Western blot-analyser ( d ) och / eller immunohistokemi färgning ( e ) för proteasomsubstrat (ubikvitinerade proteiner, p27), Bcr-Abl-relaterade proteiner (Bcr-Abl, p-Bcr-Abl) och dess nedströmsproteiner (Sta5, p-Stat5) och proteinbiomarkör relaterad till proliferation (Ki-67) i xenograftumörvävnader från KBM5-vehikelgruppen (# 1, 3, 4), KBM5 PtPT-behandlad grupp (# 13, 15, 16), KBM5-T315I fordonsgrupp (# 24, 25, 26) och KBM5R-T315I PtPT-behandlad grupp (# 34, 37 38). I e är proteinerna av intresse immunfärgade bruna. All immunhistokemisk färgning upprepades i tre mustumörvävnader och de representativa bilderna visas

Bild i full storlek

Diskussion

Trots framgången för imatinib i behandlingen av Bcr-Abl-positiv CML, är utvecklingen av resistens mot imatinib, särskilt för de i accelererade och sprängningsfaser, fortfarande en stor utmaning för behandlingar. 12, 14 För att övervinna detta motstånd har andra generationens TKI: er (såsom nilotinib, dasatinib och bosutinib) utvecklats och är effektiva mot en rad Bcr-Abl-mutationer (t.ex. E255K, M351T) förutom T315I. 19, 20, 21 Dessutom skulle motståndet mot tredje generationens TKIs ponatinib begränsa appliceringen av medlet till en viss grad. 23, 42 En strategi för att hantera denna utmaning är att hitta nya läkemedelsmål och ytterligare medel för att avbryta Bcr-Abl-signalvägar. Med den växande förståelsen för UPS: s molekylärbiologi har proteasom- och DUB-hämning visat sig vara attraktiva strategier för cancerterapi. 27, 32 Viktigt, i motsats till 20 S-proteasominhibitor, kan de flesta rapporterade DUB-hämmare specifikt rikta in sig på en eller flera DUB genom vilka mer specifika och mindre toxiska anticancermedel kan genereras. Möjligheten att påverka processer som signaltransduktion, spridning och apoptos genom att påverka deubikitinering och proteasomal nedbrytning av nyckelregulatorer är både lovande och spännande. Ytterligare föreningar som inducerar DUB-hämningsberoende apoptos av CML-celler med begränsad allmän toxicitet behövs fortfarande.

I den tidigare studien har vi rapporterat att PtPT som syntetiserats i vårt laboratorium kan producera tumörvävnadsspecifik hämning av proteasomassocierade DUB och tumörspecifik toxicitet, vilket visar klinisk betydelse för att utforma nya strategier för cancerbehandling. 35 Här, i överensstämmelse med fynd som härrör från studier som använde andra cancerceller, inducerade PtPT UPS-hämning i både Bcr-Abl vildtyp och Bcr-Abl T315I-cellinjer, liksom i primära mononukleära cancerceller härledda från CML-patienter inklusive IM-känsliga och -resistenta celler. Det bekräftades vidare att PtPT också hämmade UPS-funktion i den xenograftade tumörmodellen som bär vildtyp- och T315I Bcr-Abl- gener in vivo . Ännu viktigare analyserade vi verkningsmekanismen för PtPT i att övervinna IM-resistenta celler. I in vitro- studien orsakar PtPT dos- och tidsberoende signifikant mitokondriell skada och apoptos i både IM-känsliga och IM-resistenta CML-celler; i de mononukleära cancercellerna från CML-patienter minskade PtPT också cellviabilitet och inducerade celldöd; i experimentet in vivo inhiberades tillväxten av både IM-känsliga och -resistenta xenograftade tumörceller genom PtPT-behandling. Sammantaget kan PtPT vara en potentiell kandidat för behandling av imatinib-resistent CML. Så vitt vi vet är detta den första rapporten som visar att PtPT, som en ny hämmare av 26 S-proteasomassocierade DUB, är effektiv mot CML-celler, inklusive de som hyser gate-keeper-mutanten T315I Bcr-Abl.

Även om ytterligare studier är motiverade för att bestämma mekanismen genom vilken PtPT inducerar cellapoptos och övervinner IM-resistens, har både Bcr-Abl-beroende och oberoende mekanismer dokumenterats för att modulera uttrycket av Bcr-Abl. Å ena sidan hämmar PtPT transkriptionen av Bcr-Abl, och framtida studier måste undersöka om det minskade Bcr-Abl- genuttrycket är Bcr-Abl -genspecifikt eller en generell gentranskriptionsinhibering. Å andra sidan klyver PtPT-inducerad UPS-hämningsberoende kaspasaktivering Bcr-Abl (figurerna 5b och d), vilket sedan leder till nedreglering av Bcr-Abl och hämning av cellproliferation. Här upptäcker våra fynd en spännande ny mekanism som PtPT-medierad UPS-hämning och kaspasaktivering kan nedreglering av Bcr-Abl-protein; det senare bidrar till PtPTs övervinna IM-resistens i CML-celler.

Vi har rapporterat att proteasomhämning-inducerad ER-stressrespons har en viktig roll i kaspasaktivering och celloptoptos. 43 Här fann vi också att PtPT-tidsberoende inducerad ER-stressresponsväg (figur 5a). Vi spekulerar i att det inducerade ER-stressresponsen bidrar till induktion av mitokondriell skada, vilket återspeglas på den ökande frisättningen av cytokrom c och kaspasaktiveringen (figur 4). Aktiverade caspaser, inducerar PARP-klyvning och apoptos å ena sidan och klyver direkt Bcr-Abl-proteiner å andra sidan.

Dessutom avslöjade våra resultat att PtPT inducerade minskningar i Bcr-Abl-nivåer och dess nedströmsmål (dvs. STAT5, Akt). Med tanke på att Bcr-Abl är ett beroende onkogen i CML-celler, kan sänka Bcr-Abl-nivån och därmed inaktivera dess signalering resultera i celltillväxtinhibering. Det är värt att notera att PtPT på ett tydligt sätt utlöser ERK-fosforylering, även om det inte är tillräckligt för att fullständigt skydda CML-celler från DUB-hämmande-medierad apoptos. PtPT-behandlad stimulerad ERK-fosforylering kan tillskrivas den katalytiska processen för autofagi i leukemiceller, precis som effekten av bortezomib tidigare rapporterats. 38 I detta avseende kan PtPT-medierad autofagi-process förbättra kemoterapieffekten hos medlet. Det återstår också att undersöka om PtPT är effektivt i CML-stamcellerna, vilket tros vara en kritisk orsak till imatinibresistens och ett hinder för att härda CML.

CML är starkt beroende av närvaro av Bcr-Abl och är en klassisk modell av onkogenberoende. 44 Inaktivering av Bcr-Abl-kinas med TKI: er (t.ex. imatinib, dasatinib) eller nedreglering av de totala nivåerna av cellulär Bcr-Abl genom triptolid (på mRNA-nivå), 41 gamboginsyra, 34 auranofin 45 och PtPT 35 (på proteinnivån) ) kan vara effektiva metoder för att blockera "beroende" i Bcr-Abl-uttryckande celler. Även om triptolid, gamboginsyra, auranofin och PtPT kan påverka flera molekyler, är Bcr-Abl-nedreglering den vanliga effekten och är sannolikt den viktigaste faktorn som övervinner IM-resistens i Bcr-Abl-uttryckande celler. För närvarande är de flesta studier på Bcr-Abl-hämning centrerade för att hitta TKI: er som direkt inhiberar tyrosinkinasaktivitet. Här föreslår vi en alternativ strategi för att förbättra klyvningen av Bcr-Abl genom att aktivera caspasesystemet via DUB-hämning.

Sammantaget visar våra in vitro- , ex vivo- och in vivo- resultat att PtPT har kraftfull aktivitet mot CML-celler som bär vildtyps- eller Bcr-Abl-T315I-mutation. Dessutom är DUB-inhiberingsmedierad caspasaktivering och Bcr-Abl-nedreglering ansvarig för de proapoptotiska effekterna av PtPT på Bcr-Abl-positiva celler. Sammantaget kan PtPT ha klinisk effekt mot humant CML som drivs av aktiverad Bcr-Abl oavsett mutationsstatus, vilket ger stor vikt vid framtida klinisk CML-terapi, särskilt hos de som lider av imatinibresistens.

Material och metoder

Cell kultur

KBM5-celler som bär 210 kDa vildtyp Bcr-Abl härstammade från en kvinnlig myeloida CML-patient i explosionskris som beskrivits tidigare. 41 KBM5-T315I-cellinje (KBM5R), en imatinib-resistent KBM5-sublin, härleddes från KBM5 genom att utsättas för ökande koncentrationer av imatinib och efterföljande val av överlevnadsklonen innehållande T315I-mutation som tidigare beskrivits. 34, 41 Båda dessa cellinjer odlades i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS), såsom beskrivits tidigare. Dessutom odlades KBM5-T315I-cellerna också med 1, 0 mikrometer imatinib. Imatinib tvättades bort och KBM5-T315I-celler odlades i läkemedelsfritt medium under flera dagar före experimenten. The murine BaF3 cells stably expressing either 210 kDa wild-type Bcr-Abl (BaF3-p210-WT) or T315I Bcr-Abl (BaF3-p210-T315I) were kindly provided by Dr. BZ Carter (University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA). 46 The K562 cell line was obtained from the ATCC. BaF3-p210-WT, BaF3-p210-T315I and K562 cells were cultured in RPMI 1640 medium with 10% FCS as described previously. 41, 47 The bone marrow cells were obtained from 10 CML patients in the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. The research is consistent with the institutional guidelines and the Declaration of Helsinki principles. The isolation of mononuclear cells has been described in previous work. 34, 41 The cells were suspended in RPMI 1640 supplemented with 15% FCS. All drug treatments were not started until the cells were pre-cultured in fresh medium for 24 h.

Reagens

PtPT was synthesized in our laboratory and stored as a 20 mM stock solution in dimethyl sulfoxide (DMSO) at −20 °C. Annexin V, propidium iodide (PI) and rhodamine-123 were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The proteasome inhibitor, bortezomib (PS341), was purchased from BD Biosciences (San Jose, CA, USA). b-AP15, Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC, Boc-LRR-AMC were provided from Boston Biochem (Cambridge, MA, USA). The pan-caspase inhibitor, z-VAD-fmk, was purchased from BD Biosciences. These reagents were dissolved in DMSO as a stock solution, and stored at −20 °C. In all experiments, the final concentration of DMSO did not exceed 0.1%. The metal chelator, ethylenediamine tetraaceticacid (EDTA), was obtained from Sangon Biotech (Shanghai, China). A stored solution (100 mM) was prepared by dissolving EDTA in H 2 O and kept at −20 °C.

antikroppar

Most of the antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (MA, USA) and used at a dilution of 1:1000, including anti-poly adenosine diphophate ribose polymerase (anti-PARP; clone 4C10-5; #9532) and antibodies against phospho-c-Abl at Y245 (#2861), c-Abl (C-19; #2862), phospho-Erk1/2 (T202/Y204; #4370), Erk1/2 (#4348), phospho-Akt (#2965), Akt (#4685), RNA polymerase II (pol II; #2629), phospho-RNA Pol II at Ser2 and Ser5 (#13546), IKB-a (#4814), p27 (#3688), phospho-eIF2a (#9721), eIF2a (#2103), PERK (#5683), Bip (#3177), CHOP (#2895), XIAP (#2045), caspase-8 (#9746), caspase-9 (#9504), apoptosis-inducing factor (AIF) (#5318), Bax (#5023), phospho-STAT5A/B (Y694/Y699; clone 8-5-2; #9314) and STAT5 (#9358). Antibodies against ubiquitin (P4D1; sc-8017), caspase-3 (sc-98785), Bcl-2 (sc-56015), USP14 (SC-515812) and Ki-67 (sc-23900) were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antibodies against phospho-USP14 (S241) was from ABGENT. Antibodies against cleaved-caspase-3 (AV00021), cytochrome c (C5118) and survivin (S8191) were from Sigma-Aldrich. Anti-GAPDH (#60630) and anti-Actin (#0768) were from Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). HRP-conjugated goat anti-rabbit (AP132P) and anti-mouse (12-349) antibodies were from Merck Millipore (Billerica, MA, USA).

Cellviabilitetsanalys

Cell viability was measured using MTS assay (CellTiter 96Aqueous One Solution reagent; Promega, Shanghai, China). Briefly, KBM5, KBM5-T315I, K562, BaF3-Bcr/Abl-WT, BaF3-Bcr/Abl-T315I cells were plated in quadruplicate onto the 96-well plates at a density of 2 × 10 4 cells/ml, then treated with the escalated concentrations of PtPT for 48 h before performing the MTS assay. The absorbance at 490 nm was detected using aplate reader (Varioskan Flash 3001, Thermo, Waltham, MA, USA). The drug concentration that induced 50% inhibition of cell growth (IC 50 ) was calculated by regression fitting of a dose-response curve.

Analys av celldöd

The CML cells were treated with increasing concentrations of PtPT for durations as indicated in the figures, 0.4% Trypan blue solution was added to monitor temporal changes in the incidence of cell death under the light microscope. Cell apoptosis was evaluated by using of Annexin V/propidium iodide (PI) binding assay according to the instruction of the manufacturer (Sigma-Aldrich). The samples were analyzed using FACSCalibur flow cytometer and CellQuestPro software as previously described. 34, 41 The Annexin V/PI-positive cells in the culture dish were also imaged with an inverted fluorescence microscope equipped with a digital camera (AxioObsever Z1, Zeiss, Germany).

Determination of mitochondrial membrane potential

The mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of PtPT-treated and untreated cells were measured using rhodamine-123 (Sigma-Aldrich) staining. After being treated with PtPT for 24 h, the cells were incubated with Rh123 (2.5 μ g/ml) for further 30 min at 37 °C in the dark. The cells were washed twice with PBS before they were collected for flow cytometry analysis.

Western blot-analys

Western analyses were performed as previously described. 41, 45 The whole cell lysates were prepared in RIPA buffer(1 × PBS, 1% NP-40, 0.5% sodiumdeoxycholate, 0.1% SDS) supplemented with freshly added 10 mM β -glycerophosphate, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1X Roche Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN, USA). The cytosolic fraction was prepared with digitonin extraction buffer (10 mM PIPES (pH 6.8), 0.015% (wt/vol) digitonin, 300 mM sucrose, 100 mMNaCl, 3 mM MgCl 2, 5 mM EDTA and 1 mM PMSF) to detect the levels of cytochrome c and AIF in the cytosol.

Proteasomal activity assay

The 20 S proteasomal peptidase activities were measured using synthetic fluorogenic substrates. To evaluate in vitro proteasome inhibition, the CML cells were lysed in ice-cold lysis buffer (25 mM Tris-HCl) for 10 min. Equal amounts of protein from each sample were then treated with PtPT, PS341 or b-Ap15 for 30 min, and then incubated at 37 °C with specific fluorogenic substrates (25 μ M) for 1–2 h in the dark. The substrates used were Suc-LLVY-AMC for chymotrypsin-like activity, Z-LLE-AMC for caspase-like activity and Boc-LRR-AMC for trypsin-like activity. Fluorescence intensity was measured using a spectrophotometer at excitation of 350 nm and emission of 438 nm (Varioskan Flash 3001, Thermo).

RNA isolation and reverse transcriptase real-time quantitative polymerase chain reaction (RT 2 -PCR)

Total RNA was extracted by using Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as the manufacturer recommended. After quantification by spectrophotometry, the first-strand cDNA was synthesized from 500 ng total RNA using the RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa, Dalian, China) and random primers according to the manufacturer's instructions. RT 2 -PCR was performed using SYBR Premix Ex TaqIIKit (TaKaRa) and Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems. The relative gene expression was analyzed by the Comparative Ct method using 18 S ribosomal RNA as the endogenous control. The primers for real-time PCR are as follows: Bcr-Abl forward, 5′-AAGCGCAACAAGCCCACTGTCTAT-3′; reverse, 5′-CTTCGTCTGAGATACTGGATTCCT-3′. 18 S forward, 5′-AAACGGCTACCACATCCAAG-3′; reverse, 5′-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3′.

Tumor xenograft experiments

The male nu/nu BALB/c mice were bred at the animal facility of Guangzhou Medical University. The mice were housed in barrier facilities with a 12 h light–dark cycle, with food and water available ad libitum . KBM5 or KBM5R cells (2 × 10 7 ) were inoculated subcutaneously on the flanks of 5- to 6-week-old male nude mice. At 72 h after the inoculation, the mice were treated with either PtPT (7 mg/kg/day) or equivalent volume of the vehicle comprising DMSO, polyethylene glycol 400 and 0.9% NaCl in a 1:3:6 (v:v:v) ratio, for a total of 11 or 14 days. The tumors were measured every other day using calipers. The tumor volumes were calculated with the following formula: a 2 × b × 0.4, where a is the smallest diameter and b is the diameter perpendicular to a . The body weight, feeding behavior and motor activity of each animal were monitored as indicators of general health. The animals were then euthanized, and tumor xenografts were immediately removed, weighed, stored and fixed for biochemical or histological analyses. All animal studies were conducted with the approval of the Guangzhou Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.

Immunohistokemisk färgning

Formalin-fixed xenografts were embedded in paraffin and sectioned using standard techniques. Tumor xenograft sections were immunostained for c-Abl, Ubs, p27 and Ki-67. MaxVision TM reagent (MaixinBiol, Fuzhou, China) was applied to each slide according to the manufacturer's instructions. The color was developed with 0.05% diaminobenzidine and 0.03% H 2 O 2 in 50 mmol/l Tris-HCl (pH 7.6), and the slides were counterstained with hematoxylin. A negative control for every antibody was also included for each xenograft specimen by substituting the primary antibody with pre-immune serum.

Statistisk analys

All the experiments were performed at least thrice, and the results are expressed as mean±95% confidence interval (CI) where applicable. Programvaran GraphPad Prism 5.0 användes för statistisk analys. Comparisons between two groups involved two-tailed Student's t -test, and comparisons among multiple groups involved one-way ANOVA with post hoc intergroup comparison using Tukey test. P -value of <0.05 was considered statistically significant.