Paqr10 och paqr11 förmedlar ras-signalering i golgi-apparaten | cellforskning

Paqr10 och paqr11 förmedlar ras-signalering i golgi-apparaten | cellforskning

Anonim

Abstrakt

Ras spelar en viktig roll i många cellulära aktiviteter, och dess subcellulära avdelning ger rumslig och temporär selektivitet. Här rapporterar vi ett sätt för rumslig reglering av Ras-signalering i Golgi-apparaten med två mycket homologa proteiner PAQR10 och PAQR11 från progestin- och AdipoQ-receptorfamiljen. PAQR10 och PAQR11 är exklusivt lokaliserade i Golgi-apparaten. Överuttryck av PAQR10 / PAQR11 stimulerar basal och EGF-inducerad ERK-fosforylering och ökar uttrycket av ERK-målgener på ett dosberoende sätt. Överuttryck av PAQR10 / PAQR11 förhöjer markant Golgi-lokalisering av HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B. PAQR10 och PAQR11 kan också interagera med HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B. Det ökade Ras-proteinet vid Golgi-apparaten genom överuttryck av PAQR10 / PAQR11 är i ett aktivt tillstånd. Konsekvent minskar knockdown av PAQR10 och PAQR11 EGF-stimulerad ERK-fosforylering och Ras-aktivering vid Golgi-apparaten. Spännande, PAQR10 och PAQR11 kan interagera med RasGRP1, ett guanin-nukleotidutbytesprotein från Ras och öka Golgi-lokaliseringen av RasGRP1. Cl-domänen för RasGRP1 är både nödvändig och tillräcklig för interaktionen av RasGRP1 med PAQR10 / PAQR11. Simuleringen av ERK-fosforylering med överuttryckt PAQR10 / PAQR11 upphävs genom nedreglering av RasGRP1. Dessutom förbättras differentiering av PC12-celler signifikant genom överuttryck av PAQR10 / PAQR11. Sammantaget avslöjar denna studie ett nytt paradigm för rumslig reglering av Ras-signalering i Golgi-apparaten av PAQR10 och PAQR11.

Introduktion

Ras-proteiner är väsentliga komponenter i intracellulära signaleringskaskader som reglerar en rad grundläggande cellulära aktiviteter, inklusive spridning, apoptos, differentiering och senescens 1 . Nyligen har avdelad signalering blivit ett viktigt tema som ger en ökad komplexitet för signaltransduktion 2, 3 . Förutom sina huvudsakliga åtgärder på plasmamembranet (PM) har Ras-medierad signalering observerats i endosomer 4, 5, endoplasmatisk retikulum (ER) 6, 7, Golgi-apparat 4, 8, 9 och mitokondrier 10, 11 . Stillasproteiner, guaninbytningsfaktorer (GEF) och adapterproteiner är inblandade i den rumsliga regleringen av Ras-medierad signalering på inre membran. Ras-signalering i endosomer medieras av MP1 12, p14 13 och p-arrestin 14 . Ras-signalering i Golgi-apparaten involverar RasGRP1 15 och PLCy 16, medan Ras till ERK-signalering i ER kan förmedlas av RasGRFs 6 .

Ras genomgår en dynamisk handel inom celler på ett membranbegränsat sätt 17, 18 . Det finns fyra isoformer av Ras-proteiner: HRas, NRas, KRas4A och KRas4B. Alla fyra Ras-isoformer delar> 90% sekvenshomologi. Den huvudsakliga strukturella skillnaden mellan Ras-isoformer är lokaliserad vid C-terminalen 23-24aa hypervariable region (HVR), som innehåller de membran-interagerande sekvenserna. Å andra sidan är regionerna för effektorinteraktion och guaninnukleotidbindning nästan identiska bland Ras-isoformer. Efter att ha syntetiserats i cytosolisk ribosom genomgår alla fyra Ras-isoformer farnesylering i cytosolen vid cysteinen i det C-terminala CAAX-motivet med farnesylproteintransferas, följt av proteolys av AAX-sekvensen i ER. Farnesylering av Ras-proteiner ger endast en svag signal för membranbindning, och ett andra motiv i HVR krävs för membranassociation 19 . När det gäller HRas, NRas och KRas4A består den andra membranförankringssignalen av en eller två palmitoyleringsgrupper (en för NRas och KRas4A, två för HRas) vid cystein (er) intill den farnesylerade cystein. Palmitoyleringen av dessa Ras-proteiner sker vid ytan av Golgi-apparaten och de palmitoylerade Ras-traffikerna till PM via en utsöndringsväg och infogas i PM. Å andra sidan består den andra membraninriktningssignalen för KRas4B av en hexa-lysin-polybasisk sekvens som elektrostatiskt samverkar med sur lipidhuvudgrupp från PM. Därför kan skillnaden i palmitoylering av Ras-isoformer förklara varför HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B, kan lokaliseras vid Golgi-apparaten. Dessutom genomgår palmitoylerade Ras-proteiner en dynamisk de / re-acyleringscykel och depalmitoylering avlägsnar Ras från PM, och de enbart farnesylerade Ras återuppdelas snabbt till andra intracellulära membran, såsom ER och Golgi-apparat 20 . Ras-proteiner repalmitoyleras i Golgi och omdirigeras sedan tillbaka till PM via utsöndringsvesiklar. Under den dynamiska avdelningen av Ras i en cell kan Golgi-poolen av palmitoylerade Ras betraktas som en människohandel mellanprodukt. Det är för närvarande okänt varför palmitoylerad Ras har en relativt hög koncentration i Golgi-apparaten. Det har insett att tillväxtfaktorinducerad aktivering av Ras-signalering på PM är snabb och övergående, medan Ras-signalering i Golgi-apparaten försenas och upprätthålls 9, 20, 21 . Hur Ras-aktivitet i Golgi-apparaten kan upprätthållas och frånkopplas från initial aktivering på PM vid tillväxtfaktorstimulering förblir emellertid oklart 17 .

PAQR-familjen (progestin och AdipoQ-receptorer) identifierades först 2005 22, kännetecknad av ett gammalt sju-transmembranmotiv. Evolutionsanalys avslöjar att PAQR-familjemedlemmar finns i hela det eukaryota riket, såväl som i utvalda arter av eubakterier 22 . Elva PAQR-familjemedlemmar upptäcktes hos människor med hög bevarande. Förekomsten av PAQR-familjemedlemmar i gamla arter och de höga bevarandeegenskaperna indikerar att proteinerna i denna familj kan ha viktiga biologiska funktioner. Nyligen identifierade vårt laboratorium den biologiska funktionen hos PAQR3 inom PAQR-familjen och döpte om den till RKTG (Raf-kinasfångst till Golgi) 23 . Vi fann att RKTG fungerar som en negativ regulator av Ras till ERK-signalering genom att sekvratera Raf-kinas i Golgi-apparaten 23, 24, och en sådan reglering är sannolikt förknippad med utvecklingen av cancer i musmodellerna 24, 25 . Adiponectinreceptorer (PAQR1 och PAQR2), förutom deras etablerade roll i glukos- och lipidmetabolismen 26, befanns också reglera p38 26, JNK 27 och tumorigenes 28, 29, 30 . Dessa fynd indikerar därför att medlemmar i PAQR-familjen kan reglera grundläggande cellaktiviteter genom MAPK-signalvägar.

I pilotstudier analyserade vi den subcellulära fördelningen av PAQR-familjemedlemmar och observerade att PAQR10 och PAQR11 uteslutande var lokaliserade i Golgi-apparaten, liknande PAQR3 / RKTG. Bland de 11 PAQR-medlemmarna har PAQR10 och PAQR11 den djupaste evolutionära roten, med en hög sekvenslikhet med proteinerna av hemolysin III-typen 22 . PAQR11 uppvisar en relativt allestädes närvarande distribution i en majoritet av vävnader inklusive lunga, tarmen, skelettmuskeln, fett och hjärta, medan PAQR10 uttrycks starkt i hjärnan och testiklarna 22 . PAQR11 kan ha effekter på makrofagdifferentiering 31, men de biologiska verkningarna av PAQR10 och PAQR11 förblir dåligt löst. I denna studie, med användning av molekylära och cellulära tillvägagångssätt, visar vi att PAQR10 och PAQR11 kan binda, mobilisera och aktivera Ras i Golgi-apparaten, vilket leder till aktivering av ERK-signalväg i Golgi-apparaten och därigenom identifierar PAQR10 och PAQR11 som en ny klass av Ras-modulatorer i Golgi-apparaten.

Resultat

PAQR10 och PAQR11 är lokaliserade till Golgi-apparaten

PAQR10 och PAQR11 är två mycket homologa proteiner inom PAQR-familjen med en sekvenshomologi på 83% på aminosyranivån. Hydrofobicitetsanalys indikerade att både PAQR10 och PAQR11 innehåller sju transmembrandomäner (kompletterande information, figur S1), liknande den topologiska strukturen hos andra medlemmar i PAQR-familjen 22, 23, 26 . För att identifiera de potentiella cellulära funktionerna hos dessa två gener undersökte vi först subcellulär distribution av PAQR10 och PAQR11. När transient transfekterades till Hela-celler begränsades N-terminalt märkta humana PAQR10 och PAQR11 till Golgi-apparaten och kolokaliserades med Golgin-97, en Golgi-markör (figur 1A). För att ytterligare bekräfta att PAQR10 och PAQR11 är Golgi-proteiner genererade vi polyklonala antikroppar mot PAQR10 respektive PAQR11 (Kompletterande information, figur S2). Konsekvent fann vi att färgningsmönstret för endogent PAQR11 överlappade väl med Golgin-97 i A549-celler, som uttrycker höga nivåer av PAQR11 (figur IB).

Image

PAQR10 och PAQR11 är lokaliserade i Golgi-apparaten och aktiverar Ras / ERK-signalering. (A) Ectopiskt uttryckta PAQR10 och PAQR11 är lokaliserade i Golgi-apparaten. Hela-celler transfekterades med flaggmärkt PAQR10 och PAQR11, följt av immunfärgning och konfokal analys. Golgien märktes av Golgin-97. (B) Endogen PAQR11 är lokaliserad i Golgi. A549-celler färgades med affinitetsrenad, anti-PAQR11-antikropp och Golgi-markören Golgin-97. (C) Dosberoende aktivering av ERK-fosforylering med PAQR10 och PAQR11. HEK293T-celler transfekterades transient med ökande mängder av Flaggmärkt PAQR10 (vänster panel) eller Flaggmärkt PAQR11 (höger panel). Tjugofyra timmar efter transfektion svärvades cellerna under 6 timmar och celllysatet användes vid immunoblotting, med användning av antikroppar mot fosforylerad ERK, total ERK och Flag-tagg. Samma experiment genomfördes minst tre gånger, och en av de representativa uppgifterna visas. Detta är samma för de flesta immunoblottinganalyser under hela studien. (D) PAQR10 och PAQR11 förbättrar och förlänger EGF-inducerad ERK-signalering. HEK293T-celler transfekterades transient med flaggmärkt PAQR10 och PAQR11. Tjugofyra timmar efter transfektion var cellerna svältar i 6 timmar före behandling med EGF (100 ng / ml) under olika tidslängder. Totalt celllysat användes vid immunblotting. (E) PAQR10 stimulerar expression av transkriptionsfaktorer nedströms ERK på ett dosberoende sätt. HEK293T-celler transfekterades transient med ökande mängder Flag-PAQR10. 24 timmar efter transfektion uppsamlades cellerna och realtids RT-PCR användes för att bestämma uttrycket av cFos, junB, Egr-1 och actin. Vikförändring av varje gen jämfört med aktin visades som medelvärde ± SD för tre oberoende experiment. Vikningsändringen i kontrollgruppen sattes till 1. * P <0, 05 och ** P <0, 01 i jämförelse med kontrollgruppen. (F) PAQR10-medierad stimulering av ERK-fosforylering hämmas av GFP-RBD och PD98059. HEK293T-celler transfekterades transient med plasmiderna eller behandlades med 10 mikrometer PD98059 såsom anges. 24 timmar efter transfektion svärvades cellerna under 6 timmar och det totala celllysatet användes vid immunblotting. Den högra panelen representerar pERK / total ERK-förhållande (medelvärde ± SD) beräknat från densitometeranalyser av tre oberoende experiment. ** P <0, 01 jämfört med kontrollgruppen och ^^ P <0, 01 jämfört med PAQR10 enbart.

Bild i full storlek

Aktivering av ERK-signalering av PAQR10 / PAQR11

Medlemmar i PAQR-familjen har varit inblandade i regleringen av MAPK-signalväg 23, 26, och så undersökte vi ERK-signalering efter graderat överuttryck av PAQR10 / PAQR11. I HEK293T-celler ökade överuttrycket av PAQR10 eller PAQR11 dosberoende beroende på fosforylering av ERK (figur IC). Överuttryck av PAQR10 eller PAQR11 förbättrade och förlängde också fosforylering av ERK vid EGF-behandling (figur 1D). Som kontroll hade en annan medlem av PAQR-familjen, AdipoR2 (PAQR2), liten effekt på EGF-stimulerad ERK-fosforylering (kompletterande information, figur S3). Vi undersökte också expressionsnivåerna för några få målgenströmmar efter ERK-signalering, inklusive c-Fos , JunB och Egr-1 . Konsekvent förhöjde överuttrycket av PAQR10 expressionsnivåerna för dessa gener på ett dosberoende sätt (figur 1E). Som ett kontrollexperiment hade TGN38, ett annat Golgi-lokaliserat protein 32, ingen effekt på uttrycket av dessa gener (Kompletterande information, figur S4). Dessutom fann vi att PAQR10-aktiverad ERK-fosforylering upphävdes av hämmare som var specifika för Ras-signaleringskaskaden (figur 1F). Grönt fluorescensprotein-Ras-bindande domän (GFP-RBD) är en RBD av Raf-1 smält med GFP och detta protein kan effektivt binda med Ras i det GTP-bundna tillståndet och konkurrerande hämma Ras-aktivitet 9, 33, 34 . PD98059 är en specifik hämmare av MEK. Den PAQR10-inducerade transkriptionen av Egr-1 blockerades av GFP-RBD och PD98059 (kompletterande information, figur S5). Dessa data indikerar tillsammans att PAQR10 och PAQR11 kan aktivera Ras / ERK-signalväg.

PAQR10 och PAQR11 ökar retentionen av HRas, NRas och KRas4A i Golgi-apparaten

Med tanke på att PAQR10 / PAQR11 är Golgi-lokaliserade proteiner och kan direkt verka på Ras-signalering undersökte vi därefter om de kan förändra lokalisering av Ras-protein i Golgi-apparaten. Hos människor finns fyra Ras-isoformer inklusive HRas, NRas, KRas4A och KRas4B 35 . Dessa fyra isoformer har nästan fullständig sekvensbevaring i den N-terminala regionen, med Ras HVR i C-terminalen som möjliggör differentiell membraninriktning och lokalisering 19, 36, 37 . Alla Ras-isoformer uppvisar PM-lokalisering, medan graden av endomembran lokalisering varierar med en annan grad av affinitet för Golgi-apparaten i storleksordningen NRas ≥ HRas, KRas4A >> KRas4B 38 .

När HRas överuttrycktes i Hela-celler var det till stor del lokaliserat på PM med lite Golgi-lokalisering (figur 2A), i överensstämmelse med tidigare rapporter 4, 8 . Emellertid, när samuttryckt med flaggmärkt PAQR10 eller PAQR11, ökades lokaliseringen av HRas i Golgi-apparaten signifikant med en tydlig kolokalisering med PAQR10 / PAQR11 och Golgin-97 (figur 2A). Överuttryck av PAQR10 / PAQR11 ökade också markant Golgi-lokalisering av NRas och KRas4A (figur 2B och 2C), men inte KRas4B (figur 2D). Som ett kontrollexperiment hade PAQR10 liten kolokalisering med GFP (kompletterande information, figur S6A) och ytterligare ett litet G-protein Rac1 (kompletterande information, figur S6B). PAQR11 kunde inte heller öka Golgi-lokaliseringen av CD-MPR (Kompletterande information, figur S6C), som tidigare rapporterades till trafik genom Golgi-apparaten 39 . I MDCK-celler förhöjde PAQR10 också Golgi-lokalisering av HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B (Kompletterande information, figur S7). Dessutom, i överensstämmelse med våra resultat, minskades mängden HRas på PM signifikant med PAQR10 / PAQR11-överuttryck, medan mängden HRas i Golgi-apparaten ökades signifikant (Kompletterande information, figur S8). Sammantaget indikerar dessa data att PAQR10 och PAQR11 kan förbättra lokalisering av HRas, NRas och KRas4A i Golgi-apparaten (sammanfattad i figur 2E).

Image

Kolokalisering och interaktion mellan PAQR10 och PAQR11 med Ras. (AD) Analyser av kolokalisering av PAQR10 / PAQR11 med olika former av Ras: HRas (A), NRas (B), KRas4A (C) och KRas4B (D) . Hela-celler transfekterades med GFP-fuserade Ras-plasmider såsom indikerats med eller utan Flagg-märkt PAQR10 eller Flagg-märkt PAQR11, följt av immunfärgning och konfokal analys. Pilarna indikerar uppenbara kolokaliseringssignaler i Golgi-apparaten. (E) Kvantifiering för data från A till D. Den relativa signalintensiteten för olika Ras-proteiner vid Golgi-apparaten kvantifierades och visades som medelvärde ± SD. ** P <0, 01 jämfört med gruppen med Ras uttryckt enbart. (F) Interaktion mellan PAQR10 / PAQR11 med HRas, NRas och KRas4A. HEK293T-celler transfekterades transient med GFP-fusionerad HRas, NRas, KRas4A, KRas4B, Rac1 och CD-MPR, med flaggmärkt PAQR10 (vänster panel) eller Flaggmärkt PAQR11 (höger panel) såsom indikerats. Tjugofyra timmar efter transfektion användes celllysat vid immunutfällning (IP) och immunblotting (IB) med antikropparna såsom anges. (G) Interaktion mellan endogent PAQR10 och endogent Ras. Totalt celllysat från Hela-celler utsattes för IP med en anti-PAQR10-antikropp följt av IB med antikroppar mot pan-Ras och PAQR10. Kanin IgG användes som en negativ kontroll.

Bild i full storlek

Interaktion mellan PAQR10 och PAQR11 med Ras

För att ge bevis på att PAQR10 / PAQR11 kan bilda ett komplex med Ras, använde vi co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser för att analysera in vivo- interaktionen mellan proteinerna. Vi fann att immunutfällning av både PAQR10 och PAQR11 kunde dra ner HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B (figur 2F). Omvänt kunde immunutfällning av HRas, NRas och KRas4A, men inte KRas4B, dra ner PAQR10 och PAQR11 (Kompletterande information, figur S9). I överensstämmelse med kolokaliseringsdata (kompletterande information, figur S6), Rac1 och CD-MPR hade ingen interaktion med PAQR10 / PAQR11 (figur 2F och kompletterande information, figur S9). Dessutom fann vi att endogena Ras också kunde interagera med endogena PAQR10 i Hela-celler (figur 2G). Dessa data indikerar tillsammans att PAQR10 och PAQR11 fysiskt kan associeras med flera former av Ras.

Aktivering av Ras av PAQR10 och PAQR11 i Golgi-apparaten

Eftersom PAQR10 och PAQR11 kan interagera med Ras, förbättra lokaliseringen av Ras i Golgi-apparaten och höja ERK-signaleringskaskaden, antog vi att Golgi-lokaliserade Ras medierade av PAQR10 / PAQR11 bör vara i en aktiv form. För att lösa detta problem använde vi en tidigare välkarakteriserad in situ- markör för aktiverad Ras, GFP-RBD, en RBD av Raf-1 smält med GFP 9, 33 . Under ostimulerat tillstånd var GFP-RBD primärt lokaliserad i kärnan och inte associerad med några intracellulära strukturer, inklusive PM (figur 3A), i överensstämmelse med tidigare rapporter 9, 33 . Men när GFP-RBD samuttrycktes med PAQR10 eller PAQR11, såg vi uppenbar kolokalisering av GFP-RBD med PAQR10 / PAQR11 och HRas (figur 3B), vilket indikerar att Ras-proteinerna mobiliserade på Golgi-apparaten med PAQR10 / PAQR11 är i en aktiv stat. Vidare fann vi att överuttryck av både PAQR10 och PAQR11 signifikant ökade GTP-bundna Ras, under ostimulerade förhållanden och efter EGF-behandling (figur 3C), vilket ytterligare bekräftade att det PAQR10 / PAQR11-medierade Golgi-lokaliserade Ras-proteinet är aktivt.

Image

Aktivering av Ras i Golgi-apparaten med PAQR10 och PAQR11. (A) Ras är i ett inaktivt tillstånd i ostimulerade celler. Hela-celler transfekterades med GFP-RBD och Myc-taggade HRas och serum-svält över natten före fixering och konfokalanalys. Observera att det inte finns någon kolokalisering av GFP-RBD med HRas. (B) PAQR10 och PAQR11 aktiverar Ras i Golgi-apparaten. Hela-celler samtransfekterades med plasmiderna som angivits och användes för immunförfärgning och konfokal analys. Pilen indikerar ökad aktivering av Ras i Golgi-apparaten med PAQR10 och PAQR11 såsom avslöjats av GFP-RBD samlokaliserat med PAQR10 / PAQR11 och HRas. Den relativa signalintensiteten för GFP-RBD i Golgi-apparaten kvantifierades och visades i den nedre panelen som medelvärde ± SD. ** P <0, 01 jämfört med gruppen utan PAQR10 / PAQR11-uttryck. (C) PAQR10 / PAQR11-överuttryck ökar aktiveringen av Ras vid EGF-stimulering. HEK293T-celler transfekterades med plasmiderna såsom indikerats. Tjugofyra timmar efter transfektion servelhungades celler under 6 timmar före behandling med EGF (100 ng / ml) under olika längder och celllysatet användes i GST-neddragningsanalys med GST-RBD, följt av immunblotting med antikropparna såsom indikerats.

Bild i full storlek

Nedreglering av PAQR10 / PAQR11 påverkar Ras-signalering i Golgi-apparaten

För att ytterligare utforska den funktionella betydelsen av PAQR10 / PAQR11 på Ras / ERK-signalering, använde vi en siRNA-strategi för att slå ned endogena PAQR10 och PAQR11. Vi bekräftade först effektiviteten av siRNA för att tystna uttrycket av PAQR10 och PAQR11, visat med cirka 50% minskning på proteinnivån (Kompletterande information, figur S10). Hela-celler transfekterades med siRNA-oligos, följt av EGF-stimulering. I överensstämmelse med vår observation från överuttrycksexperimenten (figur 1C och 1D) reducerades fosforyleringsnivåerna för ERK och p90RSK, ett cytosoliskt mål för ERK 40, markant när både PAQR10 och PAQR11 tystades (figur 4A). Fosforyleringsnivåerna för ERK eller p90RSK påverkades inte signifikant när endast PAQR10 eller PAQR11 tystades (figur 4A), troligtvis på grund av den funktionella redundansen hos dessa två proteiner. Därefter genomförde vi en GST-neddragningsanalys för att analysera aktiveringen av endogena Ras (figur 4B). Som förväntat kunde EGF öka mängden GTP-bunden Ras. När PAQR10 och PAQR11 båda tystades reducerades GTP-bundna Ras signifikant vid 40 minuter efter EGF-stimulering. För att bekräfta att tystnadseffekten av PAQR10 / PAQR11 siRNA var specifik konstruerade vi siRNA-resistenta expressionsplasmider PAQR10 (r) respektive PAQR11 (r). Vi fann att upphävandet av Ras-aktivering med PAQR10 / 11 siRNA räddades av PAQR10 (r) och PAQR11 (r) (figur 4B). Vi undersökte också RAS- aktivering in situ med GFP-RBD. När PAQR10 och PAQR11 båda tystades, påverkades inte EGF-medierad snabb aktivering av Ras på PM, men den försenade aktiveringen av Ras i Golgi-apparaten minskades till stor del (figur 4C). Sammantaget indikerar dessa resultat att endogen PAQR10 och PAQR11 är involverade i regleringen av Ras-aktiviteten i Golgi-apparaten.

Image

Nedreglering av PAQR10 / PAQR11 minskar ERK-signalering. (A) Tystnad av PAQR10 och PAQR11 påverkar EGF-inducerad ERK-signalering. Hela-celler transfekterades med syntetiserad siRNA såsom anges. Fyrtioåtta timmar efter transfektion blev cellerna serum-svälta över natten och behandlades med EGF (100 ng / ml). Totalt celllysat användes vid immunoblotting med antikropparna såsom anges. (B) Nedreglerad Ras-aktivitet med PAQR10 / PAQR11 siRNA upphävs av PAQR10 / PAQR11-konstruktioner (PAQR10 (r) och PAQR11 (r)) som är eldfasta mot RNAi-interferens. Hela-celler samtransfekterades med syntetiserad siRNA och plasmiden såsom indikerats. Fyrtioåtta timmar efter transfektion blev cellerna serum-svälta över natten och behandlades med EGF (100 ng / ml). Totalt celllysat användes i en GST-neddragningsanalys med GST-RBD, följt av immunblotting med antikropparna såsom indikerats. (C) Tystnad av PAQR10 / PAQR11 påverkar aktiveringen av Ras i Golgi efter EGF-stimulering. Hela-celler samtransfekterades med syntetiserad siRNA, GFP-RBD och Myc-HRas såsom anges. Fyrtioåtta timmar efter transfektion blev cellerna serumsvalda över natten och behandlades med EGF (100 ng / ml) under de angivna tiderna före immunfärgning och konfokal analys. Pilhuvudet indikerar aktiverade Ras på plasmamembranet och pilen indikerar aktiverade Ras i Golgi. Den relativa signalintensiteten för GFP-RBD vid plasmamembranet (PM) och Golgi-apparaten kvantifierades respektive och visades i de högra panelerna. ** P <0, 01 mellan kontrollgrupp och PAQR10 / PAQR11 siRNA-grupp.

Bild i full storlek

RasGRP1 är involverad i PAQR10 / PAQR11-medierad aktivering av Ras i Golgi-apparaten

Hur kan Ras aktiveras av PAQR10 och PAQR11 i Golgi-apparaten? Klassiskt kräver Ras-aktivering guaninnukleotidutbytningsfaktorer (GEF) som underlättar BNP till GTP-utbyte på Ras. Tidigare har en Ras GEF, RasGRP1, kännetecknats för att translokera till Golgi-apparaten vid extracellulära stimuli och aktiverar Ras i Golgi 15, 16 . Vi analyserade först om RasGRP1 kunde interagera med PAQR10 / PAQR11 genom en sam-IP-analys. När PAQR10 / PAQR11 och RasGRP1 samexprimerades, kunde både PAQR10 och PAQR11 framgångsrikt co-renas med RasGRP1 (figur 5A). Vi fann också att endogen PAQR10 kunde interagera med endogena RasGRP1 (figur 5B). Med tanke på att PAQR10 / PAQR11 fysiskt förknippas med RasGRP1, antog vi att PAQR10 / PAQR11 också kunde öka Golgis lokalisering av RasGRP1. Under tillståndet av serumsvält fördelades RasGRP1 huvudsakligen diffus i cytoplasma och kärna med en liten del lokaliserad till Golgi (figur 5C). Men när PAQR10 eller PAQR11 samexpressades, ökades lokaliseringen av RasGRP1 i Golgi-avdelningen kraftigt under ostimulerat tillstånd (figur 5C). För att ytterligare undersöka om RasGRP1 krävs för att PAQR10 / PAQR11 ska aktivera Ras i Golgi-apparaten använde vi en siRNA-strategi för att slå ner endogena RasGRP1. Tre siRNA-oligos designades och testades (kompletterande information, figur S11), och två av oligos (siRNA-A och siRNA-B) gav effektiv tystnad av RasGRP1 och användes för att transfektera HEK293T-celler. Vi fann att den PAQR10 / PAQR11-inducerade ERK-fosforylering hämmas av RasGRP1-specifika siRNA (figur 5D). I Hela-celler kan RasGRP1-specifik siRNA också upphäva PAQR10 / PAQR11-medierad ackumulering av GFP-RBD i Golgi-apparaten (kompletterande information, figur S12), vilket ytterligare indikerar att RasGRP1 är implicerad i PAQR10 / PAQR11-medierad aktivering av Ras i Ras Golgiapparat.

Image

RasGRP1 är involverad i PAQR10 / PAQR11-medierad aktivering av Ras i Golgi. (A) Interaktion mellan PAQR10 / PAQR11 med RasGRP1. HEK293T-celler transfekterades transient med plasmiderna såsom indikerats. Tjugofyra timmar efter transfektion användes celllysat vid immunutfällning (IP) och immunblotting (IB) med antikropparna såsom anges. (B) Interaktion mellan endogent PAQR10 och endogent RasGRP1. Totalt celllysat av Hela-celler utsattes för IP med en anti-PAQR10-antikropp följt av IB med en antikropp mot human RasGRP1. Kanin IgG användes som en negativ kontroll. (C) PAQR10 / PAQR11 ökar lokaliseringen av RasGRP1 i Golgi-apparaten. Hela-celler transfekterades med GFP-kondenserad RasGRP1 med eller utan flaggmärkt PAQR10 / PAQR11, följt av immunfärgning och konfokal analys. Pilen indikerar kolokalisering av RasGRP1 med PAQR10 eller PAQR11 i Golgi. Den relativa signalintensiteten för RasGRP1 i Golgi-apparaten kvantifierades och visades i den nedre panelen (medelvärde ± SD). ** P <0, 01 jämfört med gruppen med RasGRP1 uttryckt enbart. (D) Tystnad av RasGRP1 påverkar PAQR10 / PAQR11-inducerad ERK-fosforylering. HEK293T-celler transfekterades med syntetiserad siRNA (en förvrängd siRNA och två siRNA för RasGRP1) och flaggmärkt PAQR10 eller PAQR11 såsom anges. Sjuttiotvå timmar efter transfektion svärvades cellerna under 6 timmar och total celllysat användes vid immunoblotting med antikroppar såsom anges. (E) Överuttryck av PAQR10 / PAQR11 ökar proteininteraktionen mellan HRas och RasGRP1. HEK293T-celler transfekterades transient med plasmiderna såsom indikerats. Tjugofyra timmar efter transfektion användes celllysat vid immunutfällning (IP) och immunblotting (IB) med antikropparna såsom anges. (F) Överuttryck PAQR10 / PAQR11 ökar kolokalisering av HRas och RasGRP1 i Golgi samtidigt. Hela-celler transfekterades med plasmiderna såsom indikerats, följt av immunfärgning och konfokal analys. Pilen indikerar kolokalisering av RasGRP1, HRas och PAQR10 / PAQR11 i Golgi. Den relativa signalintensiteten för RasGRP1 och HRas vid Golgi-apparaten kvantifierades och visades i den högra panelen (medelvärde ± SD). ** P <0, 01 jämfört med gruppen utan PAQR10 / PAQR11-uttryck.

Bild i full storlek

Därefter analyserade vi om PAQR10 / PAQR11 hade en effekt på interaktionen mellan RasGRP1 och Ras. Genom en sam-IP-analys fann vi att interaktionen mellan RasGRP1 och HRas knappt kunde detekteras i frånvaro av PAQR10 / PAQR11-överuttryck (figur 5E). Emellertid, när PAQR10 eller PAQR11 samexpressades, var samverkan mellan RasGRP1 och HRas signifikant förhöjd (figur 5E). Som kontroll förhöjdes inte interaktionen mellan RasGRP1 och HRas med RKTG / PAQR3 (figur 5E), ett annat Golgi-lokaliserat protein 23 . I överensstämmelse ökade överuttrycket av PAQR10 eller PAQR11 kraftigt Golgi-lokaliseringen av RasGRP1 och HRas samtidigt (figur 5F). Intressant nog var den ökade Golgi-lokaliseringen av HRas med PAQR10 / 11 och interaktionen mellan PAQR10 / 11 och HRas oberoende av RasGRP1, eftersom knockdown av RasGRP1 inte hade någon effekt på dessa händelser (Kompletterande information, figur S13). Sammantaget indikerar dessa data att PAQR10 / PAQR11 kan förbättra interaktionen mellan RasGRP1 och Ras i Golgi-apparaten, där Ras aktiveras av RasGRP1.

Därefter försökte vi identifiera de domäner / domäner som är nödvändiga för interaktionen mellan RasGRP1 och PAQR10 med användning av olika raderings- eller trunkeringsformer för RasGRP1 15, 41 (figur 6A). PAQR10 kunde avsevärt öka Golgi-lokaliseringen av RasGRP1 i full längd, liksom dess mutanta RasGRP1 (1-606) som hade en radering av C-terminalen innehållande SuPT- och PT-domäner (figur 6B). Däremot kunde PAQR10 inte öka Golgi-lokaliseringen av RasGRP1 (1-542) som saknar C1-, SuPT- och PT-domänerna (figur 6B). Baserat på dessa iakttagelser antog vi att C1-domänen kan vara kritisk för interaktionen mellan PAQR10 och RasGRP1. För att ta itu med denna hypotes genererade vi en annan RasGRP1-mutant som hade en radering av C1-domänen (RasGRP1ΔC1). Vi observerade att PAQR10 inte kunde förhöja Golgi-lokalisering av denna mutant (figur 6B). Dessutom konstruerade vi en avkortad version av RasGRP1, som endast innehöll C1-domänen (RasGRP1-C1). Intressant nog fann vi att PAQR10 betydligt kunde öka Golgi-lokaliseringen av RasGRP1-C1 (figur 6C). Dessa resultat indikerar därför att Cl-domänen för RasGRP1 är både nödvändig och tillräcklig för mobilisering av RasGRP1 till Golgi-apparaten med PAQR10. För att ytterligare bekräfta dessa resultat utförde vi co-IP-analyser för att analysera interaktionen mellan PAQR10 och RasGRP1-C1. Genom tvåvägs sam-IP-analyser fann vi att PAQR10 kunde interagera med C1-domänen i RasGRP1 (figur 6D). Sammanfattningsvis visade vi att C1-domänen för RasGRP1 är väsentlig för interaktionen av RasGRP1 med PAQR10, och sådan interaktion är inblandad i att knyta RasGRP1 till Golgi-apparaten med PAQR10.

Image

C1-domänen för RasGRP1 är involverad i dess interaktion med PAQR10. (A) Schematisk representation av RasGRP1-proteinerna som användes i experimenten. REM, Ras utbytesmotiv; GEF, guaninnukleotidutbytedomän som katalyserar GTP-belastning av Ras GTPaser; EF, EF-händer, kalciumbindande motiv; Cl, phorbolestrar / diacylglycerolbindande domän; PT och SuPT, plasmamembranet riktar till reglerande domäner. (B, C) Kolokalisering av PAQR10 med olika deletionsmutanter av RasGRP1. Hela-celler samtransfekterades med olika GFP-fuserade RasGRP1-mutanter med eller utan flaggmärkt PAQR10, följt av immunfärgning och konfokal analys. Pilen indikerar kolokalisering av RasGRP1-mutanter med PAQR10 i Golgi-apparaten. (D) Interaktion mellan PAQR10 och Cl-domänen för RasGRP1. HEK293T-celler transfekterades transient med plasmiderna såsom indikerats. Tjugofyra timmar efter transfektion användes celllysatet vid immunutfällning (IP) och immunblotting (IB) med antikropparna såsom anges.

Bild i full storlek

PAQR10 och PAQR11 förstärker differentiering av PC12-celler

Vi använde nästa PC12-cell som en cellulär modell för att undersöka den potentiella biologiska aktiviteten hos PAQR10 / 11. Det har rapporterats att aktivering av Golgi-lokaliserad Ras-signalering kan främja differentiering av PC12-celler 16 . När PAQR10 eller PAQR11 uttrycktes i PC12-celler, kunde endera av dem signifikant stimulera neuritutväxt (figur 7), en markör för PC12-celldifferentiering. Vidare fann vi att PC12-celldifferentiering inducerad genom samuttryck av HRas och RasGRP1 förbättrades signifikant genom PAQR10 eller PAQR11-överuttryck (figur 7B), vilket ytterligare stödjer vår modell att PAQR10 / 11 kunde aktivera en varaktig Ras-signalering i Golgi-apparaten.

Image

PAQR10 och PAQR11 förstärker PC12-celldifferentiering. PC12-celler samtransfekterades med pEGFP och överskott av andra plasmider såsom anges, och neuritutväxt analyserades 48 timmar senare. Representativa bilder visas i A och den statistiska analysen visas i B. * P <0, 05 och ** P <0, 01 jämfört med gruppen utan PAQR10 / PAQR11-uttryck.

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie demonstrerar vi för första gången att PAQR10 och PAQR11, de två Golgi-lokaliserade transmembranproteinerna, kan interagera med Ras och förbättra dess retention och aktivitet i Golgi-apparaten. Dessutom höjs lokaliseringen av RasGRP1 i Golgi-apparaten och interaktionen mellan Ras och RasGPR1 med PAQR10 / PAQR11. Differentieringen av PC12-celler som stimuleras av Ras och RasGRP1 förbättras också genom överuttryck av PAQR10 och PAQR11. Dessa fynd avslöjar därför ett nytt paradigm genom vilket Ras-signalering regleras i Golgi-apparaten via koordinerande aktiviteter för PAQR10 / PAQR11-proteinerna.

Det har insett att Ras-proteiner (förutom KRas4B) genomgår en dynamisk handel inom en cell via de / re-palmitoylering. Depalmitoylering avlägsnar Ras från PM och tillåter Ras att återuppdelas till andra intracellulära membran såsom ER och Golgi-apparater. Ras-proteiner repalmitoyleras i Golgi-apparaten och retrograderas sedan till PM via den sekretoriska vägen. Med tanke på sin unika roll i Ras palmitoylation, betraktas Golgi-apparater som en människohandel mellan Ras-proteiner. Det var emellertid okänt varför palmitoylerad Ras har en relativt hög koncentration i Golgi-apparaten. Vidare var det oklart hur Ras-aktivitet i Golgi-apparaten kan upprätthållas och frånkopplas från initial aktivering på PM vid stimulering av tillväxtfaktorer på cellytan. Våra studier indikerar att PAQR10 och PAQR11 är inblandade i att binda samman Ras till Golgi och upprätthålla Ras-aktivitet i denna organell. Överuttryck av PAQR10 och PAQR11 ökade markant Golgi-lokaliseringen av palmitoyleringsreglerade Ras-isoformer (figur 2). PAQR10 och PAQR11 interagerade också med dessa Ras-proteiner genom sam-IP-analyser (figur 2). Därför kan PAQR10 / 11 direkt eller indirekt tjäna som ett ställningsprotein för att öka retentionen av Ras-proteiner i Golgi-apparaten. Å andra sidan kan PAQR10 / 11 också bindas till aktiverad Ras till Golgi-apparaten efter att Ras har tagits bort från PM via snabb depalmitoylering vid stimulering av tillväxtfaktor. Denna idé stöds av vårt konstaterande att EGF-stimulerad och försenad Ras-aktivitet i Golgi-apparaten upphävdes genom nedreglering av PAQR10 / PAQR11 (figur 4C).

Det har varit känt att tillväxtfaktorinducerad aktivering av Ras-signalering på PM är snabb och övergående, medan Ras-aktivitet i Golgi är försenad och upprätthålls 9, 20, 21 och den ökade Ras-aktiviteten i Golgi via PAQR10 / PAQR11 kan ge upphov till en varaktig Ras-signalering. Detta koncept stöds av vårt konstaterande att PC12-differentiering, en process som huvudsakligen förlitar sig på varaktig Ras-signalering 16, 42, förbättrades avsevärt genom överuttryck av PAQR10 och PAQR11 (figur 7). För närvarande är det oklart hur PARQ10 och PAQR11 själva regleras. EGF-behandling tycktes inte ha någon effekt på uttrycket av PAQR10 och PAQR11 (Kompletterande information, figur S14). Det skulle vara viktigt att undersöka regleringen av PAQR10 och PAQR11 i framtiden, eftersom belysning av sådan reglering kan avslöja hur Golgi-begränsad Ras-signalering moduleras.

Golgispecifik aktivering av Ras-signalering involverar RasGRP1, en GEF som regleras av kalcium och diacylglycerol (DAG) 15, 16, 43, 44 . Överuttryck av RasGRP1 leder till Ras-aktivering i Golgi-apparaten 15, och sådan aktivering visar sig vara beroende av PLCy 16 . Baserat på dessa studier föreslogs att signaleringskaskaden av "receptorer / PLCy / DAG-Ca 2+ / RasGRP1" huvudsakligen är inblandad i aktiveringen av Ras-signalering i Golgi-apparaten 45 . I överensstämmelse med tidigare rapporter visar vi att RasGRP1 också är involverad i PAQR10 / 11-medierad aktivering av Ras-signalering i Golgi-apparaten (figur 5 och 6). Våra strukturella studier indikerar att C1-domänen för RasGRP1 är både nödvändig och tillräcklig för interaktion mellan RasGRP1 och PAQR10 (figur 6). C1-domänen identifierades ursprungligen som bindningsstället för DAG och phorbolester 46 . Nyligen konstaterades att Cl-domänen kan tjäna som en proteininteraktionsmodul som reglerar cellulär lokalisering av de Cl-domäninnehållande proteinerna, såsom deras lokalisering i Golgi-apparaten 47 . Därför föreslår vi att C1-domänen för RasGRP1 kan spela en väsentlig roll i PAQR10 / 11-medierad aktivering av Ras-signalering i Golgi-apparaten.

Sammantaget visar våra uppgifter ett nytt paradigm för reglering av Ras-signalering i Golgi-apparaten av PAQR10 och PAQR11. PAQR10 / PAQR11 interagerar direkt eller indirekt med RasGRP1- och Ras-proteiner, ökar lokaliseringen av dessa två proteiner i Golgi-apparaten, där Ras aktiveras genom förhöjd interaktion mellan RasGRP1 och Ras, vilket leder till aktivering av Golgi-begränsad Ras-signaleringskaskad. För närvarande är det okänt om PAQR10 och PAQR11 har andra biologiska aktiviteter utöver sina roller i Golgi-lokaliserad Ras-signalering. Det är vidare anmärkningsvärt att PAQR10 och PAQR11 delar viss grad av sekvenshomologi med andra medlemmar i PAQR-familjen 22 . PAQR1 och PAQR2 är cellyteceptorer för adiponektin och spelar viktiga roller i glukos- och lipidmetabolismen 26 . PAQR3 är ett Golgi-lokaliserat protein som negativt reglerar Ras till ERK-signalering genom att sekvestrera Raf-kinas till Golgi-apparaten 23, 24 . Att ersätta den N-terminala sekvensen för PAQR10 med den för PAQR3 upphävde dock Golgi-lokalisering och Ras-aktivering (Y Chen, opublicerad data), vilket indikerar att en sådan sekvens är nödvändig för PAQR10s unika aktivitet. Vi antyder att den funktionella skillnaden mellan PAQR-medlemmar är beroende av deras strukturella skillnad och cellulära lokalisering. Våra fynd att PAQR10 och PAQR11 är inblandade i att modulera Golgi-lokaliserad Ras-signalering har därför gett ytterligare bevis för att PAQR-familjen med det antika sju-transmembranala motivet har viktiga biologiska aktiviteter.

Material och metoder

plasmider

Mänsklig PAQR10-cDNA i full längd (GenBank-post NM_198403), PAQR11-cDNA (GenBank-post NM_012329) och adiponectinreceptor 2 (GenBank-post NM_024551.2) isolerades från HEK293T-celler med RT-PCR och bekräftades genom DNA-sekvensering. PAQR10, PAQR11 och AdipoR2 subklonades in i däggdjursuttryckningsvektorn pRc / CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med en flaggepitop-etikett tillagd till N-terminalen med en PCR-baserad metod. Konstruktion av PAQR10 / PAQR11 eldfast mot RNA-interferens hanterades genom bearbetning av samma känsla-mutation med användning av en PCR-baserad metod. Den omärkta PAQRlO och PAQRll använd i differentieringen av PC12-celler subklonades i pCS2 + plasmider. HRas (GenBank-posten NM_005343), NRas (GenBank-posten, NM_002524) och KRas4A (GenBank-posten, NM_033360.2) klonades i pEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, CA, USA) för att smälta samman med ett förbättrat grönt fluorescensprotein vid N-terminal. CD-MPR (GenBank-post NM_002355) klonades in i pEGFP-N1 (Clontech) för att smälta samman med ett förbättrat grönt fluorescensprotein vid C-terminalen. RasGRPl i full längd (GenBank-posten NM_011246) isolerades från cDNA från mushjärnan med RT-PCR och bekräftades genom DNA-sekvensering. RasGRP1 cDNA subklonades in i pEGFP-Cl och pcDNA3.1 (+) -vektorer. Deletions- och trunkeringsmutanterna av RasGRP1 genererades med en PCR-baserad metod och bekräftades genom DNA-sekvensering. The RBD of Raf1 was cloned into the pEGFP-C1 (Clontech), as well as the pGEX-4T1 (Clontech) to generate GST-fused RBD. The HA-tagged TGN38 was kindly provided by Dr Juan S Bonifacino (National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, MD, USA).

Cell culture, cell transfection and confocal microscopy

HEK293T, Hela and A549 cells were cultured in DMEM containing 10% FBS. Transient transfection was performed with the polyethylenimine method for HEK293T and Hela cells 48 . The methods for cell fixation, immunofluorescence staining and confocal analyses were described previously 23 . Quantification of proteins localized in the Golgi apparatus and on the PM was performed using LSM images by Zeiss Confocal Microscopy Software and Physiology Software Rel. 3.2 as previously described 9, 49 . The fluorescent signal in the Golgi apparatus was defined by staining with a Golgi marker, Golgin-97. We regarded the dispersed green signals in the cytoplasm as the background fluorescence. The fluorescence signal of the cytosol was subtracted from the signal in the Golgi apparatus and used to measure the fluorescence intensity of the Golgi apparatus. The images presented in the figures were captured using standardized setting and exposure times. More than 100 cells were observed in three independent experiments, and at least 20 cells were randomly chosen and quantified for each experimental group. The experiment of PC12 cell differentiation was performed as previously described 9 . In brief, PC12 cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% horse serum and 5% FBS, and co-transfected with pEGFP vector and five-fold excess of other plasmids. Neurite outgrowth was measured 48 h later and quantified as the number of transected cells (scored by expression of GFP), with at least one neurite with a length equal or longer than the cell body diameter.

Antibodies, immunoblotting and immunoprecipitation

The antibodies were purchased as follows: phospho-ERK1/2 and phospho-p90RSK (Ser-380) from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); monoclonal and polyclonal anti-Flag antibodies from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA); antibodies against Myc, tubulin, RasGRP1 and total ERK 1/2 from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); pan-Ras antibody from BD Bioscience Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA); Golgin-97 monoclonal antibody, Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG, Alexa Fluor 546 goat anti-mouse, rabbit IgG and Hoechst 33342 from Molecular Probes (Eugene, OR, USA); and Cy5-labeled goat anti-mouse IgG from GE Healthcare (Chalfont St Giles, UK). The polyclonal PAQR10 and PAQR11 antibodies were generated by rabbit immunization with a His-tagged fusion protein that contains three hydrophilic regions of human PAQR10 and PAQR11, respectively. For the PAQR10 antibody, a fusion peptide with amino acid residues 1-69, 87-111 and 234-246 were used. For PAQR11 antibody, fusion peptide with amino acid residues 1-60, 85-101 and 221-238 were used. The antibodies were affinity-purified against recombinant GST-fused PAQR10 and PAQR11 polypeptides coupled to Glutathione Sepharose 4B according to the manufacturer's instructions (GE Healthcare). Both immunoblotting and immunoprecipitation assays were previously described by us 23 .

RNA-störning

We used both chemical-synthesized oligos and lentivirus-generated shRNA to interfere with the expression of endogenous genes. Chemical oligos targeting PAQR10 and PAQR11, as well as a nonspecific oligo used as control, were synthesized by GeneChem Co Ltd (Shanghai, China). Three targeted sequences for human RasGRP1 are chosen as follows (shown as the targeting sense sequence: RasGRP1-A: 5′-CCUGAUUGACACAACUCAATT-3′, RasGPR1-B: 5′-GGGAUGAGAUCACAGCCUATT-3′, RasGPR1-C: 5′-GCCCAGUCUUGGUCAGAAATT-3′. Three targeted sequences for PAQR10 and PAQR11 each are chosen as follows: 5′-GGAUGGUGGAACACUGUAU-3′, 5′-GCUUCUCUGCUACGUCGUA-3′, and 5′-GUGCUCAGUAGCCAAACAA-3′ for PAQR10; 5′-AGAUAACAGCAUGGAUUUAA-3′, 5′-AGGACAGUGGAGCAUUGUU-3′, and 5′-GCCACUUAAGGACAGUGGA-3′ for PAQR11; 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ for the nonspecific oligo. To achieve better silencing, mixtures of three oligonucleotides were used to transfect cells for PAQR10 and PAQR11. For lentivirus-mediated RNA interference, FG12 lentiviral vector, which has an independent open reading frame of GFP, was used to produce small, double-stranded shRNA to silence target gene expression; information about this vector system has been described in detail by Qin et al 50 . The targeting sequences are 5′-CTTCTCTGCTACGTCGTA-3′ for PAQR10; 5′-AGATAACAGCATGGATTTA-3′ for PAQR11; 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′ for nonspecific control. The virus was harvested from the culture medium 48 h after transfection, concentrated by centrifugation, and used to infect cells. The infection efficiency was measured by counting GFP-positive cells with a >70% infection efficiency.

Ras activity assay

To detect the GTP-bound Ras, cells were collected and lysed in buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.4), 1% NP40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 and 10% glycerol. After centrifugation, the supernatant were collected and incubated with 20 μg of GST-RBD bound to GSH-beads (Amersham Biosciences, Sweden) at 4 °C for overnight. The beads were then collected and washed by lysis buffer. The amount of precipitated Ras proteins was analyzed by immunoblotting.

RNA-isolering och PCR i realtid

RNA isolation, reverse transcription, RT-PCR and real-time PCR were carried out as described 51 . The sequence of primers for RT-PCR are as follows: 5′-GATGTAAAGACTGCGGGATG-3′ and 5′-TTCTGACCAAGACTGGGCTA-3′ for human RasGRP1; 5′-GCACTCTTCCAGCCTTTCCTG-3′ and 5′-GGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAGC-3′ for human GAPDH. The sequence of primers for real-time PCR are as follows: 5′-CCAGGGCTGGCGTTGTGAAG-3′ and 5′-CTTGGAGTGTATCAGTCAGC-3′ for human c-Fos gene; 5′-CAGCACCTTCAACCCTCAGG-3′ and 5′-GTAACTGGTCTCCACCAGCA-3′ for human Egr-1 gene; 5′-CAGCTACTTTTCTGGTCAGG-3′ and 5′-GTGTAGGCGTCGTCGTGATC-3′ for human JunB gene; 5′-CAGGATGGTGGAACACTGTC-3′ and 5′-ACGGAAGCCATAATCCAGAC-3′ for human PAQR10; 5′-CGCCATTTGGAAATACCTTT-3′ and 5′-TCCCAAGTGCCATAATTGAA-3′ for human PAQR11; 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′ and 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′ for human actin.

Statistisk analys

Student's t -test is used for all the statistical analysis.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Tilläggsinformation, figur S1

    Hydrophobicity analysis of PAQR10 and PAQR11.

  2. 2.

    Tilläggsinformation, figur S2

    Characterization of PAQR10/11 antibodies.

  3. 3.

    Tilläggsinformation, figur S3

    PAQR10 but not AdipoR2 can activate ERK signaling.

  4. 4.

    Tilläggsinformation, figur S4

    A Golgi-specific protein TGN38 does not affect ERK signaling.

  5. 5.

    Tilläggsinformation, figur S5

    PAQR10-mediated stimulation of Egr-1 gene expression is inhibited by GFP-RBD and MEK inhibitor PD98059.

  6. 6.

    Tilläggsinformation, figur S6

    Control experiments for confocal studies.

  7. 7.

    Tilläggsinformation, figur S7

    PAQR10 increases Golgi localization of HRas, NRas, KRas4A but no KRas4B in the Golgi apparatus in MDCK cells.

  8. 8.

    Tilläggsinformation, figur S8

    The distribution of HRas on the plasma membrane and Golgi apparatus is affected by PAQR10/PAQR11 overexpression.

  9. 9.

    Tilläggsinformation, figur S9

    Interaction of PAQR10/PAQR11 with HRas, NRas and KRas4A.

  10. 10.

    Tilläggsinformation, figur S10

    Analysis of PAQR10/PAQR11 siRNA efficiency.

  11. 11.

    Tilläggsinformation, figur S11

    Analysis of RasGRP1 siRNA efficiency.

  12. 12.

    Supplementary information, Figure S12

    Silencing of RasGRP1 affects activation of Ras in the Golgi apparatus by PAQR10/PAQR11 overexpression.

  13. 13.

    Supplementary information, Figure S13

    Knockdown of RasGRP1 does not affect PAQR10/PAQR11-induced Golgi localization of HRas and the interaction between HRas and PAQR10/PAQR11.

  14. 14.

    Supplementary information, Figure S14

    EGF treatment has no effect on the expression of PAQR10 and PAQR11.

    (Tilläggsinformation är länkad till onlineversionen av uppsatsen på webbplatsen Cell Research .)