P97 atpasen associerar med eea1 för att reglera storleken på tidiga endosomer | cellforskning

P97 atpasen associerar med eea1 för att reglera storleken på tidiga endosomer | cellforskning

Anonim

Abstrakt

AAA (ATPas-associerad med olika cellulära aktiviteter) ATPase p97 verkar på olika substratproteiner för att delta i olika cellulära processer såsom membranfusion och endoplasmisk retikulumassocierad nedbrytning (ERAD). Vid membranfusion anses p97 fungera i analogi med det relaterade ATPas NSF ( N- etylmaleimidkänsligt fusionsprotein), vilket främjar membranfusion genom att demontera ett SNARE-komplex. I ERAD distribuerar p97 felfoldade proteiner från ER-membranet för att underlätta deras omsättning av proteasomen. Här identifierar vi en ny funktion av p97 vid endocytisk handel genom att etablera det tidiga endosomala autoantigen 1 (EEA1) som ett nytt p97-substrat. Vi visar att en bråkdel av p97 är lokaliserad till det tidiga endosommembranet, där det binder EEA1 via N- terminal C2H2-zinkfingerdomänen. Inhibering av p97 antingen av siRNA eller en farmakologisk hämmare resulterar i kluster och utvidgning av tidiga endosomer, vilket är associerat med ett förändrat människohandel för en endocytisk last. Mekaniskt visar vi att p97-hämning orsakar ökad EEA1 självassociation vid endosommembranet. Vi föreslår att p97 kan reglera storleken på tidiga endosomer genom att reglera det oligomera tillståndet EEA1.

Introduktion

P97 (även kallad Cdc48 i jäst) är en evolutionärt konserverad AAA ATPase. Den innehåller två ATPase-domäner av Walker-typ som är sammansatta i en hexamerisk ring med en central por 1, 2 . Det tros fungera som en ubiquitinselektiv chaperon för att separera substratproteiner från stora orörliga cellkomplex, såsom ER-membranet, kromatin och mikrotubuli. Följaktligen har p97 / Cdc48 påvisats fungera i variabla cellulära inställningar inklusive endoplasmisk retikulumassocierad proteindedbrytning (ERAD), DNA-replikering, transkriptionsreglering, bildning av kärnhölje, spindelmontering och homotypisk fusion av ER / Golgi-membran 3, 4, 5, 6, 7 . Den funktionella flexibiliteten hos p97 / Cdc48 hänger på de olika kofaktorerna som binder p97 via dess N- terminala domän. I ERAD hjälper p97-kofaktorkomplex Ufd1-Npl4 p97 vid substratigenkänning och dislokation från ER-membranet 3, 4, 8 . Vid homotyp sammansmältning av ER 9, 10, 11 och Golgi 12, 13, 14, verkar p97 på ett ännu inte identifierat substrat i samband med kofaktorn p47 och p37-VCIP135-komplexet. Således verkar adapterval diktera inskrivningen av p97 till olika cellvägar 4, 15 . I detta avseende är det intressant att notera att det endocytiska adapterprotein-clathrin var det första identifierade p97-interagerande proteinet 16 . Huruvida p97 spelar en roll i endocytisk reglering har dock förblivit oklart.

Under endocytos smälter internaliserade vesiklar ständigt för att bilda tidiga endosomer, som migrerar mot mitten av cellen medan de mognar in i MVB-avdelningen. Endocytisk vesikel dockning och fusion kräver samarbete mellan många lösliga och membrankomponenter. Bland dem är den tidiga endosomassocierade autoantigen 1 (EEA1) en viktig komponent som dynamiskt fördelar mellan en endosommembranassocierad och en löslig cytosolisk form 17, 18, 19, 20 . Membranföreningen för EEA1 regleras av Rab5 GTPase, en masterregulator för endocytisk handel 21, 22, 23 . När den är lokaliserad till endosommembranet tjänar EEA1 som en bindningsfaktor för att koppla endocytiska vesiklar till tidiga endosomer för fusion katalyserad av ett SNARE-komplex och N- etylmaleimidkänsligt fusionsprotein (NSF) 20, 24, 25 . Särskilda strukturella element inom EEA1 ger det förmågan att docka och bundna vesiklar. Karboxylterminalen hos EEA1 bär en FYVE-domän som är ansvarig för bindning till fosfatidylinositol-3-fosfat på membranet 19, 20, 26, 27, 28 . Den N- terminala C2H2-zinkfingerdomänen och en region uppströms om FYVE-domänen tjänar som Rab5-bindande platser 21 . EEA1 har också en kalmodulinbindande (IQ) domän och ett långt spiralformat segment 17 . Den senare ansvarar för homodimeriseringen av EEA1, vilket anses vara en förutsättning för bindningsfunktionen 28, 29 . I celler leder Rab5-aktivering till komplexet av EEA1-dimer till ett stort proteinkomplex som innehåller andra Rab5-effektorer såsom Rab5 GTP-utbytesfaktor Rabex-5 och Rabaptin-5 såväl som den endosomspecifika t-SNARE Syntaxin-13, vilket resulterar i fusionen av endosomer 24 .

I denna studie tog vi ett opartiskt biokemiskt tillvägagångssätt för att identifiera EEA1 som ett nytt substrat för p97. Våra resultat indikerar att p97 kan reglera det oligomera tillståndet i EEA1 för att påverka dess membranbindningsfunktion, vilket i sin tur påverkar storleken på tidiga endosomer. Dessa fynd etablerar för första gången AAA ATPase p97 som en nyckelregulator för handel med endocytiska proteiner.

Resultat

P97 är lokaliserad till endosomerna och interagerar med EEA1

P97 är lokaliserad i cytosol, kärnan och även på ER-membranet 4 . Följaktligen, när totala membran från 293T-celler analyserades med en flytningsanalys med användning av en sackarosgradient, förblev de flesta membranbundna p97 längst ner i gradienten (figur 1A), som innehöll ER och andra tunga membran, som tidigare visats 30 . Emellertid var en väsentlig mängd p97 också bunden till ljusmembran berikade med det tidiga endosomala proteinet EEA1 och endosomen / lysosommarkören LAMP1 (figur 1A), vilket indikerar att p97 också kan associeras med endosomer.

Image

P97 är lokaliserad till endosomerna och interagerar med EEA1. (A) En postnukleär supernatantfraktion från 293T-celler utsattes för sackarosgradientflytning för att separera membran baserat på deras densitet. Samlade fraktioner analyserades genom immunblotting med de indikerade antikropparna. (B) En Coomassie-blåfärgad gel som visar proteiner samrenad med p97 från solubiliserat ko-levermembran. (C) Co-IP-analys av EEA1-p97-interaktion med användning av 293T-cellextrakt. (D) Som i C, förutom att HeLa-celler användes. Såsom indikerats behandlades cellextrakt med 5 mM NEM. (E) Konfokala analyser av COS7-celler som visar endogen p97 (vänster panel), överuttryckt Rab5 (Q79L) GFP (mitten) och den sammanslagna bilden (höger).

Bild i full storlek

För att identifiera endosomala proteiner som binder p97, renade vi p97 från detergentekstrakt av endosomberikad total levernmembranfraktion med hjälp av en p97-specifik antikropp. IgG användes som en negativ kontroll. SDS-PAGE-analys avslöjade ett huvudband på ∼ 180 kD samtidigt renat med p97 samt flera mindre band. Masspektrometri-analys identifierade två proteiner närvarande i 180 kD-bandet, mitokondriell karbamoyl-fosfat-syntas (CPSM) och EEA1 (figur 1B och kompletterande information, figur S1). Med tanke på den observerade föreningen av p97 med endosomer karakteriserade vi vidare interaktionen p97-EEA1.

Vi bekräftade först EEA1-p97-interaktionen i 293T-celler med hjälp av co-immunoprecipitation (co-IP) -analys. Immunoblotting visade att anti-p97-antikroppen men inte kontrollerar IgG specifikt utfällde p97 tillsammans med endogen EEA1 (figur 1C). Interaktionen kan reproduceras med hjälp av HeLa-cellextrakt (figur 1D). Eftersom p97 tillhör en underfamilj av AAA-ATPaser som är känsliga för det cystein-specifika alkyleringsmedlet N- metylmaleimid (NEM), undersökte vi också om NEM kunde påverka EEA1-p97-interaktionen. Våra resultat visade att tillsatsen av NEM till cellextrakt signifikant minskade associeringen av EEA1 med p97, troligtvis på grund av dissociation av EEA1 från NEM-inaktiverad p97 (figur 1D).

För att ytterligare bekräfta denna interaktion i levande celler använde vi konfokal mikroskopi för att undersöka kolokaliseringen av p97 med EEA1 på endosomer i COS7-celler. Med tanke på den lilla storleken av tidiga endosomer i normala celler och den allestädes närvarande karaktären av p97-expression, visade sig en bedömning av kolokalisering mellan dessa två proteiner på vildtyps endosomer vara besvärlig. För att kringgå detta uttryckte vi en konstitutivt aktiv Rab5-mutant (Q79L). Q79L band EEA1 konstitutivt, vilket resulterade i anrikning av EEA1 på endosomala membran och utvidgning av tidiga endosomer 20, 31 . Vi antog att om p97 interagerade med EEA1, Q79L-uttryck borde leda till ansamling av p97 på dessa förstorade endosomala strukturer till en högre nivå än den cytosoliska p97-bakgrunden. Våra resultat visade att endogen p97 verkligen anrikades till de förstorade endosomerna i celler som uttrycker Rab5 Q79L-mutanten (figur 1E). Med tanke på att EEA1 skulle kunna fällas ut med p97 (figur 1C och 1D), är den mest troliga förklaringen för immunhärdande data att en bråkdel av p97 är lokaliserad till de tidiga endosomerna där den binder EEA1.

C2H2-domänen i EEA1 krävs för p97-associering

EEA1 innehåller flera etablerade funktionella domäner såsom visas i figur 2A. För att förstå hur p97 interagerar med EEA1, kartlade vi domänen i EEA1 som krävs för bindning till p97. Vi använde en mänsklig EEA1-expressionsklon med full karboxylterminal FLAG-tagg När FLAG-märkt EEA1 uttrycktes i celler visade det ett liknande lokaliseringsmönster som endogent EEA1 (data visas inte) och det kunde samutfällas med p97 (figur 2B). Vi genererade och uttryckte sedan flera trunkerade EEA1-mutanter i celler. Co-IP-experiment visade att deletion av de N- terminala aminosyrorna 69 från EEA1 var tillräcklig för att avskaffa p97-interaktion. Däremot påverkade inte borttagningen av den C-terminala FYVE-domänen bindningen (figur 2B). Dessa data indikerar att den N- terminala C2H2-domänen krävs för EEA1-bindning till p97. Eftersom FYVE-domänen krävs för associering av EEA1 med endosommembranet, tyder det faktum att dess frånvaro inte påverkar p97-EEA1-interaktionen att p97 kan binda EEA1 både på endosommembranet och i cytosolen.

Image

C2H2-domänen i EEA1 krävs för p97-associering. (A) Schematisk representation av EEA1 i full längd och de borttagande konstruktionerna som användes i den bindande studien. IQ, kalmodulinbindande ställe; R5BD, Rab5-bindande domän. (B) Co-IP-analys av p97-interaktion med EEA1-varianterna. WCE, helcellsextrakt.

Bild i full storlek

Eftersom co-immunutfällningsförsök med renad EEA1 och p97 inte lyckades avslöja en direkt interaktion (data inte visade) antog vi att interaktionen mellan p97 och EEA1 kan medieras av en p97-kofaktor i celler. Hittills har ett stort antal p97-kofaktorer identifierats 32 . Bland dem är de bäst karakteriserade ett dimeriskt komplex innefattande Ufdl och Npl4 33, vilket hjälper p97 i nedbrytning av felvikta ER-proteiner 34 och p47, vilket underlättar p97-funktionen i homotyp fusion av Golgi-membran 35 . Vi testade om dessa p97-kofaktorer var involverade i EEA1-p97-interaktion. Vi postulerade att överuttryck av en kofaktor som förmedlar interaktionen mellan p97 och EEA1 skulle öka p97-EEA1-föreningen. Varken Ufd1-Npl4-komplexet eller p47 kunde emellertid förbättra föreningen mellan p97 och EEA1 (kompletterande information, figur S2), vilket antyder att andra samverkande faktorer kan vara involverade i denna interaktion.

P97-hämningen resulterar i utvidgning av tidiga endosomer

För att undersöka den potentiella funktionen hos p97 vid reglering av tidig endosommorfologi och / eller människohandel använde vi först ett p97-specifikt siRNA för att uttömma p97 från celler. SiRNA-behandlingen av COS7-celler reducerade p97-proteinnivåerna med mer än 80% jämfört med en siRNA-kontroll (figur 3A). Vi undersökte sedan den tidiga endosommorfologin genom immunförfärgning med en EEA1-antikropp. Konfokal mikroskopi avslöjade att p97 siRNA-behandling resulterade i förstorade tidiga endosomer. Dessutom innehöll p97-knockdownceller ofta klusterade endosomer jämfört med kontroll-siRNA-behandlade celler (figur 3B, paneler 4-6 mot 1-3). Dessutom observerade vi också konsekvent ökad EEA1-färgning på endosomer i p97-utarmade celler, även om nivån av membranassocierad EEA1 var oförändrad (se nedan). För att utesluta möjligheten att den observerade fenotypen berodde på effekter utanför målen av p97 siRNA, använde vi en andra p97 siRNA som också kunde tömma p97. Det är viktigt att förstorade endosomer också observerades i celler behandlade med denna siRNA (kompletterande information, figur S3A).

Image

P97-nedfallet resulterar i överbindning / utvidgning av tidiga endosomer. (A) COS7-celler behandlades med kontroll eller p97-specifik siRNA. Hela cellextrakt utsattes för immunblotting för att verifiera knockdown-effektiviteten. (B) Celler behandlade med kontroll (panelerna 1, 2 och 3) eller p97-specifik siRNA (panelerna 4, 5 och 6) immunofärgades för att märka endogen EEA1 i rött och DNA i blått. Panelerna 2, 3, 5 och 6 är närbilder från cellerna. (C) COS7-celler behandlades med kontroll eller p97-specifikt siRNA. Hela cellextrakt utsattes för immunblottinganalys med de indikerade antikropparna. (D) Liksom i B, med undantag av att celler som behandlats med Npl4 siRNA också inkluderades. Panelerna 4-6 är närbilder från cellerna. (E) Som i B, förutom att celler färgades med en LAMP1-antikropp.

Bild i full storlek

Med tanke på att p97 är en väsentlig regulator för homeostas av ER-protein, ville vi utesluta möjligheten att avvikelsen i endosommorfologi förknippad med p97-knockdown orsakades av försämrad nedbrytning av felvikta ER-proteiner. Vi använde en siRNA för att tappa Npl4 (figur 3C), en p97-kofaktor som är nödvändig för ERAD. I överensstämmelse med tidigare rapporter 36, 37 inhiberade knockdown av Npl4 ERAD, vilket indikeras av stabiliseringen av modell ERAD-substrat TCRa (kompletterande information, figur S3B). Immunfarvning visade att EEA1-positiva tidiga endosomer i Npl4-knockdownceller inte kunde skiljas från de i kontrollcellerna (figur 3D, paneler 2, 5 mot paneler 1, 4), medan p97-uttömning utförd parallellt gav upphov till uppenbarligen förstorade och klusterade tidiga endosomer ( Figur 3D, paneler 3, 6). Dessa data antyder att effekten av nedbrytning av p97 på tidiga endosomer inte är resultatet av störd ER-proteinhomeostas.

Eftersom p97 samfraktionerade med endosomer markerade med både EEA1 och LAMP1, frågade vi om p97-utarmning också orsakade avvikande lysosommorfologi. Vi färgade kontroll- eller p97-knockdownceller med en LAMP1-antikropp. Såsom visas i figur 3E, var ingen signifikant skillnad i storlek eller distribution av de LAMP1-innehållande vesiklarna tydliga mellan kontroll- och p97 siRNA-behandlade celler. Således verkar utarmning av p97 specifikt påverka morfologin för de EEA1-innehållande tidiga endosomerna.

För att ytterligare undersöka p97s roll i endocytos bedömde vi effekten av en p97-hämmare på endosommorfologi. Jämfört med metoden för tystnad av gen kan kemiska hämmare snabbt stänga av proteinfunktionen och därmed möjliggöra observation av den omedelbara effekten som är förenad med förlust av proteinfunktion. Däremot tog siRNA-experiment flera dagar och därför kan den observerade fenotypen bero på sekundära effekter nedströms långvarig p97-utarmning. Vi kännetecknade nyligen en liten förening med namnet eeyarestatin I (EER), som företrädesvis störde funktionen hos membranassocierat p97 38 . Det är viktigt att in vitro- bindande experiment visade att EerI inte binder till det starkt relaterade AAA ATPas NSF, vilket gör det till en specifik hämmare av p97 38 .

I överensstämmelse med siRNA-resultaten resulterade behandling av COS7-celler med EER i 6 timmar i en uppenbar ökning i endosomklustering och många förstorade endosomer jämfört med DMSO-behandlade celler (figur 4A). Kvantifiering av storleken på vesiklar visade att jämfört med kontrollceller ökade den genomsnittliga diametern för endosomer i EER-behandlade celler med ∼ 2-faldig (figur 4A). Liksom p97 knockdown-celler ökades dessutom EEA1-färgningsintensiteten signifikant genom EERI-behandling (Kompletterande information, figur S3C).

Image

En p97-hämmare orsakar utvidgning av tidiga endosomer. (A) COS7-celler behandlade med DMSO (kontroll) eller Eer (10 mikrometer) under 6 timmar färgades för EEA1 i rött och DNA i blått. Insatsen visar en förstorad vy av det angivna området. Om inte annat anges motsvarar skalfält 20 μm. Grafen visar kvantifieringen av den relativa storleken på tidiga endosomer i kontroll och EER-behandlade COS7-celler. au godtycklig enhet. Varje värde är medelvärdet av 100 olika vesiklar, och felstegen representerar standardavvikelsen. P- värdet erhålls genom parad t- test. (B) COS7-celler transfekterade med en låg koncentration av en Rab5-GFP-uttryckande plasmid behandlades med antingen DMSO eller EER (10 um) under 4 timmar. Celler fixerades och färgades med DAPI. (C, D) COS7-celler behandlade med DMSO ( C ) eller 10 mikrometer Eer ( D ) under 4 timmar fixerades och analyserades med ett transmissionselektronmikroskop vid 4 000 × förstoring. Stjärnor indikerar exempel på endosomer som identifieras baserat på deras unika membranprojektioner och brist på intern elektrondensitet 47 .

Bild i full storlek

För att ytterligare karakterisera endosomfenotypen associerad med p97-hämning undersökte vi endosommorfologin i EER-behandlade celler med Rab5-GFP, en annan väl dokumenterad tidig endosommarkör 39, 40 . Celler som kortvarigt uttrycker låga nivåer av Rab5-GFP visade diffusiv cytoplasmisk lokalisering av Rab5 såväl som punkterade Rab5-innehållande vesiklar, såsom rapporterats tidigare 41 . Transferrin (Tfn) -märkningsexperiment visade att de Rab5-innehållande vesiklarna kunde märkas av Tfn (kompletterande information, figur S4), vilket tyder på att de representerade bona fide endosomvesiklar. I EER-behandlade celler utvidgades Rab5-GFP-innehållande vesiklar och klusterades (figur 4B, paneler 2, 4 mot panelerna 1, 3). Vidare visade transmissionselektronmikroskopi att EER-behandlade celler innehöll många förstorade tidiga endosomvesiklar (figur 4C kontra figur 4D). Dessa resultat visar att hämning av p97 genom EER också leder till förstoring / kluster av endocytiska vesiklar, vilket antyder att p97 kan reglera dockningen eller fusionen av endosomer för att styra deras storlek.

Hämning av p97 försenar handeln med en endocytisk last

För att bedöma den funktionella konsekvensen av p97-hämning på endocytisk handel övervakade vi transportkinetiken för den endocytiska lasten Tfn. För att undvika indirekt effekt som kan vara resultatet av långvarig p97-hämning, behandlade vi celler med EER under en kort tid (1 timme). Celler inkuberades sedan med fluorescensmärkt Tfn på is. Efter avlägsnande av den obundna Tfn, jagades cellerna i ett medium fritt från Tfn vid 37 ° C under olika tidsperioder. Cellerna fixerades sedan och bearbetades för konfokal avbildning. I DMSO-behandlade celler märkte Tfn initialt plasmamembranet, men det blev snart internaliserat och de Tfn-innehållande vesiklarna migrerade mot en perinuclear region och ackumulerades i det perinucleara området med 30 minuter (figur 5A övre paneler). Däremot inträffade Tfn-internalisering normalt i Eer-behandlade celler. Efter 30 min jakt uppvisade emellertid de flesta celler inte den perinuklara anrikningen av Tfn-innehållande vesiklar. Istället observerades Tfn som punktfärgade fläckar fördelade över cytoplasma (figur 5A, nedre paneler). När jaktperioden ökades till 60 min innehöll kontrollceller få Tfn-positiva vesiklar på grund av återvinning av Tfn. Däremot innehöll de flesta celler som behandlades med EER Tfn-positiva vesiklar som klusterades runt ett perinukleärt område (figur 5B). Således drar vi slutsatsen att p97-hämning försenar den intracellulära handeln med Tfn.

Image

Hämning av p97 försenar handeln med en endocytisk last. (A) COS7-celler behandlade med DMSO eller EER (10 um) under 1 timme märktes med Tfn och jagades under 0, 15 och 30 min. Paneler visar den temporära fördelningen av Tfn i rött relativt kärnorna i blått. På panelerna på 30 minuter visas cellgränsen i vitt. (B) Som i A, förutom att celler som jagas under 60 minuter visas. Observera att i kontrollceller detekteras få Tfn-innehållande vesiklar på grund av återvinning av Tfn.

Bild i full storlek

P97 reglerar inte EEA1-endosominteraktion

Eftersom p97 har visat sig fungera som ett "segregas" för att dislokera polypeptider från stora orörliga enheter såsom ER 4, 34 och kromatinet 7, hypotes vi från början att p97 kan kontrollera storleken på endosomer genom att flytta komponenter som krävs för endosomfusion från membranet. Med tanke på den demonstrerade EEA1-p97-interaktionen och upptäckten att EEA1-färgningsignalen förbättrades i celler som saknade funktionell p97, misstänkte vi att p97 skulle kunna reglera EEA1-lokalisering. Vi undersökte således nivån av EEA1 på endosommembranet relativt den i cytosolen i celler behandlade med EER med ett biokemiskt fraktioneringsexperiment. Jämfört med kontrollceller påverkade överraskande p97-hämning av EERI varken de totala EEA1-nivåerna eller mängden EEA1 bunden till endosomer (figur 6A). På liknande sätt påverkade inte utarmning av p97 av siRNA nivån på membranbundet EEA1 (figur 6B). Således verkar p97 inte reglera EEA1-bindning till endosommembranet.

Image

P97 reglerar inte EEA1-membranförening. (A) COS7-celler behandlade med DMSO eller EER i 4 timmar fraktionerades till membran (P) och cytosoliska (S) fraktioner. Den relativa fördelningen av de indikerade proteinerna analyserades genom immunblotting. (B) Som i A, förutom att kontroll- och p97-knockdownceller användes.

Bild i full storlek

Hämning av p97 orsakar ökad EEA1-oligomerisering

Vi övervägde sedan en alternativ möjlighet. I detta scenario kan p97 reglera det oligomera tillståndet för EEA1. Vi antydde att när p97-funktionen hämmades, kan det finnas mer oligomeriserad EEA1 på endosommembranet, vilket kan orsaka ökad fluorescensfärgning på grund av förbättrad antikroppsbindande aviditet. Detta skulle inte påverka nivån av membranbunden EEA1. EEA1 rapporterades bilda en parallell dimer i cellerna 28, 29, vilket föreslogs vara den funktionella enheten i ett EEA1-bindningskomplex. Således kunde mer EEA1-dimerisering förklara den ökade endosomklustering och förstoringsfenotyp som är förknippad med förlusten av p97-funktionen.

För att övervaka nivån på EEA1-oligomerisering använde vi först en cysteinreaktiv tvärbindare för att stabilisera EEA1-dimeren som annars skulle störa under celllys och elektrofores. COS7-celler exponerade för antingen EER eller DMSO under 4 timmar behandlades med BMH under ytterligare 20 minuter på is. Hela cellextrakt analyserades genom immunblotting. I kontrollceller behandlade med 10 μM BMH kunde SDS-resistent EEA1-innehållande högmolekylviktskomplex detekteras och EEA1-monomernivån minskades (figur 7A, spår 3 mot 1). Behandling med 25 μM BMH genererade mer EEA1-högmolekylviktskomplex med samtidig förlust av EEA1-monomeren (spår 5). I EER-behandlade celler var en signifikant ökning av EEA1-innehållande komplex med hög molekylvikt tydlig (figur 7A, spår 4 och 6 mot 3 och 5).

Image

Hämning av p97 ökar EEA1 självassociation. (A) COS7-celler exponerade för 10 mikrometer EER eller DMSO under 4 timmar behandlades med de angivna koncentrationerna av BMH. WCE analyserades genom immunblotting. (B) EEA1 immunutfälldes från detergentextrakt av EER- eller DMSO-behandlade COS7-celler och analyserades genom immunblotting under ett icke-reducerande tillstånd. (C) Renad EEA1 analyserades med SDS-PAGE under reducerande tillstånd (vänster panel). Renat EEA1 som har behandlats med den angivna koncentrationen av reduktionsmedlet DTT analyserades genom immunblotting. (D) Som i B, förutom att kontroll- och p97-knockdownceller användes. Den nedre panelen visar nedslagning av p97 i p97 siRNA-behandlade celler. Siffrorna i den högra panelen indikerar förhållandet mellan EEA1-dimer och monomeren (D / M). (E) Som i C. När det anges analyserades en fraktion av det utfällda EEA1 under reducerande tillstånd (+ DTT). (F) EEA1 co-immunutfällt med p97 från de angivna cellerna analyserades genom immunblotting under det icke-reducerande tillståndet (icke-rött). Spår 1 (icke-reducerande) och 2 (reducerande) visar renat EEA1-protein för jämförelse. Asterisken indikerar en p97 oligomerart som finns i EER-behandlade celler 38 .

Bild i full storlek

De EEA1-innehållande komplexen med hög molekylvikt kan utgöra både EEA1-homodimer såväl som EEA1-heterooligomerer som innehöll andra EEA1-interagerande proteiner. Dessa komplex hade olika rörlighet på SDS-PAGE-gel, vilket orsakade en smutsliknande immunblotting-signal. För att se om hämning av p97 ökade EEA1 självförening tog vi ett annat tillvägagångssätt. Vi antydde att eftersom EEA1-innehållande komplex med hög molekylvikt kan stabiliseras med en homo-bifunktionell cystein-tvärbindare, bör EEA1-homo-dimeren som finns i den tvärbundna komplexblandningen innehålla två eller flera proximala cysteinrester från varje monomer. I princip bör disulfidbindning bildas mellan dessa cysteinrester när EEA1 placeras i en icke-reducerande miljö (t.ex. när celler lyseras i en buffert som saknar reduktions- eller akyleringsreagens), och omfattningen av de novo disulfidbildning under rening av EEA1 bör korrelera med nivån för EEA1-dimerisering i celler. Detta visade sig verkligen vara sant för en mutant form av T-cellreceptor a-kedjan som innehåller flera par proximala cysteinrester 42 . Nivån av sådan in vitro- genererad disulfid-dimer bör verka homogen när den analyseras med immunblotting. För detta ändamål immuno-utfälldes EEA1 från cellextrakt i frånvaro av några tvärbindningsmedel. Immunoblotting under de icke-reducerande förhållandena visade att en liten fraktion av EEA1 isolerat från kontrollceller migrerade på en SDS-PAGE-gel som ett dubbelband med uppenbar molekylvikt av 500 kD (figur 7B, spår 1). Ett liknande dublettmönster upptäcktes för EEA1 som renades från celler som överuttryckte EEA1 (figur 7C). Eftersom rekombinant EEA1 renades till mer än 90% homogenitet (figur 7C, vänster panel), kunde det disulfidbundna komplexet endast produceras genom EEA1 självassociation. Storleken på dessa arter indikerade att de troligen representerade distinkta EEA1-homodimerer länkade med olika cysteinrester, som ofta visar förändrad proteinrörlighet på SDS-PAGE-gel som tidigare rapporterats för andra proteiner 43 . I överensstämmelse med vår hypotes om att EEA1-oligomerisering förbättrade antikroppsigenkänningen, verkade EEA1-homodimerbandet starkare än monomerbandet på fläcken även om samma mängd proteiner analyserades (figur 7C). Intressant nog var renade EEA1-proteiner mestadels disulfidbundna (figur 7C, höger panel), vilket antyder att majoriteten av överuttryckta EEA1 fanns i celler som en homodimer. Detta bekräftades ytterligare genom ett co-IP-experiment med EEA1-varianter som bär olika epitoptaggar (kompletterande information, figur S5A). I överensstämmelse med vår idé att EEA1 självförening främjade endosomfusion, innehöll celler som överuttryckte EEA1 många utvidgade endosomer (kompletterande figur S5B-S5D). Dessutom, liknande BMH-tvärbindningsresultatet, kunde mer disulfidbunden EEA1-homooligomer detekteras i cellextrakt härrörande från EER-behandlade celler (figur 7B, spår 2 mot spår 1). Nedbrytning av p97 med siRNA ökade också nivån av oligomeriserad EEA1 (figur 7D). Som förväntat kan den disulfidlänkade EEA1-dimeren destabiliseras av reduktionsmedlet DTT (figur 7C och 7E). Viktigare, när p97-associerad pool av EEA1 analyserades under det icke-reducerande tillståndet, detekterades mer oligomeriserad EEA1 i samband med p97 i EER-behandlade celler än i kontrollceller (figur 7F, spår 7 mot spår 4). Tillsammans antyder dessa resultat att p97 kan reglera självföreningen av EEA1 för att påverka dess bindningsfunktion.

Diskussion

P97 är ett rikligt ATPas som har många viktiga cellfunktioner. I ERAD flyttar p97 och dess kofaktorer fällbara polypeptider i cytosolen för nedbrytning av proteasomen 34, 44 . Här identifierar vi den tidiga endosome fusionsregulatorn EEA1 som ett nytt substrat för p97. För EEA1 fungerar p97 inte som ett 'dislokos' för att påverka interaktionen mellan EEA1 och endosommembranet. Istället tyder våra resultat på att p97 kan reglera EEA1-oligomera tillståndet för att reglera endosomfusion och människohandel. Denna modell skiljer sig funktionellt från den tidigare föreslagna rollen för p97 vid reglering av membranfusion genom att verka på ett SNARE-komplex innefattande Syntaxin-5 12 . I det senare fallet bromsar demontering av SNARE-komplexet med p97 fusionsreaktionen genom regenerering av fria SNARE-molekyler, som kan användas för att stödja ytterligare rundor av membranfusion. Däremot blockerar hämning av EEA1-dimerisering genom p97 membranfusion eftersom det reducerar nivåerna av funktionellt EEA1-bindningskomplex som krävs för effektiv membranfusion.

EEA1-dimeren rapporterades komma in i ett hetero-oligomert komplex med hög molekylvikt som inkluderar NSF, Rab5 och några andra Rab5-effek-torer, såsom Rabaptin-5 och Rabex-5, och denna oligomera EEA1-enhet krävs för kortvarig rekrytering av syntaxin -13, som driver membranfusionsreaktionen 24 . Intressant nog visade sig att den hetero-oligomera sammansättningen EEA1 modulerades av NSF, vilket krävs för fusionsreaktionen 24 . Mot bakgrund av dessa resultat föreslår vi att montering av ett EEA1-innehållande fusionskomplex kan omfattas av förordningar av både p97 och NSF, vars tidpunkt kan ge motsatta funktionella resultat. NSF kan avskilja EEA1-dimer från resten av fusionskomplexet efter att fusionsmaskineriet har rekryterats och monterats helt. Vid denna tidpunkt kan avlägsnandet av den långa styva EEA1-dimeren från fusionskomplexet tillåta två vesiklar att komma nära varandra, vilket underlättar fusionsreaktionen. Å andra sidan kan p97 agera på EEA1-dimer före rekryteringen av fusionsmaskineriet. P97 kan använda energin från ATP-hydrolys för att aktivt demontera en EEA1-parallell dimer. Alternativt kan den binda en EEA1-monomer för att hämma dimeriseringsprocessen. Våra resultat gynnar den första modellen eftersom när p97-funktion hämmas upptäcks mer omonterad EEA1-oligomer i samband med p97. Således är det möjligt att p97 kan känna igen oligomeriserad EEA1 för att aktivt demontera detta komplex, vilket minskar nivån av funktionellt EEA1-bindningskomplex och därför dämpar endosom bindning och fusion.

Mekanismen genom vilken p97 erkänner EEA1 är oklar. In vitro- bindande experiment antyder att p97 inte binder EEA1 direkt. Såsom andra p97-underlag involverar rekryteringen av EEA1 till p97 sannolikt en p97-kofaktor. Våra resultat stöder inte involvering av Ufd1-Npl4 eller p47 i p97-beroende endocytisk reglering eftersom överuttryck av dessa faktorer i celler inte ökar associeringen av p97 med EEA1. Vidare har de flesta p97-substrat rapporterats genomgå polyubikvitinering i celler och många p97-kofaktorer innehåller ubikitinbindande motiv som underlättar interaktion mellan p97 och polyubikitinerade substrat. Intressant nog finner vi att EEA1 endast monoubikitineras vid flera lysinrester i celler (data visas inte). Huruvida denna modifiering deltar i det nyligen etablerade samspelet mellan p97 och EEA1 är oklart. Emellertid utesluter det faktum att EEA1 endast monoubikitineras ytterligare Ufd1-Npl4-komplexet och p47 som förmedlare av p97-EEA1-interaktion eftersom dessa faktorer rapporterades företrädesvis binda polyubikitinerade proteiner 44, 45 .

Att förhindra endosomöverbindning / fusion kan vara viktigt för godshandel eftersom en försening av endocytisk handel observerades i celler behandlade med en p97-hämmare. Det är möjligt att endosom överbindning kan påverka dess rörlighet på grund av en förändrad interaktion med mikrotubulan. Ytterligare studier krävs för att belysa mekanismen genom vilken endosombindning och rörlighet regleras.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Tilläggsinformation, figur S1

    Identifiering av EEA1 som ett p97-bindande protein.

  2. 2.

    Tilläggsinformation, figur S2

    Ufd1, Npl4 och p47 kan inte förbättra EEA1-p97-föreningen.

  3. 3.

    Tilläggsinformation, figur S3

    p97 knockdown och EerI-behandling resulterar i utvidgning av EEA1-innehållande endosomer och förbättrad EEA1-färgning.

  4. 4.

    Tilläggsinformation, figur S4

    Rab5-positiva endosomer innehåller endocytisk lastöverföring.

  5. 5.

    Tilläggsinformation, figur S5

    EEA1-uttryckande celler innehåller förstorade tidiga endosomer.

  6. 6.

    Kompletterande information, tabell S1

    Primersekvenser som används för att konstruera EEA1-deletionsmutanter

Ordlista

ERAD

(endoplasmisk retikulationsassocierad nedbrytning)

EEA1

(tidigt endosomalt antigen1)

NEM

(N-etylmaleimid)

EerI

(eeyarestatin I)

( Tilläggsinformation är länkad till onlineversionen av uppsatsen på webbplatsen Cell Research .)