Oxytocin skyddar mot stressinducerad celldöd i murina pankreatiska p-celler | vetenskapliga rapporter

Oxytocin skyddar mot stressinducerad celldöd i murina pankreatiska p-celler | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Mekanismer för sjukdom
  • Diabetes typ 2

Abstrakt

Oxytocin (Oxt) är en viktig neuropeptid som reglerar moderens beteende samt sociala beteenden hos däggdjur. Intressant nog har nyligen genomförda studier visat att försämringen av Oxt-signalering är förknippad med störningen av metabolisk homeostas, vilket resulterar i fetma och diabetes. Emellertid är den molekylära mekanismen genom vilken Oxt-signalering kontrollerar metaboliska responser i stort sett okänd. Här rapporterar vi att Oxt-signalering dämpar döden av beta-celler i bukspottkörteln i holmar utsatta för cytotoxiska påfrestningar. Den skyddande effekten av Oxt minskade i holmar isolerade från oxytocinreceptor knockout (Oxtr - / - ) möss. Oxtr - / - möss utvecklades normalt men uppvisade nedsatt insulinutsöndring och visade glukosintolerans under en fettrik diet. Mekaniskt visade bristen på Oxtr-försämrad MAPK / ERK-CREB-signalering, som överdrev det endoplasmatiska retikulumets stressrespons och i slutändan ökade döden av betaceller i bukspottkörtelöarna under stressade förhållanden. Dessa resultat avslöjar att Oxt skyddar pankreatiska betaceller mot dödsfall orsakat av metabolisk stress, och Oxt-signalering kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål.

Introduktion

Oxytocin (Oxt) är ett multifunktionellt hormon som består av en mogen polypeptid av nio aminosyror 1 . Hos däggdjur produceras Oxt i subpopulationer av neuroner i supraoptiska kärnor (SON) och paraventrikulära kärnor (PVN) i hypotalamus 1 . Hormonet transporteras till nervterminalerna med axonal transport och frigörs från den bakre hypofysen 1 . De centrala fysiologiska funktionerna hos oxytocin är att reglera moder 2, känslomässiga 3, anknytande 4 och sexuella 5 beteenden samt rumslig och social kognition 6, 7 . Oxt binder till G q / 11 a-proteiner kopplade till oxytocinreceptorn (Oxtr) främst uttryckt i uterus glatt muskel och myoepitelceller 8 . Aktiveringen av Oxtr inducerar en ökning av kalcium från både intracellulärt kalciumlager och extracellulärt kalciuminflöde 9 . Ökningen i kalcium utlöser aktivering av kalciumberoende proteinkinaser, vilket slutligen inducerar sammandragning av glatt muskel och leder till födelse och amning 8 .

Förutom ovanstående fysiologiska funktioner hos däggdjur har Oxt nyligen framkommit som en nyckelkomponent för metabolisk homeostas. Behandlingen med Oxt rapporterades stimulera glukosoxidation och lipogenes i adipocyter 10 . I bukspottkörteln detekteras en fysiologisk nivå av Oxt hos både människor och gnagare 11 . Behandlingen av isolerade bukspottkörtelöar med Oxt stimulerar frisättningen av glukagon såväl som insulin 12 . Engagemanget av Oxt-signalering i metabolismen har bekräftats i en musmodell med genetisk borttagning av antingen Oxy eller Oxtr . Både Oxt- noll- och Oxtr- nullmöss hade normala matintagsmönster men utvecklade fettsjukdom senast 13, 14 . Deltagande av Oxt-signalering i metabolisk homeostas har också stöttats av mänskliga studier. CD38, ett membran ADP-ribosylcyklas, reglerar Oxt-sekretion. Intressant nog har polymorfismer med en enda nukleotid av CD38-genen varit inblandade i utvecklingen av diabetes 15 . Denna observation har validerats i CD38- nollmöss med genetisk bakgrund 16, 17 av ICR . CD38- nollmöss uppvisade nedsatt insulinutsöndring och en förhöjd plasmaglukosnivå. Dessutom visade nyligen epidemiska studier att amning troligen kommer att förknippas med en lägre förekomst av typ 2-diabetes 18, 19 . Sammantaget antyder dessa resultat att Oxt-signalering har en gynnsam effekt i metabolisk homeostas.

Med tanke på Oxt-signaleringens viktiga roll i ämnesomsättningen har ett stort antal studier syftat till att förstå de potentiella funktionerna för Oxt i adipocyter såväl som vid akut insulinsekretion 10, 11 . Emellertid har den molekylära mekanismen genom vilken Oxt-signalering reglerar den cellulära homeostasen hos bukspottkörtelöarna inte undersökts tillräckligt. I den aktuella studien undersökte vi anti-celldödeffekten av Oxt-signalering in vitro och in vivo med hjälp av cellbiologiska och genetiska metoder.

Resultat

Inhiberande effekt av Oxt på stressinducerad celldöd i bukspottkörtelöarna

För att undersöka rollen som Oxt-signalering i bukspottkörtelöarna undersökte vi först expressionsnivåerna för Oxt och Oxtr . Det fanns en stor mängd Oxtr- mRNA i bukspottkörtelöarna som isolerades från både han- och honmöss såväl som i den murina pankreatiska betacellderiverade cellinjen MIN6 (fig. 1A). Uttryckningsnivån i bukspottkörtelöarna och MIN6-cellerna var högre än den i SON SON från mus. Däremot detekterades endast ett spår av Oxt mRNA i holmarna och MIN6-cellerna jämfört med musens SON (fig. IB), vilket antyder att Oxt inte verkar genom en paracrinväg i bukspottkörtelöarna.

( A, B ) Relativa uttryck av Oxt ( A ) och Oxtr ( B ) mRNA i bukspottkörtelöarna av han- och kvinnliga vildtypsmöss; MIN6-celler och SON av manliga vildtypsmöss visas. * P <0, 05 och **** P <0, 0001 kontra SON av envägs ANOVA. n = 5–8. ( C, D ). Celldöd mättes i holmar isolerade från hanmöss behandlade med 2 ng / ml tunicamycin ( C ) eller en cytokinblandning ( D ) i närvaro av 100 pM Oxt under 24 timmar. * P <0, 05, n = 8 för ( C ), * P <0, 05, n = 12 replikerar för ( D ) med Student's t- test justerad för flera jämförelser. ( E ) Celldöd mättes i holmar isolerade från vildtyp (WT) och Oxtr - / - möss behandlade med 100 pM oxytocin och en cytokinblandning under 24 timmar. * P <0, 05 av Studentens t- test. n = 8. ( F ) Celldöd mättes i holmar isolerade från vildtypsmöss behandlade med 1 nM vasopressin och en cytokinblandning under 24 timmar. n = 12.

Bild i full storlek

Med tanke på den försämrade metaboliska homeostasen hos möss och människor med brist på Oxt-signalering 13, 14, 15, antog vi att Oxt-signalering är involverad i anticellsdödssignalering i bukspottkörtelöarna. För att undersöka denna hypotese isolerades bukspottkörtelöarna från hanmöss och behandlades sedan med Oxt i närvaro av olika metaboliska stressfaktorer inklusive tunicamycin (fig. 1C), cytokiner (fig. 1D) och palmitat (fig. 1E). Dessa cytotoxiska reagens inducerade signifikant celldöd i isolerade bukspottkörtelöar (Fig. 1C – E). Behandling med 100 pM Oxt, en fysiologisk koncentration i plasma, dämpade effektivt stressinducerad celldöd (Fig. 1C – E). För att ytterligare klargöra den hämmande effekten av Oxt isolerade vi bukspottkörtelöarna från möss med brist på Oxtr (Oxtr - / - ) och behandlade dem med cytokiner. Som förväntat observerades inte den skyddande effekten av Oxt mot cytokininducerad celldöd på holmarna isolerade från Oxtr - / - möss (fig. 1F). Oxtr är selektiv för Oxt i allmänhet, men kan också binda till vasopressin (Avp) med låg affinitet 20 . För att verifiera specificiteten av Oxt-signalering behandlades pankreasöarna med 1 nM Avp och cytokiner. Emellertid kunde behandling med Avp inte förhindra cytokininducerad celldöd (fig. 1G).

Oxtr - / - möss uppvisar normal metabolisk homeostas

Med tanke på den skyddande rollen för Oxt-signalering, kan brist på Oxtr försämra cellulär homeostas såväl som insulinmedierad glukosmetabolism i bukspottkörtelöarna, vilket tillsammans leder till sen fetma. Det fanns emellertid ingen morfologisk förändring i bukspottkörtelöarna av Oxtr - / - möss jämfört med vilda typkontrollkamrater (Fig. 2A, B). Det fanns ingen tydlig minskning av insulinpositiva eller glukagonpositiva celler i Oxtr - / - holmarna (Fig. 2A). Följaktligen var glukosnivåerna hos Oxtr - / - möss jämförbara med nivåerna för WT-möss under glukostoleranstestet (Fig. 2C). Dessutom var matintaget och kroppsvikt för Oxtr - / - möss också desamma som hos WT-möss (data visas inte). I överensstämmelse med dessa observationer var expressionsnivåerna av endoplasmatiska retikulumrelaterade gener, som är involverade i celldödssignaler, jämförbara mellan WT och Oxtr - / - möss (Fig. 2D). I överensstämmelse med en tidigare studie 13 tyder dessa resultat på att en brist på Oxt-signalering inte omedelbart leder till patologiska fenotyper.

( A ) Morfologisk undersökning av bukspottkörtelöarna av WT och Oxtr - / - möss. Bukspottkörtelöarna färgades med anti-glukagon- och anti-C-peptidantikroppar. Kärnor färgades med DAPI. Skalstänger = 50 μm. ( B ) Oxtr - / - möss öar skilde sig inte från WT-möss. n = 22. ( C ) Glukostoleranstester utfördes i WT och Oxtr - / - möss. n = 3–5. ( D ) Uttrycksnivåerna för ER-stressrelaterade gener undersöktes med kvantitativ PCR. Observera att ingen signifikant skillnad observerades mellan WT och Oxtr - / - möss. n = 5.

Bild i full storlek

Oxtr - / - möss utvecklar glukosintolerans under fettsnål diet

Oxt har varit inblandat i metabolisk reglering i perifera vävnader såsom adipocyter och bukspottkörteln 10, 11, 12 . Intressant nog, när vildtypsmöss matades med en högmatad diet, var det en signifikant ökning av både Oxt- och Oxtr- nivåer i hjärnan och Oxtr- nivån på öarna (Fig. 3A – C). Det cirkulerande blodets Oxt-nivå skilde sig emellertid inte mellan WT och Oxtr - / - möss (data visas inte). Ökningen av Oxt och Oxtr i både centrala och perifera vävnader antyder att Oxt-signalering är aktivt involverad i det adaptiva svaret på metabolisk stress. Detta perspektiv fick oss att utmana Oxtr - / - möss med metabolisk stress såsom en fettrik diet. Kroppsvikten för Oxtr - / - möss var något tyngre än för WT-möss efter fett med hög fetthalt i 16 veckor (fig. 3D). För att undersöka glukosmetabolismen utsattes Oxtr - / - möss som matade med fettrik diet för glukostoleranstestet. Insulinsekretion efter glukosutmaning försämrades signifikant hos Oxtr - / - möss (Fig. 3E). Följaktligen dämpades reduktionen av plasmaglukosnivån signifikant hos Oxtr - / - möss jämfört med den i WT-möss (Fig. 3F – G). För att undersöka den potentiella inverkan av metabolisk stress på insulinkänslighet utfördes insulintoleranstestet i WT och Oxtr - / - möss. Emellertid var insulinkänslighet hos Oxtr - / - möss som matade den fettfattiga dieten jämförbar med den hos WT-möss (Fig. 3H). Dessa resultat tyder på att insulinutsöndring från bukspottkörtelöarna var selektivt nedsatt hos Oxtr - / - möss med kronisk metabolisk stress.

( A, B ) WT-möss matades med en fettrik diet under 19 veckor. Uttrycksnivåerna för Oxt ( A ) och Oxtr ( B ) i hjärnan undersöktes med kvantitativ PCR. n = 5 ~ 6. * P <0, 05, ** P <0, 01 av Studentens t- test. ( C ) Uttrycksnivån för Oxtr i bukspottkörtelöarna av WT-möss som matades med en fettrik diet undersöktes. n = 5 ~ 8. * P <0, 05 av Studentens t- test. ( D ) WT och Oxtr - / - möss vid 12 veckor gamla matades med en fettrik diet. Förändringen i kroppsvikt visas. n = 13. ( E ) Möss matade med en fettrik diet under 18 veckor utmanades med glukos, och plasmaninsulinnivåerna vid angivna tidpunkter mättes. * P <0, 05 genom upprepade mått tvåvägs ANOVA. n = 4–5. ( F ) Glukostoleranstester utfördes på möss som matades med en fettrik diet under 18 veckor. * P <0, 05 genom upprepade mått tvåvägs ANOVA. n = 4–5. ( G ) Området under kurvan (AUC) motsvarande glukostoleranstestet ( F ) beräknades. * P <0, 05 av Studentens t- test. n = 4–5. ( H ) Insulintoleranstestet utfördes hos möss som matades med en fettrik diet under 18 veckor. n = 10.

Bild i full storlek

Stressinducerad apoptos i Oxtr - / - pankreasöar

Metabolisk stress är en av de viktigaste triggersna av kronisk inflammation som orsakar celldöd 21 . Med tanke på anti-celldödrollen för Oxt-signalering i bukspottkörtelöarna, misstänkte vi att den fettriktade dietinducerade glukosintoleransen hos Oxtr - / - möss kan bero på ökad celldöd i Oxtr - / - holmarna. Morfologisk undersökning av bukspottkörtelöarna avslöjade ingen skillnad mellan WT och Oxtr - / - möss (Fig. 4A). Varken storleken på holmarna eller antalet glukagonceller skilde sig signifikant mellan WT och Oxtr - / - möss (Fig. 4B, C). För att undersöka celldöd hos stressade möss isolerade vi bukspottkörtelöarna från de stressade mössen och undersökte celldöd. Som förväntat fanns en signifikant ökning av celldöd i Oxtr - / - holmarna (Fig. 4D). Följaktligen observerades TUNEL-positiva celler i Oxtr - / - holmarna (Fig. 4E).

( A ) Morfologisk undersökning av bukspottkörtelöarna i WT och Oxtr - / - möss matade en fettrik diet i 16 veckor. Bukspottkörtelöar färgades med anti-glukagon (röd) och anti-C-peptid (grön) antikroppar. Kärnor färgades med DAPI (blå). Skalstänger = 50 μm. ( B ) Öarområdet för WT och Oxtr - / - möss som matades med en fettrik diet under 16 veckor undersöktes. n = 21. ( C ) Det relativa glukagoncellområdet beräknades genom att dela glukagoncellområdet med det totala holmarna. n = 21. ( D ) Celldöd i holmarna hos WT och Oxtr - / - möss som matats med normal chow (NC) eller en fettrik diet (HF) under 16 veckor. * P <0, 05 av Studentens t- test. n = 5. ( E, F ) Uttrycksnivåer för gener relaterade till ER-stressrespons ( F ) och holmsfunktioner ( G ) undersöktes. * P <0, 05 av Studentens t- test. n = 5 vardera.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi den molekylära mekanismen som ligger bakom stressinducerad celldöd i Oxtr - / - holmarna. Metabolisk stress är en stark inducerare av endoplasmatisk retikulumstress (ER-stress), vilket leder till celldöd genom uppreglering av proapoptotiska gener såsom Chop och Xbp1 21 . Vi undersökte således expressionsnivåerna av ER-stressrelaterade gener såsom Bip , Chop , Xbp1 och Glut2 . I själva verket fanns en signifikant ökning av Chop och Xbp1 nivåer i stressade Oxtr - / - holmar (Fig. 4F). Vidare fanns en signifikant minskning av Glut2- nivåer, vilket återspeglade det försämrade glukosresponset i Oxtr - / - holmarna (Fig. 4F). Å andra sidan förblev uttrycksnivåerna för gener relaterade till bukspottkörtelns funktioner, såsom Ins1 / 2 , Pdx1 och Glucagon, oförändrade mellan WT och Oxtr - / - möss (Fig. 4G).

Slutligen undersökte vi molekylvägen som bidrar till den stressade inducerade celldöd i Oxtr - / - bukspottkörtelöarna. Bindningen av Oxt till Oxtr initierar en mängd nedströms signalvägar, inklusive mitogen-aktiverat proteinkinas (MAPK) / extracellulärt signalreglerat kinas (ERK) -CAMP-svarelementbindningsprotein (CREB) -väg, som nyligen har varit inblandat i ER-stressresponsen 22 . För att undersöka den potentiella involveringen av ERK-CREB-signalering i bukspottkörtelöarna, immunfärgades de aktiva fosforylerade formerna av ERK1 / 2 och CREB i bukspottkörtelöarna av WT och Oxtr - / - möss som matades med normal chow eller en fettrik diet (Fig. 5A-D). Det fanns en markant reduktion av fosfor-ERK1 / 2 och fosfor-CREB i Oxtr - / möss som matades med en fettrik diet (Fig. 5B, D). Dessa resultat antyder således att ERK-CREB-signaleringen försämrats i Oxtr - / - -möss under kronisk metabolisk stress.

( A – D ) Bukspottkörtelns sektioner av möss matade med normal chow (NC) ( A ) eller en fettrik diet (HF) ( B ) färgades med anti-insulin antikropp i kombination med anti-ERK anti-fosfo-ERK (P) -ERK). Observera att p-ERK-signalen minskade i Oxtr - / - möss matade HF. ( C, D ) Pankreatiska sektioner av möss matade NC ( C ) eller HF ( D ) färgades med anti-CREB- eller anti-fosfo-CREB (P-CREB) antikroppar. Observera att p-CREB-signalen minskade i Oxtr - / - möss matade HF. Kärnor färgades med DAPI. Skalstänger = 20 μm. ( E ) P-CREB-nivåerna i holmar av WT och Oxtr - / - möss som matades med en fettrik diet ( D ) kvantifierades genom att mäta intensiteten för p-CREB i enskilda kärnor. n = 283 celler för WT, n = 147 celler för KO. **** P <0, 0001 av Studentens t- test.

Bild i full storlek

Diskussion

Föreliggande studie avslöjade en fördelaktig roll för Oxt-signalering som svar på cytotoxisk stimulering i bukspottkörtelöarna. Aktiveringen av Oxt-signalering dämpad celldöd inducerad av cytotoxiska cytokiner i bukspottkörtelöarna. Anti-celldödeffekten av Oxt påvisades vidare hos möss med brist på Oxtr. Oxtr - / - -möss som matade med fetthaltdiet uppvisade ökad apoptos i bukspottkörtelöarna, vilket resulterar i försämrad insulinsekretion och glukosintolerans. I överensstämmelse med vår studie har den skyddande rollen för Oxt-signalering i perifer vävnad framkommit från de senaste studierna 23, 24, 25 . Applicering av Oxt-skyddade kardiomyocyter från apoptos i råtthjärtat utsatt för tillfällig ischemi liksom hos överviktiga diabetiska db / db-möss 23, 24, 25 . Dessa resultat antyder således att Oxt-signalering är aktivt involverad i skyddet av den cellulära homeostasen hos bukspottkörtelöarna, vilket i slutändan bidrar till den metaboliska balansen.

Trots de ackumulerade bevisen som visar den fördelaktiga rollen för Oxt-signalering har molekylmekanismen för anti-celldödeffekten av Oxt till stor del inte utforskats. Oxy binder till Oxtr tillsammans med Gq, vilket leder till kalciummobilisering 1 . I neuroner transducerar den Oxt-framkallade kalciumsignaleringen till MAPK / ERK-kaskaden, vilket ytterligare leder till aktivering av CREB och följaktligen bidrar till inlärning och minne 7 . ERK-CREB-kaskaden främjar cellöverlevnad genom både den ERK-beroende fosforylering av prosurvivalproteiner och CREB-beroende transkription av prosurvivalgener 22 . Med tanke på den markanta minskningen av fosforylering av ERK och CREB i Oxtr - / - holmarna är det tänkbart att förlusten av Oxt-ERK-CREB-kaskaden bidrar till den stressinducerade apoptosen.

Ett unikt fynd i denna studie var involveringen av Oxt-signalering i ER-stressresponsen i bukspottkörtelöarna. Nivåerna av kanoniska ER-stressgener, såsom Xbp1 och Chop , var betydligt uppreglerade i de stressade Oxtr - / - holmarna, vilket tyder på att Oxt-signalering undertrycker ER-stressresponsen. Emellertid förblir den molekylära mekanismen genom vilken Oxt-signalering är associerad med ER-stressresponsen okänd. Nyligen har några bevis visat att CREB är involverat i ER-stressresponsen genom konkurrenskraftig associering med aktiverande transkriptionsfaktor 6 alfa (ATF6a), som är en integrator av ER-stress 26 . Både CREB och ATF6a binder till en gemensam transkriptionsfaktor benämnd CREB-reglerad transkriptionskoaktivator 2 (CRTC2) på ett ömsesidigt exklusivt sätt. En minskning av CREB skulle resultera i en ömsesidig ökning av ATF6-CRTC2-komplexet, vilket främjar uttrycket av ER-stressresponsgener inklusive Xbp1 och Chop 26 . Det är troligt att reduktionen av fosfo-CREB i Oxtr - / - holmar ömsesidigt förbättrar det ATF6-CRTC2-medierade ER-stressrespons, vilket följaktligen främjar apoptos.

Med tanke på anti-celldödeffekten av Oxt-signalering är det värt att nämna den potentiella rollen för Oxt-signalering i Alzheimers sjukdom (AD). AD är en neurodegenerativ sjukdom som kännetecknas av unika histopatologiska och biologiska avvikelser, inklusive celldöd, amyloid-p-avlagringar och minnesförlust 27 . Ett växande bevismaterial kopplar typ 2-diabetes till utvecklingen av AD 28 . Intressant nog uppvisar kärnan basalis av Meynert i förhjärnan, som innehåller ett antal kolinergiska neuroner som degenereras hos AD-patienter, en hög uttrycksnivå av OXTR hos människor 29 . Det är troligt att dysreguleringen av Oxt-signalering är involverad i utvecklingen av 30 AD.

Med tanke på den gynnsamma effekten av Oxt i ämnesomsättningen har den tillämpats på djurmodeller av diabetes 31 . Oxt-administration reducerade effektivt fetma och fetma-relaterad glukosmetabolism i diabetiska gnagare 32, 33 . Dessutom genomfördes nyligen en klinisk prövning med Oxt som ett läkemedel mot fetma 34 . Oxt-terapin visade några positiva effekter på viktkontroll 34 . I den aktuella studien observerade vi nedsatt glukostolerans, men insulinkänsligheten påverkades inte signifikant hos Oxtr - / - möss. Dessa resultat tyder på att Oxt-signalering huvudsakligen verkar på bukspottkörtelarna för att bibehålla den hormonella balansen. Dessutom kan den skyddande effekten av Oxt-signalering på holmarna förklara de positiva metaboliska resultaten i de tidigare Oxt-terapierna. Ytterligare studier med användning av humana pankreasöar kommer att behövas för att belysa den potentiella rollen för Oxt-signalering hos människor.

Sammantaget avslöjar våra resultat att Oxt-signalering är avgörande för cellöverlevnaden för bukspottkörtelöarna under inflammatoriska metaboliska stressförhållanden. Dessa fynd avslöjar således den mekanistiska grunden för potentialen hos Oxt-terapi för att behandla diabetes.

metoder

djur

Oxtr- bristfälliga möss (T583) som beskrivits tidigare 35 användes i alla experiment. Alla musstammar korsades igen för att uppnå en C57BL / 6-genetisk bakgrund i mer än 6 generationer. Om inte annat anges var alla möss som användes i denna studie hane. Oxtr knockout (Oxtr - / - ) -möss genererades genom att erhålla heterozygota möss korsade med varandra, och kullkamraterna av vildtypen användes som kontroll. Djur hölls vid 25 ° C med 12-timmars ljus / 12-timmars mörka cykler. Chow med hög fetthalt (D12451, 45% kcal% fett) köptes från Research Diets (New Brunswick, NJ, USA). Normal chow (CE-2, 4, 6% kcal% fett) köptes från CLEA Japan (Tokyo, Japan). Alla djurförfaranden godkändes av Animal Ethics Committee vid Kumamoto University (godkännande-ID: A27-037). Alla procedurer genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.

Genuttrycksanalys

Islet isolerades från Oxtr - / - och vildtypsmöss genom intraductal kollagenas (Liberase TL-kvalitet; Roche) -smältning följt av handplockning, såsom beskrivits tidigare 36 . Hela hjärnorna skars snabbt ut från möss och skivades i en tjocklek av 500 um med användning av VT1200S (Leica). Regionen motsvarande de supraoptiska kärnorna stansades sedan ut och utsattes för RNA-rening. Totalt RNA för holmar och hjärnvävnader renades med användning av ett RNeasy Mini Kit (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll. Ett PrimerScript RT Reagent Kit (TAKARA) användes för att generera cDNA. Kvantitativa PCR: er i realtid utfördes med användning av antingen en TaqMan Gene Expression Kit (Oxt; Mm00726655-s1, Oxtr; Mm01182684-m1 från Applied Biosystems) eller SYBR Pre-mix Ex Taq-kit (Applied Biosystems). Primers för detektering av ER-stressrespons och holmfunktion beskrevs tidigare 36 . 18S rRNA användes som referensgen för normalisering.

Analys av celldöd

Islar isolerade från vildtyp och Oxtr - / - möss isolerades och odlades i RPMI-medium kompletterat med 5% FBS över natten. Därefter överfördes endast storleksanpassade och välformade holmar till en platta med 12 brunnar (20 holmar / brunn), varvid varje brunn representerar ett replikat. Öarna behandlades med 100 pM OXT (Sigma), 1 nM AVP (Sigma), 2 ng / ml tunicamycin (Sigmga-Aldrich) eller en cytokinblandning [IL1-p (50 U / ml) • TNF-a (1 × 10 3 U / ml) • INF-α (1 × 10 3 U / ml), Wako] i 24 timmar. Celldöd mättes med Cell Death Detection ELISA Assay Kit (Roche) enligt tillverkarens protokoll. Celldödnivån mättes som absorbansen vid 405 nm med avseende på ett substratlösningsämne. Experimentet upprepades i tre gånger. N-talet representerar det totala antalet replikat från dessa oberoende experiment.

Mätning av blodglukos- och insulinnivåer

För glukostoleranstestet fastades möss vid 15 till 16 veckors ålder under 14 timmar (8:00 till 10:00) eller 7 timmar (9:00 till 16:00), följt av den intraperitoneala injektionen glukos i en dos av 1 g / kg kroppsvikt. För insulintoleransprovet fastades möss under 14 timmar och injicerades med humant insulin (Humulin R, Eli Lilly) i en dos av 1 enhet / kg kroppsvikt. Blodglukos bestämdes vid de angivna tidpunkterna med en glukometer (ACCU-CHEK, Aviva; Roche). Plasmainsulinnivåer bestämdes med användning av Mouse Insulin ELISA-kit (Shibayagi) enligt tillverkarens instruktioner.

Immunohistokemisk analys

För immunhistokemisk undersökning perfuserades möss vid 15 till 16 veckors ålder med 4% paraformaldehyd och utsattes för snittning med användning av Cyrostat (Leica). Bukspottkörtelsektioner färgades med användning av anti-insulin (HyTest), anti-C peptid (cellsignalering), anti-ERK, anti-fosfo-ERK (cellsignalering), anti-CREB anti-fosfo-CREB (cellsignalering) och anti -glukagon (Sigma-Aldrich) antikroppar. Alla antikroppar användes vid 1: 500-utspädningar. DAPI-lösning (Dojindo) användes för att färga kärnor. Bilder erhölls med användning av ett FV1000 konfokalt mikroskop (Olympus). För mätning av öarområdet erhölls randomiserade pankreasavsnitt från 3 möss och färgades med anti-insulin och anti-glukagonantikroppar. De insulinpositiva och glukagonpositiva områdena mättes som holmar med användning av Image J-programvaran (NIH), såsom beskrivits tidigare 37 .

Statistisk analys

Alla data presenteras som medelvärdet ± SEM. Statistiska analyser utfördes med användning av Prism 6 Software (GraphPad Software). Den oparade studentens t- test användes för att testa skillnaderna mellan två grupper. Variansanalys (envägs ANOVA, tvåvägs ANOVA och upprepade mått tvåvägs ANOVA) användes för att testa skillnaden mellan flera grupper följt av en post-hoc undersökning av P- värdet mellan två grupper. En 2-tailed P- värde av 0, 05 ansågs vara signifikant.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Watanabe, S. et al. Oxytocin skyddar mot stressinducerad celldöd i p-buksceller från pankreas i muren. Sci. Rep. 6, 25185; doi: 10.1038 / srep25185 (2016).

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.