Överuttryck av mrna-bindande protein crd-bp i maligna melanom | onkogen

Överuttryck av mrna-bindande protein crd-bp i maligna melanom | onkogen

Anonim

Abstrakt

Wnt / ß-catenin signalväg spelar en viktig roll i embryogenes, stamcellsunderhåll, tumörigenes och åldrande. Här visar vi att RNA-bindande protein, kodande regionbestämmande bindande protein (CRD-BP) (ett transkriptionellt mål för Wnt-signalväg), uttrycks starkt i primära humana maligna melanom och melanomcellinjer med aktiverat Wnt / ß-catenin signalväg. Uppreglering av CRD-BP är associerad med en förhöjd nivå av ß-TrCP1 ubiquitin-ligasreceptor och aktivering av nukleära transkriptionsfaktorer-kappa B (NF-KB) signalering. Knockdown av CRD-BP hämmar NF-kB-aktivitet, inducerar apoptos och undertrycker spridning och tumörgeniska egenskaper hos melanomceller.

Huvudsaklig

Den ökade förekomsten av kutan melanom under de senaste tre decennierna, dess mycket progressiva natur och resistens mot behandling, har lett till ökad uppmärksamhet på denna sjukdom (granskad i Chin et al., 2006; Herlyn, 2006). Trots många studier som utförts på melanocytiska lesioner förstår de molekylära mekanismerna för melanomutveckling och progression fortfarande dåligt.

Wnt / ß-catenin-signalering spelar en viktig roll i normal utveckling och underhåll av stamceller, medan dess avvikande uppreglering är involverad i tumörigenes (Giles et al., 2003; Weeraratna, 2005). De definierande händelserna för en aktiv kanonisk Wnt-väg inkluderar ackumulering av cytoplasmatisk p-katenin, dess efterföljande kärntranslokation och initiering av p-katenin / Tcf-beroende transkription. I frånvaro av WNT regleras överflöd och transkriptionell aktivitet av p-katenin av den stora multikomponentmaskinerin som inkluderar adenomatöst polypos coli-protein (APC), axin, CK1 och glykogensyntas-kinas 3-p. Detta komplex underlättar fosforylering av p-katenin och bestämmer dess efterföljande nedbrytning. Bindning av WNT-ligand med dess Frizzled- och lågdensitets-lipoproteinreceptorrelaterade protein (5/6) -receptorer startar en kaskad av händelser som resulterar i störning av ß-catenin-fosforylering, efterföljande ansamling av fritt ß-catenin i cytoplasma, dess kärnämne translokation och transkriptionell aktivering av målgener. Överuttryck av WNT-proteiner, mutationer i APC och / eller stabiliserande ß-kateninmutationer är de vanligaste förändringarna förknippade med konstitutivt uppreglerad Wnt-signalering och tumörutveckling. Kärnlokalisering av ß-katenin, kännetecknet för en aktiv kanonisk Wnt-väg, observerades i cirka 30% av primära och metastatiska humana melanomprover (Rimm et al., 1999).

Aktivering av nukleära transkriptionsfaktorer-kappa B (NF-KB) observeras ofta i olika typer av humana tumörer, inklusive melanom (Basseres och Baldwin, 2006; Gilmore, 2006). I många celler består den huvudsakliga NF-KB-heterodimeren av p50- och RelA / p65-subenheter som är ansvariga för aktivering av kanonisk NF-KB-signalering. Hämmare av NF-KB (IBBs) reglerar tätt aktivitet för p50 / RelA-dimer. IKB: erna binder till NF-KB-dimerer och blockerar deras nukleära lokaliseringssekvens, varigenom det latenta komplexet bibehålls i cytoplasma. Vid stimuli fosforyleras IBB med IKB-kinaser (IKK), binder till ß-TrCP, en substratspecifik adapter av ett SCF ßTrCP E3 ubiquitin ligas, och genomgår ubikitination och nedbrytning av proteasomer. I frånvaro av hämning translocerar NF-KB till kärnan och aktiverar transkription av målgener, som reglerar flera cellulära processer, inklusive inflammation, värdförsvar och undertryckande av apoptos. När IKK är aktiv beror nedbrytning av hämmande proteiner och aktivering av den klassiska NF-kB-vägen på nivåerna av ß-TrCP (granskad i (Fuchs et al., 2004).

Tidigare har vi visat att Wnt / ß-catenin signalering inducerar ß-TrCP1 uttryck genom stabilisering av dess messenger RNA (mRNA) (Spiegelman et al., 2000). Vi identifierade det kodande regionen-determinant-binding protein (CRD-BP) som ett nytt transkriptionellt mål för ß-catenin, som binder och stabiliserar ß-TrCP1 mRNA som svar på Wnt-signalering (Noubissi et al., 2006). Förhöjda nivåer av ß-TrCP1 resulterar i ökad aktivitet av SCF β − TrCP1 E3 ubiquitin ligas och påskyndad nedbrytning av dess substrat, inklusive IKB. Således demonstrerade vi att Wnt / ß-catenin-signalering aktiverar NF-KB genom att inducera uttrycket av CRD-BP och ßTRCP1.

Kodningsregion-determinantbindande protein är ett multifunktionellt mRNA-bindande protein, som visade sig modulera stabiliteten, lokaliseringen och translationen av flera RNA ( c-myc , IGF-II , H19 , p TrCP1 , CD4 , MDR-1 och så på) (Prokipcak et al., 1994; Nielsen et al., 1999; Runge et al., 2000; Noubissi et al., 2006; Vikesaa et al., 2006; Sparanese och Lee, 2007). CRD-BP tillhör en konserverad VICKZ-familj av mRNA-bindande proteiner, kännetecknad av närvaron av fyra hnRNP K-homologidomäner och två RNA-igenkänningsmotiv (Doyle et al., 1998). CRD-BP uttrycks starkt under embryogenes, men förekommer sällan i vuxna vävnader. Överuttryck av CRD-BP är associerat med tumörgenes och observeras i en stor andel kolon-, bröst- och lungtumörer (Doyle et al., 2000; Ioannidis et al., 2001, 2003; Ross et al., 2001). Dess uttryck i kolorektala karcinom är korrelerade med tumöråterfall, metastaser och dåligt kliniskt resultat (Dimitriadis et al., 2007).

Även om höga nivåer av CRD-BP-uttryck har observerats i flera typer av mänskliga neoplasmer, är dess uttryck och roll i utvecklingen av maligna melanom okända. I denna studie visar vi att CRD-BP är uppreglerat i melanom, som kännetecknas av ackumulering av kärnkraftigt ß-katenin. Uppreglering av CRD-BP är associerad med förhöjd nivå av ß-TrCP1 och aktivering av NF-KB. Knockdown av CRD-BP hämmar NF-kB-aktivitet, inducerar apoptos och undertrycker proliferation och förankringsoberoende tillväxt av melanomceller.

Immunohistokemisk analys av melanomvävnadsuppsättning avslöjade olika nivåer av kärncytoplasmatisk ß-kateninuttryck i en majoritet av maligna melanom jämfört med normala hudprover. En stark kärncytoplasmisk signal (immunohistokemisk poäng 2+ och 3+) detekterades i 13 av 38 melanomprover. Dessa data överensstämmer med en tidigare rapport som visar att cirka 30% av humana melanom kännetecknas av aktivering av ß-catenin-signalering (Rimm et al., 1999). Vi observerade också starkt uttryckta CRD-BP i dessa melanom och dess uttryck korrelerade med kärnkraftslokalisering av ß-catenin (korrelationskoefficient = 0, 47) (figur 1). Kärnlokaliserad p65 (RelA) detekterades i alla maligna melanom som bekräftar att aktivering av NF-kB-vägen är viktig för melanomtillväxt (granskad i (Ueda och Richmond, 2006).

Image

Uttryck av p-katenin, kodande regionbestämmande bindande protein (CRD-BP) och p65 i humana melanom. Melanomvävnadsuppsättningar färgades för p-catenin, CRD-BP och p65 såsom beskrivits tidigare (Bhatia et al., 2002). ( a ) Korrelationen mellan kärncytoplasmatiska p-cateninnivåer och CRD-BP-uttryck (boxplotanalys). ( b - d ) Representativt immunohistokemiskt (IHC) för normal hud och malignt melanom med indikerad antikropp.

Bild i full storlek

För att ytterligare analysera regleringen av CRD-BP och NF-KB med Wnt / ß-catenin signalering i melanom, använde vi melanomcellinjer, 1241 mel, som bär en stabiliserande mutation av ß-catenin, och 928 mel, som uttrycker vilda- typ p-katenin, men ingen påvisbar adenomatös polypos coli (Rubinfeld et al., 1997). Cellinje, 1011 mel, innehållande både intakt p-katenin och APC, och normala humana melanocyter användes som kontroller. Cellinjer 928 mel och 1241 mel kännetecknas av nukleär lokalisering av p-katenin och konstitutiv aktivering av p-katenin / Tcf-beroende transkription (figur 2a och b, kompletterande figur 1A). Jämfört med normala humana melanocyter och 1011 mel åtföljdes aktivering av P-katenin-signalering i dessa celler av en förhöjd nivå av CRD-BP- och P-TrCP1-proteiner (figur 2c). Immunfluorescensanalys avslöjade stark kärnfärgning av p65 / RelA i 928 mel- och 1241 mel-cellinjer, medan melanocyter och 1011 mel visade mestadels cytoplasmisk lokalisering av p65 (figur 2d, kompletterande figur IB). Sammanfattningsvis visar dessa resultat att uppreglering av CRD-BP i kliniska melanomprover och melanomcellinjer sammanfaller med ansamling av ß-katenin och aktivering av NF-BB-signalering.

Image

Aktivering av signalväg Wnt / ß-catenin sammanfaller med överuttryck av kodande region-determinantbindande protein (CRD-BP) och aktivering av nukleära transkriptionsfaktorer-kappa B (NF-KB) signalering i melanomcellinjer. ( a ) Immunfarvning med p-kateninspecifik antikropp. ( b ) P-katenin / Tcf-responsiv luciferasaktivitet mättes och normaliserades för p-galaktosidas. ( c ) Immunoblot-analys för CRD-BP, p-TrCP1 och p-aktin. ( d ) Immunfarvning med p65-specifik antikropp.

Bild i full storlek

För att bedöma den reglerande rollen för CRD-BP vid induktion av NF-KB-beroende transkription och undertryckande av apoptos inhiberade vi uttryck av CRD-BP i melanomceller med en specifik liten hårnål-RNA (shRNA) -konstruktion. Övergående transfektion av 1241 mel med CRD-BP shRNA resulterade i minskade nivåer av CRD-BP och nedreglering av dess två specifika mål: ß-TrCP1 och c-myc (figur 3a). Knockdown av CRD-BP ledde till en signifikant undertryckning av NF-KB promotor-driven luciferasreporteraktivitet (figur 3b). Antalet celler som genomgår apoptos i CRD-BP shRNA-transfekterad grupp är ungefär två gånger högre jämfört med en kontrolltransfektion (figur 3c). Således resulterade knockdown av CRD-BP-expression i hämning av NF-KB-beroende transkription och induktion av programmerad celldöd i melanomceller.

Image

RNA-interferensmedierad nedreglering av kodande region-determinant-bindande protein (CRD-BP) resulterar i reducerat uttryck av p-TrCP1 och c-myc, hämning av nukleära transkriptionsfaktorer-kappa B (NF-KB) signalering och induktion av apoptos. ( a ) Immunoblot-analys av 1241 melceller transfekterade med indikerade små hårnål-RNA (shRNA) -konstruktioner. ( b ) NF-KB responsiv luciferasaktivitet mättes i 1241 melceller i närvaro eller frånvaro av indikerade shRNA-konstruktioner och normaliserades för p-galaktosidas. ( c ) 1241 mel-celler, samtransfekterade med shRNA-konstruktioner och grönt fluorescerande proteinkodande plasmid, analyserades för apoptos med flödescytometri. * P <0, 01; ** P <0, 05 i studentens t- test jämfört med förvrängd shRNA.

Bild i full storlek

Kolonibildningsanalys avslöjade att nedreglering av CRD-BP hämmar proliferation av melanomceller, och minskade således antalet kolonier av 1241 mel och 928 mel celler 16 × respektive 4 × (figur 4a och b). Vi observerade också undertryckande av förankringsoberoende tillväxt av melanomcellinjer 1241 mel och 928 mel transfekterade med CRD-BP shRNA-konstruktionen. Knockdown av CRD-BP-uttryck undertryckte tillväxten av 1241 mel- och 928 mel-celler i mjuk agar 6, 7 × respektive 2, 5 × (figur 4c). CRD-BP shRNA påverkade emellertid inte tillväxten av normala humana melanocyter (data visas inte). Dessa resultat visar att uttryck av CRD-BP är viktigt för både proliferativa och tumörgena egenskaper hos melanomceller.

Image

Knockdown av det kodande region-determinant-binding protein (CRD-BP) hämmar proliferation och förankringsoberoende tillväxt av melanomceller. ( a, b ) 1241 mel- och 928 mel-celler samtransfekterades med indikerade små hårnål-RNA (shRNA) -konstruktioner och pTk-puro. Kolonierna valdes ut för puromycinresistens, färgades med kristallviolett och räknades. ( c ) 1241 mel-celler, samtransfekterade med indikerade shRNA-konstruktioner och grönt fluorescerande protein (GFP), fick växa i mjuk agar och GFP-positiva kolonier räknades. * P <0, 01 i studentens t- test jämfört med förvrängd shRNA.

Bild i full storlek

Våra data ger den första insikten om rollen av CRD-BP i maligna melanom. Vi fann överuttryck av CRD-BP i en majoritet av melanomvävnader jämfört med normala hudprover. Vi visade att nukleär lokalisering av ß-catenin i primära melanom och melanomcellinjer är associerat med förbättrad expression av CRD-BP. Aktivering av Wnt-signalering tycks vara en viktig mekanism för CRD-BP-induktion vid maligna melanom. Emellertid uppvisade flera kliniska prover av malignt melanom höga nivåer av CRD-BP som inte åtföljdes av nukleär lokalisering av p-catenin, vilket antyder att CRD-BP-uttryck också kan regleras av andra transkriptionella och / eller post-transkriptionella faktorer.

Tidigare har vi visat att CRD-BP är avgörande för induktion av ß-TrCP1-aktivitet (Noubissi et al., 2006). Överuttryck av CRD-BP leder till stabilisering av ß-TrCP1 mRNA, förhöjda ß-TrCP1 proteinnivåer och ökad aktivitet av SCF β − TrCP1 E3 ubiquitin ligas. IkB-proteiner är bland de specifika substraten för SCF β − TrCP1 E3 ubiquitin ligas. Accelererad nedbrytning av IkB visade sig vara ansvarig för aktivering av NF-KB i melanomceller (Shattuck-Brandt och Richmond, 1997; Yang och Richmond, 2001). De flesta av de analyserade melanomcellinjerna uttrycker höga nivåer av ß-TrCP, jämfört med normala humana melanocyter (Liu et al., 2007). Hämning av ß-TrCP-funktion sensibiliserar humana melanomceller för apoptos (Soldatenkov et al., 1999). I denna studie visar vi att induktion av CRD-BP är en väsentlig mekanism för modulering av ß-TrCP1 och NF-kB-aktivitet i humana melanom med aktiverad ß-catenin signalering.

Vi har tidigare rapporterat att expression och aktivitet av p-TrCP2-protein, homologen av p-TrCP1, induceras som svar på mitogena stimuli (Spiegelman et al., 2002). Uppreglering av mitogenaktiverad proteinkinasväg förekommer ofta i melanom som ett resultat av onkogen mutation av BRAF- och NRAS- gener (Smalley och Herlyn, 2004). Nyligen genomförda studier indikerar att induktion av mutanten BRAF v600E i melanocyter ökar ßTrCP2-uttrycket och stimulerar IKB-nedbrytning (Liu et al., 2007). Dessa observationer tyder på att flera mekanismer är implicerade i uppregleringen av SCF β − TrCP1 E3 ubiquitin ligas och aktivering av NF-kB i maligna melanom.

Tidigare studier indikerar att uttryck av onkogen c-myc , vars mRNA är ett väl karakteriserat mål för CRD-BP, är viktigt för att upprätthålla spridning av melanomceller (Wang et al., 2008). Det har också visats att nedreglering av c-myc i melanom resulterar i induktion av apoptos (Hussein et al., 2003). Här demonstrerar vi att knockdown av CRD-BP effektivt minskar nivåerna av c-myc, vilket också kan bidra till att undertrycka tillväxten av melanomceller (figur 3a).

Sammanfattningsvis visar våra resultat att CRD-BP-uttryck är viktigt för melanomcellproliferation och överlevnad. Knockdown av CRD-BP i melanomceller resulterar i hämning av NF-KB-beroende transkription och induktion av apoptos. Inhibering av CRD-BP-expression resulterade också i undertryckning av melanomcells tillväxt in vitro . Framtida studier kan etablera CRD-BP som en ny molekylär markör för maligna melanom och som ett potentiellt mål för förebyggande och behandling av melanom.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande legende

  2. 2.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)