Osmosenserande och ställningsfunktioner för den oligomera fyra-transmembrane domänen osmosensor sho1 | naturkommunikation

Osmosenserande och ställningsfunktioner för den oligomera fyra-transmembrane domänen osmosensor sho1 | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Cell signalering
  • Membranproteiner
  • Strukturell biologi

Abstrakt

Jästvägen med hög osmolaritetsglycerol (HOG) aktiverar Hog1 MAP-kinaset, som koordinerar anpassning till förhållanden med hög osmolaritet. Här demonstrerar vi att det fyra-transmembrane (TM) domänproteinet Sho1 är en osmosensor i HKR1-undergrenen av HOG-vägen. Tvärbindningsstudier indikerar att Sho1 bildar plana oligomerer av dimers-of-trimers-arkitekturen genom dimerisering vid TM1 / TM4-gränssnittet och trimerisering vid TM2 / TM3-gränssnittet. Hög extern osmolaritet inducerar strukturella förändringar i Sho1 TM-domänerna och Sho1-bindning till det cytoplasmiska adapterproteinet Ste50, vilket leder till Hog1-aktivering. Förutom sin osmosenserande funktion tjänar Sho1-oligomeren som ett ställning. Genom att binda till TM-proteinerna Opy2 och Hkr1 vid TM1 / TM4 respektive TM2 / TM3-gränssnittet bildar Sho1 ett multikomponent signalkomplex som är väsentligt för Hog1-aktivering. Våra resultat belyser hur de fyra TM-domänerna i Sho1 dikterar oligomerstrukturen såväl som dess osmosensing och ställningsfunktioner.

Introduktion

Extrema osmotiska miljöer är stora hot mot levande organismer 1, 2 . För att hantera extern hög osmolaritet aktiverar den spirande jäst Saccharomyces cerevisiae Hog1 MAP-kinaset (MAPK) genom signalvägen 3, 4 med hög osmolaritetsglycerol (HOG). Jäst uppnår långsiktig anpassning till hyperosmotiska tillstånd genom att ackumulera den kompatibla osmolytglycerolen i cytoplasma. För att göra detta transporteras aktiverad Hog1 från cytoplasma till kärnan 5, där den inducerar uttrycket av generna som kodar de enzymer som är nödvändiga för glycerolsyntes (Gpd1, Gpp1 / 2 och så vidare), och genen som kodar glycerol / protonsymporter Stl1 (ref 6, 7). I cytoplasma stänger aktiverad Hog1 glycerolläckekanalen Fps1 (ref. 8). Således förbättrar Hog1 produktion, import och retention av glycerol. Aktiverad Hog1 reglerar också cellcykelprogressionen för optimal anpassning 9 .

HOG-vägen innefattar uppströms SLN1- och SHO1-grenarna, vilka båda aktiverar Hog1 MAPK (fig. 1). SHO1-grenen använder två relaterade, men distinkta signalmekanismer 10, som vi nedan kallar HKR1- och MSB2-undergrenarna. För aktivering av HOG-vägen måste en osmosensor detektera den extracellulära osmotiska förändringen och sedan överföra en signal till cytoplasma. Sln1-sensorns histidinkinas har etablerats som osmosensor för SLN1-grenen 11 . Det har emellertid varit en kontrovers om osmosensorns identitet för SHO1-grenen. Tre TM-proteiner, Hkr1, Msb2 och Sho1, har vardera ställts som förmodade osmosensorer, huvudsakligen baserade på deras mutanta fenotyper 12, 13, men inga definitiva bevis finns.

Image

Proteiner som är involverade i undergrenen HRK1 visas i lavendel. Proteiner som är specifika för SLN1-grenen är färgade blått och de som är involverade i MSB2-undergrenen är gröna färgade. Proteinerna separerade med en snedstreck (/) är funktionellt redundanta. Inte alla de kända komponenterna visas. Den gula horisontella stapeln representerar plasmamembranet (PM). Pilarna indikerar aktivering, medan de inverterade T-formade staplarna representerar hämning.

Bild i full storlek

Hkr1 och Msb2 har en gemensam funktion, eftersom det är nödvändigt att störa både HKR1- och MSB2- generna för att fullständigt inaktivera SHO1-gren 13 . Även om både Hkr1 och Msb2 är envägs-TM-proteiner vars extracellulära domäner innehåller en mycket O-glykosylerad Ser / Thr-rik (STR) -domän och en bevarad Hkr1 – Msb2-homologi (HMH) -domän, skiljer sig deras cytoplasmatiska domäner. Radering av STR-domänen från antingen Hkr1 eller Msb2 aktiverar proteinet konstitutivt, medan borttagning av HMH-domänen inaktiverar proteinet, vilket antyder att både Hkr1 och Msb2 är involverade i signalering.

Sho1 består av fyra TM-domäner och en cytoplasmatisk SH3-domän som binder till MAPK-kinaset (MAPKK) Pbs2 (ref. 12). Mutationer har identifierats i Sho1 TM-domänerna som upp- eller nedreglerar osmostress-signalering, vilket antyder att Sho1 TM-domänerna aktivt signalerar 13, 14 . Men konstaterandet att borttagningen av de fyra TM-domänerna i Sho1 inte helt avskaffade signalering genom SHO1-grenen verkade motsäga idén att Sho1 kan vara en osmosensor, eftersom TM-signalering skulle anses vara nödvändig för en föreslagen osmosensor 15 . Uppföljningsanalyser indikerade emellertid att denna Sho1-TM-oberoende Hog1-aktivering endast sker genom MSB2-undergren 13 . Därför kvarstår möjligheten att Sho1 fungerar som en osmosensor för undergrenen HKR1. Den här artikeln undersökte Sho1s roll som osmosensor i HKR1-undergrenen.

Som svar på hyperosmolaritet aktiverar undergrenen HKR1 Hog1 genom Ste20 – Ste11 – Pbs2 – Hog1-kinaskaskaden 4 . Den PAK-liknande kinas Ste20 rekryteras till membranet av det lilla G-proteinet Cdc42 (ref. 15) såväl som av Hkr1 (förmodligen genom ett hypotiserat adapterprotein) 10 . På liknande sätt rekryteras MAPKK-kinaset (MAPKKK) Ste11 till membranet av Opy2 – Ste50-komplexet 16 (fig. 2a). Ste50 är ett cytoplasmatisk adapterprotein som binder både till Ste11 och till envägsmembranförankringsproteinet Opy2 (refs 17, 18). Slutligen rekryteras Pbs2 också till membranet av Sho1 (ref. 12). Således sker både Ste20 → Ste11-reaktionen och Ste11 → Pbs2-reaktionen på membranet. En eller båda av dessa aktiveringsreaktioner regleras sannolikt av osmostress; inga sådana mekanismer är emellertid kända.

Image

( a ) En förenklad schematisk modell av HKR1-undergrenen av HOG-banan. Röda pilar anger signalflödet genom sekventiell fosforylering. Den gula horisontella stapeln representerar plasmamembranet (PM). ( b ) Schematisk modell av Ste50. Horisontella svarta staplar representerar Ste50-borttagningskonstruktionerna som används i detta arbete. RA, Ras föreningsdomän; SAM, sterilt alfamotiv; SB, Sho1-bindande domän. ( c ) Schematisk modell av Sho1. Horisontella svarta staplar representerar Sho1-borttagningskonstruktionerna. Den korta röda stapeln representerar myristoyleringsplatsen (myr). ND, inte bestämd. ( d - j ) Ste50 – Sho1-bindande analyser. Jäststammen KY594-1 samtransfekterades med expressionsplasmiderna för indikerade derivat av HA-Sho1 ( d - h, j ) eller Sho1-GFP ( i ) under GAL1- promotorn och för GST-Ste50 under TEF2- promotorn. Celler odlades i CARaf och uttryck av märkt Sho1 inducerades av 2% galaktos under 2 timmar. NaCl (1 M, slutlig koncentration) tillsattes (+) under 5 minuter eller under de tider som anges i ( e ) eller tillsattes inte (-), och celllysat framställdes med användning av buffert A innehållande 0, 2% Triton-X- 100. GST-Ste50 utfälldes från celllysat med glutation Sepharose, och samutfälld HA-Sho1 eller Sho1-GFP undersöktes med en anti-HA ( d - h, j ) respektive en anti-GFP ( i ) antikropp. IB, immunblotting; IP, immunutfällning. ( k ) En modell av den osmostressinducerade Ste50 – Sho1-interaktionen. Den blå pilen indikerar inducerbar fysisk associering, medan de röda pilarna indikerar signalflödet.

Bild i full storlek

I den här artikeln visar vi att Sho1 är en osmosensor i HKR1-undergrenen av HOG-vägen. Sho1 bildar plana oligomerer i dimers-of-trimers-arkitekturen genom dimerisering vid TM1 / TM4-gränssnittet och trimerisering vid TM2 / TM3-gränssnittet. Hög extern osmolaritet inducerar strukturella förändringar i Sho1 TM-domänerna och Sho1-bindning till det cytoplasmiska adapterproteinet Ste50, vilket leder till Hog1-aktivering. Genom att binda till TM-proteinerna Opy2 och Hkr1 vid TM1 / TM4 respektive TM2 / TM3-gränssnittet bildar Sho1 dessutom ett signalkomplex med flera komponenter som är väsentligt för Hog1-aktivering. Således dikterar de fyra TM-domänerna i Sho1 oligomerstrukturen såväl som dess osmosenserande och ställningsfunktioner.

Resultat

Osmostress inducerar föreningen Ste50 – Sho1

För att se om Sho1 potentiellt fungerar som en osmosensor undersökte vi först om osmostress kan reglera Sho1-interaktion med någon signalmolekyl i SHO1-vägen. Vi tyckte adapterproteinet Ste50 särskilt en trolig kandidat, eftersom vi tidigare visade att en hyperaktiv Ste50-D146F, men inte den vilda typen Ste50, binder till Sho1 (ref. 19). Hyperaktiva mutanter efterliknar ofta stimuleringsinducerade aktiveringstillstånd för deras vildtyps motsvarigheter. Vi testade därför om osmostress kunde inducera vildtyp-Ste50 – Sho1-interaktion med hjälp av samimmunoprecipiteringsanalyser (se fig. 2b, c för schematiska strukturer av Ste50- och Sho1-konstruktioner). Även om GST-Ste50-WT inte binder till HA-Sho1 i frånvaro av osmostress, binds det väsentligen till HA-Sho1 när cellerna exponerades för osmostress, såsom 1, 0 M NaCl (fig. 2d, spår 1-2). Bindningen mellan GST-Ste50-D146F och HA-Sho1, som var detekterbar även i frånvaro av osmostress, förstärktes ytterligare av osmostress (Fig. 2d, spår 3-4). Som vi kommer att visa senare i denna artikel interagerar Sho1 också med Opy2. För att förhindra en indirekt associering av Sho1 och Ste50 förmedlade av Opy2, använde vi Ste50ΔRA-mutanten, som inte kan binda till Opy2, för Ste50 – Sho1-bindande analyser i resten av detta arbete. Osmostressinducerad bindning mellan GST-Ste50ΔRA och HA-Sho1 inträffade snabbt och nådde en platå på 10 minuter (Fig. 2e). Dessa data indikerar därför att osmostress inducerar interaktionen av Sho1 med adapterproteinet Ste50. Inducerad Ste50 – Sho1-förening kan förbättra Ste11 – Pbs2-interaktion, vilket är ett viktigt steg i Hog1 MAPK-kaskaden (steg 2 i fig. 2a).

En bevarad domän i Ste50 binder till Sho1 TM-domänerna

Därefter behandlade vi de Ste50 – Sho1-bindande platserna inom dessa molekyler. Ste50 innehåller tre evolutionärt konserverade domäner - den aminoterminala (N-terminala) SAM-domänen som binder Ste11, ett centralt konserverat område (aminosyrapositioner 114–150) med okänd funktion och karboxylterminal (C-terminal) RA-domäner som binder Opy2 (se fig. 2b) 16, 17, 19 . Med användning av GST-Ste50-konstruktioner som saknade en av dessa domäner fann vi att det centrala konserverade området var nödvändigt för den osmostressinducerade bindningen av GST-Ste50 till HA-Sho1 (fig. 2f). Nedan hänvisar vi till den centrala konserverade regionen i Ste50 som Sho1-bindande (SB) -domän.

För att identifiera platsen i Sho1 som binds till Ste50, undersökte vi på liknande sätt bindningen av en uppsättning HA-Sho1-partiella deletionsmutanter till GST-Ste50ΔRA (se fig. 2c för använda mutanter). Osmostress-inducerad Ste50 – Sho1-bindning påverkades inte av radering av någon del av Sho1-C-terminalen (fig. 2g – h, Sho1Δ4 – Δ12) eller N-terminal (fig. 2i, Sho1Δ2) cytoplasmiska regioner, men avskaffades genom borttagning av de fyra Sho1 TM-domänerna (fig. 2i, Sho13; och fig. 2j, Δ1). Vi drog därför slutsatsen att de fyra Sho1 TM-domänerna, men inga andra delar av Sho1, är nödvändiga för dess osmostressinducerade Ste50-bindning.

Inducerad Ste50 – Sho1-bindning aktiverar Hog1

Därefter bestämde vi om Ste50 – Sho1-bindning kan vara avgörande för Hog1-aktivering. Ste50ΔSB, som saknade Sho1-bindningsstället, kunde stödja betydande Hog1-aktivering i ssk2 / 22 Δ MSB2 + -celler, men inte i ssk2 / 22 Δ msb2 Δ-celler (Fig. 3a). På liknande sätt stödde en Sho1-mutant som saknade det Ste50-bindande stället, nämligen myr – Sho1Δ1, Hog1-aktivering i ssk2 / 22 Δ MSB2 + -celler men inte i ssk2 / 22 Δ msb2 Δ-celler (fig. 3b). I detta experiment fästes en myristoyleringssignal (myr) vid N-terminalen av Sho111 så att den kunde rekrytera den bundna Pbs2 till membranet 15 . I motsats till dessa data inhiberade inte Ste50- SB-mutationen den feromonsvariga Fus3 / Kss1 MAPK-vägen som också involverar Ste50-signalering 20 (Fig. 3c). I överensstämmelse med dessa resultat kan GST-Ste50ΔSB binda till Ste11, vilket krävs både för HKR1-undergrenen och för parningsvägen (fig. 3d). På grundval av dessa resultat drar vi slutsatsen att osmostressinducerad Ste50 – Sho1-bindning är nödvändig specifikt för Hog1-aktivering via HKR1-undergrenen (men varken för MSB2-undergrenen eller för parningsvägen).

Image

( a, b ) Hog1-specifika reporteranalyser av jäststammar av de indikerade genotyperna; KT048 och KT193 i a eller QG153 och KT040 i b, vilka transfekterades med expressionsplasmider för de indikerade mutanterna från STE50 ( a ) eller SHO1 ( b ). Cellerna stimulerades med (orange) eller utan (blå) 0, 4 M NaCl under 30 minuter, och expression (expr.) Av 8xCRE-lacZ- reportergen bestämdes. ß-galaktosidasaktivitet uttrycks i Miller-enheter. Felfält representerar sd ( n 3). ( c ) Reporteranalys för den feromonsvariga Fus3 / Kss1 MAPK-vägen. FP66 transformerades tillsammans med den Fus3 / Kssl-specifika reporterplasmiden pFUS1-lacZ och expressionsplasmider för de indikerade Ste50-mutanterna. Cellerna stimulerades med eller utan 1 μM a-faktor under 2 timmar, och expression av FUS1-lacZ- reportergen bestämdes. Felfält representerar sd ( n 3). ( d ) In vivo Ste50 – Ste11-bindande analys. Jäststammen KY594-1 samtransfekterades med expressionsplasmider för indikerade derivat av GST-Ste50 och HA-Ste11ΔC (= 1-413) under GAL1- promotorn. Celler odlades i CARaf, och expression av GST-Ste50 och HA-Ste11C inducerades med 2% galaktos under 2 timmar. Celllysat framställdes med användning av buffert A innehållande 0, 2% Triton-X-100. GST-Ste50 fälldes ut från celllysat med glutation Sepharose och samutfälld HA-Ste11C testades med en anti-HA-antikropp.

Bild i full storlek

Membranpermeabilisering inducerar Ste50 – Sho1-associering

Osmostress har olika fysiska och kemiska effekter på cellen. För att bestämma vilka av dessa effekter av osmostress som inducerade Sho1 att binda Ste50, undersökte vi ett antal farmakologiska och toxikologiska medel som kan härma effekterna av osmostress. Av dessa medel var det antifungala läkemedlet nystatin av särskilt intresse, eftersom det tidigare visat sig hämma SHO1-gren 21 och därför förväntades hämma osmostressinduktion av Ste50 – Sho1-föreningen. I motsats till våra förväntningar inducerade dock nystatin en stark Ste50 – Sho1-förening även i frånvaro av osmostress (Fig. 4a). För att bättre förstå denna effekt av nystatin granskade vi dess effekter på Hog1-aktiveringsstegen. I en ssk2 / 22 Δ msb2 Δ-mutantstam, där endast HKR1-undergrenen är funktionell, hämmade 5 μg ml −1 nystatin fullständigt den osmostressinducerade Hog1-aktiveringen (fig. 4b, övre rader). I en motsvarande stam där den hyperaktiva STE11- Q301P uttrycktes (från den nativa STE11- promotorn) aktiverade emellertid nystatin Hog1 även i frånvaro av osmostress (Fig. 4b, nedre rader). För att tolka dessa resultat ansåg vi att två steg i Hog1 MAPK-kaskaden, Ste20 → Ste11 (steg 1 i fig. 2a) och Ste11 → Pbs2 (steg 2), troligen kommer att regleras av osmostress för att åstadkomma Hog1-aktivering 19 . Ste11-Q301P-mutantproteinet efterliknar det aktiverade tillståndet för Ste11 och gör således steg 1 onödigt. Således är en trolig tolkning av dessa resultat att nystatin stimulerar steg 2 men hämmar steg 1.

Image

( a ) Ste50 – Sho1-bindande analyser. Förfarandet var detsamma som i fig. 2d, förutom att cellerna behandlades med de angivna koncentrationerna av nystatin under 5 minuter omedelbart innan 1 M NaCl (slutlig koncentration) tillsattes. ( b ) Hog1-fosforyleringsanalyser. Jäststammarna KT034 och KT033 av de angivna genotyperna behandlades med den indikerade koncentrationen av nystatin under 5 minuter och stimulerades sedan med (+) eller utan (-) 1 M NaCl under ytterligare 5 minuter. Hog1-fosforylering bestämdes genom immunblotting genom användning av en anti-fosfo-p38-antikropp. ( c, d ) Samma som i a respektive b, förutom att natamycin användes i stället för nystatin. ( e ) Modell av den inducerade Ste50 – Sho1-interaktionen. Röda pilar, positivt flöde av signalen; svart stapel, hämning av signalering; blå pil, inducerbar proteinbindning; Nat, Natamycin; Nys, Nystatin. ( f ) Hog1-specifika reporteranalyser av KY594-1-celler transformerade med en expressionsplasmid för Ste50ΔRA-Cpr-konstruktionen. Ste50ΔRA-Cpr uttrycktes från GAL1- promotorn under 2 timmar. Expression av 8xCRE-lacZ- reportergenen bestämdes som i fig. 3a. Felfält indikerar sd ( n = 3).

Bild i full storlek

Därefter bestämde vi hur nystatin inducerade Sho1 – Ste50-interaktion. Nystatin utövar sina svampdödande effekter genom två distinkta mekanismer - sekvestrering av ergosterol och membranpermeabilisering 22 . För att skilja vilka av dessa effekter som kan aktivera steg 2 studerade vi det strukturellt relaterade natamycinet, som binder till ergosterol men inte permeabiliserar membranet 22 . Till skillnad från nystatin inducerade natamycin inte bindningen av GST-Ste50ΔRA till HA-Sho1 (fig. 4c) och aktiverade inte Hog1 i STE11- Q301P-celler (fig. 4d, nedre rader). I likhet med nystatin inhiberade emellertid natamycin Hog1-aktivering i STE11- WT-celler (fig. 4d, övre rader). Således drog vi slutsatsen att hämningen av Hog1-aktivering av båda läkemedlen beror på deras ergosterolbindning och att induktion av Ste50 – Sho1-interaktionen genom nystatin orsakas av membranpermeabilisering (fig. 4e).

I bakterier svarar de N- och C-terminala cytoplasmatiska domänerna hos flera osmosensorer, såsom betaintransportören BetP, på ökad koncentration av K + i cytoplasma 23 . För att undersöka om Sho1-osmosensorn också svarar på förändringar i den cytoplasmiska koncentrationen av specifika joner, såsom H + eller K +, behandlade vi jästceller (uttrycker det hyperaktiva STE11-Q301P-kinaset) med protonjonofor-karbonylcyanid-3-klorfenylhydrazon eller med kaliumjonoforen valinomycin 24 . De aktiverade emellertid varken Hog1 i frånvaro av osmostress eller inhiberade inte heller Hog1-aktivering i närvaro av osmostress (Kompletterande figur 1a). I motsats härtill aktiverade enzymatisk digerering av cellväggen med zymolyas kraftigt Hog1 om cellerna utförde Ste11-Q301P-mutationen (kompletterande figur Ib). Eftersom dessa behandlingar (membranpermeabilisering, matsmältning av cellväggen och extracellulär hög osmolaritet) minskar turgor 21, kan Sho1 svara på reducerad turgor. Det är emellertid också möjligt att Sho1 svarar på förändringar i andra egenskaper hos plasmamembranet, såsom sidotryck eller viskositet.

Sho1 är en funktionell osmosensor

För att ge ett formellt bevis på att Sho1 i sig själv är en osmosensor, snarare än en kofaktor för en annan TM-osmosensor, undersökte vi om Sho1 kan aktivera Hog1 som svar på osmostress i frånvaro av Hkr1, Msb2 och Opy2. Normalt kan inga spår av Hog1-aktivering detekteras i frånvaro av Hkr1, Msb2 och Opy2 (i en ssk2 / 22 Δ bakgrund). För att testa vårt Sho1-osmosensorförslag skapade vi emellertid celler där behovet av dessa membranproteiner för osmostressinducerad Hog1-aktivering förbi. För detta ändamål uttryckte vi först hyperaktiv Ste11-Q301P (från sin egen promotor) för att åtminstone delvis kringgå behovet av Hkr1 och Msb2, vars huvudsakliga funktion är att hjälpa Ste20 att aktivera Ste11 (ref. 10). För det andra lokaliserade vi Ste50 konstant till membranet genom fästning av en C-terminal prenyleringssignal (Cpr), som kringgår åtminstone delvis behovet av Opy2 (ref. 13). Genom att kombinera dessa förhållanden var det verkligen möjligt att aktivera Hog1 med osmostress i frånvaro av Hkr1, Msb2 och Opy2 (Fig. 4f). Därför drog vi slutsatsen att Sho1 är en korrekt osmosensor.

Sho1 oligomeriseras med dimers-of-trimers-arkitekturen

För att förstå hur Sho1 sänder en signal över membranet studerade vi först strukturen för Sho1. Eftersom Sho1 har rapporterats homo-oligomerisera 25 undersökte vi vilken region av Sho1 som krävs för oligomerisering, genom analys av samutfällningen av Sho1-grönt fluorescerande protein i full längd (GFP) med olika partiella borttagningskonstruktioner av GST-Sho1 (Fig. 5a, b). Sho1Δ1, som saknar alla fyra TM-domäner, kunde inte alls oligomerisera, medan Sho114, som endast innehåller de fyra TM-domänerna och deras omedelbara flankerande regioner, kunde oligomerisera, om än svagt (fig. 5c). Således är de fyra TM-domänerna ansvariga för Sho1-oligomerisering. Omfattningen av Sho1-oligomerisering förändrades inte av extern hög osmolaritet (fig. 5d).

Image

( a ) Sho1-borttagningskonstruktionen som används i c . TM, transmembrane domäner. ( b ) Schematisk modell av Sho1. Siffror är aminosyrapositioner. L, slingregion. ( c, d ) Sho1 – Sho1-bindande analyser. p424GAL1-GST-Sho1 (eller dess deletionsderivat såsom anges) och p416GAL1-Sho1-GFP uttrycktes samtidigt i KT079 ( sho1 ) celler. GST-Sho1 affinitetsrenades med användning av glutationpärlor och samutfällt Sho1-GFP detekterades genom immunblotting. ( d ) 1 M NaCl tillsattes såsom indikerades i 5 minuter före framställning av celllysat.

Bild i full storlek

För att bestämma vilka av de fyra TM-domänerna som deltog i Sho1 – Sho1-bindning, använde vi en platsriktad cystein (Cys) kemisk tvärbindningsstrategi 26 . Eftersom Sho1-WT innehåller två nativa Cys-rester, genererade vi först en Cys-mindre (C78S C85S) mutant (benämnd Sho1 *), som var funktionell (kompletterande figur 2a). Vi konstruerade sedan en samling av single-Cys-substitutionsmutanter av HA-taggade Sho1 * (HA-Sho1 *), genom att individuellt muteras till Cys på nästan alla positioner i de fyra TM-domänerna (se fig. 5b). En detergentfri membranfraktion framställdes sedan från Sho1- celler i vilka single-Cys-mutanter uttrycktes individuellt. Det isolerade membranet behandlades med bifunktionella tioltvärbindare av olika längder; N , N '- o- fenylendimaleimid ( o -PDM; 6 Å), N , N' - p- fenylendimaleimid ( p -PDM; 10 Å) eller 1, 6- bis- maleimidohexan (BMH; 6–16 Å) 26 . Det fanns flera rester i varje TM-domän som kunde homo-tvärbindas (fig. 6a, kompletterande fig. 2b). Eftersom Sho1-tvärbindning inträffade effektivt vid 0 ° C (kompletterande figur 2c), vilket är långt under lipidfasövergångspunkten, var den observerade tvärbindningen mellan stabilt associerade Sho1-molekyler, snarare än mellan slumpmässigt kolliderade molekyler 27 . Vi drog därför slutsatsen att varje TM-domän i en Sho1-molekyl är fysiskt nära samma TM-domän i en angränsande Sho1.

Image

( a - c ) Kemisk tvärbindning av Sho1-singel- eller dubbel-Cys-substitutionsmutanter. De indikerade mutantderivaten av de Cys-mindre HA-Sho1 * uttrycktes individuellt i KT079-celler, och isolerade membranfraktioner behandlades med de indikerade tvärbindarna in vitro . Prover underkastades SDS – PAGE med 2-ME och HA-Sho1 * detekterades genom immunblotting. Siffror till höger indikerar omfattningen av Sho1-polymerisation (1, monomer; 2, dimer och så vidare). Siffror i rött anger Cys-mutationernas TM-domänplats. o, o- PDM; p, p- PDM; B, BMH. ( d ) Schematiska modeller för tolkning av resultaten från dubbel-Cys tvärbindningsexperiment (se text). ( e ) Kemisk tvärbindning av Sho1-single-Cys-substitutionsmutanter med den homo-trifunktionella tvärbindaren TMEA. Proceduren var densamma som i en . ( f ) Schematisk modell av Sho1-oligomerisering. Sho1 representeras av en cirkel, med det dimera TM1 / TM4-gränssnittet indikerat i blått och det trimeriska TM2 / TM3-gränssnittet i orange. En potentiell oligomeriseringsväg visas, men andra mellanprodukter och slutliga strukturer är också möjliga.

Bild i full storlek

För att bestämma hur en Sho1 ankom mot en annan Sho1 konstruerade vi dubbel-Cys-mutanter. Sho1-mutanter som har en Cys i TM2 och en annan i TM3 (T66C I94C och T66C T112C) bildade trimrar (och dimerer) vid tvärbindning (fig. 6b, spår 2 och 4). En Sho1-mutant som har två Cys i TM3 (I94C T112C) bildade också trimrar (fig. 6c, spår 16). Däremot bildade Sho1-mutanter som har en Cys i TM1 och en annan i TM4 (G50C A124C) endast dimerer (fig. 6c, spår 8). Sho1-mutanter med andra kombinationer av två Cys genererade en stege av högre ordning oligomerer (Fig. 6c). Modellerna i fig. 6d visar hur arrangemangen för TM-domäner dikterar resultaten av dubbel-Cys tvärbindning. Om de två TM-domänerna som innehåller Cys-substitutioner har ett vanligt dimer-gränssnitt, kommer deras tvärbindning att generera kovalenta dimerer (fig. 6d, till vänster). Detta var fallet när TM1 och TM4 var tvärbundna. Om å andra sidan de två Cys-substitutionerna har ett trimer-gränssnitt kommer tvärbindning att generera kovalenta trimrar (fig. 6d, mitten). Detta var fallet när TM2 och TM3 var tvärbundna. Slutligen, om de två Cys-substitutionerna tillhör olika gränssnitt, kommer tvärbindning att generera oligomerer av högre ordning (Fig. 6d, höger). Detta var fallet för alla andra kombinationer än TM1 / TM4 och TM2 / TM3.

Vi undersökte också strukturen hos Sho1-oligomerer med användning av den homo-trifunktionella tvärbindaren tris- (2-maleimidoetyl) amin (TMEA) 28 . Tvärbindning av single-Cys-substitutionsmutanter T66C (TM2) eller T112C (TM3) av TMEA-bildade trimrar, medan tvärbindning av G50C (TM1) eller A124C (TM4) endast bildade dimerer (fig. 6e). Dessa resultat bekräftade att Sho1 trimeriserar vid TM2 / TM3-gränssnittet, medan det dimeriseras vid TM1 / TM4-gränssnittet. Med andra ord oliomeriserar Sho1 genom upprepande "dimers-of-trimers" -arkitektur (fig. 6f).

Arrangemanget av TM-domäner inom de två gränssnitten

När två Cys-rester är tillräckligt nära varandra kan de bilda en disulfidbindning 29 . Bland single-Cys-mutanterna bildade I53C, S54C, V105C, N109C och A123C spontana homodimerer under icke-reducerande förhållanden (fig. 7a och kompletterande fig. 3a). Dessa dimerer bundna disulfid, eftersom dimerisering inhiberades av reduktionsmedlet 2-merkaptoetanol (2-ME) och förbättrades med oxidanten koppar / fenantrolin (fig. 7b och kompletterande fig. 3b).

Image

( a ) Spontan disulfidbindningsbildning genom Sho1-single-Cys-substitutionsmutanter. Membranfraktioner utsattes för SDS – PAGE (utan 2-ME) och HA-Sho1 och dess mutantderivat detekterades genom immunblotting. ( b ) Hämning av bildning av disulfidbindning med reduktionsmedlet 2-ME. Provfält separeras avsiktligt med två tomma körfält. ( c ) Spontan disulfidbindningsbildning med en Sho1-dubbel-Cys-substitutionsmutant. G / C, G50C; A / C, A124C. ( d ) Spontan disulfidbindningsbildning mellan två Sho1-single-Cys-substitutionsmutanter. Membranfraktioner behandlades med (+) eller utan (-) BMH och utsattes för SDS – PAGE (utan 2-ME). 66C, T66C; 112C, T112C; Sho1Δ11 är Sho1Δ (296–367). ( e ) Kemisk tvärbindning av molekylär linjal. Enstaka Cys-substitutionsmutanter av HA-Sho1 * Δ11 tvärbindades kemiskt med användning av en uppsättning tvärbindare med olika distanslängder (M1M – M17M). Proceduren var densamma som i Fig. 6a, förutom att SDS – PAGE gjordes under icke-reducerande förhållanden. ( f ) Modell för helixpackning vid gränssnitten TM1 / 4 och TM2 / 3 (ovanifrån från utsidan). Stora cirklar representerar TM-spiraler och små cirklar är aminosyrarester. Röda och gröna linjer representerar spontant bildade disulfidbindningar. Inset är en mindre skala av de dimera och trimeriska komplexen. ( g ) Osmostress-inducerade förändringar i kemisk tvärbindning av Sho1. KT079 transformerades med expressionsplasmider för de indikerade mutanterna av HA-Sho1 *. HA-Sho1 * inducerades av 2% galaktos under 2 timmar och tvärbinddes i intakta celler med BMH, i närvaro eller frånvaro av NaCl, såsom indikerats. ( h ) Effekter av sorbitol på Sho1-tvärbindning. HA-Sho1 * G50C uttrycktes i KT079 och tvärbindes som i ett undantag i närvaro (+) och frånvaro (-) av 2 M sorbitol.

Bild i full storlek

Disulfidbindning kan också uppstå mellan de två olika Cys-resterna. I själva verket kan det ses i fig. 6c (spår 7) att G50C A124C-dubbelmutanten bildade spontana dimerer utan kemisk tvärbindning. Eftersom varken G50C eller A124C bildade disulfidbindningar måste G50C och A124C ha bildat en hetero-disulfidbindning (Fig. 7c). Screening av utvalda dubbel-Cys-mutanter avslöjade att T66C T112C-dubbelmutanten spontant bildade disulfidbundna trimrar (kompletterande figur 3c). Varken T66C eller T112C-single-Cys-mutanten homo-dimeriserad. För att bevisa mer direkt att disulfidbindningar endast bildades mellan heterologa kombinationer genererade vi Sho1-FL-T66C i full längd och trunkerade Sho1-Δ11-T112C, som kan urskiljas genom deras storlekar. I frånvaro av kemisk tvärbindare bildas dimerer endast mellan T66C och T112C (fig. 7d, spår 6–8). Däremot var kemisk tvärbindning också möjlig mellan två T66C eller mellan två T112C (fig. 7d, spår 2-4). Således är T66 (TM2) och T112 (TM3) mycket nära varandra.

Vi mätte avståndet mellan två TM2-domäner eller två TM3-domäner vid TM2 / TM3-trimera gränssnittet med hjälp av en "molekylär linjal". Denna molekylära linjal består av en uppsättning bifunktionella tvärbindare med olika längder (från den kortaste, M1M (3, 9 Å) till den längsta, M17M (24, 7 Å)) 30 . Således fann vi att TM3 – TM3-avståndet är mycket kortare än TM2 – TM2-avståndet. Till exempel kan S110C i TM3 tvärbindas av den kortaste tvärbindaren M1M, medan W68C i TM2 effektivt kan tvärbinds endast med M11M (16, 9 Å) eller en längre tvärbindare (fig. 7e och kompletterande fig. 3d). På basis av dessa analyser konstruerades ett plausibelt arrangemang av de fyra TM-domänerna såsom visas i fig. 7f.

Osmostress inducerar strukturella förändringar i Sho1 TM-domänerna

Nästa frågade vi hur Sho1 överför den osmotiska signalen över plasmamembranet. Generellt överför cellytreceptorer signaler antingen genom ligandinducerad dimerisering eller genom ligandinducerade konformationella förändringar i deras TM-domäner. Eftersom vi inte kunde hitta några bevis på att omfattningen av Sho1-oligomerisering förändrades av extern hög osmolaritet, undersökte vi om osmostress skulle inducera strukturella förändringar i Sho1 TM-domänerna. Strukturella förändringar i TM-domänerna kommer att förändra tvärbindningseffektiviteten hos de rörda resterna, antingen genom att ändra avståndet mellan två Cys-rester eller genom att ändra tillgängligheten för tvärbindningsreagenset. Vi fann att effektiviteten för tvärbindning av HA-Sho1 * G50C, W67C, C85C (de nativa Cys vid 85) och A127C-mutanter förbättrades med osmostress, på ett osmostressdosberoende sätt (fig. 7g). Förbättrad tvärbindning av dessa mutanter inducerades av sorbitol såväl som av NaCl (fig. 7h), vilket indikerar att osmostress, inte en specifik lösning, är ansvarig. Förbättringen av tvärbindning berodde inte på ökad underenhetsassociation, eftersom tvärbindning vid många andra positioner påverkades inte av osmostress (kompletterande figur 4a). Denna tvärbindning inhiberades vid låg temperatur (kompletterande figur 4b), vilket antydde att membranfluiditeten var väsentlig för de osmostressinducerade strukturella förändringarna (det bör noteras att tvärbindningsreaktionen själv kan fortsätta effektivt vid 0 ° C; se kompletterande figur 2c ). Osmostressinducerad tvärbindning av Sho1 kan uppstå i frånvaro av de andra TM-proteinerna från SHO1-grenen, nämligen Hkr1, Msb2 och Opy2 (kompletterande figur 4c, d), vilket antyder att Sho1-strukturförändringarna är autonoma svar från Sho1. Hur Sho1-strukturförändringarna relaterar till den inducerade Ste50 – Sho1-bindningen är okänt.

TM1 / TM4-gränssnittet är viktigt för osmosensing

Därefter undersökte vi rollen för Sho1 oligomer struktur i osmosensing och signalering. För detta ändamål screenades vi för Sho1-mutanter som är defekta i Ste50-bindning med användning av en samling Sho1-mutanter i vilka två på varandra följande aminosyror ersattes av andra aminosyror. Vi fann att HA-Sho1-W139A I140A (WI / AA), som muterades i TM4-domänen, inte kunde binda GST-Ste50 (fig. 8a) och inte visade förbättrad tvärbindningseffektivitet (fig. 8b), som svar till osmostress. Det är viktigt att Sho1-WI / AA inte kunde aktivera Hog1 via undergrenen HKR1 (fig. 8c). Närvaron av en TM4-mutant som inte kan svara på osmostress antyder att TM1 / TM4-gränssnittet är viktigt för osmosensing. Eftersom Sho1-WI / AA kan dimerisera förblir det emellertid oklart om dimerisering är nödvändig för osmosensing eller inte.

Image

( a ) Ste50 – Sho1-bindande analyser genomfördes som i fig. 2d. WI / AA, W139A I140A. ( b ) Sho1-tvärbindningsanalyser i närvaro eller frånvaro av osmostress utfördes som i fig. 7g. ( c ) Hog1-specifika reporteranalyser av KT053-stammen transformerad med de indikerade Sho1-expressionsplasmiderna. Cellerna stimulerades med 0, 4 M NaCl under 30 minuter och expression av 8xCRE-lacZ- reportergen bestämdes. Felfält indikerar sd ( n = 3). ( d ) Mutanter som stör TM2 / TM3-gränssnittet. De indikerade mutanterna av HA-Sho1 * uttrycktes i KT079-celler, och spontan bildning av disulfidbindningar analyserades som i fig. 7a. T / CT / C, T66C T112C; WW, V105W N109W; FF, V105F N109F. ( e ) Hog1-specifika reporteranalyser. KT079, KT053 och KT088-celler transformerades med de indikerade expressionsplasmiderna för Sho1. 8xCRE-lacZ reporteranalysen utfördes som i c . Felfält indikerar sd ( n = 3). ( f ) Hkr1 – Sho1-bindande analys. De indikerade Hkr1- och Sho1-konstruktionerna uttrycktes samtidigt i KT075. Celllysat framställdes med buffert A innehållande 1% digitonin och bindning analyserades som i fig. 2d. ( g ) Sho1-tvärbindningsanalyser utfördes som i fig. 7g. ( h ) Ste50 – Sho1-bindande analyser genomfördes som i fig. 2d. ( i ) Schematisk modell av Sho1 – Hkr1-interaktionen. Blå cirklar med siffror representerar de fyra TM-domänerna i Sho1.

Bild i full storlek

TM2 / TM3 trimer-gränssnittet binder till Hkr1

För att undersöka om TM2 / TM3-gränssnittet krävs för osmosensing skapade vi Sho1-mutanter som är defekta i samband via TM2 / TM3-gränssnittet. Vi muterade specifikt V105 och N109, som båda är tätt packade vid gränssnittet TM2 / TM3 (se fig. 7f), till den skrymmande Phe eller Trp. Både V105F N109F (FF) och V105W N109W (WW) -mutationer reducerade kraftigt trimeriseringen av Sho1 vid TM2 / TM3-gränssnittet (som detekteras med T66C T112C disulfidbindning; Fig. 8d, spår 3 och 4). Sho1-WW-mutationen hade ingen negativ effekt på dimerisering vid TM1 / TM4-gränssnittet (som detekterades med G50C A124C-disulfidbindning; Fig. 8d, spår 6). Således stör Sho1-WW specifikt TM2 / TM3-gränssnittet utan att påverka gränssnittet TM1 / TM4.

Sho1-WW kunde inte aktivera Hog1 i ssk2 / 22 Δ msb2 Δ mutantceller , medan den kunde i ssk2 / ssk22 Δ hkr1 Δ celler, vilket indikerar att HKR1 undergren är defekt i celler som uttrycker denna mutant (Fig. 8e och kompletterande) Fig. 5a, b). I överensstämmelse med denna tolkning kunde Sho1-WW inte binda Hkr1, medan Sho1-WT kunde binda Hkr1 (ref. 13; Fig. 8f). Som svar på osmostress genomgick emellertid HA-Sho1-WW-mutanten strukturella förändringar i TM-domänerna (fig. 8g) och associerades med GST-Ste50 (fig. 8h). Således är Sho1-trimerisering vid TM2 / TM3-gränssnittet viktigt för Sho1 – Hkr1-växelverkan (Fig. 8i) och för signalfunktionen för Sho1, men inte för Sho1s osmosenseringsfunktion.

TM1 / TM4 dimer-gränssnittet binder till Opy2

Därefter övervägde vi om Sho1 också kan interagera med det andra membranproteinet i SHO1-vägen, nämligen Opy2, genom deras TM-domäner (se fig. 9a för strukturen hos Opy2). För att först bestämma om TM-domänen för Opy2 är funktionellt viktig för osmostressinducerad aktivering av Hog1 eller inte, screenades vi för hyperaktiva Opy2-mutanter (för mer information, se avsnittet Metoder). Two hyperactive Opy2 mutations in the TM domain (F96I and A104V) strongly activated Hog1 when overexpressed (without osmostress) in STE11-Q301P host cells (Fig. 9b left panel). In STE11-WT host cells, however, Opy2-F96I only weakly activated Hog1, and Opy2-A104V did not activate Hog1 at all (Fig. 9b right panel). The Opy2-F96I A104V double mutant potently activated Hog1 even in STE11-WT cells, suggesting that F96I and A104V activated Hog1 by different mechanisms, and their effects are synergistic.

Image

( a ) Schematic structure of Opy2. The amino-acid sequence of the TM domain is shown in red using the one-letter code. ( b ) Hog1-specific reporter assays. KY517 and KY477 were transformed with expression plasmids for the indicated Opy2 mutants. Opy2 mutants were expressed from the GAL1 promoter for 2 h, and expression of 8xCRE-lacZ was determined in the absence of osmostress. Error bars indicate sd ( n 3). ( c ) Opy2–Sho1-binding assays. TM257 was co-transfected with the indicated derivatives of pRS426GAL1-GST-Sho1 and pRS414GAL1-Opy2-GFP. Expression of the Opy2 and Sho1 constructs were induced by 2% galactose for 2 h, cell lysates were prepared with Buffer A containing 0.3% Brij-35 and binding was assayed as in Fig. 2i. ( d ) Hog1-specific reporter assays of KY517 cells transformed with expression plasmids for the indicated Opy2 mutants. Assays were conducted as in b . Felfält indikerar sd ( n = 3). ( e ) Opy2–Sho1-binding assays were conducted as in c . ( f ) Schematic model of the Opy2–Sho1 interaction. Green arrow, physical association; blue arrow, inducible physical association; red arrow, signal flow. ( g ) Chemical crosslinking of Sho1 to Opy2. Expression plasmids ( GAL1 promoter) for the indicated mutant derivatives of Opy2-myc and HA-Sho1*-A124C were co-transfected into KY590-1. After induction by 2% galactose for 2 h, intact cells were treated with 0.4 mM BMH at 30 °C for 5 min. Cell lysates were prepared with buffer A containing 0.2% Triton-X-100. HA-Sho1* was immunoprecipitated, and co-precipitated (covalently bound) Opy2-myc was detected by immunoblotting. ( h ) Schematic model of the Opy2–Sho1 interaction.

Bild i full storlek

We then tested if Opy2 bound Sho1. Opy2–Sho1 binding was undetectable when Triton-X-100 or NP-40 were used for cell lysis, but became detectable if milder detergents (such as digitonin, Brij 97 or Brij L23) were used (Supplementary Fig. 6a). Opy2-A104V had a substantially higher affinity for Sho1 than did Opy2-WT or Opy2-F96I (Fig. 9c). To test if the increased affinity of Opy2-A104V for Sho1 was responsible for its hyperactivity, we isolated intragenic suppressor mutants of Opy2-A104V. The best mutant so far identified, I100D, completely suppressed the hyperactivity of Opy2-A104V (Fig. 9d). Importantly, the Opy2-I100D mutant was incapable of binding to Sho1 (Fig. 9e). Thus, enhanced Opy2–Sho1 interaction promotes Hog1 activation, likely by increasing the chance of direct Ste50–Sho1 interaction (Fig. 9f). Osmostress, however, did not increase Opy2–Sho1 interaction (Supplementary Fig. 6b).

We next examined which of the four Sho1 TM domains interacted with the Opy2 TM domain. The Sho1 TM2/TM3 trimer interface was not required for Opy2 binding, as the Sho1-WW mutant bound Opy2 as efficiently as Sho1-WT (Supplementary Fig. 6c). To more systematically identify the sites in Sho1 that interacted with Opy2, we employed the site-directed chemical crosslinking method. For that purpose, we generated single-Cys substitution mutants of Opy2ΔSR1-myc at residues near the extracellular end of the TM domain. Each single-Cys Opy2 mutant was expressed together with HA-Sho1* single-Cys mutants chosen from the four TM domains (also near their extracellular ends). These mutants were crosslinked in vivo with BMH, and cell lysates were prepared using a Triton-X-100 buffer so that non-covalently associated Opy2 would not co-precipitate with Sho1. HA-Sho1* was immunoprecipitated, and the covalently bound Opy2-myc/HA-Sho1* heterodimer was detected by immunoblotting using anti-myc antibody (Supplementary Fig. 7a). Strongly crosslinkable Sho1 Cys residues were found only in TM1, L3 and TM4 regions (Supplementary Fig. 7b). For example, Sho1-A124C in TM4 was preferentially crosslinked to Opy2-I93C, -G95C and -F96C (Fig. 9g). We thus conclude that Opy2 binds to the TM1/TM4 interface of Sho1 (Fig. 9h). This finding raises the possibility that the hyperactive Opy2-F96I activates Sho1 by inducing a structural change in Sho1. Such a mechanism explains the synergistic effect of the F96I and the high affinity A104V mutations. However, direct demonstration of Sho1 activation (structural change or Ste50 binding) by Opy2-F96I is currently difficult because only a small fraction of Sho1 is bound to Opy2.

Hkr1 and Opy2 interact through their extracellular domains

The binding of Sho1 to both Hkr1 and Opy2 suggested the possibility that Hkr1 and Opy2 might also interact. The HMH domain of Hkr1 is functionally essential for Hog1 activation 13 . We found that the Cys-rich (CR) domain of Opy2 is also essential for Hog1 activation (see below). As these domains are both extracellularly located (Fig. 10a, also see Fig. 9a), we examined the possibility that Hkr1 and Opy2 might interact through these domains. Indeed, Hkr1ΔSTR-HA and Opy2-GFP could be co-precipitated in vivo (Fig. 10b, lane 2), and this interaction was completely abolished by deletion of the CR domain from Opy2 (lane 3) or the HMH domain from Hkr1 (lanes 6–7). Thus, Hkr1 and Opy2 interact with each other in a manner that requires the Hkr1 HMH domain and the Opy2 CR domain.

Image

( a ) Schematic model of Hkr1. Structures of the HMH domain deletion mutants are enlarged. Numbers are amino-acid positions. ( b ) Opy2–Hkr1-binding assay. The indicated Hkr1 and Opy2 constructs were expressed in TM257 (left) or QG158 (right) strains. Cell lysates were prepared with Buffer A containing 1% digitonin. Hkr1ΔSTR-HA was immunoprecipitated, and co-precipitated Opy2-GFP was detected by immunoblotting. ( c ) Hog1-specific reporter assays of KY585 and KY599-2 strains co-transfected with the indicated Hkr1 and Opy2 expression plasmids. Cells were stimulated with or without 0.4 M NaCl for 30 min, and the expression of the 8xCRE-lacZ reporter gene was determined. Error bars are sd ( n 3). ( d ) Schematic model of sequential interaction among Hkr1, Opy2 and Sho1. ( e ) Summary of the interactions among Sho1, Opy2 and Hkr1. Only a portion of the Sho1 oligomer is shown. ( f ) Mutations that disrupt the interactions between Sho1, Opy2 and Hkr1. ( gh ) Hog1-specific reporter assays of the yeast strains AN004 ( g ) and KY602-12 ( h ) transformed with expression plasmids for the indicated mutants of Opy2 and Hkr1 (native promoters). Cells were stimulated with or without 0.4 M NaCl for 30 min and expression of the 8xCRE-lacZ reporter gene was determined. Error bars are sd ( n =4). ( i ) Summary of the functional effects of mutations that disrupt interactions between Sho1 (S), Opy2 (O) and Hkr1 (H).

Bild i full storlek

In host cells in which only the HKR1 sub-branch is functional ( ssk2/22 Δ msb2 Δ), neither Hkr1ΔHMH nor Opy2ΔCR could support Hog1 activation (Fig. 10c left panel), indicating that Hkr1–Opy2 binding is essential for osmostress-induced activation of the Hog1 MAPK cascade. However, both Hkr1ΔHMH and Opy2ΔCR could support substantial Hog1 activation if the cells expressed the constitutively active Ste11-Q301P (Fig. 10c right panel). These results imply that the Hkr1–Opy2 interaction is necessary for activation of Ste11 by Ste20. This conclusion is consistent with our previous finding that the Hkr1 cytoplasmic domain functionally interacts with Ste20, presumably through an unidentified adaptor protein, and is necessary for activation of Ste11 by Ste20 (ref. 10). It is likely that the Hkr1–Opy2 interaction tethers Ste20 and Ste11 together to allow Ste20 activate Ste11, which then activates Pbs2 (Fig. 10d).

Role of a Sho1–Opy2–Hkr1 complex in Hog1 activation

Interactions among Sho1, Opy2 and Hkr1 potentially form a large complex as shown in Fig. 10e. Thus, the sequential pair-wise interaction model in Fig. 10d might be incomplete, as it does not incorporate the direct Hkr1–Sho1 interaction. We therefore examined the effects of mutations that disrupted one of the three pair-wise interactions (Fig. 10f) on osmostress-induced activation of Hog1 in Ste11-Q301P mutant host cells. We used the constitutively active Ste11-Q301P mutant, to monitor the effects of these mutations on the activation steps after Ste20 has activated Ste11. Disruption of the Sho1–Opy2 interaction (by Opy2-I100D) or the Opy2–Hkr1 interaction (by Opy2ΔCR) only partially interfered with the osmostress-induced Hog1 activation (Fig. 10g). Similarly, disruption of the Sho1–Hkr1 interaction alone (by sho1-WW encoded in the host genome) did not prevent Hog1 activation (Fig. 10h). In contrast, disruption of any two interactions simultaneously (for example, by Opy2ΔCR-I100D) completely abolished Hog1 activation. Thus, the disruption of any one interaction, among Sho1, Opy2 and Hkr1, had only moderate impact on Hog1 activation, whereas disruption of any two interactions completely inhibited Hog1 activation (Fig. 10i).

On the basis of these results, we conclude that the Sho1 oligomer serves, not only as an osmosensor, but also as a scaffold onto which the Opy2–Ste50–Ste11 and Hkr1–Ste20 subcomplexes bind, resulting in efficient signalling between these molecules. Disruption of any one of these interactions would be tolerated because the other two interactions would allow, if not very efficiently, the incorporation of all components into the signalling complex. Disruption of any two interactions would exclude at least one component from the complex, and prevent efficient Hog1 activation.

Diskussion

I den här artikeln demonstrerade vi att Sho1 fungerar både som osmosensor och ställning. De två funktionerna är emellertid inte helt beroende av varandra: Sho1-WW-mutanten, som inte kan oligomerisera och inte kan binda Hkr1, är ändå en effektiv osmosensor. Erkännandet av att Sho1 har två separerbara funktioner hjälper till att avslöja den förbryllande komplexiteten hos Sho1-mutanta fenotyper. Exempelvis är Sho1- mutanter defekta i den filamentösa tillväxten Kss1 MAPK-signalvägen, i vilken osmosenseringsfunktionen hos Sho1 uppenbarligen är irrelevant 31 . Det är troligt att endast ställningsfunktionen hos Sho1 är involverad i den trådformade tillväxtvägen.

Även om vi presenterade bevis för att Sho1 är en osmosensor, betyder det inte nödvändigtvis att Sho1 är den enda osmosensorn i SHO1-grenen. Som noterats tidigare kan Myr – Sho1-mutanten, som saknar de fyra Sho1 TM-domänerna, aktivera Hog1 MAPK-kaskaden i närvaro av Msb2 (ref. 13). Eftersom Myr – Sho1 inte kan fungera som en osmosensor enligt vår modell har vi föreslagit att Msb2 också är en osmosensor som fungerar i SHO1-gren 13 . Den starkt glykosylerade STR-domänen av Msb2, som hämmar spontan aktivering av Hog1, kan tjäna som en osmosenseringsanordning. I så fall kan den strukturellt liknande Hkr1 också fungera som en osmosensor. Här föreslår vi en tvåsensormekanism där Hkr1-osmosensorn aktiverar Ste20 → Ste11-reaktionen (steg 1) och Sho1-osmosensorn aktiverar Ste11 → Pbs2-reaktionen (steg 2; se fig. 2a). Framgångsrik aktivering av Hog1 skulle endast ske när båda osmosensorerna var påslagen: med andra ord skulle HKR1-undergrenen fungera som en logik OCH grind. Eftersom Hkr1 och Sho1 antagligen svarar på olika aspekter av osmostress, kommer AND-grindmekanismen att säkerställa att en icke-osmostress-stimulans som kan aktivera antingen Hkr1 eller Sho1, men inte båda, inte aktiverar Hog1. Substansiering av två-sensormodellen kräver ytterligare karaktärisering av den Hkr1 förmodade osmosensorn.

4TM-proteinet Sho1 oligomeriseras med dimers-of-trimers-arkitekturen. Många andra 4TM-proteiner, såsom tetraspaniner från däggdjur, är också kända för att oligomerisera 32, 33, 34, 35, 36 . Eftersom andra 4TM-proteiner också kan oligomerisera genom repetitiva TM – TM-interaktioner som liknar Sho1, kan Cys kemiska tvärbindning vara en värdefull strategi för att studera deras strukturella organisation.

Högre ordningsenheter av TM-signalproteiner anses vara viktiga för signalförstärkning, överkänslighet, reduktion av biologiskt brus och rumslig reglering 37 . I själva verket visar SHO1-grenen ett brant sigmoidalt svar på ökande osmolaritet (det vill säga överkänslighet) 12 och har en låg basal signalering (det vill säga brusreducering) 38 . Det är troligt att bildandet av ett flerkomponentkomplex runt Sho1-oligomeren är viktigt för att uppnå dessa signalegenskaper hos Sho1. Därför kommer Sho1 att vara en utmärkt modell för utredning av det framväxande paradigmet för montering av högre ordning vid signalöverföring.

metoder

Media och buffertar

Standardjästmedier och genetiska procedurer beskrevs tidigare 39, 40 . CAD-medium består av 0, 67% jästkvävebas (Sigma), 2% glukos, 0, 5% casaminosyra (BD) och lämpliga tillskott (20 μg ml −1 uracil och 40 μg ml −1 tryptofan) vid behov. CARaf- och CAGal-media är desamma som CAD, förutom att de innehåller 2% raffinos respektive 2% galaktos i stället för glukos. SRaf-medium består av 0, 67% jästkvävebas och 2% raffinos med ett lämpligt jäst-syntetiskt bortfallsmedietillskott. Buffert A för samimmunutfällningsanalyser innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 15 mM EDTA, 15 mM EGTA, 2 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM bensamidin, 5 μg ml −1 leupeptin, 50 mM NaF, 25 mM p-glycerofosfat och 150 mM NaCl. Buffert C2 för rengöringsmedelfritt membranframställning innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 7, 2), 15 mM EDTA, 15 mM EGTA, 150 mM NaCl, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM bensamidin och 5 ug ml −1 leupeptin. Buffert X för tvärbindning innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 7, 2) och 15 mM EDTA. Buffert Z för p-galaktosidasanalys innehåller 60 mM Na2HP04, 40 mM NaH2P04, 10 mM KCl och 1 mM MgS04, justerad till pH 7, 0. SDS-laddningsbuffert (1 x) innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 6, 8), 2% SDS, 0, 01% Bromophenol Blue, 10% glycerol och 700 mM 2-ME. För icke-reducerande förhållanden utelämnades 2-ME.

Reagens

Följande reagens användes. Cys-specifika kemiska tvärbindningsmedel: BMH och TMEA (Thermo Scientific), o- PDM och p -PDM (Sigma) och Bis-MTS (metantiosulfonat) reagens (M1M till M17M) (Toronto Research Chemicals). Tvättmedel: Brij L23, Brij 97 och Brij 99 (Sigma), Triton-X-100, NP-40 och Tween-20 (MP Biochemical) och Digitonin (Sigma och Calbiochem). o- fenantrrolin (Wako). Polyenantibiotika: nystatin (Wako) och natamycin (Fluka). Andra kemikalier köptes från Sigma, Wako Pure Chemical, Nacalai Tesque och BD.

Jäststammar

Alla jästmutanter som används i detta arbete är derivat av S288C-stammen (kompletterande tabell 1).

Plasmidkonstruktioner

Deletions- och missense-mutanter konstruerades med användning av PCR-baserad oligonukleotidmutagenes och bekräftades genom bestämning av nukleotidsekvens.

Vector plasmider . pRS414, pRS416, YCpIF16, p414GAL1, p424GAL1, p416GAL1, p426GAL1 och p426TEG1 har beskrivits 41, 42, 43 .

Sho1-plasmider . pRS416-Sho1 (= P SHO1 -SHO1, URA3, CEN6 ) är en genomgående DNA-klon i full längd och uttrycker Sho1 under kontroll av SHO1- promotorn. p416GAL1-Sho1-GFP (= P GAL1- SHO1-GFP , URA3 , CEN6 ) uttrycker C-terminalt GFP-märkt Sho1 (Sho1-GFP) under kontroll av GAL1- promotorn. p424GAL1-GST-Sho1 (= P GAL1- GST-SHO1, TRP1, 2 μ), p416GAL1-GST-Sho1 (= P GAL1- GST-SHO1, URA3, CEN6 ) och p426GAL1-GST-Sho1 (= P GAL1- GST -SHO1, URA3, 2 μ) uttrycker N-terminalt GST-märkt Sho1 (GST-Sho1) under kontroll av GAL1- promotorn. YCpIF16-Sho1 (= P GAL1 - HA-SHO1, TRP1, CEN4 ) kodar N-terminalt HA-märkt Sho1 (HA-Sho1) under kontroll av GAL1- promotorn.

Opy2-plasmider. pRS416-Opy2 (= P OPY2 -OPY2, URA3, CEN6 ) är en genomisk DNA-klon i full längd och uttrycker Opy2 under kontroll av OPY2- promotorn. p414GAL1-Opy2 (= P GAL1 -OPY2 , TRP1 , CEN6 ) och p416GAL1-Opy2 (= P GAL1 -OPY2 , URA3 , CEN6 ) uttrycker Opy2 under kontroll av den galaktosinducerbara GAL1- promotorn. p416GAL1-Opy2-GFP (= P GAL1 -OPY2-GFP , URA3 , CEN6 ) kodar C-terminalt GFP-märkt Opy2 under kontroll av GAL1- promotorn. p416GAL1-Opy2ΔSR1-myc (= P GAL1 -OPY2 Δ SR1-3xmyc , URA3 , CEN6 ) kodar C-terminalt 3 × myc-taggad Opy2ΔSR1 under kontroll av GAL1- promotorn.

Ste11-plasmid . YCpIF16-Ste11ΔC (= P GAL1 - HA-STE11 (1–413), TRP1, CEN4 ) kodar N-terminalt HA-märkt Ste11ΔC, som saknar kinaskatalytisk domän, under kontroll av GAL1- promotorn.

Ste50-plasmider . pRS414-Ste50 (= P STE50 -STE50, TRP1, CEN6 ) är en genomgående DNA-klon i full längd och uttrycker Ste50 under kontroll av STE50- promotorn. p426TEG1-Ste50 (= P TEF2 -GST-STE50 , URA3 , 2 μ) uttrycker N-terminalt GST-märkt Ste50 (GST-Ste50) under kontroll av TEF2- promotorn.

Hkr1 plasmid . pRS414GAL1-Hkr1ΔSTR-2xHA (= Hkr1Δ (41–1200) -HA, TRP1 , CEN6 ) har två HA-taggar, en på platsen för intern radering, och en annan vid C-terminalen.

Andra plasmider . Den cysteinfria GST-mutanten (GST *) genererades genom mutering av alla fyra av cysteinerna i GST (Cys85, Cys138, Cys169 och Cys178) till serin. GST * är funktionell 44 . Aktivering av den parande feromonen MAPK-vägen analyserades med användning av den parande feromonspecifika reporteren pFUS1-lacZ ( FUS1-lacZ, URA3, CEN ) (= pSB231) 19, 45 .

HOG reporter analys

Jäststammar transformerades med antingen pRS414–8 × CRE-lacZ (= 8xCRE-lacZ, TRP1 , CEN6 ) eller pRS416-8xCRE-lacZ (= 8xCRE-lacZ, URA3 , CEN6 ). Exponentiellt växande transformanter inducerades för reporteruttryck såsom beskrivits i varje figurlegende. För att kvantitativt analysera p-galaktosidasaktivitet pelleterades 0, 5 ml kultur, tvättades en gång och resuspenderades i 0, 1 ml Z-buffert. Cellerna permeabiliserades genom två cykler med frysning och upptining. Analysreaktionen initierades genom tillsats av 0, 7 ml Z-buffert innehållande 50 mM 2-ME och 0, 16 ml 4 mg ml -1 o-nitrofenyl-P-D-galaktopyranosid och inkuberades vid 37 ° C tills mild gul färg hade utvecklats. Efter avkylning av reaktionen med 0, 4 ml 1 M Na2C03 centrifugerades proverna vid 18 000 g under 10 minuter vid 4 ° C och supernatanternas OD 420 mättes. P-galaktosidasaktivitet beräknades med användning av följande formel: P-galaktosidasaktivitet (Millerenhet) = 1 000OD 420 / (inkubationstid ( min ) × volym av kulturen (ml) × OD 600 av odling) 46 . Alla reporteranalyser genomfördes i tre exemplar (eller mer) med användning av oberoende kulturer.

In vivo- bindande analys

Celler innehållande galaktosinducerbara uttryckskonstruktioner odlades exponentiellt i CARaf och odlades under ytterligare 2 timmar efter tillsats av 2% galaktos. Celler skördades, tvättades en gång med iskall buffert A utan tvättmedel och återsuspenderades i 0, 5 ml buffert A. Celler bröts genom virvling med glaspärlor och centrifugerades vid 10 000 varv per minut under 10 minuter vid 4 ° C i en mikrocentrifug, och supernatant (cellextrakt) utvanns. En alikvot av cellextrakt (200–750 μg) inkuberades med 50 ul glutathion Sepharose-pärlor under 2 timmar vid 4 ° C, tvättades tre gånger i buffert A och återsuspenderades i SDS-laddningsbuffert. Prover inkuberades antingen vid 50 ° C (när Sho1 analyserades) eller kokades under 5 minuter och separerades genom SDS – PAGE (polyakrylamidgelelektrofores). Proteiner detekterades genom immunblotting. För immunutfällning och / eller immunblotting användes följande antikroppar såsom indikerats: anti-HA 12CA5 (Roche, nr. 11583816001) 200 ng ml −1 ; anti-HA 3F10 (Roche, nr. 11867431001) 4 μg ml −1 ; anti-HA F-7 (Santa Cruz, sc-7392) 1: 1 000 utspädning; anti-GST B-14 (Santa Cruz, sc-138) 1: 1 000 utspädning; anti-GFP B-2 (Santa Cruz, sc-9996) 1: 300 utspädning; anti-myc 9E10 (Santa Cruz, sc-40) 1: 1 000 utspädning; anti-fosfo-p38 (Cell Signaling Technology, No. 9211L) 1: 1 000 utspädning; och anti-Hog1 yC-20 (Santa Cruz, sc-6815) 1: 1 000 utspädning. Bilder togs digitalt med hjälp av ChemiDoc XRS Plus (Bio-Rad) utrustad med en laddkopplad enhetskamera. Fullständiga genomsökningar av representativa immunblott presenteras i kompletterande figur 8 och 9.

Isolering av konstitutivt aktiva OPY2-mutanter

Ett DNA-segment inklusive den OPY2- kodande regionen mutageniserades genom felbenägen PCR i närvaro av 0, 1 eller 0, 2 mM MnCl2. KT018 ( ssk2 Δ ssk22 Δ STE11-Q301P ) celler som bär en dämpad 8xCRE-lacZ reportergen (pRS416-8xCRE-CYC m- lacZ) samtransformerades med PCR-produkterna och lineariserade pRS414-PGAL1. Gapreparerade plasmider valdes på CAD (w / o Ura och Trp) -plattor, replikerades på nitrocellulosamembranskivor och inkuberades på CAGal-plattor över natten för att inducera den plasmidburna OPY2- genen. Aktivering av HOG MAPK-vägen bedömdes kvalitativt med användning av en p-galaktosidas-filteranalys med kolonylift 39 . Konstitutivt aktiva OPY2- mutanter som inducerade lacZ- expression, vilket gjorde cellerna blåa, utvanns.

Beredning av membranfraktioner

Den lämpliga stammen, till exempel KT079, som bär en HA-Sho1 * -uttrycksplasmid YCpIF16-Sho1 *, odlades till loggfas i ett selektivt medium. Expression av HA-Sho1 * -mutantproteinet inducerades under 2 timmar med 2% galaktos. Membranfraktionen framställdes sedan enligt följande. I korthet centrifugerades 20 ml kultur vid 2 000 g under 3 minuter, och cellpelleten återsuspenderades i 500 ul av detergentfria buffert C2. Celler bröts genom kraftig virvling med glaspärlor. Obrutna celler avlägsnades genom två omgångar centrifugering med låg hastighet (300 g under 3 minuter) och supernatantfraktionen (S300) underkastades en höghastighetscentrifugering (13 000 g under 10 minuter). Den utfällda fraktionen (P13 000) återsuspenderades i 150 ul buffert X.

Kemisk tvärbindning av membranfraktioner

Kemiska tvärbindningsmedel löstes i dimetylsulfoxid (DMSO) eller N , N- dimetylformamid (DMF). I en typisk kemisk tvärbindningsreaktion inkuberades 30 ul av membranfraktionen med 0, 2 mM tvärbindare (eller kontroll DMSO eller DMF) under 20 minuter vid 25 ° C. Omedelbart efter reaktionen tillsattes 15 ul 3 × SDS-laddningsbuffert (innehållande 2-ME) och inkuberades under 5 minuter vid 37 ° C. Prover underkastades SDS – PAGE under reducerande betingelser (icke-reducerande betingelser i fallet med MTS-tvärbindningsmedel såsom M1M), och HA-Sho1 * detekterades genom immunblotting.

Kemisk tvärbindning av Sho1 i intakta celler

En kemisk tvärbindare (eller kontroll DMSO eller DMF) tillsattes direkt till en exponentiellt växande jästkultur. Alternativt blandades jästkulturen med en lika stor volym färskt medium som innehöll en lämplig koncentration av tvärbindningsmedel. Efter inkubering vid 30 ° C under 5 minuter (eller som specificerats i legenderna) centrifugerades cellerna vid 1 700 g under 3 minuter. För att stoppa tvärbindningsreaktionen återsuspenderades cellpellets i 1 ml buffert C2 innehållande 50 mM ditiotreitol och inkuberades på is under 15 minuter. Cellerna fälldes sedan ut med en kort snurrning i ett mikrocentrifugrör, frystes i vätska N2 och tinades och återsuspenderades i 400 ul buffert C2. Membranfraktionen bereddes och underkastades immunblotanalyser.

Ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln: Tatebayashi, K. et al . Osmosensing och ställningsfunktioner för den oligomera fyra-transmembran domän osmosensorn Sho1. Nat. Commun. 6: 6975 doi: 10.1038 / ncomms7975 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande figurer 1-9, kompletterande tabell 1 och kompletterande referenser.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.