Oligomannuraratsulfat hämmar cxcl12 / sdf-1-medierad proliferation och invasion av humana tumörceller in vitro | acta Pharmacologica sinica

Oligomannuraratsulfat hämmar cxcl12 / sdf-1-medierad proliferation och invasion av humana tumörceller in vitro | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

JG6 är en ny marin-härledd oligosackarid som har visat hämma angiogenes och tumörmetastas. I denna studie försökte vi identifiera det potentiella målet som är ansvarigt för anti-canceraktiviteten för JG6.

metoder:

Mänsklig levercancercellinje Bel-7402 och mänsklig livmoderhalscancercellinje HeLa undersöktes. CXCL12-stimulerad cellproliferation och migration bestämdes med användning av ett CCK-8-kit respektive en transwell-analys. Western blotting genomfördes för att undersöka förändringarna i CXCL12 / CXCR4-axeln. Molekylär dockning och ytplasmonresonans (SPR) utfördes för att karakterisera den möjliga interaktionen mellan JG6 och CXCL12 / CXCR4-axeln.

Resultat:

Behandling med CXCL12 stimulerade kraftigt spridningen och migrationen i både Bel-7402 och HeLa-celler. Sambehandling av cellerna med JG6 (10, 50 och 100 μg / ml) dosisberoende hindrade CXCL12-stimulerad cellproliferation och migration. Vidare inducerade CXCL12 snabbt fosforylering av AKT, ERK, FAK och Paxillin i Bel-7402 och HeLa-celler, medan förbehandling med JG6-dosberoende hämmade den CXCL12-inducerade fosforyleringen av dessa proteiner. SPR-analysen visade att JG6 band till CXCL12 med en hög affinitet. I molekylär dockningsstudie verkade JG6 interagera med CXCL12 via flera polära interaktioner, inklusive 6 joniska bindningar och 7 vätebindningar.

Slutsats:

Inhibering av CXCL12 / CXCR4-axeln av JG6 kan redogöra för dess anticanceraktivitet.

Introduktion

CXCL12, även kallad stromalcell-härledd faktor-1 (SDF-1), är en CXC-kemokin som binder primärt till CXC-receptor 4 (CXCR4). Denna bindning inducerar intracellulär signalering som spelar en avgörande roll vid kemotaxi, cellöverlevnad, proliferation och metastas av CXCR4 + tumörceller till organ som uttrycker CXCL12 1, 2 . Det har rapporterats att CXCR4 + -cancer metastaserar till ben och lymfkörtlar på ett CXCL12-beroende sätt 3, 4 . Därför har CXCL12 / CXCR4-axeln framkommit som ett potentiellt mål för cancerterapi.

Ökande ansträngning har gjorts för att hindra funktionen av CXCL12 / CXCR4-axeln genom att rikta antingen liganden eller receptorn med användning av småmolekylreceptorantagonister, receptorbindande antikroppar eller modifierade kemokiner 5, 6 . Bland dessa alternativ är det en effektiv metod att blockera CXCL12 till CXCR4. Det har rapporterats att glykosaminoglykaner (GAG) och syndecan-4 hindrade invasionen av humana tumörceller (HeLa-celler) genom att blockera växelverkan mellan CXCL12 och CXCR4 7, och detta fynd stöds av den strukturella analysen av CXCL12: s interaktioner med GAGs 8, 9 . Följaktligen blockerade heparin, en sulfaterad glykosaminoglykan, CXCL12-inducerad humant cancercellstillväxt, migration och invasion 7, 10 . Vidare inhiberade behandling av humana hepatomceller med en serie GAG-mimetika CXCL12-inducerad migration och invasion 11 .

JG6 är en ny marin-härledd oligosackarid som upptäcktes i vårt laboratorium. JG6 undertryckte signifikant cancertillväxt och metastaser in vitro och in vivo 12, 13, men mekanismerna förblir oklara. Det är viktigt att vi har noterat att strukturen för JG6 liknar strukturen för GAG: er. Här undersökte vi om JG6 har potentiell anti-canceraktivitet genom sin intervention i CXCL12 / CXCR4-axeln.

Material och metoder

Reagens

JG6 skapades genom semisyntes följt av sulfatmodifiering genom omsättning av oligomannurarat från natriumalginat med ClS03H i formamid. Produkternas pH justerades till 7, 0 med 4 mol / L NaOH och avsaltades med användning av Sephadex G-10. Produkterna slogs samman och frystorkades. Analys utfördes med användning av High Performance Gel Permeation Chromatography (HPGPC) med en G3000W × 1-kolonn (300 mm x 7, 8 mm) (TOSOH, Japan). Strukturen är avbildad i figur 1. JG6 är sammansatt av p- (1–4) glykosidbundet D-mannurarat med sulfatmodifiering av hydroxylgruppen vid C2 / C3-position. CXCL12 köptes från R&D Systems (Minneapolis, MN, USA).

Kemisk struktur för JG6.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Cell kultur

Bel-7402 humana levercancerceller och HeLa humana livmoderhalscancerceller erhölls från Institute of Biochemistry and Cell Biology respektive American Type Culture Collection. Cellerna odlades i RPMI-1640 eller DMEM-medium med hög glukos (Gibco, Grand Island, NY, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) och antibiotika (100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin). Cellerna hölls i en 5% CO2 fuktad atmosfär vid 37 ° C.

Proliferationsanalys

Bel-7402- och HeLa-celler inkuberades i serumfritt medium under 6 timmar och exponerades sedan för olika koncentrationer av JG6 (0, 10, 50 eller 100 ug / ml) och CXCL12 (300 ng / ml) under 72 timmar. Cellproliferation bestämdes med användning av ett CCK-8-kit (Dojindo, Kumamoto, Japan).

Migrationsanalys

Cellmigrationsanalysen utfördes i en transwell Boyden Chamber (8 mikrometer porstorlek, Costar, MA, USA). I korthet sås tumörceller (3, 5 x 105 celler per brunn) i den övre kammaren i transwelln, medan den nedre kammaren fylldes med odlingsmedium kompletterat med 50 eller 300 ng / ml CXCL12 plus JG6 (0, 10, 50, eller 100 μg / ml). CXCL12 lades inte till den negativa kontrollgruppen. Celler odlades under 24–36 timmar vid 37 ° C i en välfuktad inkubator, och sedan fixerades de totala migrerade cellerna, färgades med 0, 1% kristallviolett och avbildades under ett mikroskop. Målade celler extraherades med 10% ättiksyra och OD- värdet mättes vid 595 nm.

Western blotting analys

Cellerna svaldes under 24 timmar, inkuberades i förväg med JG6 (0, 10, 50 eller 100 ug / ml) under 6 timmar och inducerades sedan med CXCL12 (R&D, Minneapolis, MN, USA) vid 50 ng / ml under 15 timmar. min. Efter inkubation lyserades cellerna i 1 x SDS-lysbuffert (50 mmol / L Tris-HCl, pH 6, 8, 100 mmol / L DTT, 2% SDS, 0, 1% bromofenolblått och 10% glycerol), och sedan klargjordes lysaten genom centrifugering vid 14 000 × g under 10 minuter. Lika mängder protein underkastades SDS-PAGE och överfördes till nitrocellulosamembran (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Membranen blockerades med 5% mjöl utan fett och inkuberades med motsvarande primära antikroppar vid 4 ° C över natt. De immunoreaktiva banden visualiserades med SuperSignal West PicoChemiluminescent kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) med användning av Image Quant LAS4000 (GE, USA). Primära antikroppar som används inkluderar antikroppar specifika för fosfo-Paxillin (Y118), Paxillin, Fak, fosfo-Erk1 / 2, Erk1 / 2, fosfo-Akt (Ser473) och Akt (Cell Signaling Technology, USA), p-Fak (pY861) (Invitrogen, USA), CXCL12 och CXCR4 (Abcam, Storbritannien).

Molekylär dockning

NMR-strukturen för kemokin CXCL12 hämtades från Brookhaven Protein Data Bank (PDB-post: 2K03). Kedja A och kedja C från 2K03 bibehölls som receptorn, medan kedja B valdes för att definiera rutnätets centrum. Molekylär dockning utfördes med användning av Glide med XP-läget 14, 15 . Föreningarna skissades av Maestro och behandlades sedan av LigPrep med Epik för att behandla protonationstillstånd. De dockade konformationerna i det ligandbindande stället valdes för ytterligare analys.

Ytan plasmon resonansanalys

Kinetiken och specificiteten för bindningsreaktionen mellan JG6 och CXCL12 analyserades med användning av BIAcore-ytplasmonresonansapparaten. I korthet immobiliserades JG6 på ett NLC-sensorchip enligt Ligand Thiol-protokollet som beskrivs i BIA-applikationshandboken. För att bedöma bindningskapacitet i realtid injicerades 5–80 nmol / L CXCL12 över sensorchipytan med den immobiliserade JG6 och tvättades sedan med HBS-EP-buffert under 5 minuter. Sensorchipsytan regenererades med användning av 60 ul NaCl (2 mol / L). Alla bindningsexperiment utfördes vid 25 ° C med en konstant flödeshastighet av 10 ul / min HBS-EP. För bindande affinitetsbedömning tilläts associeringsfasen att fortsätta till jämvikt.

De obehandlade ytgrupperna blockerades med etanolamin. För att korrigera för icke-specifik bindnings- och bulkbrytningsindexförändringar användes en tom kanal (FC2) utan oligosackarid som kontroll för varje experiment. Sensorgram för alla bindande interaktioner registrerades i realtid, och de tomma kanalavläsningarna subtraherades från resultaten före analysen. Förändringar i massa på grund av bindningssvaret registrerades som resonansenheter (Ru). Bindningskinetik och affiniteter bestämdes med SPR med användning av BIAcore-programvara 3.1.

Statistisk analys

Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SD. Statistisk signifikans analyserades med två-tailed Student's t- test. Ett värde av P <0, 05 ansågs vara signifikant.

Resultat

JG6 hindrade CXCL12-inducerad proliferation av cancerceller

Den biologiska axeln CXCL12 / CXCR4 spelar en viktig roll vid reglering av tumörcellsproliferation. Först undersökte vi om JG6 påverkade CXCL12-stimulerad celltillväxt. CCK-8-analysen applicerades för att mäta cellproliferationsgraden för Bel-7402-celler och HeLa-celler. CXCL12 stimulerade tumörcelltillväxt, såsom tidigare rapporterats 10 . Proliferationshastigheten ökades med nästan 50% efter behandling med 300 ng / ml CXCL12 (figur 2A). Denna effekt reverserades till stor del när celler samtidigt behandlades med JG6. JG6 orsakade ett dosberoende undertryckande av CXCL12-stimulerad Bel-7402-cellproliferation. Cellproliferationshastigheten inhiberades med 22, 2% vid 10 μg / ml, 46, 5% vid 50 μg / ml och 51, 0% vid 100 μg / ml. Liknande resultat observerades i HeLa-celler, för vilka behandling med 10, 50 eller 100 μg / ml JG6 gav 22, 2%, 37, 2% respektive 41, 5% lägre cellproliferationshastigheter än i frånvaro av JG6 (figur 2A). JG6 inhiberade emellertid inte Bel-7402 och HeLa-cellproliferation in vitro under normala cellkulturförhållanden (data visas inte).

JG6 blockerade CXCL12-inducerad cancercellproliferation och migration in vitro . (A) JG6 inhiberade cancercellproliferation inducerad av CXCL12. (a) CXCL12 inducerade Bel-7402 (vänster) och HeLa (höger) cellproliferation. Bel-7402 (b) och HeLa (c) -celler behandlades med CXCL12 (300 ng / ml) och 0, 10, 50 eller 100 μg / ml JG6 under 72 timmar. (B, C) JG6 undertryckte cellmigrationen inducerad av CXCL12 i Bel-7402 (B) och HeLa-celler (C). Representativ bild av cellmigrering visades (förstoring: 200 ×; +: behandling med CXCL12). Hastigheten för cellmigrationsinhibering med JG6 visades som procent av CXCL12-behandling (medelvärde ± SD, från tre oberoende experiment. BP <0, 05, cP <0, 01 mot kontroll).

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

JG6 undertryckte CXCL12-inducerad cancercellmigration

Den biologiska axeln CXCL12 / CXCR4 är också känd för att modulera den kemotaktiska rörligheten hos cancerceller. Därefter utvärderade vi om JG6 hade en hämmande effekt på denna process. Såsom visas i figur 2B svarade Bel-7402-celler på CXCL12-induktion vid en JG6-koncentration av 50 ng / ml under 48 timmar när en märkbar ökning av migrerande celler observerades jämfört med den negativa kontrollgruppen (som inkuberades utan CXC12 och FBS ). JG6 inhiberade CXCL12-inducerad migration av Bel-7402-celler på ett dosberoende sätt, vilket gav 100% hämning vid 100 μg / ml. Även om HeLa-celler var mindre lyhörda för CXCL12-stimulering än Bel-7402-celler, reducerade JG6 på liknande sätt CXCL12-inducerad migration i HeLa-celler med 44%, 88% och 97% efter behandling med 10, 50 eller 100 μg / ml av JG6 (figur 2C). Emellertid hindrade JG6 inte Bel-7402-cellmigration inducerad av 10% FBS (data visas inte).

JG6 blockerade CXCL12-inducerad signaltransduktion

Vi visade att JG6 effektivt hämmade CXCL12-inducerad cellproliferation och migration i Bel-7402 och HeLa-celler. Vi fortsatte sedan med att utforska dess effekt på nedströmssignaler från CXCL12 / CXCR4-axeln. Western blottingdata presenterade i figur 3 visar att 50 ng / ml CXCL12 snabbt inducerade fosforylering av AKT, ERK, FAK och Paxillin i Bel-7402 och HeLa-celler inom 15 minuter. Däremot inhiberade förinkubation med JG6 under 6 timmar CXCL12-inducerad fosforylering av dessa proteiner på ett dosberoende sätt. Liknande resultat observerades i HeLa-celler.

JG6 blockerade CXCL12 / CXCR4 axelsignaltransduktion i Bel-7402 (A) och HeLa-celler (B). Dessa två celltyper svältades och inkuberades sedan med CXCL12 (50 ng / ml) ensam eller CXCL12 förinkuberades med JG6 (10, 50 eller 100 ug / ml) under 15 minuter.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

JG6 interagerade med CXCL12

Därefter bedömde vi hur JG6 påverkar signalering på axeln CXCL12 / CXCR4. Tidigare studier i vårt laboratorium har antytt att strukturen för JG6 liknar strukturen för GAG och att GAG verkar interagera med CXCL12. Vi använde därför SPR-analysen för att identifiera den möjliga interaktionen mellan CXCL12 och JG6. JG6 immobiliserades på NLC-sensorchips. När CXCL12 injicerades i biosensorn observerades en typisk ökning av SPR-svaret motsvarande associeringsfasen på ett dosberoende sätt (5-80 nmol / L). Vid förflyttning av kemokinet med den löpande bufferten uppstod en anmärkningsvärd minskning av SPR-responssignalen, i överensstämmelse med dissocieringsfasen (figur 4). Bindningskurvan anordnades och demonstrerade ett multivalent bindningssätt med en klar associeringstaktkonstant ( k on ) av 11, 7 nmol / L och en jämviktdisociationskonstantkonstant av 16, 5 nmol / L. Dessa data stödde resultaten ovan som indikerar att JG6 har en hög affinitet för CXCL12.

JG6 binder till CXCL12. (A) Bindande svarskurva. (B) Jämviktsdissociationskurva. Surface plasmon resonance (SPR) -analys av interaktionen mellan JG6 och CXCL12. CXCL12 injicerades i en koncentration av 80, 40, 20, 10, 5 nmol / L (från topp till botten). Jämviktsdissociationskonstanten beräknades av BIAcore-programvaran 3.1.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Den automatiserade dockningsimuleringen som exemplifierades med JG6-CXCL12-interaktion utfördes för att förstå interaktionsläget mellan dem. Kristallstrukturen hos human CXCL12 användes som målstruktur, medan disackariden av JG6 användes som en dockningssond. Vi fann att JG6 dockade väl till CXCL12 med en låg dockningsenergi vid -13, 08 kcal / mol. JG6 verkade interagera med CXCL12 via flera polära interaktioner, inklusive 6 joniska bindningar och 7 vätebindningar (figur 5).

Interaktionsläget för JG6 och CXCL12 modellerad genom molekylär dockning. (A) Strukturen för JG6 i disackaridform. (B) Interaktionsläget för JG6 och CXCL12. CXCL12 visas i den vita tecknade filmen med JG6 visas som gröna pinnar. Nyckelresterna från CXCL12 som interagerar med JG6 visas också som pinnar. Vätebindningar indikeras med röda streckade linjer, och jonbindningar indikeras med gula streckade linjer.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Dessa data, tillsammans, antydde att JG6 försämrade CXCL12 / CXCR4-axeln troligen via en direkt interaktion med kemokinet CXCL12, vilket resulterade i försämrad intracellulär signaltransduktion nedströms CXCL12-stimulering.

Diskussion

CXCL12 / CXCR4-axeln spelar en kritisk roll i cancerframsteg, inklusive cellproliferation, överlevnad, angiogenes och särskilt kemotaktisk metastas. Som ett resultat har CXCL12 / CXCR4-axeln blivit ett allmänt studerat läkemedel mot cancer. I denna studie har vi visat att JG6, en ny marin-härledd oligosackarid, stör CXCL12 / CXCR4-signalaxeln och dess tillhörande biologiska funktioner i cancerceller. JG6 reverserade inte bara signifikant CXCL12-inducerad spridning av cancerceller utan minskade också dramatiskt CXCL12-medierad cellmigration in vitro .

CXCL12 binder till GAG, såsom heparinsulfat (HS). CXCL12 binder till S-domänerna hos HS med hög affinitet övervägande genom 2-0- och N-sulfatgrupper 16 . HS-kedjor är linjära upprepande polymerer bestående av p- D- glukuronat och a- D- N-acetylglukosamin 17 med ett relativt enhetligt mönster av alternerande sulfaterade och omodifierade regioner längs HS-kedjan 18 . Tidigare studier av HS-struktur har identifierat en CXCL12-bindande domän 8, 19 . Dessutom uppvisade en serie sulfaterade GAG-mimetika riktade till CXCL12 anti-canceraktivitet 11 . Baserat på den strukturella likheten mellan JG6 och GAG: er, antagde vi att JG6 troligen skulle binda till CXCL12. Med användning av SPR-analysen visade vi att JG6, liksom HS, binder direkt till CXCL12 i ett multivalent bindningsläge, vilket var förenligt med den molekylära dockningsmodellen för interaktionen. Den beräknade energin visade att JG6 effektivt kan binda till CXCL12 med en relativt låg energi (-13, 28 kcal / mol). Tillsammans antyder dessa resultat att JG6 direkt kan interagera med CXCL12 och därigenom blockera CXCL12 / CXCR4-axeln och de efterföljande biologiska funktionerna såsom tumörtillväxt och migration.

Sammanfattningsvis visar vår studie att de strukturella funktionerna hos JG6 gör det möjligt att interagera med CXCL12 och ger ett alternativ för att rikta in sig på CXCL12 / CXCR4-axeln. Påverkan av JG6 på CXCL12 / CXCR4-axeln kan bero på anticanceraktiviteten för JG6.

Författares bidrag

Wei-wei WEN, Yi CHEN och Jian DING designade studien; Wei-wei WEN utförde experiment, analyserade resultaten och skrev manuskriptet; Yi CHEN, Jian DING och Mei-yu GENG reviderade manuskriptet; Xian-ling XIN-syntetiserade föreningar; och Shao XIE deltog i en del av studien.