En ny terapeutisk molekyl mot htlv-1-infektion riktad mot provirus | leukemi

En ny terapeutisk molekyl mot htlv-1-infektion riktad mot provirus | leukemi

Anonim

ämnen

  • Leukemi
  • Riktade terapier
  • Virusinfektion

Abstrakt

Humant T-cell leukemi-virus typ 1 (HTLV-1), som orsakar vuxen T-cell leukemi (ATL) hos människor, skapar en livslång latent infektion. Nuvarande terapier är inte särskilt effektiva mot HTLV-1-associerade störningar. En ny terapeutisk strategi kan hjälpa till att bekämpa HTLV-1-infektion. En molekylär terapi som är inriktad på provirala genom är gynnsam eftersom den terapeutiska effekten förekommer specifikt i HTLV-1-infekterade celler, oavsett om de uttrycker virala gener. I denna proof-of-concept-studie utvecklade vi en terapeutisk molekyl baserad på zink finger nuclease (ZFN) för att uppnå detta mål. Vi designade ett ZFN som specifikt kände igen konserverad region av HTLV-1 lång terminalupprepning (LTR) och introducerade den i olika HTLV-1-positiva humana T-cellinjer, inklusive HTLV-1-transformerade och ATL-härledda cellinjer. ZFN störde promotorfunktionen för HTLV-1 LTR och dödade specifikt HTLV-1-infekterade celler. Vi visade också ett potentiellt tillvägagångssätt för denna terapeutiska molekyl för att ta bort det provirala genomet från HTLV-1-infekterade celler, något som inte har varit möjligt tidigare. Den terapeutiska effekten av ZFN bekräftades i en in vivo- modell av ATL. Denna strategi kan utgöra grunden för en terapi som kan utrota HTLV-1-infektion. Liknande tillvägagångssätt kan användas för att rikta in sig på andra malignitetsassocierade virus.

Introduktion

Humant T-cell leukemi-virus typ I (HTLV-1) är ett retrovirus som orsakar vuxen T-cell leukemi (ATL) och den neurologiska störningen, HTLV-1-associerad myelopati, hos människor. 1, 2, 3 HTLV-1 upprättar en livslång latent infektion eftersom det virala genomet är integrerat i värdcell-DNA. HTLV-1 genomgår den lytiska fasen av den virala livscykeln i vissa infekterade celler, medan de flesta av de andra cellerna förblir latent infekterade. När de virala generna har uttryckts kan värdets immunsystem ta bort infekterade celler; emellertid är det svårt att utrota HTLV-1-positiva celler fullständigt från infekterade individer eftersom latent infekterade celler inte aktivt transkriberar de virala generna. Inga cellytemarkörer har identifierats som skiljer HTLV-1-infekterade celler från oinfekterade celler. Inget effektivt vaccin har ännu utvecklats och HTLV-1-associerade störningar svarar dåligt på nuvarande behandlingar. 4, 5 Därför behövs en molekylär terapi brådskande. Med tanke på fenomenet med viral latens är det rimligt att rikta in sig på proviruset. Här använde vi konstgjord endonukleas-teknik för att uppnå detta mål.

Zink finger nuclease (ZFN), ett syntetiskt endonukleas, introducerar en dubbelsträngsbrytning (DSB) i sitt kognata DNA-ställe och aktiverar därmed DNA-skada-inducerad apoptos. 6, 7, 8 Därför antog vi att inriktning på HTLV-1-provirus med ZFN bör döda HTLV-1-infekterade celler genom DSB-inducerad apoptos, vilket resulterar i eliminering av provirus-positiva celler från de virusinfekterade individerna (Kompletterande information S1). Vissa av DNA-strängbrytningsplatserna repareras av DNA-skadesvar-mekanismer, såsom icke-homolog ändförening, som ligerar de trasiga ändarna av kromosomalt DNA. När detta inträffar störs den ursprungliga DNA-sekvensen. Det integrerade retrovirala genomet har två identiska kopior av en sekvens som kallas viral long terminal repeat (LTR). Inriktning på LTR är fördelaktigt eftersom antalet terapeutiska mål per provirus fördubblas (ingen annan del av det virala genomet har två kopior). LTR fungerar som en viral promotor; därför, även om celldöd inte induceras, bör proviralt DNA skadas irreversibelt, varigenom expression av virala gener och efterföljande patogenicitet reduceras. Dessutom tar ZFN bort ett DNA-fragment från kromosomen. 1 Detta är möjligt när två DSB: er införs i kromosomalt DNA proximalt till varandra. DSB-reparationssystemet ligerar DNA-ändarna och tar bort det korta DNA-fragmentet som alstras av de två DSB: erna (en process benämnd som målinriktad raderingsaktivitet; kompletterande information S1). Således bör det vara möjligt att radera provgenen om ett repetitivt element, såsom LTR, som är placerat i båda ändarna av proviruset, riktas av ZFN. Därför genomförde vi en proof-of-concept-studie där vi använde ZFN för att skada HTLV-1 provirus i infekterade celler och hämma cellproliferation av virusinfekterade celler. Det var möjligt att utforma en ZFN-molekyl med de erforderliga egenskaperna eftersom endonukleaset har hög substratspecificitet, och HTLV-1 LTR har begränsad sekvensdiversitet jämfört med LTR för humant immunbristvirus.

Material och metoder

Celler och transfektion

Alla T-cellinjer bibehölls i RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Japan Bioserum, Tokyo, Japan), penicillin och streptomycin (Invitrogen, Tokyo, Japan). Dulbeccos modifierade örnmedium (Sigma) användes för att odla 293 T-celler. Celler inkuberades vid 37 ° C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2. Celler transfekterades med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) eller FuGENE6-transfektionsreagens (Roche, Tokyo, Japan). S1T- och ED-cellinjerna var generösa gåvor från Drs Baba (Kagoshima University) och Matsuoka (Kyoto University).

Plasmider och den murina leukemivirusvektorn

ZFN- gener köptes från Sigma. De retrovirala plasmiderna pQc, pCMMP och pMX konstruerades med användning av standardmolekylära kloningstekniker. Den skatteuttryckande plasmiden, pCGtax och pHTLV LTR-luciferas tillhandahålls vänligen av Dr Watanabe (Tokyo University). Produktionen av, och infektion med, murint leukemivirus (MLV) -vektorer har beskrivits tidigare. 9, 10, 11

Cellavbildning

Celler avbildades genom konfokal fluorescensmikroskopi (LSM510 Meta × 40 NA 1.4-lins, Carl Zeiss MicroImaging Inc., Tokyo, Japan) eller fluorecensmikroskopi (Olympus IX70, Tokyo, Japan).

Reporteranalys

Luciferasaktivitet mättes 48 timmar efter transfektion eller infektion med användning av ett Dual-Glo- eller Renilla-Glo Luciferase-analyspaket (Promega, Madison, WI, USA) enligt tillverkarens protokoll. Kemiluminescens detekterades med en Veritas luminometer (Promega).

immunoblotting

Western blotting och immunutfällning utfördes såsom tidigare beskrivits 12 med användning av en anti-FLAG-antikropp (F7425, Sigma) och Envision Dual Link System-HRP (Dako, Glostrup, Danmark). Kemiluminescens genererades med användning av Lumilight (Roche) eller Lumigen (GE Healthcare, Tokyo, Japan), och signalerna detekterades med användning av en LAS-3000 mini Lumino-Image-analysator.

Cellproliferationsanalys

C8166- och S1T-celler transducerades med ZFN-gener införda i MLV-vektorn och selekterades bulk i medium innehållande 1 ug / ml puromycin. Cellerna omvandlades sedan med en andra ZFN- gen i MLV-vektorn, ympades i plattor med 96 brunnar (5 eller 100 celler / brunn) och selekterades i medium innehållande 500 ug / ml G418 3 dagar efter infektion. Antalet brunnar innehållande livskraftiga celler räknades 3–4 veckor efter selektion. Cellulärt DNA isolerades med hjälp av Wizard DNA Purification Kit (Promega), och den provirala DNA-sekvensen analyserades genom sekvensering efter PCR-amplifiering av målregionerna.

Musstudie

Balb / c-nakna Rag-2 / Jak3-dubbel-bristfälliga (nakna R / J) -möss etablerades genom att korsa Balb / c-nakna möss och Balb / c Rag-2 / jak3-dubbel-bristande möss. 13 nakna R / J-möss inokulerades subkutant i höger- och vänsterflankerna med 2 × 105 ED ZFN2 / ZFN1 respektive ED ZFN2 / ZFN2- celler. Tumörtillväxt övervakades 6 veckor efter ympning genom veckovis mätning av maximal och minimal diameter med användning av bromsok. Tumörstorlek uppskattades med användning av formeln: tumörstorlek (mm 3 ) = längd (mm) × bredd 2 (mm) × 0, 4. 14, 15 Mössen hölls och övervakades i djurforskningsanläggningen enligt institutionella riktlinjer. Alla experimentella förfaranden och protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Kumamoto University (B23-201).

Statistisk analys

Experimentella resultat analyserades med studentens t- test, Personens exakta test eller Paired Wilcoxon Rank-Sum-test, i förekommande fall. P < 0, 05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Vi syntetiserade två par ZFN som riktade sig mot HTLV-1 LTR, som är: ZFN1 / 2, som känner igen R-regionen (524–563 bp, enligt GenBank-anslutningsnummer D13784-koordinaten) och ZFN3 / 4, som känner igen U5 region (627–665 bp) (figur 1a). Enligt våra egna data och NCBI-databasen bevaras dessa sekvenser i 77, 8% (14/18 kloner) av oberoende HTLV-1-kloner isolerade i Asien, Europa och Nord- och Sydamerika. Sekvensanalys indikerade att det mänskliga genomet inte innehåller sekvenser som är identiska med dessa ZFN-mål. ZFN märktes vid N-terminalen med en 3 × FLAG-epitop och ZFN-uttryck verifierades genom westernblotting av 293 T-celler transfekterade med ZFN-expressionsvektorerna (figur Ib). Då ZFN: er fusionerades till en nukleär lokaliseringssignal fördelades de främst i kärnan (figur 1c).

Karaktärisering av ZFN-funktion med reporterkonstruktioner. ( a ) Struktur av HTLV-1 provirus och målen för ZFN1 / 2 och ZFN3 / 4. Nukleotidnummerkoordinaterna härrör från GenBank-anslutningsnummer D13784. De stora bokstäverna i blått representerar ZFN-igenkänningssekvensen och de små bokstäverna i rött representerar länken där DSB: er introduceras. ( b ) Bekräftelse av ZFN-expression i transfekterade 293 T-celler genom westernblotting av celllysat med en anti-FLAG-antikropp. ( c ) Immunofluorescensanalys som visar fördelningen av ZFN: er i 293 T-celler transfekterade med varje expressionsplasmid. ZFN: er som detekteras med en anti-FLAG-antikropp är gröna och de Hoechst 33258-färgade kärnorna är blå. Förstoring är × 400. ( d ) Övergående transfektionsanalys för att undersöka effekten av ZFN på skatteförstärkt LTR-transkription. ZFN-expressionsvektorerna (20, 100 eller 500 ng; innehållande varje subenhet ensam eller en lika stor mängd av varje subenhet (1/2 eller 3/4), Tax (100 ng) och en reporterplasmid som kodar LTR-luciferas-kassetten (200 ng) samtransfekterades i 293 T-celler och luciferas-signalerna detekterades 2 dagar efter transfektion (röd). Uttrycksvektorn innehållande GFP användes som kontroll. Den totala mängden transfekterad plasmid justerades med användning av en plasmiduttryckande GFP. En CMV-driven luciferas-expressionsvektor (50 ng) användes för jämförelse (blå). Medelvärdet och standardavvikelsen för luciferas-signalerna relativt kontrollkontrollen visas från fyra oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader mellan varje plasmid och motsvarande CMV-kontroll analyserades med användning av en två-svansad Student's t- test (asterisk betecknar P <0, 01).

Bild i full storlek

Därefter undersöktes ZFN-aktivitet i mänskliga celler. Först bedömde vi om ZFN inhiberade LTR-driven genuttryck. För detta ändamål transfekterades ZFN-expressionsvektorer in i 293 T-celler tillsammans med en Tax expressionsvektor och en reporterplasmid som kodar en HTLV-1 LTR-luciferas-kassett. Luciferasaktivitet reducerades markant efter samuttryck av funktionella ZFN-par (figur 1d). Denna effekt var beroende av mängden transfekterad plasmid. Däremot påverkade ZFN-uttrycket inte transkriptionell aktivitet av cytomegalovirus (CMV) -promotorn (figur 1d). För det andra konstruerades två deletionsreporterplasmider för att testa den riktade deletionsaktiviteten. En deletionsreporter innehöll en CMV-promotor och grönt fluorescerande protein (GFP) och renilla luciferasgener (figur 2a). GFP- genen var sandwichad av det kognata ZFN-stället (figur 2a). Renilla luciferas uttrycktes inte om GFP-kassetten avlägsnades. Resultaten från ett samtransfektionsexperiment i 293 T-celler visade att GFP-fluorescens minskade väsentligt i närvaro av funktionella ZFN-underenheter (figur 2b), medan en markant ökning av renilla luciferasaktivitet detekterades vid samuttryck av funktionella ZFN-underenheter (figur 2c).

Upptäckt av ZFN-målinriktad borttagningsaktivitet. ( a ) Schematisk representation av reporterplasmiden som används för att detektera ZFN: s förmåga att avlägsna ett DNA-fragment flankerat av två ZFN-igenkänningsställen. Uttrycket av renilla luciferas (Rluc) drivs av CMV-promotorn när GFP-expressionskassetten avlägsnas med ZFN. ZFN-målsidorna indikeras av cirklar. pA är polyadenyleringssignal. ( b ) ZFNl / 2 eller 3/4 reporterplasmider transfekterades till 293 T-celler i närvaro av ZFN-expressionsvektorer såsom anges i varje panel. Cellerna observerades under ett fluorescensmikroskop vid en låg förstoring (× 100) 2 dagar efter transfektion. ( c ) Övergående transfektionsanalys för att utvärdera den målinriktade raderingsaktiviteten för ZFN ZFN-expressionsvektorerna (500 ng; innehållande varje subenhet ensam eller lika stora mängder av varje ZFN-subenhet) och reporterplasmiden (50 ng) cotransfekterades till 293 T-celler och luciferas-signalerna detekterades 2 dagar efter transfektion. En GFP-expressionsvektor användes som kontrollen. Representativa data från fyra oberoende experiment, vardera utförda i tre exemplar, visas. Betydande skillnader mellan ZFN-paren och subenheterna enbart analyserades med användning av en två-svansad Student's t- test (asterisk betecknar P <0, 001).

Bild i full storlek

För att bekräfta detta fynd konstruerade vi en annan raderingsreporter innehållande en bakteriell LacZ-alfa-expressionskassett flankerad av ZFN-kognatställen och cotransfekterade den i 293 T-celler med ZFN-uttrycksplasmiderna. Escherichia coli transformerades sedan med DNA som utvanns från de transfekterade 293 T-cellerna. Radering av LacZ-alpha-expressionskassetten bör resultera i vita bakteriekolonier på agarplattor som innehåller X-Gal. Som väntat ökade antalet vita kolonier avsevärt när ZFN-paren uttrycktes i 293 T-celler (tabell 1). Intressant nog orsakade uttryck av ZFN-paren en minskning av antalet kolonier, vilket antydde att DSB: er infördes effektivt i reporterplasmiden, men inte alla DSB-loci ligerades av DSB-reparationssystemet i 293 T-celler. Ett litet antal vita kolonier observerades, förmodligen på grund av att ZFN-oberoende borttagning av LacZ från reporterplasmiden inträffar spontant och med låg frekvens. Sammantaget antyder dessa data att ZFN: er inhiberar funktionen hos LTR-promotorn och avlägsnar DNA flankerat av ZFN-kognatställena. Vi antar att hämningen av LTR-promotorfunktionen (figur 1d) orsakades av fysisk skada på LTR.

Full storlek bord

Därefter undersökte vi den biologiska effekten (erna) av ZFN: er i HTLV-1-transformerade och ATL-härledda CD4-positiva humana T-cellinjer, med HTLV-1-proviruset. HTLV-1 odödliggör humana CD4-positiva T-celler, och proliferationen av HTLV-1-transformerade celler är beroende av HTLV-1-genuttryck. Om ZFN hämmar promotorns funktion av LTR, bör ZFN-uttrycket hämma spridningen av HTLV-1-transformerade cellinjer. Dessutom bör HTLV-1-positiva celler genomgå DSB-triggad apoptos vid ZFN-expression. Vi bekräftade att ZFN-målsekvensen i LTR bevarades i alla cellinjer som användes i denna studie. Till en början omvandlade vi en underenhet av ZFN till C8166-celler 16 med användning av en MLV-vektor. En andra ZFN-subenhet omvandlades sedan in i cellerna med användning av en MLV-vektor som bär en distinkt selektionsmarkör, och cellproliferation undersöktes genom att mäta cellkloningseffektiviteten (figur 3a). För kontrollcellerna introducerades samma ZFN-subenhet som initialt transducerades igen (kallas ett "icke-funktionellt par"). När de funktionella ZFN1 / 2 och ZFN3 / 4-paren uttrycktes minskades kloningseffektiviteten för C8166-celler signifikant med 26, 9 respektive 20, 0 gånger jämfört med kontrollen ( P = 0, 001 respektive P = 0, 002; Studentens t- test, tabell 2). Därefter undersökte vi ATL-cellinjen S1T, som sprider sig på ett interleukin-2-oberoende sätt. 17 Under samma experimentella förhållanden reducerades kloneffektiviteten för S1T-celler med 4, 4- och 1, 9-fald jämfört med kontrollen när funktionella ZFN1 / 2 respektive ZFN3 / 4-par uttrycktes (tabell 2). Minskningen av cellkloningseffektiviteten medierad av ZFN1 / 2 (men inte ZFN3 / 4) var statistiskt signifikant ( P <0, 001; Studentens t- test). Proliferativ hämning av HTLV-1-transformerade och ATL-härledda cellinjer observerades när celltillväxt bedömdes i bulkodling med användning av metaboliska mätningar (data visas inte). Vi observerade liknande resultat i HTLV-1-transformerade MT-2- och MT-4-celler och de ATL-härledda cellinjerna, ED och TL-OmI (data visas inte). Dessutom observerades dessa fynd inte i fyra HTLV-1-negativa CD4-positiva T-cellinjer, inklusive CEM, MOLT-4, Jurkat och SUP-T1 (data visas inte). Dessa data antyder att ZFN hämmar spridningen av HTLV-1-infekterade celler, specifikt. Vi noterade också att cellkloningseffektiviteten minskades i större utsträckning i HTLV-1-transformerade celler än i ATL-härledda celler. Antagligen beror detta på att HTLV-1-transformerade celler är mer mottagliga för DSB-inducerad apoptos.

Effekt av ZFN-medierad platsriktad mutagenes av HTLV-1 LTR. ( a ) Experimentellt förfarande som används för att bedöma effekten (erna) av ZFN-uttryck i HTLV-1-infekterade celler. ( b och c ) Sekvens av LTR (som sträcker sig över ZFN-målställena) utvunnits från S1T-celler transducerade med ZFN1 / ZFN2 ( b ) eller ZFN3 / ZFN4 ( c ). Nukleotidnummerkoordinaterna härrör från GenBank-anslutningsnummer D13784. Blå bokstäver representerar ZFN-igenkänningssekvensen och röda bokstäver representerar DSB-induktionsställen som i figur la. Streck representerar borttagningar och understrukning representerar ersättningar. ( d - g ) Reporteranalys för att bedöma promotoraktiviteten för LTR-mutanter som visas i ( b ) och ( c ). Skatteuttrycksvektorn (100 ng) och reporterplasmiden som bär LTR-mutanterna (200 ng) samtransfekterades in i 293 T-celler och luciferas-signalerna detekterades 2 dagar efter transfektion. Den transkriptionella aktiviteten för den positiva ( d och f ) och den negativa strängen ( e och g ) indikeras. Data är representativa för fyra oberoende experiment. Den streckade linjen indikerar vildtypnivån.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Därefter undersöktes den fysiska skadan på LTR-sekvensen orsakad av ZFN i S1T-cellkloner utvunnna från ovanstående experiment. Vi identifierade platsspecifika mutationer i 44, 1% (15/34 kloner) av LTR-sekvenser härledda från S1T-cellkloner, vilket uttryckte funktionella ZFN-par, medan inga mutationer hittades i LTR-kloner isolerade från kontrollerna (0/7 kloner, P <0, 05 ; Pearsons exakta test, tabell 3). De flesta av mutationerna var borttagningar (medelvärde, 14, 1 bp / klon). Expression av ZFN3 / 4 resulterade i större deletioner (15, 0 bp / klon) än expression av ZFN1 / 2 (10, 2 bp / klon). En insertionsmutation detekterades endast i en enda ZFN3 / 4-transducerad klon (2 bp, 2, 9%, 1/34 kloner; figurerna 3b och c). Dessa data antyder att DSB-reparation sker i ATL-celler, men att kvaliteten på reparationen på ZFN1 / 2 och ZFN3 / 4-platserna är annorlunda. Vi antar att kloner som bär en vildtyp-LTR kan ha misslyckats med att uttrycka ZFN: er effektivt eller förlorat ZFN-uttryck under valet.

Full storlek bord

Promotoraktiviteten hos vissa LTR-mutanter undersöktes i en reporteranalys där reporterplasmiden innehöll både eldfly och renilla luciferaser, vilket representerar positiv respektive negativ strängtranskription (figur 3d – g). Den skatteförstärkta transkriptionen av den positiva strängen reducerades med de flesta av mutationerna införda med ZFN1 / 2 (4/6 kloner, figur 3d). På liknande sätt reducerades den negativa strängtranskriptionen också med ZFN1 / 2-inducerade mutationer (5/6 kloner, figur 3e). Å andra sidan observerades ökad positiv trådtranskription i 4/7 LTR-mutanter utvunnna från ZFN3 / 4-transducerade celler (figur 3f). Däremot uppvisade många av LTR-mutanter måttligt reducerad transkription av negativ sträng (figur 3g). Sekvensanalys antydde att LTR-sekvenserna riktade av ZFN inte innehåller bindningsställen för tidigare kända transkriptionsfaktorer; därför är det möjligt att målplatsen ZFN1 / 2 sträcker sig över ett cisverkande element som stöder effektiv transkription av den positiva strängen. Alla S1T-cellkloner var positiva för gaggenen , vilket antydde att avlägsnande av hela provirala genomet var ineffektivt, eller att ATL-celler inte kan spridas utan proviruset. Vissa S1T-cellkloner visade emellertid reducerade gag-till-LTR-förhållanden mätt med kvantitativ realtids-PCR, vilket antyder att avlägsnande av vissa provirala genkopior är möjliga (data visas inte). Sammantaget antyder dessa data att ZFN-förmedlat dödande av S1T-celler inte beror på förlusten av virala gener, utan mer sannolikt på grund av DSB-inducerad apoptos.

För att utvärdera ZFN1 / 2: s potential att hämma tumörgenicitet hos ATL-celler in vivo , antog vi ATL-cellens xenograftmodell i Balb / c nakna Rag-2 / Jak3-dubbeldeficita (nakna R / J) -möss. Vi valde att använda ED-celler eftersom de bildar en tumörmassa i nakna möss och inte kräver human interleukin-2 för tillväxt. 18 Dessutom är ED-celler mycket mottagliga för infektion med MLV-vektorer. Som visas ovan var den biologiska effekten av ZFN1 / 2 större än effekten av ZFN3 / 4 i både HTLV-1-transformerade och ATL-härledda cellinjer. Därför använde vi ZFN1 / 2-paret för in vivo- studien. ED-celler som konstitutivt uttrycker ZFN2 (ED ZFN2 ) infekterades med MLV-vektorer och innehöll GFP- , ZFN1- eller ZFN2- genen (figur 3a). Ungefär hälften av cellerna infekterades av MLV-vektorerna, beräknat med antalet GFP-positiva celler (data visas inte). Celler inokulerades intradermalt in i nakna möss 2 dagar efter MLV-infektion. ED ZFN2 / ZFN1- celler uppvisade en lägre hastighet av tumörbildning, och tumörerna var signifikant mindre än de i kontrollmöss (Paired Wilcoxon Rank-Sum test, P <0, 05; figur 4). Dessa data indikerar att ZFN1 / 2 visar lovande terapeutisk effekt mot ATL.

ZFN-medierad hämning ATL-celltumorigenes in vivo. ( a ) Engraftment av ED-celler transducerade med ZFN: er i Balb / c-nakna Rag-2 / Jak3-dubbelt bristfälliga (nakna R / J) -möss. ED ZFN2 / ZFN1- och ED ZFN2 / ZFN2- celler transplanterades i vänster- och högerflankerna. Möss fotograferades vid 6 veckor efter inokulation av celler. ( b ) Naken R / J-möss dödades 6 veckor efter inokulation av celler. Tumörerna dissekerades, fotograferades och mättes. ( c ) Den uppskattade tumörvolymen visas. Fältet representerar gruppens medelvärde. Betydande skillnader mellan de två grupperna analyserades med användning av det parade Wilcoxon Rank-Sum-testet ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

Vi syntetiserade två par ZFN som framgångsrikt riktade HTLV-1 proviral LTR och hämmade spridningen av HTLV-1-transformerade och ATL-härledda T-cellinjer. ZFN orsakade fysiska skador på LTR och störde dess funktion. Även om vissa celler överlevde, innehöll de ett defekt provirus; därför bör de terapeutiska effekterna vara långvariga. ZFN kunde avlägsna åtminstone en del provirala gener från HTLV-1-infekterade celler och visade antitumöreffekter in vivo . Sammantaget visar dessa data att ZFN är en attraktiv terapeutisk molekyl för behandling av HTLV-1-infektion och kan utgöra grunden för en behandling som eliminerar viruset från infekterade celler. Tidigare studier använde ZFN för att redigera det mänskliga genomet. 19, 20 Arbetet som rapporteras här är emellertid unikt i det att ZFN användes för att döda målceller via DSB-triggad apoptos. Detta tillvägagångssätt kan användas för andra virus som upprättar latenta infektioner och är associerade med mänskliga maligniteter, inklusive retrovirus, Epstein-Barr-virus, Kaposi sarcoma herpesvirus, papillomavirus och hepatit B-virus.

Valet av en viral vektor kan förbättra effektiviteten av ZFN när det gäller att begränsa spridningen av HTLV-1-infekterade celler. Vi levererade ZFN- genen med en MLV-vektor; adenovirala vektorer har emellertid använts för klinisk applicering av ZFN: er. 20 Fördelen med en adenoviral vektor är att den inducerar övergående, men höga nivåer av ZFN-expression, medan retrovirala vektorer uttrycker genen av intresse konstitutivt, men vid låga nivåer. Vi fann att ZFN-uttryck i celler gradvis minskade efter långvarig odling, vilket ofta är fallet med andra gener. Detta antyder att MLV-medierad gentransduktion kanske inte är lämplig för klinisk tillämpning. Vi förväntar oss också att ZFN-medierad celldödning kan förbättras genom att hämma DSB-reparationsproteiner, en metod som används för att öka effektiviteten av DNA-skadliga medel mot tumörceller. 21

Det största hindret som måste övervinnas om ZFN ska användas kliniskt för att behandla HTLV-1-infektion är deras effektiva leverans till virusbehållare. För att eliminera HTLV-1 från infekterade individer måste ZFN levereras direkt till latent infekterade celler; emellertid är den latenta behållaren för HTLV-1 dåligt förstått. Även om ZFN har en hög-substratspecificitet och dess icke-specifika effekter anses vara minimal, kan leverans av ZFN till alla celler inte vara önskvärt. Cellytemarkörer för HTLV-1-infekterade celler, antingen transformerade eller inte, återstår att identifieras. Vi måste öka vår förståelse för HTLV-1-latens om vi ska använda ZFN: er i en klinisk miljö. Effekter utanför målet är ett annat problem. Även om ZFN inte hämmar spridningen av HTLV-1-negativa celler, måste risken för att ZFN kan redigera det mänskliga genomet tas upp i framtida studier. Fas I och II kliniska prövningar med ZFN för att behandla humant immunbristvirusinfektion och återkommande / refraktär malignt gliom pågår för närvarande (NCT00842634, 01044654 och 01082926), vilket antyder att den kliniska tillämpningen av ZFN är genomförbar. En annan fråga som ska behandlas är stadiet för HTLV-1-infektion där ZFN ska användas; till exempel under den latenta perioden eller efter uppkomsten av HTLV-1-associerad sjukdom.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • D13784

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegend

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)