Ny roll av hdac-hämmare i aml1 / eto-amlceller: aktivering av apoptos och fagocytos genom induktion av annexin a1 | celldöd & differentiering

Ny roll av hdac-hämmare i aml1 / eto-amlceller: aktivering av apoptos och fagocytos genom induktion av annexin a1 | celldöd & differentiering

Anonim

Abstrakt

Det chimära fusionsproteinet AML1-ETO, skapat av t (8; 21) -translokationen, rekryterar histondeacetylas (HDAC) till AML1-beroende promotorer, vilket resulterar i transkriptionell repression av målgenerna. Vi analyserade transkriptionella förändringar i t (8; 21) Kasumi-1 AML-celler som svar på HDAC-hämmare, depsipeptid (FK228) och suberoylanilidhydroxaminsyra (SAHA), vilket inducerade markant tillväxthämning och apoptos. Med användning av cDNA-array identifierades annexin Al (ANXA1) som en av de FK228-inducerade generna. Induktion av ANXA1-mRNA associerades med histonacetylering i ANXA1-promotor och reversering av HDAC-beroende undertryckning av C / EBP a med AML1-ETO med direkt rekrytering av C / EBP a till ANXA1-promotor. Detta ledde till en ökning av den N-terminala klyvda isoformen av ANXA1-protein och ackumulering av ANXA1 på cellmembranet. Neutralisering med anti-ANXA1-antikropp eller gen-tystnad med ANXA1 siRNA inhiberade FK228-inducerad apoptos, vilket antyder att uppregleringen av endogen ANXA1 främjar celldöd. FK228-inducerad ANXA1-expression var associerad med massiv ökning av cellbindning och uppsvulning av Kasumi-1-celler genom humana THP-1-härledda makrofager, som fullständigt upphävdes med ANXA1-knockdown via siRNA-transfektion eller ANXA1-neutralisering. Dessa fynd identifierar en ny verkningsmekanism av HDAC-hämmare, som inducerar expression och externisering av ANXA1 i leukemiska celler, som i sin tur medierar det fagocytiska clearance av apoptotiska celler av makrofager.

Huvudsaklig

T (8; 21) -translokationen skapar det chimära fusionsproteinet AML1-ETO, 1 som rekryterar histondeacetylas-enzymer (HDAC) -enzymer till AML1-beroende promotorer, vilket resulterar i transkriptionell repression av målgenerna. Histonacetylering är väsentlig för etablering av transkriptionellt kompetent kromatin. 2 Acetyleringstillståndet för histoner och andra proteiner som reglerar transkription kontrolleras av histonacetyltransferaser och histondeacetylaser (HDAC). 3 HDAC bildar också ett komplex med leukemi-fusionsproteiner, såsom AML1-ETO, PML-RAR a , MLL-CBP och andra, vilket resulterar i det avvikande undertryckta uttrycket av gener som krävs för kontroll av celltillväxt och därmed transformeringen av primitiva hematopoietiska celler. 4 Omvänt är histondeacetylas-hämmare (HDACI) kapabla att inducera apoptos, differentiering och tillväxt i tumörceller, inklusive leukemiceller. 5 Dessa egenskaper hos HDACI har gjort dem av särskilt intresse som ett sätt att övervinna läkemedelsresistensen som är karakteristisk för akut myelooid leukemi (AML) som nu minskar utsikterna för långvarig överlevnad hos dessa patienter. Flera strukturellt olika HDACI har nu utvecklats som cancerläkemedel; av dessa natriumfenylbutyrat, depsipeptid (FK228), suberoylanilidhydroxaminsyra (SAHA) och MS-275 studeras för närvarande i kliniska prövningar hos patienter med hematologiska maligniteter och solida tumörer. 5 Mekanismen för HDACI är dock okänd. Kunskap om deras mekanism kan användas i utvecklingen av andra förbättrade HDACI: er och i utformningen av kombinationsbehandling.

Vi studerade därför mekanismerna för de anti-leukemiska effekterna av HDACI i AML-cellinjen Kasumi-1. Vi valde FK228 som tidigare visades ha cytotoxisk aktivitet mot myeloida leukemi 6, 7 men inte i T-celllymfomceller, 8 och använde en annan HDACI SAHA, som för närvarande genomgår kliniska studier i hematologiska maligniteter. 9 För att identifiera gener som regleras av HDAC i Kasumi-1-celler med AML1-ETO-fusionsproteinet analyserade vi först transkriptionella förändringar som svar på FK228 med hjälp av cDNA-array-teknik. Vi fann att FK228-inducerad apoptos var förknippad med induktionen av expressionen av det pro-apoptotiska proteinannexinet A1 (ANXA1) genom histonacetyleringen av dess promotor. ANXA1 är en 37 kDa medlem av annexinsuperfamiljen som strukturellt tillhör en familj av allestädes närvarande fosfolipider och kalciumbindande proteiner. Beroende på cellsystemet är det involverat i apoptosinduktion, 10 kaspas-3-aktivering, 11, 12 celltillväxtinhibering, 13, 14 och fagocytos. 15 Vidare har nedreglering av ANXA1-uttryck rapporterats korrelera med tumörprogression i huvud- och nackcancer. 10 I denna studie upptäckte vi att FK228 inducerade histonacetylering, induktion av ANXA1-genuttryck och C / EBP a- bindning i ANXA1-promotor specifikt i AML1 / ETO-uttryckande AML-celler, och dessa effekter bidrog till apoptotisk celldöd och uppslukningen av apoptotisk celler av makrofager. Dessa effekter blockerades både av den ANXA1-blockerande antikroppen och genom tystnad av ANXA1-genen med ANXA1 siRNA. Eftersom den fagocytiska clearance av apoptotiska leukemiceller spelar en viktig roll i upplösningen av inflammation efter kemoterapi, betonar våra resultat även den avgörande rollen för ANXA1 som mediator för apoptos och fagocytos som svar på HDAC-hämning.

Resultat

FK228 hämmar tillväxt och inducerar apoptos av Kasumi-1-celler

Vi undersökte först de dosberoende hämmande effekterna av FK228 på tillväxten av Kasumi-1-celler exponerade för inkrementella koncentrationer av FK228 (1, 5 och 10 nM) under 16 timmar. Cellantal bestämdes vid 24, 48, 72 och 96 timmar efter tvättning av läkemedlet (figur la, i). Eftersom behandling med 5 nM FK228 signifikant hämmade tillväxten av Kasumi-1-celler jämfört med tillväxten av kontrollceller, valdes denna koncentration för ytterligare mekanistiska studier.

Image

Image

FK228-effekter på tillväxtinhibering, apoptos och cellcykel i Kasumi-1 och NB4-celler. ( a ), ( c ) Kasumi-1-celler ( a ) och NB4-celler ( c ) odlades i närvaro av olika koncentrationer av FK228 (1, 5 och 10 nM) under 16 timmar, följt av tvättning av läkemedel med medium förändring. Effekterna på celltillväxt (i) bestämdes genom livskraftiga cellräkningar med användning av Trypan blue exclusion-metoden. Grafer visar medelvärdet av SD för resultat från tre oberoende experiment. (ii) Procentandel av annexin V-positiva kontrollceller och celler behandlade med FK228 (72 timmars tidpunkt). Grafer visar medelvärde ± SD för resultat från tre oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader ( ** P <0, 01) bestämdes med en parad Studentt-test. ( b ) Exempel på resultat från flödescytometrisk cellcykelanalys. Kasumi-1-celler behandlades med FK228 (5 nM) under 16 timmar, följt av tvättning av läkemedlet, varefter fixerade celler färgades med PI vid 72 timmars tidpunkt. Siffror anger genomsnittet ± SD för procentandelen celler i G1- och S-faserna i cellcykeln från tre oberoende experiment, beräknat med ModFit-programmet. ( d ), ( e ) Kasumi-1-celler ( d ) och NB4-celler ( e ) odlades i närvaro av olika koncentrationer av SAHA (0, 5, 1, 0 och 2, 0 mikrometer ) under 16 timmar. Effekterna på celltillväxt (i) bestämdes genom livskraftiga cellräkningar med användning av Trypan blue exclusion-metod. Grafer visar medelvärdet av SD för resultat från tre oberoende experiment. (ii), procent av annexin V-positiva kontrollceller och celler behandlade med SAHA (72 timmars tidpunkt). Grafer visar medelvärde ± SD för resultat från tre oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader ( ** P <0, 01) bestämdes med en parad Studentt-test

Bild i full storlek

Eftersom FK228 har rapporterats inducera apoptos i många tumörcelltyper undersökte vi därefter om FK228 inducerade apoptos i Kasumi-1-celler. Vid 72 timmars odling inducerade den övergående (16 timmar) exponeringen av celler för 5 nM FK228 apoptos ( P <0, 001, figur la, ii). Vid en koncentration av 10 nM inducerade FK228 döden av nästan alla Kasumi-1-celler. FK228 vid 5 nM påverkade också cellcykeln, genom att förhållandet G0 / G1-fasceller ökade måttligt och förhållandet mellan S-fasceller minskade signifikant jämfört med fynden i obehandlade kontrollceller vid 72 timmar ( P = 0, 03), med ökning av hypodiploid (sub-G 1 ) -populationen (figur Ib). Sammantaget visade detta att den FK228-inducerade celltillväxtinhiberingen av Kasumi-1-celler orsakas av kombinationen av apoptotiska och cellcykelinhiberande svar.

Såsom visas i figur 1c var emellertid NB4 APL-celler, som uttrycker fusionsprotein PML-RAR a4 kända för att bilda komplex med HDAC, mindre känsliga än Kasumi-1-celler för FK228. Även om de dosberoende tillväxtinhiberande effekterna av FK228 också observerades i NB4-celler, inducerade 5 nM FK228 inte signifikant apoptos och påverkade endast minimalt G0 / G1-cellcykeldistributionen (G 0 / G 1 : kontroll 44, 8 ± 4, 2 kontra FK228 57, 6 ± 4, 0, P = 0, 04; S: kontroll 49, 0 ± 4, 2 mot FK228 38, 5 ± 2, 5, P = 0, 03, vid 72 timmar). En högre dos (10 nM) av FK228 hämmade emellertid signifikant NB4-celltillväxt och apoptos, i överensstämmelse med resultaten från en tidigare studie. 7

En annan HDACI, SAHA, orsakade de dosberoende celltillväxtinhiberande effekterna och induktionen av apoptos i både Kasumi-1 och NB4-celler (figur 1d och e). Medan lägre dos av SAHA (0, 5 och 1 μM ) inducerade mer apoptos i Kasumi-1 än NB4-celler, inducerade högre dos (1 μM) SAHA nästan fullständig celldöd för Kasumi-1 och NB4-celler.

FK228 uppreglerar ANXA1- uttryck i AML1-ETO-positiva Kasumi-1 och SKNO-1-celler

För att bestämma mekanismerna för induktion av apoptos genom FK228 undersökte vi förändringar i genuttrycket av FK228-behandlade Kasumi-1-celler med hjälp av en cDNA-grupp. Följande kriterier användes för att identifiera gener som differentiellt uttrycks i FK228-behandlade celler och kontrollceller: en nedre gräns för vikningsändringar (FC)> 2 och en skillnad på medel på> 150 användes för att identifiera uppreglerade gener och en övre gräns av FC 2 och skillnaden i medelvärdet av 150 användes för att identifiera nedreglerade gener. I FK228-behandlade Kasumi-1-celler uppreglerades 123 gener och 14 gener nedreglerades. Bland dessa var genen som kodar tumörnekrosfaktorn a (TNF a ) måttligt uppreglerad (2, 1-faldig), i överensstämmelse med en tidigare rapport om TNF- a -induktion genom histonhyperacetylering. 16 Den antiinflammatoriska cytokinen TGF-p17-genen befanns på liknande sätt vara uppreglerad med 2, 3 gånger i de FK228-behandlade Kasumi-1-cellerna. Genen uppreglerade> 2, 1 gånger sammanfattas i tabell 1. Vi fokuserade våra studier på den pro-apoptotiska ANXA1-genen, som visade en 3, 5-faldig ökning av uttrycket som svar på FK228.

Full storlek bord

För att bekräfta resultaten från mikroarray analyserade vi förändringar i mRNA-uttrycket av ANXA1-genen med hjälp av PCR i realtid. Detta visade att ANXA1 mRNA-uttrycket i Kasumi-1-celler upprepades upprepade gånger med 5 nM FK228 eller 1 μM SAHA (FK228 6, 4 ± 0, 2, SAHA 7, 4 ± 0, 5 gånger ökning jämfört med kontroll; figur 2a). Emellertid observerades ingen ytterligare ökning i ANXA1-mRNA-nivåerna vid en högre (10 nM) dos av FK228 (data visas inte). På samma sätt inducerade dessa HDACI: er ANXA1-mRNA i en annan AML1-ETO-positiv cellinje, SKNO-1-celler (FK228 6, 0 ± 0, 7-, SAHA 9, 6 ± 1, 3-faldig ökning jämfört med kontroll), men inte i AML1-ETO-negativa NB4, U937 eller OCI / AML2-celler (figur 2a). Ingen ytterligare induktion av ANXA1-mRNA observerades i NB4-celler vid en högre dos av FK228 (10 nM) eller vid senare tidpunkter (48 och 72 timmar; data visas inte).

Image

Image

FK228 och SAHA inducerar ANXA1 mRNA med ökningar i histonacetylering i ANXA1-promotorn i Kasumi-1 och SKNO-1-celler. ( a ) Induktion av ANXA1-mRNA-uttryck i Kasumi-1, SKNO-1, NB4, U937 och OCI / AML2-celler behandlade med FK228 (5nM), SAHA (1 μM ) och / eller Z-DEVD-fmk (50 μM ) under 24 timmar, som detekteras med TaqMan RT-PCR-analys. Överflödet av transkript av ANXA1 i förhållande till överflödet av transkript av p2- mikroglobulin bestämdes såsom beskrivits i materialen och metoderna. Grafer visar representativa data från tre oberoende experiment. ( b ) Chromatin från Kasumi-1, SKNO-1 eller NB4-celler behandlade med FK228 (5 nM) eller SAHA (1 μM ) under 24 timmar immunutfälldes med en antikropp mot acetylerad H3-Lys9 (i) och H4 (ii) ) och analyserades sedan med TaqMan PCR med användning av prober och primrar motsvarande ANXA1-promotorn. Grafen visar överflödet av acetylerad H3-Lys9 och H4 i förhållande till storleken på "input" såsom beskrivs i materialen och metoderna. Grafer visar representativa data från tre oberoende experiment. ( c ) Realtids TaqMan PCR-profiler av ANXA1-promotorförstärkning visade med exempel på ChIP-analyser. Representativa profiler av acetylerad H3-Lys9 i Kasumi-1 (i) och NB4 (ii) celler behandlade med FK228. (iii) In put- kurvan visar det totala genomiska DNA före immunutfällning

Bild i full storlek

FK228 aktiverar ANXA1 -gentranskription genom histonacetylering i AML1-ETO-positiva Kasumi-1 och SKNO-1-celler

Därefter bestämde vi om induktion av ANXA1-transkription förmedlas genom histonacetylering. Detta undersöktes med hjälp av ChIP-analysen och kvantifierades med TaqMan PCR för att identifiera den kritiska histonresten på ANXA1-promotorn modifierad av HDACI i AML1-ETO-positiva och-negativa celler. Såsom visas i figur 2b och c främjade både FK228 och SAHA histonacetylering i ANXA1-promotorn i AML1-ETO-positiva Kasumi-1-celler (histon H3L9; FK228 38, 1 ± 7, 6-, SAHA 83, 6 ± 13, 5-, H4; FK228 3, 9 ± 0, 8-, SAHA 4, 1 ± 0, 8-faldig ökning jämfört med kontroll). Liknande resultat observerades i SKNO-1-celler (H3L9; FK228 3, 4 ± 0, 6-, SAHA 58, 1 ± 9, 5-, H4; FK228 1, 4 ± 0, 3-, SAHA 2, 6 ± 0, 5-faldig ökning jämfört med kontroll) men inte i AML1-ETO -negativa celler (dvs NB4, U937 och OCI / AML2-celler).

För att klargöra mekanismerna för histonacetylering i ANXA1-promotorn i AML1-ETO-positiva celler undersökte vi möjligheten att ANXA1 är ett direkt mål för AML1-ETO-genen. Emellertid identifierades inga direkta AML1-bindande platser i ANXA1-promotorn. Därefter fokuserade vi på ANXA1-promotorregionen som en möjlig plats för bindningsställen för kandidatens AML1-målgener. En undersökning av denna region visade att dessa platser förtrycks av AML1-ETO via HDAC-rekrytering, 18 och identifierade fyra kandidat C / EBP a (transkriptionsfaktor CCAAT / förstärkande bindande protein a ) bindningsställen: tgtgaTTCCAact (GenBank U25414; nukleotider 410–422 ), aaaTGTAAtattt (nukleotider 610–622), cttTGTAAtgcca (nukleotider 822–834) och gtgTGAAAtcttc (nukleotider 1001–1013). Eftersom uttryck av C / EBP a- genen och C / EBP a- beroende transkription hämmas av AML1-ETO genom undertryckandet av dess positiva autoreguleringsslinga, 19, 20 undersökte vi huruvida HDACI kan inducera C / EBP a genuttryck i AML1- ETO-positiva celler. Detta visade att FK228 eller SAHA specifikt ökade C / EBP a mRNA-nivåer i Kasumi-1-celler (FK228 9, 1 ± 0, 9, SAHA 4, 6 ± 0, 5-faldig ökning jämfört med kontroll) och SKNO-1-celler (FK228 5, 2 ± 0, 6-, SAHA 3, 3 ± 0, 4-faldig ökning jämfört med kontroll) men inte i NB4, U937 och OCI / AML2-celler (figur 3a). Med hjälp av en ChIP-analys bekräftade vi rekryteringen av C / EBP a till ANXA1-promotorregionen i Kasumi-1-celler (12, 2 ± 3, 3-faldig ökning) och SKNO-1-celler (induktion av C / EBP a från ingen detektion i kontroll) efter exponering för FK228 (figur 3b). Dessa fynd indikerar starkt att transkriptionen av ANXA1 regleras av reversering av HDAC-beroende undertryckning av C / EBP a med AML1-ETO och direkt rekrytering av C / EBP a till ANXA1 genpromotorn.

Image

FK228 och SAHA inducerar C / EBP a mRNA med ökningar i C / EBP a rekrytering till ANXA1 promotorn i Kasumi-1 och SKNO-1 celler. ( a ) Induktion av C / EBP a mRNA-uttryck i Kasumi-1, SKNO-1, NB4, U937 och OCI / AML2-celler behandlade med FK228 (5 nM) eller SAHA (1 μM ) under 24 timmar upptäckt av TaqMan RT -PCR-analys. Överflödet av transkript av C / EBP a relativt det för P2-mikroglobulin bestämdes såsom beskrivits i materialen och metoderna. Grafer visar representativa data från två oberoende experiment. ( b ) Chromatin från Kasumi-1 och SKNO-1-celler behandlade med FK228 (5 nM) under 24 timmar immunutfälldes med en antikropp mot C / EBP a och analyserades med TaqMan PCR med användning av prober och primrar motsvarande ANXA1-promotorn. Grafen visar överflödet av C / EBP α- rekrytering i förhållande till storleken på "input" som beskrivs i Material och metoder. Grafer visar representativa data från två oberoende experiment

Bild i full storlek

FK228-inducerad ANXA1 främjar apoptos

Därefter fokuserade vi på utredningen av den funktionella rollen för ANXA1 i de cellulära effekterna inducerade av HDAC-hämmare i Kasumi-1-celler. Överuttryck av både ANXA1 i full längd och av den N-terminala klyvningen av ANXA1 har visat sig främja apoptos. 11, 12 Immunofluorescensanalys med antingen monoklonal ANXA1-antikropp, som detekterar fullängds ANXA1, eller polyklonal ANXA1-antikropp, detekterar klyvt N-terminal-trunkerat protein ANXA1 med full längd, visade ökning i ANXA1-uttryck lokaliserat på plasmamembranet i FK228 -behandlade Kasumi-1-celler, mer framträdande påvisbara med polyklonal anti-ANXA1 (figur 4a). Den kaspasinducerade klyvda produkten av ANXA1-protein har rapporterats vara associerad med celldöd, 11 och som visas i figur 4b bekräftade vi verkligen ökningen i mängden spaltat N-terminal-trunkerat ANXA1-protein (33 kDa) av FK228 med användning av Western blot-analys med polyklonal anti-ANXA1. Monoklonal anti-ANXA1-antikropp detekterade också ANXA1-proteinökningen med full längd (37 kDa) med FK228. FK228 initierade kaspas-3-klyvning associerad med uppkomsten av den ökade klyvade versionen av ANXA1 i Kasumi-1-celler (figur 4b, ii). Caspase-3-hämmare Z-DEVD fmk blockerade effektivt kaspas-3-klyvning (figur 4b, ii), minskad FK228-inducerad apoptos (% AnnexinV + celler: kontroll 16, 1 ± 3, 2, FK228 54, 4 ± 4, 6, FK228 / Z-DEVD 34, 4 ± 4, 5 P = 0, 01, vid 72 timmar, undertryckt accelererad klyvning av ANXA1 (detekterat av polyklonal antikropp) och delvis förhindrad ökning av protein i full längd (detekterat av monoklonal antikropp; figur 4b), utan förändring i ANXA1 mRNA (figur 2a) . Dessa resultat indikerar att caspase-3-aktiveringen delvis bidrar till ANXA1-aktiveringen och celldöd, men dessa effekter är transkriptionsoberoende.

Image

( a ) ANXA1 induktion och translokation inducerad av FK228 i Kasumi-1-celler. Induktion och translokation av ANXA1 i Kasumi-1-celler detekterade med immunofluorescensmikroskopi efter 24 timmar med FK228 (5 nM) -behandling. Celler färgades för ANXA1 (med monoklonal eller polyklonal antikropp, grön), och kärnor förseglades med DAPI (blå). Resultaten är representativa för två oberoende experiment. ( b ) FK228-inducerad ANXA1-klyvning och kaspas-3-klyvning i Kasumi-1-celler. Hela-cell-lysat framställdes från Kasumi-1-celler odlade med och utan FK228 (5 nM) eller FK228 / Z-DEVD-fmk (50 mikrometer ) under 24 timmar och utsattes för immunblotanalys för ANXA1 och kaspas-3-uttryck. De anti-polyklonala och monoklonala ANXA1, anti-procaspas-3 och anti-klyvda caspase-3-antikropparna användes. p- aktin uppvisade lika belastning av prover. Uppgifterna som visas är representativa för tre oberoende experiment. ( c ) Neutralisering av ANXA1 hämmar FK228-inducerad apoptos i Kasumi-1-celler. Procentandel av Kasumi-1-celler som visar FK228-inducerad annexin V-positivitet förbehandlad med eller utan ANXA1-neutraliserande antikropp. FK228 sattes till cellerna 24 timmar efter förbehandling med den ANXA1-neutraliserande antikroppen, varefter celler tvättades och mediet byttes. Celler inkuberades sedan under 48 timmar och annexin V-positivitet analyserades med flödescytometri. Grafer visar medelvärde ± SD för resultat från tre oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader ( * P <0, 05) bestämdes med en parad Student's t- test

Bild i full storlek

För att fastställa bidraget från ANXA1-uppreglering till FK228-inducerad apoptos undersökte vi först effekten av den ANXA1-neutraliserande antikroppen på de cytotoxiska effekterna av FK228 på Kasumi-1-celler. Neutraliseringen av ANXA1 blockerade fullständigt FK228-inducerad apoptos i Kasumi-1-celler (figur 4c). I ett alternativt tillvägagångssätt analyserade vi FK228-inducerad apoptos i ANXA1 knockdown Kasumi-1-celler. Detta visade att ANXA1 mRNA-expression i ANXA1 siRNA-transfekterade celler reducerades med 80% vid 48 timmar jämfört med dess uttryck i icke-specifika (NS) siRNA-transfekterade celler (figur 5a, i). Detta översatte till fullständigt försvinnande av den spjälkade isoformen av ANXA1 och en partiell minskning av uttrycket av proteinet i full längd (figur 5a, ii). Anmärkningsvärt var att ANXA1 siRNA-transfekterade celler var signifikant mindre mottagliga för FK228-inducerad apoptos än NS-siRNA-transfekterade celler (figur 5b, i). ANXA1-tystnad blockerade emellertid endast delvis de tillväxtinhiberande effekterna av FK228 (figur 5b, ii), vilket antyder att medan ANXA1 spelar en roll i apoptosinduktion, är ANXA1-oberoende mekanismer ansvariga för de anti-proliferativa effekterna av FK228.

Image

( a ) ANXA1- knockdown i ANXA1 siRNA-transfekterade Kasumi-1-celler. Kasumi-1-celler transfekterades med NS-siRNA eller ANXA1 siRNA, såsom beskrivs i material och metoder. (i) Överflödet av transkript av ANXA1 mRNA i förhållande till p2- mikroglobulin i kontroll (otransfekterad) och NS-siRNA- eller ANXA1 siRNA-transfekterade Kasumi-1-celler visas. Grafer visar medel ± SD för representativa data från tre oberoende experiment. En statistiskt signifikant skillnad ( ** P <0, 01) bestämdes med en parad Studentt-test. (ii) ANXA1-proteinuttryck i NS-siRNA- eller ANXA1 siRNA-transfekterade Kasumi-1-celler analyserades i Western blots med användning av polyklonal-ANXA1-antikropp mot kanin. Uppgifterna är representativa för två experiment som gav jämförbara resultat. ( b ) Effekter av ANXA1-tystnad genom siRNA på apoptos och livskraft hos Kasumi-1-celler. Procentandel av annexin V-positiva celler (och livskraftiga cellantal (ii) för NS-siRNA- eller ANXA1 siRNA-transfekterade Kasumi-1-celler behandlade med FK228. FK228 tillsattes under 24 timmar, varefter celler tvättades, mediet förändrades, och celler inkuberades under 48 h. Annexin V-positivitet mättes med flödescytometri, och livskraftiga cellantal bestämdes med användning av Trypan-blå exklusionsmetod. Grafer visar medelvärdet av SD för resultat från tre oberoende experiment. Statistiskt signifikanta skillnader ( * P <0, 05 ) bestämdes av en parad Student- t- test

Bild i full storlek

ANXA1 förmedlar uppbrytning av apoptotiska celler av makrofager

Eftersom ANXA1 är en endogen ligand som naturligt förmedlar uppbrytningen av apoptotiska celler, 21 undersökte vi de funktionella effekterna av ANXA1 på fagocytos hos leukemiceller. Vi använde ett samkultursystem bestående av humana THP-1-härledda makrofager och Kasumi-1-celler och utförde en cellhäftningsanalys för att utvärdera uppslukningen av Kasumi-1-celler av makrofager i samkulturen. Som visas i figur 6a (i) ökade exponering för FK228 under 24 timmar dramatiskt bindningen av Kasumi-1-celler till makrofager (obehandlade kontra FK228-behandlade celler: 57 ± 9 celler mot 196 ± 33 celler / mikroskopiska fält (0, 08 mm2) n = 5; P = 0, 01). Uppbrytningen av Kasumi-1-celler genom makrofager bekräftades genom fluorescensmärkningsexperiment, i vilka makrofager märktes med PE-konjugerad CD14 (figur 6a, ii).

Image

Image

Involvering av ANXA1 i uppslukning av Kasumi-1-celler av makrofager. Kluster av FK228 (5 nM) -behandlade Kasumi-1-celler på makrofag-differentierade THP-1. Kontroll och FK228-behandlade Kasumi-1-celler tillsattes till den makrofag-differentierade THP-1 under 3 timmar. Kasumi-1-cellklustering visualiserades efter tvättning av celler som inte hade intagits. (i) Representativt mikrofotografi av Kasumi-1-cellkluster på den makrofag-differentierade THP-1-monolagen (× 40). (ii) Uppbrytningen av makrofager visualiserades genom immunofluoresensdetektering av makrofager med PE-konjugerad anti-CD14-mus monoklonal antikropp (× 400). ( b ) Kasumi-1-celler transfekterade med ANXA1 siRNA eller NS siRNA och behandlades med FK228 samodlades med makrofag-differentierad THP-1 under 3 timmar. Representativt mikrofotografi av Kasumi-1-celler som klusterade på den makrofag-differentierade THP-1-monoskiktet: (i) × 40 och (ii) × 400. ( c ) Kasumi-1-celler förbehandlade med ANXA1-neutraliserande antikropp följt av FK228 samodlades med makrofag-differentierad THP-1 under 3 timmar. Representativt mikrofotografi av Kasumi-1-celler som kluster på den makrofag-differentierade THP-1-monolagen: (i) × 40 och (ii) × 400

Bild i full storlek

Däremot upphävdes FK228-inducerad cellfästning markant i de ANXA1 siRNA-transfekterade Kasumi-1-cellerna (60, 5 ± 10, 5% hämning; n = 5; P <0, 001; figur 6b). På samma sätt resulterade förbehandling med FK228 och ANXA1-neutraliserande antikropp under 24 timmar före samodlingsexperimenten resulterande i signifikant förtryck av FK228-stimulerad uppsvulning av leukemiceller med makrofager (54, 1 ± 3, 0% hämning; n = 5; P = 0, 02; figur 6c ). Denna effekt förstärktes emellertid inte när ANXA1-neutraliserande antikropp tillsattes till mediet vid tidpunkten för samodling, vilket antydde att det är den membranbundna och inte lösliga formen av ANXA1 som bidrar till uppslukningen av leukemiceller av makrofager (inte visad).

Diskussion

I denna studie undersökte vi en ny verkningsmekanism av HDACI: er i leukemiceller som innehöll AML1-ETO-fusionsproteinet. I synnerhet observerade vi en djup tillväxtinhibering och apoptos av AML1-ETO-positiva Kasumi-1 och SKNO-1-celler som svar på FK228 och SAHA. Vi demonstrerade vidare att detta svar var associerat med uppreglering av den pro-apoptotiska genen ANXA1 10, 11, 12, 22 genom histonacetylering i dess promotorregion. Däremot misslyckades HDAC-hämning att inducera ANXA1-uttryck i APL-cellinjen NB4 eller i de andra AML-linjerna U937 och OCI-AML2. Dessa AML1-ETO-negativa celler visade också en minskad känslighet för de tillväxtinhiberande effekterna av HDACI: er, vilket antyder att ANXA1 bidrar till de pro-apoptotiska effekterna av dessa medel.

Den specifika moduleringen av ANXA1-transkriptionen i AML1-ETO-positiva celler antyder en molekylär koppling mellan detta chimära fusionsprotein och regleringen av ANXA1-promotoraktivitet. Som det förstås rekryterar AML1-ETO HDAC-komplexet till AML1-beroende promotorer, 1, 4, 23 vilket resulterar i transkriptionell modulering av AML1-reglerade gener, inklusive uppregleringen av TIS11b, 24 c-myc, cyclin D1 25 gener och nedreglering av generna som kodar för transkriptionsfaktorn C / EBP a , 19, 20 tumörsuppressorn p14 ARF, 26 neurofibromatosis-1-proteinet, 27 och interleukin 3. 28 Nyligen har den proteasomala nedbrytningen av AML1-ETO av FK228 rapporterades resultera från den avbrutna föreningen av AML1-ETO med värmechockprotein 90 (HSP90). 29 Tillägg till denna förståelse identifierade våra studier C / EBP α- bindningsställen inom ANXA1-promotorregionen som inte innehåller något direkt AML1-bindande ställe. Våra fynd att FK228 uppreglerade C / EBP a- genen och främjade C / EBP a- bindning på ANXA1-promotorn indikerar möjligheten att C / EBP a- beroende ANXA1 transkriptionell aktivering är en av de molekylära mekanismerna som dikterar specificiteten för histonacetylering och transkriptionell aktivering av målgenerna i AML1-ETO-uttryckande AML-celler. Men våra resultat av induktion av apoptos genom höga doser av FK228 eller SAHA oberoende av AML1-ETO-uttryck, och observationen att ANXA1-tystnad i Kasumi-1-celler endast delvis blockerade tillväxthämmande effekter av FK228, tyder på att medan ANXA1 spelar en roll vid induktion av apoptos i AML1-ETO-uttryckande Kasumi-1-celler kan ANXA1-oberoende mekanismer bidra till pro-apoptotiska egenskaper hos HDACIs oberoende av AML1-ETO-uttryck. Nya rapporter har tillskrivit anti-leukemi-aktiviteten hos HDACI: er SAHA, valproinsyra och bensamidderivatet MS275 till den direkta aktiveringen av promotorn av den tumorselektiva dödsliganden TRAIL genom cAMP-responselementets bindande protein (CBP) och rekryteringen av SP1 och SP3 i AML-celler. 7 Dessa effekter sågs i AML-celler oberoende av deras AML-ETO-uttrycksstatus. Eftersom, liknande MS275, hämmar FK228 också kraftigt HDAC1 och HDAC2, 30 kan induktionen av TRAIL också bidra till den FK228-inducerade apoptosen i Kasumi-1-celler. Rekryteringen av CBP av HDACI inducerar i sin tur promotorhistonacetylering och målgentranskriptionen. 4 Även om ANXA1-promotorn inte innehåller ett SP1-ställe, väntar rollen för CBP-rekrytering i induktionen av ANXA1 och identifiering av de involverade acetyleringsställena på ytterligare karakterisering.

Därefter fokuserade vi på den pro-apoptotiska funktionen av ANXA1 i AML1-ETO-uttryckande AML-celler. I detta avseende befanns FK228 öka proteinnivåerna för både fullängds- och 33 kDa N-terminala klyvningsprodukter av ANXA1, vilket ledde till lokalisering av ANXA1 på plasmamembranet. Omvänt, hämningen av ANXA1-funktionen (genom ANXA1-neutraliserande antikropp, som blockerade ANXA1-lokalisering på plasmamembranet) eller uttryck (av siRNA) minskade signifikant FK228-inducerad apoptos, vilket indikerar att ANXA1 är involverad i apoptosinduktion som svar på FK228. Dessutom antyder våra resultat en specifik roll för det klyvda ANXA1-proteinet i att påskynda celldödsprocessen. Tidigare rapporter indikerade att celler transfekterade med klyvt ANXA1-protein uppvisade högre konstitutiv och inducerbar kaspas-3-aktivitet, 12 vilket tyder på att aktivering av ANXA1 bidrar till initieringen av kaspaskaskaden och apoptos. Vi demonstrerade att i sin tur caspase-3-hämning delvis blockerar FK228-inducerad apoptos och klyvning av ANXA1 utan att reglera ANXA1-genen. Detta konstaterande överensstämmer med Debret et al. 11, som visade att ANXA1-klyvning inhiberades i U937-celler av kaspasinhibitorer. Dessa fynd tyder på att även om ANXA1 bidrar till aktivering av caspase-3, klyvs kaspas-3 i sin tur främjar klyvning av ANXA1 och apoptos i leukemiceller.

Våra cDNA-array-data demonstrerade att FK228 uppreglerar 123 gener, plus att det samarbetar med andra proteiner i uppregleringen av generna som kodar för de pro-apoptotiska proteinerna TNF α (2, 1-faldigt) och profilin (fyra gånger) som har rapporterats associera med ANXA1. 12, 31 Det har vidare visats att FK228 aktiverar TNF a -gentranskription genom hyperacetylering av histon H3 och H4 i dess promotorregion, som är associerad med aktiveringen av caspases-8 och -10 och därmed klyvningen av caspases-3 och -7. 16 Vidare har behandlingen av U937-celler med TNF a visat sig öka ANXA1-mRNA och proteinuttryck; 12 tvärtom har U937-celler som överuttrycker ANXA1 rapporterats vara mer mottagliga för TNF a- inducerad apoptos. 32 Dessa observationer antyder att ANXA1 och TNF a , vars genpromotorer är målen för FK228-inducerad histonacetylering, kooperativt främjar apoptosinduktion. Den transkriptionella aktiveringen av flera andra proapoptotiska gener, inklusive Fas, Bax och TRAIL, har också varit inblandade i HDAC-inducerad apoptos. 7, 33 Vissa av dessa FK228-inducerade apoptotiska händelser kan inträffa i samband med aktiveringen av caspase-3 som bidrar till ökat ANXA1-uttryck och klyvning.

Förutom ANXA1: s roll i apoptosen som inducerats av FK228, identifierade våra studier en unik roll för ANXA1 i interaktioner mellan leukemiceller och makrofager, ett av de kritiska egenskaperna i benmärgsmikro-miljö. Specifikt blockerade den ANXA1-neutraliserande antikroppen och siRNA / ANXA1 effektivt uppbrytningen av FK228-behandlade Kasumi-1-celler genom makrofager, vilket antyder att membranlokaliserad ANXA1 spelar en kritisk roll i fagocytos. Detta förklaras potentiellt av det faktum att de apoptotiska cellerna inducerade genom antitumörterapi måste erkännas och internaliseras effektivt av makrofager. I linje med detta har Arur et al. 21 visade att ANXA1 rekryterades från cytosol till membranet i Jurkat T-celler som genomgick apoptos och att denna rekrytering var specifik för ANXA1 bland de uttryckta annexinerna. Dessa författare drog av detta slutsatsen att exporten av ANXA1 var en kritisk signal för uppslukningen av de apoptotiska cellerna.

Medan dessa observationer dokumenterar rollen för ANXA1 som en kaspasberoende endogen ligand som förmedlar uppbrytningen av apoptotiska celler och därmed fungerar som en överbryggande molekyl mellan apoptotiska celler och makrofager, är vår första observation som HDACI: er deltar i denna mekanism. I linje med dessa fynd, visades den ANXA1-härledda peptiden Ac 2-26, som motsvarar de första aminosyrorna i ANXA1 N-terminalen, stimulera fagocytos av apoptotiska polymorfonukleära leukocyter av humana monocyt-härledda makrofager. 34 Våra cDNA-array-data visade att den antiinflammatoriska cytokinet TGF- ß , som fungerar i samband med ANXA1 vid fagocytos, 17 också inducerades transkriptionellt av FK228, vilket tyder på det nära samspelet mellan ANXA1 och TGF- ß i fagocytos hos apoptotiska Kasumi- 1 celler.

Sammanfattningsvis tyder våra resultat på att FK228 och SAHA, ett mycket potent antitumörmedel som för närvarande genomgår kliniska fas I / II-studier hos patienter med hematologiska maligniteter, 9, 35 inducerar transkriptionell aktivering av ANXA1 genom histonacetylering av dess promotor. Våra data antyder vidare att induktionen av ANXA1 är specifik för leukemiceller som uttrycker det AML1-ETO chimära fusionsproteinet. Detta resulterar i uppreglering och eksternalisering av det intracellulära ANXA1-proteinet som inducerar apoptos och, ännu viktigare, ger en "eat-me" -signal som leder till fagocytisk clearance av leukemicellerna genom makrofager. Eftersom det snabba igenkänningen och uppslukningen av apoptotiska celler genom angränsande makrofager och fagocytos är en viktig komponent i anticancerterapi, drar vi slutsatsen att FK228 har lovat som ett effektivt antitumörmedel i AML1-ETO-positiva leukemier, fungerar via dubbla mekanismer - induktion av apoptos och kontroll av inflammatoriska svar.

Material och metoder

Reagenser och cellkulturer

Vi använde följande två AML1-ETO-positiva AML-cellinjer: Kasumi-1, som tillhandahölls av Dr. H. Asou, 36 och SKNO-1, som tillhandahölls av Dr. T. Nakagawa. 37 Följande fyra AML1-ETO-negativa cellinjer erhölls också. NB4-cellinjen tillhandahölls av Dr. M. Lanotte, 38 och OCI-AML2-cellinjen tillhandahölls av Dr. M. Minden (Ontario Cancer Institute, Toronto, Kanada). U937-celler köptes från American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) och THP-1-celler köptes från Riken Bioresource Center (Tsukuba, Japan). Kasumi-1, NB4, OCI-AML2, U937 och THP-1-celler hölls i RPMI-1640-medium innehållande 10% fetalt kalvserum, 1% L-glutamin och penicillin-streptomycin; 2 ng / ml GM-CSF sattes till SKNO-1-cellkulturer. FK228 (Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japan), som löstes i dimetylsulfoxid till en koncentration av 10 mM och lagrades vid -20 ° C, späddes i odlingsmedium före in vitro- exponering av celler.

Celler behandlades med FK228, caspase-3-hämmaren Z-DEVD-fmk (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) och / eller SAHA (tillhandahålls av Drs. P. Marks och V. Richon, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA) vid de angivna koncentrationerna. Medium ändrades efter 16 timmar med exponering av FK228.

Cellviabilitetsanalys

24–96 timmar efter exponering av läkemedel identifierades livskraftiga celler med hjälp av metoden för att utesluta blå färgämne och räknades i en hematocytometer.

Flödescytometrisk analys

Cellcykelfördelningen bestämdes genom flödescytometri av propidiumjodid (PI) -färgade kärnor. I korthet tvättades cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), fixerades i iskall etanol (70% volym / volym i vatten) och färgades med PI-lösningen (25 μg / ml PI, 180 U / ml RNas 0, 15% Triton X-100 och 30 mg / ml polyetylenglykol i 4 mM citratbuffert, pH 7, 8; ​​allt från Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). DNA-innehållet mättes med användning av en FACScan flödescytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) och analyserades med ModFit-programmet (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Celler med ett hypodiploid DNA-innehåll (<2 n ) ansågs apoptotiska.

För PI / annexin V-bindningsstudier som gjordes för att analysera apoptos tvättades färska celler två gånger med bindningsbuffert (10 mM HEPES, 140 mM NaCl och 5 mM CaCl2, pH 7, 4; alla från Sigma Chemical Co.) och färgades med FITC-konjugerad annexin V (Roche Diagnostic Co., Indianapolis, IN, USA) under 15 minuter vid rumstemperatur. Annexin V-fluorescens bestämdes med användning av en Becton Dickinson FACScan flödescytometer, och cellmembranens integritet bedömdes samtidigt med PI-uteslutningsmetoden.

Oligonukleotid-array-baserad uttrycksprofilering

Hybridisering utfördes med användning av humant genom U95Av2-sondarrayer (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) innehållande sonduppsättningar med tidigare karakteriserade gener. The target was labeled and hybridized to the probe arrays, and the arrays washed, stained, and scanned, as described previously. Briefly, total RNAs were prepared after 24 h of treatment with FK228 (5 nM) using the RNeasy Total RNA isolation kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), and double-stained cDNA was synthesized from total RNA. An in vitro transcription reaction was carried out to produce biotin-labeled cRNA from the cDNA, and the cRNA was fragmented and hybridized to the oligonucleotide probes on the probe array during 16 h of incubation at 45°C. Immediately after hybridization, the hybridized probe array underwent an automated washing and staining on the fluids station, and the Genechip Microarray Suite 4.0 Software (Affymetrix) was used to measure the intensity of the expression of each target gene by calculating the average differences (perfect match intensity minus mismatch intensity) of the 14–20 probe pairs used for the particular gene.

DNA-Chip Analyzer Software was used to analyze the quantified images and the expression change for each target gene was estimated with the reduced Li Wong PM-MM difference model. 39 The statistical results were imported into the Result Viewer 2.0 software.

Western blot och antikroppar

An equal amount of cell lysate was separated by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, followed by immunoblotting on Hybond-P membranes (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Proteins were visualized using the enhanced chemiluminescence detection system (Amersham Pharmacia Biotech) after incubation overnight at 4°C with the following antibodies: anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody, 15 anti-mouse monoclonal ANXA1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), and anti-procaspase-3 and anti-cleaved caspase-3 antibodies (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Anti- β -actin (Abcam, Cambridge, MA, USA) blots were run in parallel as loading controls.

Kvantitativ PCR i realtid

RNA was isolated using TRIZOL (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA). One microgram of total RNA template was used per 10 μ l of reverse transcriptase reaction by AMV reverse transcriptase (Roche Diagnostic Co.) using hexanucleotide random primers at 42°C for 1 h following the manufacturer's instructions. For quantitative real-time RT-PCR, duplicate 1 μ l samples of each cDNA were amplified as follows: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, 40 or 50 cycles at 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s. The relative amount of gene expression was calculated using the expression of β 2 -microglobin as an internal standard. Primers (FP, forward; RP, reverse) and probe sequences of ANXA1, C/EBP α , and β 2 -microglobin ( β 2 -m) were as follows: ANXA1 (GenBank δ accession number BC035993; nucleotides 375–450), FP: 5′-CAGGTCACCTTGAGGAGGTTGT-3′; RP: 5′-CAGCACGAAGTTCATCAGCATC-3′; probe: 5′-TTGGCTCTGCTAAAAACTCCAGCGCA-3′; C/EBP α (GenBank™ accession number NM_004364; nucleotides 161–230) FP:5′- GCATCTGCGAGCACGAGAC-3′; RP:5′- AACTCGTCGTTGAAGGCGG-3′; probe:5′- TCCATCGACATCAGCGCCTACATCG-3′; β 2- m FP: 5′-AGCTGTGCTCGCGCTACTCT-3′; RP: 5′-TTGACTTTCCATTCTCTGCTGG-3′; probe: 5′-TCTTTCTGGCCTGGAGGGCATCC-3′. The abundance of each transcript of interest relative to the abundance of β 2 -microglobulin was calculated as follows: relative expression (RE)=100 × 2exp(−Δ C T ), where Δ C T is the mean C T of the transcript of interest minus the mean C T of the transcript for β 2 -microglobulin. To obtain the mean C T values, we performed all reactions in duplicate.

Kromatinimmunutfällningsanalys

The chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed following the manufacturer's instructions (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA). The cells were fixed with formaldehyde (final concentration, 1%), lysed, sonicated, and then immunoprecipitated by overnight incubation at 4°C with anti-acetylated H3-lys9, anti-dimethylated H3-Lys9 (both antibodies from Upstate Biotechnology), and anti-C/EBP α (Santa Cruz Biotechnology). PBS or rabbit IgG was added as a negative control. A small portion of chromatin was set aside for use as the 'input' fraction by processing for immunoprecipitated chromatin. After immunoprecipitation, salmon sperm DNA beads (Upstate Biotechnology) were added and incubated for 1 h at 4°C. The chromatin-antibody/beads complexes were washed sequentially with low salt, high salt, and LiCl immune complex wash buffers and then with TE buffer. The immunoprecipitated and input chromatin was treated with RNase and proteinase K and maintained at 65°C for 6 h to reverse the formaldehyde crosslinks, after which the DNA fragments were purified (QIAquick PCR purification kit; Qiagen, Tokyo, Japan). Total DNA (10 × diluted input fraction) and immunoprecipitated DNA samples were applied to real-time PCR. For quantitative real-time PCR, primers and probes were designed by Primer Express software packaged with the Applied Biosystems Model 7700 sequence detector (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Probes and primers were selected to include the proximal promoter where a large number of the described transcriptional response elements reside. The probes were labeled at the 5′ end with FAM and at the 3′ end with TAMRA, which served as a quencher. The amplification conditions were as follows: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, 50 cycles at 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s. Annexin A1 promoter elements (GenBank™ accession number U25414; nucleotides 873–953), FP: 5′-TCACTTTGTTTTTGGACATAGCTGA-3′; RP: 5′-CCACACCTAGCAACCAGAAGTTAG-3′; probe: 5′-CCATGTACTTCAAACAGAAGGCAGCCAATT-3′. The abundance of each transcript of interest relative to that of 'input' C T values was calculated as follows: RE = 2ΔCT, where Δ C T is the difference in C T between the transcript of interest and total DNA (10 × diluted 'input' fraction), which represents a relative change of the targeted modification in the ANXA1 gene promoter region compared with the input. 40 The C T data from duplicate PCRs, in which the same DNA was used were averaged before the RE was calculated.

The Gene regulation program (www.gene-regulation.com) was used to predict transcription factor binding sites.

Liten störande RNA-transfektion

ANXA1 gene expression in leukemia cells was silenced by the siRNA technique. The sense strand of the siRNA silencing (ANXA1-siRNA) was ACUCCAGCGCAAUUUGAUGTT (BC035993; nucleotides 412–432). Mock transfection was done with buffer alone. A nonspecific control pool containing four pooled nonspecific siRNA duplexes was also used as a negative control (referred to as NS-siRNA; Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Transfection of Kasumi-1 cells was facilitated by the Trans IT-TKO Tranfection Reagent (Mirus Corporation, Madison, WI, USA), following the manufacturer's instructions, with modification. Briefly, 24 μ l of the TKO reagent was first incubated with 100 μ l of OPTIMEM-I medium (Invitrogen Co.) at room temperature for 15 min before siRNA was added. After another 15 min at room temperature, 500 μ l of RPMI-1640 (with 20% calf serum) containing 0.8 × 10 6 cells was added. The final siRNA concentration was 125 nM, and the incubation was allowed to continue for 4 h at 37°C in 5% CO 2, after which 3.5 ml of RPMI-1640 (with 20% calf serum) was added, and the incubation continued at 37°C for 24 s. FK228 was added to a final concentration, as indicated, and the cells were harvested 72 h later for apoptosis and cell cycle analysis. The gene silencing was verified by TaqMan RT-PCR and Western blot performed at 48 h after transfection.

Preparation of cells for phagocytosis studies

THP-1 cells (0.5 × 10 6 cells per 35-mm dish) were first differentiated by stimulation with PMA (160 nM) for 72 h to obtain a macrophage-like phenotype that closely resembled that of human monocyte-derived macrophages. Kasumi-1 cells were cultured at a density of 0.2 × 10 6 cells/ml in the presence or absence of FK228 (5 nM) for 24 h, after which the medium was changed. PMA-treated THP-1 cells were washed with PBS, and Kasumi-1 cells (either treated or untreated with FK228) added. Cells were then incubated for 3 h at 37°C. Non-ingested cells were removed by three washes with cold PBS. The engulfment by macrophages was visualized by the immunofluorescence detection of macrophages with PE-conjugated anti-CD14 mouse monoclonal antibody.

For each experiment, the number of Kasumi-1 cells that adhered to macrophages was determined in at least five fields (× 200), and an average was calculated for duplicate wells.

For the ANXA1-neutralizing studies, macrophage-differentiated THP-1 and Kasumi-1 cells were treated for 24 h with the neutralizing anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody (1 : 100) that binds to full-length and N-terminal–truncated ANXA1 with and without FK228 before co-incubation, as described above.

Konfokal mikroskopi

In preparation for confocal microscopy, cells were washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min at room temperature, permeabilized with 90% methanol in TBST buffer (10 mM Tris, 15 mM NaCl, and 0.1% Triton X-100) for 15 min, and rinsed with PBS for 5 min. Next, cells were blocked with 5% goat serum in PBS for 30 min and incubated with anti-mouse monoclonal ANXA1 antibody (1 : 100) or anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody (1 : 100) overnight at 4°C. Excess antibody was removed by washing with PBS. Then cells were incubated with secondary FITC-labeled anti-mouse IgG (1 : 250, H+L; Calgat, Burlingame, CA, USA) for 30 min at 37°C. Cells were washed with PBS, mounted on slides, and analyzed under a Zeiss LSM 510 laser confocal microscope (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Statistisk analys

Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD. Levels of significance were evaluated by a two-tailed, paired, Student's t -test, and P <0.05 was considered statistically significant.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • BC035993
  • NM_004364
  • U25414