En ny homozygot missense-mutation i bhlha9 orsakar mesoaxial synostotisk syndaktisk med falangeal reduktion i en pakistansk familj | människans genomvariation

En ny homozygot missense-mutation i bhlha9 orsakar mesoaxial synostotisk syndaktisk med falangeal reduktion i en pakistansk familj | människans genomvariation

Anonim

ämnen

  • Släktskap
  • Sjukdomgenetik
  • Genetisk rådgivning

Abstrakt

Mesoaxial synostotisk syndaktisk med fallangal reduktion (MSSD) är en sällsynt icke-syndromisk leddeleformation med autosomal recessiv arv. Hittills har endast ett fåtal drabbade familjer med MSSD som hade BHLHA9- mutationer rapporterats. Den här rapporten beskriver en ihärdig pakistansk familj med fem drabbade individer med MSSD som uppvisade ett autosomalt recessivt mönster. Genotypning följt av Sanger-sekvensering utfördes, och vi identifierade en ny homozygot missense-mutation (c.311T> C, p.Ile104Thr) i BHLHA9- genen. Detta fynd utvidgar spektrumet av kända mutationer i BHLHA9- genen som orsakar MSSD.

Introduktion

Utveckling av lemmarna under embryogenesen är en mycket komplex och välorganiserad process. Under utveckling impliceras transkriptionell reglering, många gener och dosberoende signaler kraftigt i regleringen av molekylära och cellulära processer. De gener som är involverade i tidig embryonal lemmutveckling inkluderar HOXD13 , GLI3 , GLI2 , SHH , FGF8 , WNT7A och WNT10B . 1

Mesoaxial synostotisk syndaktisk med falangeal reduktion (MSSD, MIM 609432) är en sällsynt medfödd lemdefekt som kännetecknas av mesoaxial osseös synostos på en metacarpal nivå, en minskning av antalet phalanges med en eller flera, hypoplasia av distala phalanger i preaxial och postaxial siffror, klinodaktiskt av femte fingrarna och preaxiell fusion av tårna. 2, 3, 4 Fram till nu har endast ett par familjer med MSSD som uppvisade autosomal recessiv arv rapporterats. 2, 4 BHLHA9- genen (MIM 615416), som kodar en basisk helix-loop-helix (bHLH) A9-transkriptionsfaktor och innefattar ett enda exon, verkar vara en huvudregleringsgen för lemmutveckling på grund av dess exklusiva uttryck i det distala mesenkymet av lemmaknoppen i musembryot E10.5 – E11.5. 5, 6, 7 Studier har visat att BHLHA9 är förknippad med tre olika fenotyper i lemmarna: missbildning med delad hand / fot med lång benbrist-3 (MIM 612576), komplex camptosynpolydactyly (MIM 607539) och MSSD. Hittills är det känt att tre missense-mutationer är förknippade med MSSD, och det finns tre besvärliga familjer med MSSD som kommer från Pakistan. 4, 8 Här beskriver vi den fjärde ihärdiga familjen av pakistansk ursprung med MSSD. Sanger-sekvensering avslöjade en ny homozygot missense-variant (c.311T> C, p.Ile104Thr) i BHLHA9- genen som orsakade MSSD. Detta är den fjärde MSSD-orsakande mutationen i BHLHA9 och den första mutationen i helixdomänen.

Material och metoder

Etiskt godkännande och familjehistoria

Studiens design var i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkänd av institutionella granskningsnämnder (IRB) från Peking Union Medical College (Kina) och Quaid-i-Azam University (Islamabad, Pakistan). Familjen bodde i en förort till Khyber Pakhtunkhwa-provinsen, i Pakistan. Familjen hade fem individer inklusive tre män (IV-1, IV-6 och IV-12) och två kvinnor (IV-3 och IV-8) som hade MSSD (figur 1a). I den här familjen fanns det ingen tidigare familjehistoria med benformiga missbildningar.

Image

Stamtavla struktur och kliniska egenskaper för proband. ( a ) De svarta symbolerna representerar de drabbade individerna, och öppna symboler representerar opåverkade individer. Pilen indikerar proband. De individer som var tillgängliga för genotypning indikeras av asterisker. ( b ) Fotografier av proband (IV-1) och drabbade individer (IV-3, IV-8 och IV-12) visar syndaktiska fenotyper i händerna samt fusion av andra och tredje tår. ( c ) Röntgenbilder av probandens högra hand.

Bild i full storlek

Genotypning och sekvensering

Blodprover erhölls från fem drabbade och fem opåverkade individer i familjen. Genomiskt DNA extraherades från perifera blodprover med användning av en QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) och kvantifierades med användning av en Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific; Waltham, MA, USA). Ett enda kodande exon av BHLHA9- genen (NM_001164405.1) amplifierades med användning av PCR. PCR-reaktionen påbörjades med ett initialt 5-minuters denatureringssteg vid 95 ° C, följt av 35 cykler av denaturering (94 ° C) under 30 s, glödgning (56-62 ° C) under 30 s och förlängning (72 ° C) C) under 30 sekunder och avslutades med ett slutligt förlängningssteg vid 72 ° C under 10 minuter. PCR-produkterna renades och utsattes för direkt sekvensbestämning med användning av en ABI3700 autosquencer. Kontrollprover från de 200 etniskt matchade individerna screenades med användning av Sanger-sekvensering.

Resultat

Kliniska fynd

Vad gäller proband IV-1, i åldern 24 år, observerades fyra siffror på höger hand, och båda händerna hade breddade tummarna. På höger sida ersattes den tredje och den fjärde fingern med en ensiffrig siffra, som hade en stor proximal falanx och en hypoplastisk, klubbformad terminal phalanx, och naglarna reducerades bilateralt. Högerhandens femte finger visade klinodaktiskt. När det gäller den vänstra handen hade fjärde fingret valgusavvikelser vid den terminala falanxen. Fötternas fenotyp kännetecknades av hallux varus; det partiella utseendet på zygodactyly mellan andra och tredje tår; och hypoplastiska naglar på andra, tredje och fjärde tårna (figur 1b). Förutom den tidigare beskrivna fenotypen, överlappade probandens yngre syster (IV-3, 22 år) femte tår. När det gäller hans bror (IV-6, 16 år), var hans fötter involverade, men händerna var normala. Ämne IV-8 hade fem fingrar på sin högra hand och fyra fingrar på sin vänstra hand (figur 1c). Vid en fysisk undersökning hade patient IV-12 fyra fingrar bilateralt, men hans fötter var normala. En röntgenundersökning av proband avslöjade synostos av den tredje och fjärde metakarpalen, vilket resulterade i en stor, enkel och konisk proximal falanx och dysplastiska mitt- och terminala falanger. De femte fingrarna hade klinodaktiskt med symfalangism i mellan- och distala falanger. Metakarpalerna hade distalt huvudhypoplasi (figur 1c). Det fanns inga tecken på benaktigt engagemang i individens fötter. En fysisk undersökning och roentgenografiska studier av de andra drabbade individerna i denna familj avslöjade en liknande fenotyp med en något annorlunda manifestation.

Mutationsanalys

Vi identifierade en ny homozygot missense-mutation vid position 311 (c.311T> C) på den kodande exonet av BHLHA9 i alla drabbade individer med användning av en Sanger-sekvensanalys (figur 2a). Denna missense-transversionsmutation ledde till substitution av en isoleucin med en treonin i position 104 (p.Ile104Thr) som förutsägs befinna sig i helix-loop-helix-domänet i en bHLH A9-transkriptionsfaktor (figur 2b). Genotypning i denna familj avslöjade att alla drabbade individer innehöll samma homozygota c.311T> C-missense-mutation, medan alla obligatoriska bärare hade den heterozygota mutationen, vilket tyder på en Mendelisk samsegregering med fenotypen för alla familjemedlemmar (figur 1a). Den nya mutationen var inte närvarande i dbSNP (//www.ncbi.nih.gov/SNP) (åtkomst till december 2015), 1000 genomprojekt (1000 Genome Project Consortium 2015) eller Exome Aggregation Consortium (ExAC) (// www.exac.broadinstitute.org) och observerades inte hos 200 etniskt kontrollerade individer. Den drabbade aminosyraresten har också varit mycket bevarad under utvecklingen av ryggradsdjur (figur 2c). Användning av olika bioinformatikverktyg inklusive Polyphen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (//sift.jcvi.org/), PROVEAN (//www.provean.jcvi.org) och Mutation Taster (//www.mutationtaster.org/) hjälpte till att förutsäga att mutationen (c.311T> C) är patogen och påverkar proteinstrukturer.

Image

BHLHA9- mutationen, proteinstrukturerna och bevarandeanalysen av BHLHA9 . ( a ) Genomisk DNA-sekvenseringselektroferogram av den drabbade individen (övre), opåverkad bärare (mitten) och kontrollindivid (nedre). ( b ) Proteinstrukturer i BHLHA9 . (* —Förändring av aminosyra rapporterad av Malik et al. 4 i MSSD och # —aminosyraförändring rapporterad av Phadke et al. 8 i Complex Camptosynpolydactyly), och aminosyraförändringen associerad med den nuvarande familjen visas med användning av en röd färg i diagrammet (** s.Ile104Thr). ( c ) Aminosyrorna muterade i de drabbade individerna bevaras i olika arter. MSSD, mesoaxial synostotisk syndaktiskt med falangeal reduktion.

Bild i full storlek

Diskussion

BHLH-proteinerna innefattar en stor superfamilj av transkriptionella regulatorer i organismer från jäst till människor och spelar en viktig roll i utvecklingsprocesser och könsbestämning, liksom i utvecklingen av lemmar, muskler och nervsystem. Familjen bHLH har två konserverade domäner, dvs (1) en basdomän som binder till E-box och en konsensushexanukleotidsekvens; och (2) HLH-domänen som hjälper till att samordna och interagera med det andra proteinet för homodimer och heterodimerbildning. 9

BHLHA9- genen lokaliseras på kromosom 17p13.3, och det kodade proteinet tillhör bHLH-superfamiljen och är involverat i lemmens utvecklingsprocess. Klopocki et al. erkände att knockdown bhlha9 kan orsaka bröstfenaförkortning hos sebrafisk. 5 I musmodeller, Schatz et al. 7 märkte det tidiga uttrycket av bhlha9 i det distala mesenkymet av lemmaknopparna i E10.5-E11.5-musembryot, och homozygota bhlha9- knockout-möss hade olika nivåer av syndaktiskt involverande mjuka vävnader, men inte skelettelement. Studier har visat att duplikationer eller triplikering på kromosombandet 17p13.3 med en liten överlappningsregion som omfattar BHLHA9 är ansvarig för en autosomal dominerande missbild av hand / fotben med lång benbrist-3. Nyligen Phadke et al. identifierade en ny patogen mutation i BHLHA9 som orsakar en komplex kamptosynpolydaktiskt kännetecknad av grovt onormala händer, polydaktiskt med siffror som härrör från ryggen i händerna, syn- och kamptodaktiskt av vissa fingrar, mjukvävnad syndaktiskt från de första och andra tårna och hypoplastiska naglar . 8, 10 Malik et al. 4 visade att tre angränsande missense-mutationer som påverkar den mycket konserverade DNA-bindande regionen av BHLHA9 är associerade med MSSD. Här identifierade vi en ny homozygot missense-variant (c.311T> C, p.Ile104Thr) i BHLHA9 i en allvarlig familj med pakistanskt ursprung. Mutationen observerades inte hos 200 etniskt kontrollerade individer eller i offentliga databaser (dbSNP142, 1000 Genomes och ExAC), vilket indikerar att det inte är en vanligt tyst polymorfism. Aminosyraresten Ile104 är mycket bevarad under utvecklingen av ryggradsdjur, och fyra olika bioinformatikverktyg förutspådde att mutationen (c.311T> C) är patogen och påverkar proteinstrukturer. Denna mutation är den första som förväntas påverka helix-loop-helix-domänen i BHLHA9 . Men detaljer angående den patogena mekanismen måste studeras ytterligare.

Sammanfattningsvis antyder vår observation, i kombination med andra undersökares undersökare, att BHLHA9- genen är en viktig aktör i lemmens utveckling. Dessutom utvidgar vårt fynd av den nya homozygota missensmutationen (c.311T> C, p.Ile104Thr) vår kunskap om mutationsspektrumet för BHLHA9- genen beträffande benfenotyper som hjälpte till i den prenatala genetiska och molekylära diagnosen av denna familj.

Förlagets anmärkning

Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.